Бх крови расшифровка: Биохимический анализ крови: расшифровка у взрослых

Содержание

Биохимический анализ крови — расшифровка биохимии

Биохимический анализ крови приходится сдавать чуть ли не чаще, чем общеклинический. Мы поможем разобраться в основных показателях «биохимии».

Дежурный терапевт сервиса онлайн-консультаций Доктис бесплатно поможет расшифровать Ваш анализ крови. Скачать мобильное приложение.

Глюкоза. Норма — 3,9−5,8 ммоль/л

Повышение глюкозы натощак в результатх биохимического анализа крови свидетельствует о нарушении углеводного обмена в той или иной степени выраженности – от нарушения толерантности к глюкозе до сахарного диабета 1 или 2 типа. Верхняя граница нормы заявлена как 5,8 ммоль/л, но в последнее время многие специалисты «отодвигают» эту границу до для людей старше 60 лет до 6,1 ммоль/л.

Показатели в коридоре от 6,1 до 6,69 свидетельствуют о нарушении толерантности к глюкозе или предиабете, на этом этапе ещё не поздно остановить развитие заболевания, изменив режим питания, похудев и избавившись от вредных привычек.

Показатель выше 6,7 ммоль/л с большой долей вероятности говорит о диабете, но и это не окончательно. Эндокринологи советуют в этом случае сдать дополнительный анализ на гликированный гемоглобин – он продемонстрирует усредненный показатель глюкозы в плазме крови за последние три месяца.

АЛТ. Норма – менее 31 Ед/л для женщин и 41 Ед/л для мужчин.

Этот фермент синтезируется главным образом в печени, и обычно в кровь попадет лишь небольшое его количество. Повышение значений в результатах анализа характерно для заболеваний печени – жирового гепатоза, (когда из-за неправильного питания с преобладанием жирной пищи и алкоголем гепатоциты заменяются жировыми клетками), а также гепатитов — вирусных, токсических (где на первом месте алкогольный, затем лекарственный), аутоиммунных и других, а также цирроза печени. Еще одна возможная причина повышения – недавно перенесенный инфаркт миокарда.

АСТ. Норма – менее 31 Ед/л для женщин и 37 Ед/л для мужчин.

Также печеночный фермент, повышение концентрации в крови свидетельствует о поражении этого важного органа. Правда, еще он содержится в сердце, почках, скелетных мышцах. Редко повышается изолированно и почти всегда сопровождает повышение АЛТ. В этом случае нужно не откладывая обратиться к гастроэнтерологу, печень страдает. Изолированно может повышаться при инфаркте миокарда, травме почек, повреждении скелетных мышц, сердечной недостаточности. А иногда – и после излишней физической нагрузки.

ГГТП. Норма – менее 49 Ед/л для женщин и 32 Ед/л для мужчин.

Еще один «печёночный» показатель и основной маркер холестаза – застоя желчи. А еще его повышение нередко свидетельствует о частом злоупотреблении алкогольными напитками.

Общий билирубин. Норма – 3,4−17,1 мкмоль/л.

Важный показатель работы печени, основной компонент желчи. Если значение в норме, значит все звенья работают нормально. Если же показатель в результатах биохимического анализа крови повышен, в лаборатории проведут дополнительный анализ и выяснят, за счёт какой составляющей произошло повышение. Их две – прямой (связанный) и непрямой (свободный) билирубин. Если повышение произошло за счёт непрямого, значит проблема в высвобождении билирубина из кровяных клеток, в организме происходит гемолиз – разрушение клеток красной крови. Если за счёт прямого, значит проблема в печени, начинается или уже имеет место нарушение выделения и всасывания желчи, клинически проявляющееся желтухой.

Амилаза. Норма – 28−100 Ед/л.

Фермент поджелудочной железы, который также содержится в кишечнике. Повышение амилазы в биохимических показателях крови свидетельствует о развитии воспаления поджелудочной – острого или хронического панкреатита. Если нельзя исключить повреждение кишечника, необходимо выполнить более «прицельный» анализ на панкреатическую амилазу.

Общий белок. Норма – 64−83 г/л.

Показатель основного обмена белка в нашем организме. Возможны – гипопротеинемия (снижение уровня), гиперпротеинемия (повышение уровня) и диспротеинемия (нарушения соотношения основных белков -альбуминов и глобулинов). Повышение уровня белка в биохимическом анализе крови свидетельствует о насыщенном белком обильном питании. Снижение уровня – опасный симптом, который может говорить о многих причинах, начиная от голодания и заканчивая онкологическим заболеванием.

Общий холестерин. Норма – 3,0−7,2 ммоль/л в зависимости от пола и возраста.

Показатель уровня всего холестерина, содержащегося на данный момент в плазме. Повышение уровня традиционно считается неблагоприятным признаком развития атеросклероза сосудов, хотя на самом деле требуется уточнение, за счёт какой составляющей происходит повышение. (О «плохом и «хорошем» холестерине мы отдельно расскажем в ближайшее время).

Креатинин. Норма – 53−97 мкмоль/л женщины и 62−115 мкмоль/л мужчины.

Показатель работы мочевыделительной системы. Повышение уровня креатинина в результатах биохимического анализа свидетельствует о той или иной стадии почечной недостаточности. Но также может повышаться в крови после значительных физических нагрузок, временной «перегрузки» почек белковой пищей или лекарствами, у спортсменов. Такое повышение через некоторое время нормализуется.

Мочевина. Норма – 2,5−6,4 ммоль/л, после 60 лет – 2,9−7,5 ммоль/л.

Ещё один «почечный» показатель. По сути это показатель уровня распада белков, но обычно повышение уровня мочевины свидетельствует не об этом, а о неспособности почек выводить обычное количество распадающегося белка.

Доктора используют этот показатель биохимического анализа крови для контроля лечения почечной недостаточности и оценки состояния больных. У придерживающихся белковой диеты возможно эпизодическое повышение уровня мочевины при относительно здоровых почках.

Мочевая кислота. Норма – 150−350 мкмоль/л женщины и 210−420 мкмоль/л мужчины.

Несмотря на название, больше применяется не для оценки состояния почек, а с целью выявления подагры. Именно о развитии этого заболевания говорит увеличение мочевой кислоты в плазме, а появление типичных для заболевания болей в суставах лишь подтверждает лабораторный диагноз.

Калий. Норма – 3,5−5,5 ммоль/л.

Повышение уровня этого электролита чаще всего говорит о развитии почечной недостаточности, в результате чего нарушается выведение электролита. Калий выше 6,5 ммоль/л опасен возможной остановкой сердца. Снижение уровня бывает вызвано большой потерей жидкости (рвота, понос, часто обильное мочеиспускание) и чревато развитием нарушений сердечного ритма (мерцательной аритмией).

Натрий. Норма – 136−145 ммоль/л.

Снижение уровня связано с обезвоживанием, повышение с нарушением работы почек, но не так выраженно, как в случае с калием. Снижение концентрации натрия в результатах биохимического анализа проявляется общей слабостью и различными неврологическими нарушениями, повышение часто сочетается с повышением артериального давления.

Задать вопрос врачу о своём здоровье Вы всегда можете в мобильном приложении Доктис. Скачивайте прямо сейчас!

Читайте также

11 показателей. Расшифровываем общий анализ мочи

14 показателей. Расшифровываем общий анализ крови

10 показателей. Расшифровываем анализ мочевого осадка 

7 показателей. Расшифровываем анализ крови на липидый профиль

Онлайн-консультации ведущих врачей и исследования в лабораториях по России

показатели, норма, расшифровка. Подготовка к анализу крови на биохимию

Автор

Таволжанская Татьяна Васильевна

Ведущий врач

Семейный врач

Биохимический анализ крови – это метод лабораторного исследования, позволяющий на основании измерения определенных параметров, получить представление о состоянии обмена веществ (белков, углеводов, жиров), а также о работе различных внутренних органов.

Данный анализ отличается информативностью и достаточно высокой достоверностью. На основе результатов анализа специалисты могут составить представление о функционировании почек, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы и некоторых других органов, а также выявить недостаток микроэлементов и витаминов. Биохимический анализ крови используется в гастроэнтерологии, терапии, урологии, кардиологии, гинекологии и других направлениях медицины.

Когда назначается биохимический анализ крови?

Биохимия кровиВрач может назначить биохимический анализ крови в следующих случаях:
  • в целях выявления патологии. Биохимический анализ крови может помочь  установить нарушения в работе того или иного органа, даже если отсутствуют проявленные симптомы. Именно поэтому врачи рекомендуют сдавать кровь на анализ биохимии два раза в год в порядке скринингового обследования. Это позволит обнаружить заболевания на ранней стадии, что значительно облегчит их последующее лечение.
    Выявленные изменения химического состава свидетельствуют о неблагополучной ситуации и означают необходимость медицинского вмешательства.
  • Для уточнения диагноза. Результаты биохимического анализа крови позволяют уточнить картину заболевания и являются необходимым дополнением к данным осмотра и жалобам пациента.
  • В порядке наблюдения за ходом лечения и течением заболевания. С этой целью анализ биохимии назначается при заболеваниях внутренних органов (почек, печени, поджелудочной железы), авитаминозах, интоксикации организма.

Показатели биохимического анализа крови: норма и отклонения. Расшифровка биохимического анализа крови

Необходимые показатели для биохимического анализа определяются лечащим врачом. Набор показателей может зависеть от характера заболевания и состояния пациента. Стандартный биохимический анализ включает в себя следующие основные показатели:

  • общий белок – суммарная концентрация белков. Норма — 65-85 г/л. Повышенное значение этого показателя может свидетельствовать об инфекционном заболевании, артрите, ревматизме или онкологическом заболевании. Пониженное значение может указывать на заболевание печени, кишечника, почек или онкологическое заболевание;
  • глюкоза. Норма — 3,5-6,5 ммоль/л. Повышенное значение данного показателя говорит об угрозе сахарного диабета;
  • мочевина – продукт распада белков. Норма -1,7-8,3 ммоль/л. Повышенный уровень мочевины говорит о нарушении в работе почек, мочевыводящих путей, может свидетельствовать о сердечной недостаточности, кровотечениях или опухолях. Кратковременное повышение уровня мочевины может быть следствием интенсивных физических нагрузок
  • холестерин – компонент жирового обмена. Норма для общего холестерина — 3,5-5,7 ммоль/л. Повышенное значение показателя указывает на риск заболеваний сердечно-сосудистой системы, атеросклероза или заболеваний печени. Общий холестерин складывается из трех показателей — ЛПОНП (липопротеиды очень низкой плотности), ЛПНП (липопротеиды низкой плотности) и ЛПВП (липопротеиды высокой плотности).
    Липопротеиды очень низкой плотности и низкой плотности осаждаются в бляшках на стенках сосудов и способствуют развитию атеросклероза. Липопротеиды высокой плотности, наоборот, способствуют торможению атеросклероза, «вытягивая» холестерин из бляшек. Нормальные значения:  для ЛПНП — <0,9 ммоль/л; для ЛПВП — >0,09 ммоль/л.
  • билирубин – пигмент, образующийся в результате распада гемоглобина. Норма: общий билирубин — 3,4-20,5 мкмоль/л. Повышенное значение показателя может быть вызвано гепатитом, циррозом печени, отравлением и желчнокаменной болезнью. Прямой билирубин (норма): 0-8,6 мкмоль/л.

Также в число показателей входят: АсАТ, АлАТ (ферменты, вырабатываемые печенью), креатинин, триглицериды, фосфор, натрий, мочевая кислота, магний, липаза, натрий, кальций, калий и многие другие.

Подготовка к биохимическому анализу крови

Для того чтобы результаты анализа были точными, сдавать кровь на биохимию следует натощак. Лучше всего это сделать утром. Если утром не получается, то следует спланировать так, чтобы перед сдачей крови на анализ не есть и не пить ничего, кроме воды,  в течение хотя бы 6-ти часов.

Накануне анализа не надо есть жирную пищу и принимать алкоголь. В течение часа перед сдачей анализа желательно не курить.

Если Вы принимаете какие-либо лекарственные препараты, об этом следует известить лечащего врача. Если приём лекарства прерывать нельзя, исследование, возможно, придётся отложить.

Непосредственно перед сдачей анализа желательно присесть и находиться в покое 10-15 минут, чтобы исключить влияние физических и эмоциональных нагрузок на результаты исследований.

Где сдать биохимический анализ крови в Москве?

Сдать биохимический анализ крови быстро и без очереди Вы можете в АО «Семейный доктор». Вы можете сдать биохимический анализ в любой из наших поликлиник, выбрав ту, что находится в нужном Вам районе Москвы. Если результаты анализа Вам нужны срочно, сделайте биохимический анализ крови в режиме CITO. Анализы в режиме CITO можно сдать в поликлинике №15. У нас Вы можете сдать биохимический анализ крови в выходные и праздничные дни.

Для анализа на биохимию у пациента берётся около 5 мл. крови из локтевой вены. Анализ проводится на автоматическом анализаторе, позволяющим произвести измерения более чем по 100 различным параметрам. Результаты исследования заносятся в электронную форму – бланк исследования.

Результаты анализа трактуются врачом индивидуально, в зависимости от результатов осмотра, других исследований, особенностей организма пациента и его состояния.

Не занимайтесь самолечением. Обратитесь к нашим специалистам, которые правильно поставят диагноз и назначат лечение.

подготовка, таблица нормальных значений, расшифровка

Биохимический анализ крови – это развернутое исследование венозной крови пациента, проводимое для оценки работы внутренних органов, выявления дефицита витаминов, ферментов, макро- и микроэлементов, а также для диагностики патологии обмена веществ. Биохимия крови более показательна, чем общий клинический анализ, результаты анализа позволяют обнаружить многие заболевания на начальной стадии. Именно поэтому данное исследование рекомендуется проходить не только по назначению врача, но и в профилактических целях не реже одного раза в год. Результаты биохимического анализа крови включают множество связанных между собой показателей и их интерпретацией должен заниматься врач – самолечение опасно для вашего здоровья!

Как подготовиться к процедуре?

  • Забор крови на биохимию всегда выполняется натощак, чаще всего между 8 и 11 часами утра. В день проведения допускается прием негазированной воды, а за сутки до проведения процедуры следует исключить из рациона тяжелую пищу, газированные напитки, крепкий кофе, чай и алкоголь.
  • В последний час перед сдачей крови нельзя курить.
  • Непосредственно перед процедурой постараться избегать физических и эмоциональных нагрузок, последние 10–20 минут лучше просто посидеть возле манипуляционного кабинета.
  • Если дата проведения биохимического анализа крови выпадает на период прохождения курса медикаментозного лечения или курса физиотерапии, то стоит проконсультироваться с врачом – возможно он порекомендует перенести исследование на другое время или прервать курс лечения на несколько дней.

Расшифровка результатов биохимического анализа крови

Лабораторные анализаторы нового поколения способны предоставить результаты исследования уже через два часа после выполнения забора крови. Как правило, пациент получает результаты в течение 2–3 дней в виде распечатанной или электронной таблицы, где перечислены изученные показатели, их значения и референсные (среднестатистические) диапазоны нормы. Разные лаборатории предлагают разные объемы данных, в этой же статье будут описаны наиболее часто исследуемые показатели крови.

Белки

 ОбозначениеНорма (женщины)Норма (мужчины)Единицы измерения
Альбумин ALB < 14 лет: 38–54
14–60 лет: 35–50
> 60 лет: 34–38
г/л
Гликированный гемоглобин HbA1c, A1c, гликозилированный гемоглобин < 5,7 %
Общий белок TP, TProt, Serum < 1 года: 47–72
1–4 года: 61–75
5–7 лет: 52–78
8–15 лет: 58–76
> 15 лет: 64–83
г/л
C-реактивный белок CRP, СРБ < 0,5 г/л
Железосвязывающая способность сыворотки TIBC, IBC, ОЖСС 45,3–77,1 мкмоль/л
Миоглобин Myoglobin 12–76 19–92 мкг/л
Трансферрин Tf 2,2–2,4 2–4 г/л
Ферритин Ferritin 13–150 30–400 мкг/л

Общий белок характеризует состояние белкового обмена и выявляет диспротеинемию (изменение количественного соотношения белковых фракций в сыворотке крови). Пониженные значения могут указывать на неправильное питание, заболевания печени, последствия ожогов, травм и операций, а повышенные – на инфекционное заболевание, неинфекционный гепатит, аутоиммунные заболевания, дегидратацию или могут быть вызваны диареей и рвотой.

Белок альбумин занимает до 65 % объема плазмы крови, вырабатывается печенью и выполняет важнейшую функцию переноса многих биологически активных веществ. Причины понижения концентрации альбумина совпадают с таковыми для общего белка. Повышается же значение довольно редко, например, при дегидратации, гемоконцентрации или вследствие приема анаболических стероидов.

Железосодержащий белок миоглобин исследуется преимущественно с целью ранней диагностики инфаркта миокарда. Высокая концентрация миоглобина может указывать на инфаркт миокарда, сердечную недостаточность, острое повреждение почек, последствия термических ожогов, электрошока. Низкий миоглобин сопровождает течение ревматоидного артрита и полиомиелита.

Значение гликированного или гликозилированного гемоглобина очень важно пациентам с сахарным диабетом, а также используется для его диагностики. Гликированный гемоглобин дает представление о среднем уровне глюкозы в крови в разрезе большого промежутка времени (1–2 месяца). Если концентрация данной фракции белка не превышает 5,7 % от общего объема гемоглобина в крови, то можно говорить о компенсированном состоянии. Значения в диапазоне 5,7–6,4 % свидетельствуют о риске развития сахарного диабета, выше 6,4 % – о выраженном декомпенсированном диабете.

C-реактивный белок выступает в роли индикатора воспалительного процесса в организме. Превышение порога в 0,5 г/л указывает на острое воспаление или злокачественное новообразование. Также данный параметр важен для оценки эффективности антибактериальной и противовоспалительной терапии.

Исследуемые значения трансферрина, ферритина и железосвязывающей способности сыворотки позволяют диагностировать патологию метаболизма железа в крови. Трансферрин – это основной переносчик железа, повышение его концентрации, как правило, свидетельствует о развитии железодефицитной анемии, а понижение – об инфекциях, циррозе печени, анемиях иной этиологии или белковом голодании. При железодефицитной анемии ферритин, наоборот, понижается, а его повышение указывает на воспалительные процессы, заболевания печени или онкопатологию.

Липиды

 ОбозначениеНорма (женщины)Норма (мужчины)Единицы измерения
Триглицериды TRIG < 15 лет: 0,40–1,48
15–30 лет: 0,4–1,63
30–55 лет: 0,44–2,63
> 55 лет: 0,62–2,71
< 15 лет: 0,34–1,41
15–30 лет: 0,45–2,81
30–55 лет: 0,56–3,61
> 55 лет: 0,65–3,29
ммоль/л
Холестерин общий CHOL 5,2 ммоль/л
Холестерин-ЛПВП HDL, ХС-ЛПВП 1,03–1,55 ммоль/л
Холестерин-ЛПНП LDL, ХС-ЛПНП 0–3,3 ммоль/л

Общий холестерин используется для выявления первичных и вторичных нарушений липидного обмена, оценки вероятности развития атеросклероза, а также для оценки эффективности лечения атерогенных нарушений метаболизма липидов. Понижение значения вызывают кахексия, голодание, мальабсорбция, тяжелые острые заболевания, печеночная недостаточность, гипертиреоз, а повышение – первичные и вторичные дислипопротеинемии. Опасными последствиями низкого холестерина являются психофизиологические нарушения и репродуктивная дисфункция, высокого – сахарный диабет и атеросклероз. Биохимическое исследование крови на триглицериды (продукты метаболизма углеводов в печени) преследует те же задачи, причины роста и падения их концентрации также совпадают с общим холестерином. 

Холестерин липопротеинов высокой и низкой плотности (ХС-ЛПВП и ХС-ЛПНП соответственно) исследуется и интерпретируется в комплексе с общим холестерином и триглицеридами для более точной диагностики. ХС-ЛПВП повышается при первичном билиарном циррозе, гепатите, алкоголизме, или же его увеличение может быть обусловлено генетически. У пациентов с атеросклерозом, декомпенсированным сахарным диабетом, хронической болезнью почек, холестазом значение ХС-ЛПВП снижается. Липопротеиды низкой плотности задействованы в переработке и выведении жиров, снижение их концентрации может говорить о развитии хронической анемии, синдрома Рейно или миеломы, а повышение – о гипотиреозе, нефротическом синдроме, сахарном диабете, порфирии, синдроме Кушинга, риске развития атеросклероза. 

Углеводы 

 ОбозначениеНорма (женщины)Норма (мужчины)Единицы измерения
Глюкоза GLUC 3,3–5,5 ммоль/л
Фруктозамин FRA 0–285 мкмоль/л

Глюкоза является основным источником энергии для всех клеток и тканей организма человека и, в частности, единственным ее источником для мозга. Значение глюкозы в результатах биохимического анализа отражает уровень сахара в крови. Если это значение повышено, то возможен риск развития сахарного диабета, поражения центральной нервной системы, гормональных нарушений. Глюкоза «падает» при образовании опухолей в поджелудочной железе, при печеночной и надпочечниковой недостаточностях, гипотиреозе, недоедании или из-за приема инсулина. 

Значение фруктозамина отражает колебание уровня глюкозы в крови в период 2–3 недель, предшествовавших сдаче анализа. Если его концентрация превышает 280–285 мкмоль/л, то врачом рассматривается вероятность развития сахарного диабета. 

Неорганические вещества и витамины 

 ОбозначениеНорма (женщины)Норма (мужчины)Единицы измерения
Витамин B12   208–963,5 пг/мл
Железо Fe, IRON < 2 лет: 7–18
2–14 лет: 9–22
> 14 лет: 9–30
< 2 лет: 7–18
2–14 лет: 9–22
> 14 лет: 11–31
мкмоль/л
Калий K 3,5–5 ммоль/л
Кальций Ca 2,25–2,5 ммоль/л
Магний Mg 0,75–1,25 ммоль/л
Натрий Na 136–145 ммоль/л
Фосфор P < 2 лет: 1,45–2,16
2–12 лет: 1,45–1,78
12–60 лет: 0,87–1,45
> 60 лет: 0,90–1,32
< 2 лет: 1,45–2,16
2–12 лет: 1,45–1,78
12–60 лет: 0,87–1,45
> 60 лет: 0,74–1,2
ммоль/л
Хлор Cl 98–107 ммоль/л

Витамин B12 в организме человека участвует, в частности, в выработке эритроцитов. Высокий уровень данного витамина может указывать на болезни печени, почек или лейкоз. Болезни паразитарной этиологии, воспалительные процессы в желудочно-кишечном тракте и соблюдение вегетарианской (веганской) диеты, наоборот, приводят к понижению уровня витамина B12 в крови. 

В одном из предыдущих абзацев упоминалось, что железо принимает участие в процессе транспортировки кислорода. Его недостаток обычно объясняется неправильным питанием или метаболическими нарушениями, а переизбыток – функциональными расстройствами кишечника. 

Калий отвечает за регуляцию водного баланса и нормализует сердечный ритм. Дефицит калия возникает вследствие неправильного или недостаточного питания, рвоты, при почечной недостаточности, синдроме Кушинга, осмотическом диурезе, хронической болезни почек, а также сопутствует длительному приему стероидных препаратов. Повышается же калий при остром обезвоживании организма, обширных травмах и ожогах, хронической надпочечниковой недостаточности, диабетической коме или вследствие приема калийсберегающих мочегонных препаратов. 

Кальций задействуется в образовании костной ткани, крайне важен для нормальной работы мышц, нервов, сердечной мышцы и сосудов. Низкие значения кальция в крови указывают на дефицит витамина D, функциональные заболевания почек, панкреатит, нарушение метаболизма магния или на гипопаратиреоз. Повышение уровня кальция сопутствует гиперпаратиреозу или является симптомом онкопатологии.

Магний выполняет функцию внутриклеточного обмена и передачи импульсов от нервных окончаний к мышцам. Неполноценное питание, нарушение абсорбции, длительная диарея, колиты, энтероколиты и диспепсии понижают концентрацию магния в крови. К ее повышению приводят функциональные нарушения почек, гипотиреоз, лактат-ацидоз и новообразования. 

Наряду с магнием, за передачу импульсов в мышцы отвечает натрий, также принимающий участие в метаболизме кальция. Причиной снижения натрия может выступать гипотиреоз, болезнь Аддисона, сахарный диабет, заболевания почек и желудочно-кишечного тракта, застойная сердечная недостаточность, прием гентамицина, реже – синдром Пархона или гиперкальциурия. Высокие показатели натрия в результатах биохимии свидетельствуют об обезвоживании, перенасыщении организма солями, несахарном диабете или заболеваниях почек с олигурией. 

Нормальная работа нервной и костно-мышечной систем невозможна без достаточного количества фосфора в организме. Содержание фосфора в крови возрастает при гипопаратиреозе, переизбытке витамина D, рабдомиолизе, заболеваниях костей или неправильном рационе, реже – при акромегалии. С другой стороны, гиповитаминоз D, гиперпаратиреоз, трансплантация почки, внутривенные вливания глюкозы, дыхательный алкалоз вызывают снижение концентрации фосфора в крови. 

Хлор выполняет функции поддержания кислотно-щелочного баланса крови и осмотического давления. Самыми очевидными причинами понижения уровня хлора являются обильные потоотделения, рвота, диарея, некорректное лечение мочегонными препаратами, реже снижение вызывается нефротическим синдромом и гипокалиемическим метаболическим синдромом. Переизбыток хлора в крови может быть последствием дегидратации, отечности, алкалоза и декомпенсации сердечной деятельности. 

Пример результатов биохимии крови

Низкомолекулярные азотистые вещества 

 ОбозначениеНорма (женщины)Норма (мужчины)Единицы измерения
Креатинин CREA 53–97 62–115 мкмоль/л
Мочевая кислота UA < 14 лет: 120–320
> 14 лет: 150–350
< 14 лет: 120–320
> 14 лет: 210–420
мкмоль/л
Мочевина UREA 2,2–6,7 3,8–7,3 ммоль/л

Мочевина и креатинин исследуются в комплексе, их значения отражают функциональное состояние почек пациента, в частности, степень нарушения фильтрационной и выделительной функций. Высокие значения указывают на проблемы с почками, но могут объясняться чрезмерными физическими нагрузками, высокобелковой диетой, продолжительным голоданием или заболеваниями щитовидной железы. Низкие значения мочевины могут объясняться низкобелковой диетой, беременностью и заболеваниями печени. 

Уровень мочевой кислоты, как вспомогательного параметра, отражает способность организма выводить отходы процессов обмена нуклеиновых кислот и пуринов. Представляет особый диагностический интерес для пациентов с подагрой. Основными причинами повышения мочевой кислоты являются подагра и алкоголизм, реже – патология почек и печени. Низкие значения мочевой кислоты в результатах биохимического анализа крови встречаются намного реже и указывают, как правило, на неправильное или недостаточное питание. 

Пигменты

 ОбозначениеНорма (женщины)Норма (мужчины)Единицы измерения
Общий билирубин BILT 3,4–17,1 мкмоль/л
Прямой билирубин BILD, D-BIL 0–7,9 мкмоль/л
Билирубин непрямой ID-BIL BILT — BILD мкмоль/л

Желтый пигмент билирубин начинает накапливаться в крови при заболеваниях и наследственных патологиях печени, желчевыводящих путей, например, при синдроме Жильбера. Непрямой билирубин также может повышаться при некоторых анемиях и малярии.

Ферменты

 ОбозначениеНорма (женщины)Норма (мужчины)Единицы измерения
Аланинаминотрансфераза ALT < 31 < 41 ед./л
Амилаза AMY 28–100 ед./л
Панкреатическая амилаза AMY-P 0–50 ед./л
Аспартатаминотрансфераза AST < 32 < 40 ед./л
Гамма-глутамилтрансфераза GGT 6–42 10–71 ед./л
Креатинкиназа CK 0–25 ед./л
Лактатдегидрогеназа LDH 250 ед./л
Липаза LIP 0–190 ед./л
Фосфатаза щелочная ALP 0–240 0–270 ед./л
Холинэстераза CHE 5860–11800 5800–14600 ед./л

Фермент печени с труднопроизносимым названием аланинаминотрансфераза участвует в аминокислотном метаболизме. Показатель повышается при инфаркте миокарда, остром гепатите A и B, иных заболеваниях печени. 

Фермент амилаза вырабатывается слюнными железами и поджелудочной железой, отвечает за переваривание углеводов. Превышение нормы в 3–5 раз может указывать на острый аппендицит, перитонит, язву желудка и 12-перстной кишки, холецистит. При остром панкреатите или обострении его хронической формы значение амилазы возрастает в 10–30 раз. Повышенное значение панкреатической амилазы позволяет своевременно обнаружить осложнения операций на органах брюшной полости и заболевания поджелудочной железы. 

Концентрация фермента аспартатаминотрансферазы в крови человека сильно возрастает в случае повреждении печени или сердечной мышцы, из-за злоупотребления алкоголем показатели могут увеличиваться в два раза относительно нормы. 

Высокие значение фермента гамма-глутамилтрансферазы наблюдаются у пациентов с острым гепатитом, вне- и внутрипеченочным холестазом, алкоголизмом, раком поджелудочной и предстательной желез, первичными опухолями печени. 

Возрастание концентрации креатинкиназы в крови может указывать на инфаркт миокарда, поражение мышц различного генеза, почечную недостаточность. Лактатдегидрогеназа повышается при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, печени и почек, а также у беременных. Высокие значения липазы наблюдаются у пациентов с острым панкреатитом, инфарктом кишечника, при желчной колике, ранах, переломах, раке молочной железы. Метаболизм фосфора в организме напрямую связан с содержанием щелочной фосфатазы – ее повышение сопутствует острому вирусному и алкогольному гепатиту, циррозу печени, мононуклеозу, раку печени или метастазам в нее. Холинэстераза понижается при циррозе печени, печеночной недостаточности, гепатите, инфаркте миокарда. Значение холинэстеразы также показательно для пациентов, принимающих миорелаксанты. 

что показывает биохимический анализ крови и как он проводится?

Биохимический анализ крови — это информативный анализ, который часто назначают врачи разного профиля. Процедура состоит в заборе крови из вены и тестировании ее показателей. Результаты биохимического анализа крови сводятся в довольно обширную таблицу, и расшифровка значений неизменно вызывает любопытство у пациента. В чем заключаются особенности исследования, как к нему подготовиться и где можно пройти?

В чем особенности биохимического анализа крови

Это диагностический лабораторный метод, позволяющий оценить работу внутренних органов и систем, определить потребность организма в микро- и макроэлементах, витаминах, гормонах и ферментах, распознать патологии метаболизма. Биохимия крови представляет интерес в диагностике практически любой болезни. Это более подробный анализ крови, чем клинический. Также важен биохимический анализ крови при наблюдении беременности. При нормальном самочувствии женщины его назначают в первом и третьем триместре. Если наблюдается токсикоз, есть угроза выкидыша или женщина жалуется на недомогание, его проводят чаще.

Подготовка к биохимическому анализу крови

  1. Следует уточнить у врача, не требуется ли перерыв в приеме лекарственных препаратов, и если требуется, то на какое время. Кровь очень чувствительна к медикаментам, они могут исказить результаты анализа.
  2. Тем, кто проходит курс физиотерапии, необходимо спросить у врача, не следует ли отложить анализ крови на биохимию.
  3. Физические и эмоциональные нагрузки накануне следует снизить. Непосредственно перед взятием крови рекомендуется спокойно посидеть возле кабинета минут 10–20.
  4. Не следует курить перед процедурой как минимум час. Алкоголь нельзя принимать в течение суток до процедуры.
  5. Кровь сдается натощак утром, между 8:00 и 11:00. Накануне и в день процедуры рекомендуется пить негазированную воду, другие напитки следует исключить, как и тяжелую пищу.

Динамику лабораторных показателей лучше отслеживать в одном медицинском учреждении и при максимально сходных условиях, тогда результаты, скорее всего, будут корректны.

Расшифровка результатов биохимического анализа крови

С появлением современных лабораторных анализаторов, которые способны предоставить полные данные о биохимическом составе крови в течение пары часов, расшифровка существенно ускорилась. В течение максимум трех дней пациент получает на руки распечатанную таблицу, где отмечено, какие показатели изучались, какие значения получены и как они соотносятся с нормой. Следует знать, что нормы биохимического анализа крови у женщин и мужчин по ряду показателей могут различаться, также некоторые цифры зависят от возраста пациента.

Белки
  • Альбумин. Этот белок продуцируется печенью, он составляет до 65% плазмы крови. В разном возрасте референтные значения отличаются, по половому признаку они не варьируются. До 14 лет норма составляет 38–54 г/л, после 14 и до 60 лет — 35–50 г/л, а у людей старше 60 лет — 34–38 г/л[1]. Повышение альбумина в крови может быть следствием обезвоживания организма при заболеваниях ЖКТ или ротавирусных инфекциях. Также растет этот показатель во время цирроза, диабета, волчанки. Падение альбумина обычно обусловлено неполноценным питанием, табакокурением, печеночной недостаточностью[2].
  • Гликированный гемоглобин. Это химически связанная с глюкозой составляющая гемоглобина. Показатель нужен для диагностики и лечения диабета первого и второго типов. В норме гликирировано должно быть не более 5,9% от всего гемоглобина в крови[3]. 5,9–6,4% говорят о риске развития сахарного диабета. 6,5% и более — выраженный диабет. Гликированный гемоглобин отражает среднее содержание сахара в крови за длительный период — от трех до четырех месяцев[4].
  • Железосвязывающая способность сыворотки. Показатель способности крови к переносу железа важен для диагностики анемий. Норма — 45,3–77,1 мкмоль/л[5]. Снижение говорит о высокой концентрации железа в крови, повышение — о низкой.
  • Миоглобин. Белок, содержащий железо. В крови его концентрация повышается при сердечных патологиях, особенно при инфаркте миокарда. Понижение миоглобина наблюдается при полиомиелите и ревматоидном артрите. Референтные значения имеют широкие пределы: у мужчин 19–92 мкг/л, у женщин 12–76 мкг/л.
  • Общий белок. В плазме крови насчитывается около 150 разных белков. Общий белок проверяют, чтобы исключить патологии обмена веществ, наличие злокачественных опухолей, фактор неправильного питания. Высокий уровень белка в крови — повод заподозрить инфекционное заболевание, ревматоидный артрит, злокачественные образования. Снижают белок панкреатит, патологии печени и ЖКТ, серьезные травмы и ожоги.
  • Ревматоидный фактор. В норме его в биохимическом анализе крови быть не должно, сколько бы лет ни было пациенту. От пола это тоже не зависит. Ревматоидный фактор — это антитела, которые выбрасываются в кровь при заболеваниях мышечных и соединительных тканей, вирусных инфекциях, развитии злокачественных опухолей, системных и аутоиммунных заболеваниях. Их наличие — тревожный сигнал для врача.
  • C-реактивный белок (CRP, СРБ). Скачок C-реактивного белка — показатель воспалительного процесса. Этот белок является стимулятором защитных реакций организма. В любом возрасте его концентрация должна быть не более 0,5 г/л, хотя прием оральных контрацептивов может его немного повышать — и это считается нормой.
  • Трансферрин. Белок, который является основным переносчиком железа[6]. Его концентрация в крови снижается при анемиях, циррозе печени, избытке железа в организме, хронических воспалительных процессах. Референтные значения колеблются в пределах 2–4 г/л для мужчин, для женщин допустимо 2,2–4,4 г/л. С возрастом содержание трансферрина в крови естественным образом понижается.
  • Ферритин. Если метаболизм железа в организме нарушен, это обязательно скажется на содержании ферритина в плазме крови. Норма у взрослых женщин — 13–150 мкг/л, у мужчин — 30–400 мкг/л. Выше референтных значений ферритин может быть при заболеваниях печени, хронической почечной недостаточности, раковых заболеваниях.
Липиды
  • Триглицериды. Продукты углеродного обмена в печени. Также могут поступать в кровь с пищей. Для мужчин от 20 до 60 лет норма составляет 0,5–3,23 ммоль/ л, для женщин того же возраста — 0,41–2,96 ммоль/л. При сахарном диабете и сердечно-сосудистых патологиях, а также при беременности уровень триглицеридов повышается. В терминальных стадиях поражения печени, при заболеваниях щитовидной железы, недостаточном питании — понижается.
  • Холестерин-ЛПВП. Показатель риска развития атеросклероза. Липопротеины высокой плотности используются при переработке и выведении жиров организмом, за это они получили название «хорошего» холестерина. Норма — 1,03–1,55 ммоль/л[7]. При высоких значениях меньше риск появления сосудистых бляшек, при низких — возможно прогрессирование атеросклероза даже при нормальном общем холестерине.
  • Холестерин-ЛПНП. Липопротеины низкой плотности — основные переносчики «вредного» холестерина, который поступает в организм с пищей. Норма колеблется в пределах 0–3,3 ммоль/л, повышение уровня говорит о риске атеросклероза.
  • Общий холестерин. Сумма значений ЛПВП и ЛПНП. В норме составляет 5,2 ммоль/л. Понижение общего холестерина может привести к психофизиологическим расстройствам, нарушениям репродуктивной функции, повышение — к сахарному диабету и атеросклерозу.

Это интересно!

Слишком ожесточенная борьба с холестерином в крови способна навредить здоровью. Холестерин участвует в синтезе половых гормонов, важен для правильного формирования плода у беременных, является жизненно необходимым компонентом клеточных мембран, нормализует мозговую деятельность. Излишне жесткие диеты, направленные на полное «изгнание» холестерина из организма, способны существенно снизить половую функцию как у мужчин, так и у женщин[8].

Углеводы
  • Глюкоза. Источник энергии для всех клеток и тканей организма. Нормальным считается показатель глюкозы в крови на уровне 3,3–5,5 ммоль/л. Более высокие значения наблюдаются при сахарном диабете, низкие могут отмечаться на фоне приема инсулина или развития опухолевых заболеваний поджелудочной железы.
  • Фруктозамин. Это соединение белка с глюкозой. Его уровень помогает определить колебания глюкозы в крови в среднем за две–три недели до сдачи анализа. В норме фруктозамин в крови содержится в концентрации 0–285 мкмоль/л. Если значение выше — это признак сахарного диабета.
Неорганические вещества и витамины
  • Витамин B12. Участвует в процессах продуцирования эритроцитов красным костным мозгом и их созревания. Норма — 208–963,5 пг/мл. Лейкоз, заболевания печени и почек приводят к повышению содержания B12 в крови, а вегетарианское питание, паразитарные заболевания, воспаления ЖКТ — к снижению[9].
  • Железо. Требуется для кислородного обмена. Референтные значения для детей до двух лет — 7–18 мкмоль/л, от двух до 14 лет — 9–22 мкмоль/л. У мальчиков-подростков и взрослых мужчин норма составляет 11–31 мкмоль/л; у девочек-подростков и взрослых женщин — 9–30 мкмоль/л. При дефиците железа в крови обычно следует проверить рацион пациента и обмен веществ, при избытке — функции кишечника.
  • Калий. Обеспечивает естественную сердечную деятельность. В норме в крови концентрация калия составляет 3,5–5 ммоль/л. Заболевания сердечно-сосудистой системы и ЖКТ, неправильное питание, диабет, опухолевые заболевания могут существенно снизить этот показатель.
  • Кальций. Используется в работе мышц, нервов, сердца и сосудов, участвует в образовании костной ткани. Референтные значения — 2,25–2,5 ммоль/л. Если пациенту не хватает витамина D, он питается несбалансированно, страдает эндокринными расстройствами или заболеваниями почек и печени, концентрация кальция в крови снижается[10]. Повышенный уровень кальция — признак развития опухолевых заболеваний.
  • Магний. Внутриклеточные обменные процессы и передача импульсов от нервов к мышцам невозможны без магния. Норма в крови составляет 0,75–1,25 ммоль/л. При почечной недостаточности магний повышается, при неправильном питании и патологиях печени — снижается.
  • Натрий. Вместе с магнием отвечает за передачу нервных импульсов в мышцы, также необходим для кальциевого обмена. В норме натрия в крови должно быть 136–145 ммоль/л. Повышенные значения характерны для несахарного диабета и болезней мочевыводящей системы, пониженные отмечаются при сахарном диабете, печеночной или почечной недостаточности.
  • Фосфор. Нужен нервно-мышечной и костной системам организма для нормальной работы. Референтные значения: в возрасте до двух лет — 1,45–2,16 ммоль/л, от двух до 12 лет — 1,45–1,78 ммоль/л, далее до 60 лет — 0,87–1,45 ммоль/л. В возрасте старше 60 лет женская норма — 0,90–1,32 ммоль/л, мужская — 0,74–1,2 ммоль/л. Слишком много фосфора в крови бывает у людей, злоупотребляющих фастфудом и газированными напитками. При избытке фосфора возможны проблемы с иммунитетом за счет подавления выработки лейкоцитов. Пониженное содержание фосфора приводит к нервному истощению и депрессиям.
  • Фолиевая кислота. Требуется для осуществления многих жизненно важных процессов — от вынашивания плода до кроветворения и усвоения аминокислот, сахара[11]. Нормальное значение — 10–12 мкмоль/л. Если пациент страдает алкоголизмом или долгое время принимает антибиотики, уровень фолиевой кислоты, скорее всего, будет понижен. То же наблюдается и при беременности. Повышенные значения могут отмечаться при серьезных болезнях почек.
  • Хлор. Нужен для регулировки кислотно-щелочного баланса крови и поддержания осмотического давления. Референтные значения — 98–107 ммоль/л. Повышенный уровень хлора — признак обезвоживания организма, проблем с почками и надпочечниками, несахарного диабета. Гормональные нарушения, травмы головы, почечная недостаточность приводят к снижению концентрации хлора в крови.

Важно понимать!

Витаминно-минеральные комплексы следует принимать курсами по назначению врача, самостоятельный их прием может негативно сказаться на здоровье. Прием витаминов круглый год возможен только при доказанной их нехватке и контроле их содержания в крови при помощи лабораторных тестов. Профилактические курсы обычно составляют три–четыре недели, в отдельных случаях — до двух месяцев.

Низкомолекулярные азотистые вещества
  • Креатинин. Образуется в результате белкового обмена, выводится из организма с мочой. У женщин концентрация креатинина в крови может в норме составлять 53–97 мкмоль/л, у мужчин — 62–115 мкмоль/л. Низкие значения креатинина в крови могут свидетельствовать о голодании, снижении мышечной массы. Высокие — результат проблем с почками, заболеваний щитовидной железы, следствие лучевой болезни.
  • Мочевая кислота. Образуется в печени, выводится почками. Референтные значения для детей составляют 120–320 мкмоль/л, для взрослых женщин — 150–350 мкмоль/л, для взрослых мужчин — 210–420 мкмоль/л. Скачок концентрации вверх — один из симптомов подагры, алкоголизма, патологий печени и почек. Уровень мочевой кислоты снижается при неправильном питании.
  • Мочевина. Образуется после распада аммиака, который для организма токсичен. Женская норма — 2,2–6,7 ммоль/л, мужская — 3,8–7,3 ммоль/л. При почечной недостаточности и высокобелковом рационе концентрация мочевины в крови повышается, а при вегетарианском питании, циррозе печени и беременности — снижается.
Пигменты
  • Билирубин общий. Желтый пигмент, состоящий из прямого и непрямого билирубина. Референтные значения — 3,4–17,1 мкмоль/л. Высокие значения наблюдаются прежде всего при серьезных нарушениях работы печени.
  • Билирубин прямой. В норме концентрация в крови составляет 0–7,9 мкмоль/л. Превышение говорит о тяжелых патологиях желчевыводящих путей и печени.
  • Билирубин непрямой. Токсичный продукт распада гемоглобина, нарушающий нормальную работу клеток. Высчитывается как разность общего и прямого билирубина. Повышение непрямого билирубина бывает при анемиях, малярии.
Ферменты
  • Аланинаминотрансфераза (АЛТ). Один из важных ферментов печени, необходимый для аминокислотного обмена. У женщин в норме может составлять до 31 Ед/л, у мужчин — до 41 Ед/л. Более высокие показатели отмечаются во время серьезных проблем с печенью, сердцем, сосудами.
  • Амилаза. Фермент, синтезируемый в слюнных железах для переваривания углеводов. Нормальный показатель колеблется в пределах 28–100 Ед/л. При нарушении работы ЖКТ показатели выходят за указанные пределы.
  • Панкреатическая амилаза. Также участвует в переваривании углеводов. Референтные значения — 0–50 Ед/л. Если нарушена работа поджелудочной железы, показатель растет.
  • Аспартатаминотрансфераза (АСТ). Фермент, который выбрасывается в кровь в существенных количествах только при повреждениях печени или сердечной мышцы. До четырех лет норма АСТ — не более 59 Ед/л, с четырех до семи — не более 48 Ед/л, с 13 до 18 — в пределах 39 Ед/л. Далее «женский» показатель еще немного снижается — до 32 Ед/л.
  • Гамма-глутамилтрансфераза (Гамма-ГТ). Вырабатывается поджелудочной железой и печенью, ее концентрация растет при патологиях печени и алкоголизме. С рождения и до года норма составляет до 203 Ед/л, затем показатель снижается. После 18 лет норма для мужчин — до 60 Ед/л, для женщин — до 40 Ед/л.
  • Креатинкиназа. Проверяется при подозрении на системные болезни соединительной ткани, инфаркт миокарда, почечную недостаточность. Для мужчин норма — до 190 Ед/л, для женщин — до 170 Ед/л.
  • Лактат (молочная кислота). Вырабатывается в ходе сжигания энергии. Норма — 0,5–2,2 ммоль/л. Повышается при физических нагрузках, сахарном диабете, алкогольных отравлениях, снижении функции печени и почек, передозировке аспирином. Всем знакомые боли в мышцах после тренировок возникают из-за активного выброса в кровь молочной кислоты.
  • Лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Фермент, необходимый для образования лактата. У людей старше 12 лет нормальное значение ЛДГ составляет 250 Ед/л. У беременных женщин и новорожденных немного повышенный уровень ЛДГ не является патологией, для остальных он может быть одним из проявлений заболеваний кровеносной системы, печени, почек.
  • Липаза. Помогает перевариванию жиров. Концентрация липазы в крови в пределах 0–190 Ед/л нормальна, отклонение указывает на проблемы с поджелудочной железой. Близкие к нулю показатели — повод пересмотреть рацион питания и провериться на онкологические заболевания.
  • Фосфатаза щелочная. Помогает фосфорному обмену. Нормальные показатели для женщин 35–104 Ед/л, у мужчин нормой считается 55–149 Ед/л. Патологии почек, желчевыводящих путей, печени, проблемы с костной системой проявляются повышением уровня фосфатазы в крови.
  • Холинэстераза. Вырабатывается печенью, требуется нервным и мышечным волокнам. В крови у мужчин в норме концентрация составляет 5800–14 600 Ед/л, для женщин нормален показатель 5860–11 800 Ед/л. Уровень холинэстеразы снижается при инфаркте миокарда, заболеваниях печени, злокачественных опухолях, а повышается при сахарном диабете, ожирении, артериальной гипертонии маниакально-депрессивном психозе.

Приведенные данные имеют справочный характер, вопросы диагностики следует оставить врачу. Если необходимо скорее узнать диагноз, можно обратиться в лабораторию, где результаты биохимического анализа крови предоставляются в максимально короткие сроки.


Вся информация, касающаяся здоровья и медицины, представлена исключительно в ознакомительных целях и не является поводом для самодиагностики или самолечения.

Биохимический анализ крови у взрослых и детей (НОРМА)

Биохимический анализ крови у взрослых и детей (НОРМА)

Биохимический анализ крови – метод лабораторной диагностики, позволяющий довольно точно судить о функциональном состоянии большинства жизненно важных органов человеческого организма.

Биохимический анализ крови – метод лабораторной диагностики, позволяющий довольно точно судить о функциональном состоянии большинства жизненно важных органов человеческого организма. Показатели биохимического анализа крови играют решающую роль в диагностике целого ряда серьезных заболеваний и широко используются практически во всех отраслях практической медицины. Особую диагностическую ценность биохимическое исследование крови имеет при заболеваниях сердца, печени, почек и эндокринной системы.

Как правильно сдать биохимический анализ крови?

Надлежащая подготовка к рассматриваемому тестированию обеспечит достоверность полученных результатов.

 Правил такой подготовки не слишком много, они не сложные в выполнении:

  • Время голодания перед сдачей крови должно составлять не менее 8 часов. От воды желательно отказаться на этот период, однако при сильной жажде можно позволить себе выпить незначительное количество негазированной водички.
  • От употребления напитков, содержащих алкоголь, следует отказаться за 24 часа до забора крови, от курения – за 1 час.
  • Жевательные резинки, мятные конфеты, кофе, чай, соки утром, перед сдачей анализа, употреблять запрещено.
  • В течение 3-х дней перед тестированием крови нужно отказаться от жирной, острой, жареной пищи. Экспериментировать с новыми блюдами в этот период не стоит.
  • Физические упражнения в течение3-х дней до сдачи анализов нужно исключить. То же самое касается стрессовых ситуаций.
  • Прием медикаментов необходимо прекратить за 3 дня до проведения тестирования крови. Если это невозможно в связи с лечением, о типе препаратов, дозах следует известить доктора, что назначил биохимический анализ.

Если в день проведения анализа назначены лечебные процедуры (массаж, лазеротерапия), их нужно проводить только после сдачи крови.

Все показатели биохимического анализа крови — что означает каждый показатель.

Данный тип тестирования крови может назначаться любым доктором для выявления определенных патологий. При помощи биохимического анализа крови возможно получить обширную картину состояния здоровья пациента, однако диагностировать существующие погрешности в функционировании внутренних органов/систем может только врач.

Белки в биохимическом анализе крови

Для выявления обширного перечня недугов посредством рассматриваемого анализа устанавливают содержание белка в крови. При наличии дефектов в работе внутренних органов уровень белка зачастую будет завышен.

 Основными компонентами белка являются альбумины+глобулины. Без белков процесс свертывания крови невозможен. Благодаря рассматриваемому веществу осуществляется перенос билирубина, гормонов (стероидных), липидов в ткани организма, что определяет качество обменных процессов.

Ферменты в биохимическом анализе крови

Указанные вещества – белковые молекулы (голоферменты), что состоят из 2-х компонентов: белковая составляющая (апофермент), активный центр (кофермент). Ферменты (энзимы) помогают ускорить биохимические реакции в тканях организма.

 В состав коферментов могут входить 2 группы веществ:

  • Органические:витамины группы В (В1, В6, В12), флавин и т.д.
  • Неорганические:микрочастицы меди, цинка, кобальта, других металлов.

 Принцип функционирования фермента предусматривает наличие следующих составляющих:

  • Вещество, которое подвергается влиянию фермента (субстрат). Процесс взаимодействия субстрата+фермента заключается в индивидуальности: каждый энзим может воздействовать лишь на один субстрат:
  1. Сукцинатдегидрогеназа– фермент, что воздействует на янтарную кислоту (сукцинат). В данном случае сукцинат – субстрат.
  2. Лактатдигидрогеназа– энзим, посредством которого происходит распад молочной кислоты (лактат). В этом случае лактат – субстрат.
  • Вещество, что образуется вследствие биохимической реакции (продукт).
Липиды в биохимическом анализе крови

Указанные вещества (растворенные в крови жиры) играют важную роль для организма: они являются составной частью некоторых биологически активных веществ, гормонов. В случае если доктор подозревает у пациента ряд серьезных патологий (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, патологии в работе мозга), у пациента проводят исследование липидного профиля.

Липидный профиль предусматривает целую линию анализов крови, что дает возможность изучить дефекты в жировом обмене организма.

 Липидный профиль состоит из нескольких показателей:

Главный липид, что преобразовывается в печени, поступает в организм с продуктами питания. Посредством рассматриваемого показателя можно предопределить вероятность возникновения атеросклероза.

  • Триглицериды.

Относятся к категории нейтральных липидов.

  • Коэффициент атерогенности.

Помогает определить соотношение «хороших», «вредных» холестеринов в крови.

  • Липопротеины низкой плотности («вредный» холестерин).

Фракции липидов, что насыщены холестерином. Липопротеины низкой плотности способствуют возникновению атеросклеротических бляшек.

  • Липопротеины высокой плотности.

Единственная составная часть липидов («хороший» холестерин), что препятствуют возникновению в сосудах атеросклеротических бляшек. Местом утилизации холестерина в этом случае является печень.

Углеводы в биохимическом анализе крови
  • Главным показателем в аспекте углеводного обмена в крови является уровень глюкозы. Глюкоза – важный источник энергии, при дефиците которого обменные процессы в организме будут нарушены.

Изучение уровня глюкозы посредством биохимического анализа крови дает возможность обнаружить патологии в работе эндокринной системы (сахарный диабет, сбои в работе поджелудочной железы, опухоли надпочечников, дефекты в выработке гормонов роста, иные болезни).

  • Важным моментом в плане полноценного усвоения глюкозы является количество инсулина в крови (гормон поджелудочной железы).
  • Вследствие «сотрудничества» глюкозы с альбумином, возникает фруктозамин. Определение уровня содержания указанного вещества в крови помогает проследить за качеством лечения сахарного диабета, спрогнозировать возникновение этой болезни. Зачастую биохимический анализ крови на фруктозамин назначают беременным женщинам, младенцам в первые дни после рождения.
Пигменты в биохимическом анализе крови

Посредством рассматриваемого вида тестирования крови, можно получить данные о 3-х пигментах:

  • Билирубин общий.

Образуется вследствие распада гемоглобина в клетках печени. Указанный пигмент крови имеет оранжево-желтый цвет. Диагностирование уровня билирубина общего помогает доктору определить причины возникновения желтухи; гемолитической анемии; патологий, связанных с работой желчного пузыря.

  • Билирубин прямой.

Составной элемент билирубина общего. Повышение уровня указанного фрагмента билирубина может произойти при желтухе, что развилась вследствие погрешностей в оттоке желчи из печени.

  • Билирубин непрямой.

Отклонение от нормы данной фракции билирубина – следствие гемолитической анемии, кровоизлияний, малярии. По своей сути билирубин непрямой – разница между билирубином общим, билирубином прямым.

Низкомолекулярные азотистые вещества в биохимическом анализе крови

В ходе проведения рассматриваемого вида тестирования крови, производят исследование на наличие/уровень следующих низкомолекулярных азотистых веществ.

Является следствием распада белков. В крови у человека допустимое количество указанного вещества меняется с возрастом. Зачастую уровень мочевины зашкаливает у пациентов, что имеют патологии в работе почек: доктора назначают подобный анализ крови для диагностики, прогнозирования недуга. Снижение уровня мочевины в крови может быть спровоцировано причинами, что имеют физиологическую (беременность, голодание, чрезмерные физнагрузки), патологическую природу (целиакия, цирроз печени, отравление тяжелыми металлами).

Его образование связано с распадом белков, аминокислот. Местом локализации указанного вещества является мышечная ткань.

Уровень креатинина в крови будет зависеть от 2-х факторов:

  1. Количества белка в крови.
  2. Времени, в течение которого происходит синтез белка.

Причины, что могут спровоцировать погрешности в содержании креатинина в крови аналогичны причинам, что вызывают увеличение/уменьшение уровня содержания мочевины. Однако в случае с креатинином спектр таких факторов дополняется сбоями в работе эндокринной, мышечной системы.

  • Мочевая кислота.

Указанное вещество имеет несколько особенностей:

  1. Ее образование связано с синтезом пуринов (компонентов ДНК).
  2. Местом образования данного азотистого вещества является печень.
  3. Выведением мочевой кислоты из организма занимаются почки.

Причины, что могут вызвать повышение/снижение уровня содержания мочевой кислоты, зачастую связаны с повышением/снижением количества употребления пурин-содержащих продуктов. К патологическим факторам риска относят болезни крови, болезни печени, мочевыводящей системы.

Неорганические вещества и витамины в биохимическом анализе крови

Перечень указанных веществ достаточно обширный:

Калий.

В связи с тем, что преимущественным местом локализации иона калия служит полость клетки (89%), его относят к числу внутриклеточных ионов. В силу присутствия данного вещества в каждом внутреннем органе, системе, нарушение допустимой нормы калия в крови может иметь объемные проявления:

  • Сбои в работе ЦНС.
  • Погрешности в функционировании сердечнососудистой/дыхательной систем.
  • Дефекты в работе почек.
  • Гормональный сбой.
  • Нарушения со стороны ЖКТ.

Спровоцировать изменение концентрации калия в крови могут:

  • Инсулин.
  • Адреналин/норадреналин.
  • Гормон, что продуцируется почками (альдостерон).
  • Мочегонные препараты.

Натрий.

В виду пребывания основной массы натрия (75%) за пределами клетки, его относят к числу внеклеточных ионов. Исходя из количества натрия в кровеносной системе выделяют несколько типов погрешностей:

  1. Увеличение концентрации ионов натрия в полости кровеносных сосудов: провоцирует повышение артериального давления.
  2. Увеличение адекватного количества натрия в полости клетки: вызывает отек тканей.
  3. Превышение допустимого уровня натрия во внеклеточной структуре: ведет к обезвоживанию организма.

Увеличение количества натрия в организме зачастую связано с неравномерными процессами поступления, выведения жидкости из организма. Больной испытывает сильную жажду, достаточно часто производит мочеиспускание, при тестировании его мочи в ней (моче) будет выявлен белок. К распространенным патологическим явлениям, что провоцируют гипернатриемию, относят сбои в работе почек, стрессовые ситуации.

Хлор.

Аналогично предыдущему неорганическому веществу – представитель внеклеточных ионов. Функции, что выполняют ионы хлора, функционируя в организме человека:

  1. Принимают участие (совместно с частицами натрия, калия) в регулировке водно-солевого обмена.
  2. Благоприятствуют выработке желудочного сока.
  3. Осуществляют балансировку осмотического давления.
  4. Способствуют поддержке кислотного баланса крови.

Поступление указанного вещества в организм связано с продуктами питания. Выводится хлор посредством мочи, пота, кала.

Кальций.

В рамках биохимического анализа крови производится изучение количества ионизированного, общего кальция. Основным местом расположения ионов кальция служит внеклеточное пространство.

Функции, что выполняют ионы кальция, находясь в организме человека:

  • Принимают участие в сокращении мышц.
  • Помогают удерживать жидкость в кровеносном русле.
  • Незаменимы при свертывании крови.

Недостаток рассматриваемого вещества в крови (гипокальцемия) зачастую является следствием неправильного питания, недостатка витамина Д. Переизбыток кальция (гиперкальцемия) может возникнуть на фоне онкозаболеваний, патологий в работе печени, сердца, при пневмонии. Оба указанных состояния могут стать причиной серьезных нарушений в будущем.

Фосфор (неорганический).

Составная часть нуклеиновых кислот, костной ткани. Количество ионов кальция в крови будет влиять на уровень фосфора. Определение уровня фосфатов в крови при биохимическом тестировании назначают редко: при необходимости получения дополнительных сведений.

Магний.

Основная масса указанного вещества (60-70%) формирует структуру макромолекул. Относится к числу внутриклеточных ионов.

Функции, что выполняют ионы магния, пребывая в организме человека:

  • Регулируют процесс синтеза белка.
  • Провоцируют расслабление мышц.
  • Принимают участие в поддержании работы сердца.

Нарушение допустимой нормы магния в крови чревато объемной симптоматикой:

  • Сбоями в работе ЦНС.
  • Погрешностями в функционировании сердечнососудистой, дыхательной систем.
  • Дефектами в работе мышечной системы.
  • Психическими нарушениями.
  • Нарушениями со стороны желудочно-кишечного тракта.
  • Нарушениями, что затрагивают иные внутренние органы/системы.

Железо.

Важность указанного вещества определяется его присутствием в ферментах, гемоглобине. Без его участие невозможен процесс кроветворения. Железо поступает в организм вместе с продуктами питания.

Увеличение уровня концентрации железа в крови чревато его скоплением в кожных покровах, внутренних органах, что ведет к развитию разнообразных патологий в будущем.

При снижении уровня концентрации железа в организме развиваются анемии (железодефицитные).

Фолиевая кислота.

Нужна для процесса деления клеток. При невозможности клеток осуществлять полноценное деление, в кровь поступают клетки больших параметров, что провоцирует развитие анемий (фолиеводефицитных).

Витамин В12.

Важность указанного вещества определяется его функциями для организма:

  1. Необходим для нормальной работы почек, селезенки.
  2. Способствует сокращению мышц.
  3. Принимает участие в процессах кроветворения.
Расшифровка показателей биохимического анализа крови

 

расшифровка, норма, что означает повышение уровня АсАТ

4 июня, 2020 242479 0 Биохимический анализ крови на АсАТ широко распространен в клинической практике и используется для диагностики множества заболеваний. К данному исследованию прибегают самые разные специалисты, в том числе кардиологи, терапевты и гастроэнтерологи. Причиной такой востребованности является его информативность и универсальность относительно патологических изменений в тканях и органах. Тест на АСТ специфичен при повреждениях сердечной мышцы, гепатитах всех типов, злокачественных поражениях костной ткани и т. д. Как правило, его используют в комплексе с исследованием крови на АлАт*. АлАт – биохимический тест крови, сопровождающий диагностику заболеваний печени. Применяется в качестве самостоятельного исследования и в комплексе с АСТ.

АсАТ и АЛТ

Тесты на АСТ и АЛТ – это два исследования, зачастую назначаемые врачом в комплексе. Почему уровень этих двух ферментов так важно определять одновременно? Впервые идею об информативности их соотношения выдвинул ученый Фернандо Де Ритис из Италии. Он использовал метод для дифференциальной диагностики гепатитов различных видов. С тех пор его имя стало нарицательным. Коэффициент Ритиса показывает соотношение активности АСТ и АЛТ. У здоровых людей коэффициент составляет 0,91-1,75. Показатель информативен только в том случае, если значения этих ферментов превышают референсные. Если в двойном тесте превышены только показатели АсАТ, это означает что поврежден миокард. При поражении сердечной мышцы уровень АСТ увеличивается в 8-10 раз, АЛТ – только в 1,5-2 раза. Если у пациента проблема с печенью, напротив, в 8-10 раз возрастает уровень АЛТ, а значения АСТ – лишь в 2-4 раза.

Что представляет из себя фермент

АсАТ или АСТ – белок, синтезирующийся внутри клеток человеческого организма. Самые высокие его концентрации отмечаются в тканях миокарда, мышц и печени. В меньшей степени фермент присутствует в почках, поджелудочной железе, клетках центральной нервной системы и головном мозге. Кодируют его гены GOT 1 и GOT 2. У здорового человека уровень фермента достаточно низок. Его активный выброс в кровь начинается при разрыве сердечной мышцы, а также разрушении печени в результате гепатита, цирроза или онкологической опухоли. Фермент важен тем, что содержит в себе витамин B 6, задействованный в аминокислотном обмене и, соответственно, синтезе инсулина. В анализах показатель измеряется в единицах на литр крови.

Спектр применения анализа на АСТ

  • В кардиологии в качестве маркера инфаркта миокарда. В сердечной мышце фермент активен более чем в 10 000 раз нежели в крови. При инфаркте происходит интенсивное выделение фермента.
  • При патологиях печени. Такие заболевания как гепатит и цирроз непременно сопровождаются разрушением тканей печени и резким скачком значений АСТ.
  • При хроническом алкоголизме.
  • В акушерстве и гинекологии. Во время беременности у женщины может происходить незначительное повышение значений АсАТ. Это объясняется воздействием растущего плода на печень матери. В первом триместре его значения не должны превышать 31 Ед/л, во втором и третьем – 30 Ед/л.
  • В эндокринологии при сахарном диабете и/или избыточном весе.

Симптомы, при которых рекомендуется анализ на АСТ

  • Желтушность кожи
  • Желтушность глазных склер
  • Боли в правом и левом подреберье
  • Диспепсические расстройства (рвота, тошнота, изжога)
  • Общее снижение аппетита и тяги к еде
  • Отклонения в результатах мочи и кала
  • Кожный зуд

Как подготовиться к анализу

Чтобы повысить степень достоверности анализа, следует соблюдать некоторые правила и ограничения. Так накануне исследования стоит воздержаться от употребления жирной и копченой пищи, а также кондитерских изделий. Лучше всего, если тест будет проведен на голодный желудок с утра. При приеме лекарственных препаратов нужно проконсультироваться с врачом насчет их возможной отмены. Дело в том, что при биохимическом анализе крови многие медикаменты могут воздействовать на результаты исследования. При лечении антидепрессантами, антибиотиками, мочегонными и другими препаратами, показания тест могут быть искажены. Кроме того, непосредственно перед визитом в процедурный запрещается выполнять УЗИ, рентгенологическое исследование и процедуры физиотерапии.

Расшифровка анализа на АсАТ

Норма у женщин

Значения анализа на АсАТ различаются в зависимости от возраста и пола. Так у женщин норма фермента в крови составляет 31 Ед/л. Чем старше человек, тем ниже его активность в организме. Это связано с замедлением обмена веществ в целом. Такое естественное физиологическое состояние, как беременность, также оказывает влияние на уровень фермента. В этот период могут наблюдаться его небольшие скачки как в одну, так и в другую сторону.

Норма у мужчин

Концентрация фермента у мужчин начинает превышать его количество у женщин начиная с 12-17 лет. Более высокие его концентрации объясняются большим объемом мышечной ткани. В пубертатном возрасте норма АСТ у мальчиков около 29 Ед/л. Это примерно на четыре единицы выше, чем у девочек в том же возрасте. У взрослого мужчины уровень фермента может достигать 37 Ед/л.

Отклонения от норм

Превышение АСТ в крови может происходить по следующим причинам:

Разрыв сердечной мышцы (инфаркт миокарда)

Злокачественные поражения печени Метастазы злокачественных опухолей в печень Злоупотребление алкогольными напитками Аутоиммунные заболевания мышечных тканей Отравления, в том числе алкоголем, наркотическими веществами и ядовитыми грибами Травмы, переломы Злокачественные поражение костной ткани Тепловой или солнечный удар

Если высокие показатели АсАТ держатся несколько дней, это означает что пациент находится в тяжелом состоянии. Усиление роста значений свидетельствует о том, что ткани в очаге патологии некротизировались и нужно срочно предпринимать дополнительные меры реабилитации.

Понижение уровня АСТ наблюдается при:

  • Манипуляциях с кровью (гемодиализ)
  • Дефиците витамина В
  • Некрозе печени
  • Беременности
Не забывайте о том, что интерпретировать значения может только лечащий врач. Причиной отклонений в показаниях теста крови на АСТ могут быть не только заболевания, но и другие факторы, например употребление БАДов и лечение медикаментозными препаратами. Результаты могут быть неудовлетворительными из-за заболеваний сердца, печени или других органов. Выяснить истинную причину превышения уровня фермента помогут дополнительные исследования, включая тест на билирубин, общий белок и АлАт. Специалист сопоставит все данные с результатами, после чего сделает соответствующие выводы. 

(26 оценок, среднее 4.35 из 5)

Читайте также

норма в 1, 2 и 3 триместре

В чем заключается важность исследования?

Организм беременной подвергается сильным нагрузкам и значительным перестройкам. Это часто приводит к обострению хронических заболеваний и появлению новых патологий.

Биохимический анализ крови важный элемент скрининга при беременности. Анализ позволяет:

  • оценить функции внутренних органов;
  • определить нарушения водно-солевого обмена;
  • выявить недостаток микроэлементов;
  • диагностировать заболевания на ранних стадиях.

При каких показаниях беременной стоит сдать анализ?

Для назначения исследования врачу не нужны какие-либо основания. Анализ является обязательным и на протяжении беременности проводится несколько раз: в первом триместре при постановке на учет, а также во втором и третьем триместрах. При определенных показаниях исследование может назначаться дополнительно.

Подготовительный этап

Забор крови выполняется из вены, утром и натощак. Правильная подготовка к исследованию заключается в следующем:

  • интервал между последним ужином и анализом должен быть не менее 12 часов;
  • непосредственно перед анализом можно употреблять только воду. Запрещены соки, кофе, чай и другие напитки;
  • за 48 часов до исследования нужно отказаться от физической активности и стараться избегать стрессов.

Показатели биохимического анализа крови

Биохимический анализ крови комплексное исследование, состоящее из множества тестов.

Общий белок и альбумин

Общий белок показывает содержание всех видов белков в сыворотке крови. Белки отвечают за транспортировку питательных веществ, защищают организм от инфекций, служат строительным материалом для клеток, тканей и органов, поддерживают гормональный баланс в женском организме.

Во время беременности уровень белка может снижаться. Это происходит за счет расхода вещества на построения клеток плода.

Патологическими причинами уменьшения белка могут быть:

  • заболевания печени, почек;
  • сбой в работе щитовидной железы;
  • внутренние кровотечения.

Концентрация белка возрастает при воспалительных процессах, системных патологиях, аутоиммунных заболеваниях, острых кишечных инфекциях.

Альбумины — белки с небольшой молекулярной массой. Концентрация этих веществ влияет на осмотическое давление крови, которое регулирует водный обмен между тканями и кровью.

Альбумин не является обязательным параметром исследования. В основном он определяется у беременных в следующих ситуациях:

  • при появлении отеков;
  • при гестозе;
  • при повышении уровня общего белка.

Мочевина и креатинин

Мочевина и креатинин — химические соединения, которые образуется в результате распада белков и выводятся из организма почками. Концентрация этих веществ позволяет оценить работу мочевыделительной системы. Например, при дисфункции почек продукты белкового обмена накапливаются в крови, вызывая интоксикацию организма. Высокий уровень мочевины и креатинина может вызвать опасные для беременной и плода патологии.

Во время беременности риск почечных заболеваний возрастает в разы. Это происходит по следующим причинам:

  • из-за гормональной перестройки снижается иммунитет и организм становится восприимчивым к вирусам и бактериям. В результате увеличивается вероятность развития пиелонефрита и других воспалительных заболеваний почек;
  • увеличенная матка сдавливает мочеточники, что приводит к застою урины в почках.

Высокие мочевина и креатинин могут наблюдаться у беременных при мочекаменной болезни, почечной недостаточности, диабетической нефропатии, воспалении мочевыводящих путей.

Кроме этого, концентрация мочевины и креатинина позволяют отследить состояние и других органов. Например, низкое содержание мочевины наблюдается при патологиях печени.

Холестерин

В крови человека холестерин содержится в виде комплексных соединений со специальными белками. В зависимости от плотности комплексных соединений холестерин можно разделить на несколько видов:

  • ЛПВП — «хороший холестерин», который обеспечивает клеточным оболочкам прочность и эластичность, способствует выработке в организме витамина D, принимает участие в синтезе половых и стероидных гормонов;
  • ЛПНП — «плохой холестерин». Избыток вещества снижает функциональность ЛПВП и приводит к образованию на стенках сосудов атеросклеротических бляшек. Высокий уровень ЛПНП наблюдается при гипотиреозе, сахарном диабете, системных заболеваниях соединительной ткани, ожирении.

В период вынашивания ребенка уровень холестерина повышается. Это связано с изменением гормонального фона и обмена веществ в женском организме. Поэтому для беременных разработаны специальные нормы, которые и следует учитывать при расшифровке анализа.

Глюкоза

У здоровой беременной женщины содержание глюкозы в крови (гликемия) находится в определенных физиологических границах. Повышенные значения могут указывать на сахарный диабет I или II типа, а также на гестационный диабет (ГСД).

ГСД — наиболее распространенное нарушение обмена веществ у беременных, с которым встречаются эндокринологи и акушеры-гинекологи. Основная причина заболевания изменение гормонального фона. Чаще всего при ГСД отсутствует выраженная симптоматика, что затрудняет диагностику. Определение глюкозы в биохимическом анализе — один из способов выявления патологии. ГСД требует немедленного лечения, так как может стать причиной выкидыша, отразиться на здоровье будущего ребенка и самой женщины.

АЛТ и АСТ

АЛТ и АСТ это ферменты подгруппы трансаминаз, которые считаются основными маркерами заболеваний печени. При повреждении паренхимы органа вещества в большом количестве поступают в кровь, что указывает на наличие патологии.

Кроме этого, уровень ферментов позволяет отследить работу сердечно-сосудистой системы, состояние скелетной мускулатуры.

Синтез веществ связан с содержанием в организме витамина B6. Соответственно, при нехватке этого витамина, значения АЛТ и АСТ будут понижены.

Билирубин

Билирубин — вещество, которое образуется при разрушении эритроцитов. Преимущественно этот процесс происходит в печени, поэтому в первую очередь значение билирубина отражает работу этого органа.

В результатах биохимического анализа указываются значения трех видов билирубина:

  • общего;
  • прямого;
  • непрямого.

Непрямой билирубин очень опасен: его высокое содержание в крови вызывает интоксикацию организма. Прямой билирубин растворим в воде и менее токсичен.

Если беременность протекает без осложнений, то показатели трех видов билирубина не отклоняются от референсных значений. Причиной повышенных результатов могут стать острые и хронические гепатиты, опухоли печени. Также высокие цифры наблюдаются при сильном токсикозе.

Альфа-амилаза

Альфа-амилаза — фермент, который расщепляет крахмал до более простых сахаридов и участвует в процессе пищеварения. Без этого вещества организм не смог бы усваивать углеводы основной источник энергии.

Повышение фермента при беременности может указывать на следующие проблемы:

  • сахарный диабет;
  • панкреатит — воспаление поджелудочной железы;
  • холецистит — воспаление стенок желчного пузыря;
  • почечную недостаточность — нарушение всех функции почек;
  • внематочную беременность — прикрепление оплодотворенной яйцеклетки за пределами полости матки.

Щелочная фосфатаза (ЩФ)

Это самый распространенный в организме фермент, который присутствует во всех тканях и органах. Вещество принимает участие в транспорте фосфора и ускоряет распад сложных соединений фосфорной кислоты. Определение количества фермента необходимо для оценки состояния печени, почек, желчного пузыря, костной ткани и других органов и структур.

Во втором триместре беременности в материнский кровоток начинает поступать плацентарная щелочная фосфатаза плода. Уровень ЩФ женщины растет и достигает своего максимума в третьем триместре.

Физиологический рост концентрации вещества не опасен и не считается патологией. Но если результат анализа значительно превышает референсные значения, то это может указывать на наличие заболеваний:

  • гестационного сахарного диабета;
  • гестационного дерматоза;
  • воспалительных процессов печени, почек, желчного пузыря.

Микроэлементы

Микроэлементы вещества, которые обеспечивают полноценную работу организма. Недостаток микроэлементов у беременной может негативно сказаться на эндокринной, нервной, пищеварительной системе, а также привести к аномалиям развития плода. Поэтому так важно во время беременности проверять содержание этих полезных веществ в организме.

При биохимическом анализе определяется уровень кальция, железа, натрия и других микроэлементов. При назначении анализа врач определяет количество исследуемых позиций, учитывая индивидуальные особенностей пациентки. При дефиците какого-либо вещества требуется коррекция рациона или прием витаминно-минеральных комплексов.

Онлайн консультация Врача-гинеколога

Консультация онлайн

В рамках консультации вы сможете озвучить свою проблему, врач уточнит ситуацию, расшифрует анализы, ответит на ваши вопросы и даст необходимые рекомендации.

Таблица: референсные значения биохимического анализа крови при беременности по триместрам

 

Показатели

Единицы измерения

1 триместр

2 триместр

3 триместр

Уровень общего белка

г/л

63-83

Альбумин

г/л

31-50

28-55

25-66

Мочевина

ммоль/л

2,5-7,1

2,5-6,2

Общий холестерин

ммоль/л

6,16-13,7

 

Уровень глюкозы в крови

ммоль/л

3,5–5,83

АЛТ

ед/л

до 32

до 31

до 31

АСТ

ед/л

до 31

до 30

до 30

Креатинин

мкмоль/л

32-70

32-50

32-47

Общий билирубин

мкмоль/л

3,4-21,6

Прямой билирубин

мкмоль/л

До 7,9

Непрямой билирубин

мкмоль/л

3,4-13,7

Альфа-амилаза

ед/л

28-110

Щелочная фосфатаза

ед/л

40-150

40-190

40-240

Уровень железа

мкмоль/л

8,93-30,4

7,2-25,9

Уровень натрия

ммоль/л

135-155

135-145

135-155

Уровень хлора

ммоль/л

98-107

Уровень калия

ммоль/л

3,4-5,3

3,4-5,5

3,4-5,3

Уровень фосфора

ммоль/л

1-1,57

1-1,4

0,87-1,47

Уровень магния

ммоль/л

0,85-2

0,85-1,7

0,85-1,4

Заключение

Биохимическое исследование крови при беременности — важный анализ, который является обязательным. Результаты исследования позволяют оценить состояние женского организма, спрогнозировать течение беременности и родов.

Зависящая от времени потеря транскриптов мРНК из пятен судебно-медицинской экспертизы

1 Школа судебных наук, Центр медицинских наук, Государственный университет Оклахомы, Талса, штат Оклахома, США; 2 Лаборатория судебной экспертизы полиции штата Орегон, Клакамас, штат Орегон, США; 3 Департамент статистики, Государственный университет Оклахомы, Стиллуотер, штат Оклахома, США

Резюме: Судебно-медицинское применение анализа РНК включало идентификацию жидкостей организма и анализ деградации РНК в старых пятнах в качестве возможного индикатора времени.Что касается оценки возраста пятна с помощью анализа РНК, полное понимание закономерностей и скорости деградации РНК в посмертных образцах и пятнах жидкостей тела отсутствует. В этом исследовании деградация мРНК в свежих и старых пятнах жидкости организма (кровь, слюна, сперма и влагалищная жидкость) была проанализирована с использованием секвенирования РНК следующего поколения (RNA-seq). Общее количество транскриптов, присутствующих в каждом из разных красителей, со временем уменьшалось. Однако в глобальном масштабе определенные транскрипты исчезали из экстрактов РНК с разной скоростью.Например, наблюдалась положительная корреляция между исходной численностью типичного транскрипта и временем, когда он больше не мог быть обнаружен в результатах RNA-seq. Другими словами, чем больше исходное количество транскриптов, тем дольше он может быть обнаружен с помощью RNA-seq. Транскрипты с нулевым содержанием, которые, тем не менее, исчезли из транскриптома в разные моменты времени во время хранения, можно было легко идентифицировать, и они были членами групп транскриптов, общих для всех окрашенных жидкостей организма, а также групп, присутствие которых было ограничено среди жидкостей организма.Возможная взаимосвязь между длиной транскрипта и продолжительностью жизни во время хранения была исследована, и не было обнаружено значительной корреляции. Результаты этого исследования будут способствовать нашему пониманию деградации мРНК в пятнах жидкости организма, значимых для судебной экспертизы, что может привести к разработке инструмента для оценки возраста пятна на месте преступления.

Введение

Исторически анализ ДНК играл доминирующую роль в судебно-медицинских исследованиях, в то время как использование анализа РНК было ограниченным.Воспринимаемая судебно-медицинская ценность анализа РНК была низкой из-за общего мнения, что РНК лабильна и, следовательно, подвержена деградации. Однако исследования последнего десятилетия показали, что РНК может быть намного более стабильной ex vivo, чем считалось ранее. 1 Анализ РНК использовался для идентификации тканей, оценки времени с момента осаждения, посмертного интервала, а также для определения болезненного состояния, употребления наркотиков и механизма смерти. 2–4 РНК может существовать в пятнах биологической жидкости в течение длительного времени.Kohlmeier и Schneider 5 смогли обнаружить и профилировать РНК, выделенную из пятен крови 23-летней давности. Об аналогичном успехе в обнаружении РНК в пятнах крови в возрасте до 16 лет сообщили Зубаков и соавт. 6 Помимо образцов крови, исследования слюны, спермы, семенной жидкости, носовых и вагинальных выделений (VS), пота и кожи демонстрируют, что РНК можно выделить из многих типов старых биологических образцов и использовать их для исследований, имеющих отношение к судебной медицине. расследования. 7–11

Оценка времени, прошедшего с момента отложения жидкости организма посредством мониторинга деградации РНК, в основном сосредоточена на рибосомной РНК (рРНК), транскриптах мРНК домашнего хозяйства и тканеспецифических транскриптах мРНК. 8–11 В исследованиях использовалась как конечная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в сочетании с капиллярным электрофорезом, так и количественная ОТ-ПЦР для мониторинга скорости деградации некоторых выбранных видов РНК. В работе, выполненной Bauer et al. 7 , анализ 106 пятен крови в возрасте до 15 лет показал, что количество транскриптов β-актина и циклофилина снижается в зависимости от возраста образца. Anderson et al. 2,12 также изучали деградацию мРНК β-актина и предположили, что приблизительный возраст пятна крови можно предсказать, определив соотношение численности мРНК β-актина и 18S рРНК.Молекулярные методы оценки возраста также включают пропорциональное количественное определение более коротких и более длинных молекул кДНК, предполагая, что более длинные транскрипты исчезнут из транскриптома быстрее, чем короткие транскрипты. 2 Андерсон и др. 12 обнаружили, что наиболее надежная оценка возраста была получена на основе многомерного анализа, который учитывает несколько ампликонов (разного размера), представляющих несколько генов.

В исследовании, описанном здесь, использовалось секвенирование РНК следующего поколения для идентификации и количественной оценки большого количества транскриптов, извлеченных из пятен биологических жидкостей.Таким образом, наш подход представляет собой «дробовик» подход к скринингу большого количества транскриптов РНК в криминалистически значимых пятнах, выдержанных при комнатной температуре в течение периодов до 1 года. Исследование преследовало две основные цели: 1) идентифицировать основные мРНК, присутствующие в окрашенных с судебно-медицинской экспертизе окраске жидкостей организма, и идентифицировать те транскрипты, общие для жидкостей организма, а также те, которые ограничены конкретной жидкостью тела; 2) Проследить исчезновение транскриптов в пятнах высохшей жидкости организма, выдержанных в течение периода до 1 года, в надежде идентифицировать специфические транскрипты, деградация которых может быть полезна при оценке возраста пятна жидкости организма.Обоснованием этого исследования было то, что секвенирование РНК библиотек транскриптомов с использованием технологии секвенирования следующего поколения (NGS) позволило бы идентифицировать и количественно оценить большое количество транскриптов в каждом окрашивании жидкости организма в течение периода хранения и позволить выбрать оптимальный вариант. стенограммы кандидатов, которые могут быть информативными относительно возраста пятна.

Материалы и методы

Описание образцов

Вся работа с пробами, описанная в этой методологии, соответствует протоколу, утвержденному Советом по надзору за учреждениями (IRB) OSU-CHS от 13 мая 2013 г.К заявке на получение IRB прилагалось этическое обоснование исследования. Таким образом, утверждение IRB охватывает как процедуры получения согласия, так и этические нормы, связанные с исследованием.

Образцы биологических жидкостей, включая кровь, слюну, сперму и вагинальную жидкость, были собраны у доноров старше 18 лет, предоставивших письменное информированное согласие на секвенирование их образцов. Для исследования были собраны два образца крови (мужчина и женщина, которые не были родственниками), два образца спермы от неродственных доноров, два образца слюны (мужской и женский) и два образца VS.Образцы крови отбирали в пробирки для сбора ЭДТА. Образцы слюны собирали путем внесения донором 1,0–2,0 мл слюны в стерильную пробирку для сбора. Влагалищную жидкость собирали путем предоставления донорским мазкам из дакрона для сбора образца. Семя собирали путем помещения образца в стерильную пробирку для сбора, предоставленную донору.

После сбора образцы крови, слюны и спермы помещали на свободные от нуклеаз карты для сбора образцов Fitzco (карты образцов 705 Classic, не обработанные FTA) в аликвотах по 50 мкл (Fitzco Inc., Спринг-Парк, Миннесота, США). Образцы были помечены уникальным 10-значным кодом, и все образцы (карты, содержащие кровь, сперму и слюну и дакроновые мазки для вагинальной жидкости) хранили в темноте при комнатной температуре. Образцам давали возможность состариться в течение определенного периода времени (таблица 1), прежде чем была проведена экстракция РНК путем вырезания пятна из карты сбора, измельчения пятна на мелкие кусочки, а затем добавления реагента для экстракции РНК или погружения головки тампона. в экстракционном реагенте. Обратите внимание, что в таблице 1 транскрипты, полученные из всех окрашенных жидкостей тела, были секвенированы в нулевой момент времени (T0) и через 60, 120 и 180 дней (T60, T120 и T180 соответственно) хранения при комнатной температуре в темноте.

Таблица 1 План отбора проб для выявления пятен биологических жидкостей

Примечание: XX означает, что образцы были проанализированы дважды.

Выделение РНК

Выделение РНК

выполняли с помощью TRI Reagent ® (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), следуя инструкциям производителя. Водную фазу реагента TRI ® (Sigma Aldrich), содержащую выделенную РНК, переносили в чистую 1.Пробирка Эппендорфа 5 мл. РНК подвергали дальнейшей очистке с помощью набора Zymo Research RNA Clean and Concentrator ™ в соответствии с инструкциями производителя (Zymo Research, Ирвин, Калифорния, США). Чистые препараты РНК в 15 мкл воды для реагентов подвергали расщеплению ДНКазой с использованием ДНКазы TURBO ™ (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя. Все образцы были количественно определены на флуориметре Qubit ® с использованием набора RNA HS (Life Technologies).

Препарат библиотеки кДНК

Образцы, содержащие 20 нг изолированной РНК, смешивали с 4 мкл смеси 1 для добавления РНК ERCC (Ambion ® , Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в разведении 1: 10000.Смесь ERCC Spike-in Mix состоит из синтетических молекул РНК, которые не отображаются в геноме человека и присутствуют в известных молярных количествах. 13 Библиотеки секвенирования были приготовлены из экстрактов РНК, содержащих вставки ERCC, и как только результаты секвенирования были получены и выровнены с геномом человека, была рассчитана глубина считывания секвенирования (выраженная как считывания на килобаз транскрипта на миллион последовательностей или RPKM). с помощью CLC Bio Genomics Workbench (Кембридж, Массачусетс, США). Значение RPKM рассчитывается по следующей формуле:, где N представляет собой общее количество считываний секвенирования, произведенных в ходе цикла секвенирования; 14 L представляет собой общую длину экзонов в гене, с которым совпадает считывание секвенирования, а C представляет количество считываний секвенирования, которые отображаются на карте этого гена.Выражение глубины считывания секвенирования как RPKM нормализует результаты секвенирования для длины кодирующей части гена, с которой согласуются данные секвенирования. Значения RPKM также отражают относительное содержание данной молекулы РНК в экстракте, а включение смеси молекул РНК с добавлением шипов ERCC позволяет создать стандартную кривую и использовать ее для оценки молекулярных количеств отдельных молекул мРНК (выраженных как log 2 молекул / мкл), извлеченных из пятен.

Образцы

РНК были преобразованы в кДНК с использованием набора NuGEN Ovation ® RNA-seq Kit v2 (NuGEN Technologies, Сан-Карлос, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.Праймеры, которые управляют процессом обратной транскрипции, являются полуслучайными в том смысле, что последовательности праймеров исключены из синтеза кДНК, которые распознают последовательности рРНК, присутствующие в большом количестве в пятнах жидкости организма. Поиск последовательностей 18S рРНК в результатах RNA-seq из библиотек кДНК транскриптов показал, что наши библиотеки в значительной степени лишены рибосомных последовательностей. Таким образом, кДНК, синтезированная с помощью набора Ovation, обогащена последовательностями мРНК. Все образцы кДНК были проверены на чистоту (A260 / 280> 1.8) и количества с помощью микроспектрофотометра Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Уилмингтон, Делавэр, США).

Аликвоты проб 30 мкл TE-4 (10 мМ Трис-Cl, pH 8,0 + 0,1 мМ EDTA), содержащие 1 мкг кДНК, были фрагментированы на Bioruptor ® UCD 200 (Diagenode, Denville, NJ, США) до средний размер фрагмента 200 п.н. После завершения фрагментации проводили дальнейший отбор размера диапазона фрагментов 200 п.н. с помощью электрофореза в агарозном геле (E-gel Size Select 2%, Life Technologies).По данным программы секвенирования Ion Torrent, средний размер фактически секвенированных фрагментов кДНК составлял 168 п.н. ± 18 п.н. Библиотеки кДНК конструировали с использованием набора Ion Plus Fragment Library (Life Technologies), следуя протоколу производителя для фрагментов 200 п.н. из 1 мкг препарата входной библиотеки. Все библиотеки получили адаптеры со штрих-кодом на одном конце каждого фрагмента, так что каждая пара технических реплик (один и тот же тип образца и момент времени) могла быть секвенирована на одном и том же чипе Ion 318 ™ v2 (Life Technologies).Следует отметить, что технические повторы заключались в выполнении подготовки библиотеки и секвенирования с отдельным извлечением РНК из окрашивающей жидкости организма. Адаптеры штрих-кода Ion Xpress ™ использовались для всех штрих-кодов. Все библиотеки были количественно оценены с использованием набора для количественного анализа библиотек ионов на приборе для количественной ПЦР ABI 7500 в соответствии с протоколом производителя (Life Technologies).

Подготовка шаблона и секвенирование

Амплификацию фрагментов кДНК с помощью эмульсионной ПЦР проводили на приборе OneTouch 2 ™ (OT2) (Life Technologies).Технические копии образцов (один и тот же тип образца, один и тот же момент времени), несущие разные штрих-коды, были объединены вместе в равной концентрации 26 пМ и загружены в OT2 ™ в соответствии с протоколом производителя (Life Technologies). После завершения эмульсионной ПЦР на OT2 ™ образцы обогащали на Ion Torrent ™ ES для удаления нестандартных ионных сферических частиц (ISP).

После завершения подготовки матрицы обогащенные положительные по матрице ISP смешивали с буфером, контрольными ISP и ферментом и загружали на чип Ion 318 ™ v2 для секвенирования на Ion Torrent ™ PGM (Life Technologies).Таким образом, две библиотеки технических реплик, содержащих разные штрих-коды, были секвенированы на одном и том же чипе Ion 318 TM . Параметры секвенирования по умолчанию для библиотек из 200 п.н. на чипе 318 ™ v2 использовали для всех реакций секвенирования. Показатели качества результатов секвенирования, сообщаемые программным обеспечением Ion Torrent, включают процент считываний секвенирования, равных или превышающих показатель качества Q20, среднюю длину считывания фрагмента, процент загрузки микросхемы секвенирования, клональность фрагмента на каждой бусине ISP (т. Бусинка ISP, несущая одну последовательность шаблонов), и процент пригодных для использования считываний.Типичные показатели в циклах секвенирования, о которых здесь сообщается, были ≥80% всех вызовов оснований, согласованных с геномом человека для образцов крови и спермы (> Q20). Средняя длина фрагмента для секвенированных образцов составила 168 п.н. (± 18 п.н.). Загрузка ISP в среднем составила 76% (± 5%). Клональность секвенированных библиотек в среднем составляла 68% (± 3,7%), что указывает на то, что более половины гранул ISP содержат одну матричную последовательность. Полезные показания в среднем составили 49% (± 13,2%).

Анализ данных

Анализ данных последовательностей, полученных из всех образцов, проходил в многоэтапном процессе: сначала необработанные данные последовательности для данного образца были сопоставлены с эталонным геномом человека, Hg19 (GRCh48).После выравнивания каждый образец имел уровни экспрессии РНК, рассчитанные в форме RPKM. Значения RPKM отражают глубину считывания секвенированных транскриптов (и, следовательно, численность), которая была нормализована по уровням экспрессии с учетом общего количества считываний секвенирования в прогоне, размера гена и количества считываний секвенирования, которые соответствуют этому ген. 14 Расчеты выравнивания и RPKM были выполнены с помощью программного обеспечения CLC Bio Genomics Workbench. После того, как начальные значения RPKM были рассчитаны для каждого транскрипта, эти значения были нанесены на стандартную кривую, созданную с использованием дополнительных стандартов ERCC (входное количество стандарта ERCC по сравнению с RPKM) для оценки содержания в молекулах log2 (рис. 1). 13

Рис. 1 Стандартная кривая, сравнивающая концентрацию всплесков ERCC в сравнении со значениями RPKM, полученными в результате секвенирования.

Примечания: Известные количества молекул синтетической РНК, поставляемые в виде разведения смеси добавок ERCC, добавляли к каждому экстракту РНК перед генерацией кДНК и подготовкой библиотеки. ERCC-контроль состоит из 92 транскриптов, присутствующих в различных молярных концентрациях, которые при секвенировании образуют стандартную кривую (входные молекулы в сравнении с RPKM).

Сокращение: RPKM, число чтений на килобазу транскрипта на миллион последовательностей.

Нормализация различных прогонов секвенирования в соответствии со стандартами ERCC также частично контролирует технические вариации, которые могли быть внесены во время подготовки библиотек. Стохастические эффекты, связанные с извлечением РНК и этапами амплификации, участвующими в подготовке библиотеки, могут влиять на разнообразие обнаруживаемых транскриптов, тем более что наш подход вряд ли захватит весь транскриптом.

Транскрипты, обнаруженные в каждом пятне биологической жидкости, сравнивали друг с другом в поисках транскриптов, экспрессируемых в каждом пятне судебно-медицинской экспертизы. В идеале, уровни экспрессии в разных красителях должны быть примерно сопоставимы, поскольку любой процесс оценки возраста образца будет нацеливаться на молекулы, универсально присутствующие во всех тканях, которые исчезают из-за обнаружения в результате секвенирования с примерно сопоставимой скоростью. С помощью этой стратегии набор транскриптов, присутствующих во всех жидкостях организма, был идентифицирован на основе следующих критериев соответствия: чтобы их можно было рассматривать для дальнейшего анализа, результаты секвенирования для каждой временной точки должны были присутствовать и показывать снижение уровня изобилия в течение определенного периода времени. 180-дневный временной курс (поскольку данные секвенирования для всех пятен включали время 0, 60, 120 и 180 дней старения).Успешные локусы, присутствующие в VS, сперме и крови, были выбраны из более чем 4000 человеческих транскриптов. Значения содержания транскриптов, полученные для пятен слюны, быстро и беспорядочно уменьшались, поэтому слюна была исключена из более полного анализа, проведенного на оставшихся жидкостях организма.

Статистический анализ выполняли с использованием статистического программного обеспечения Prism Graphpad (v6.0, Graphpad Inc., Сан-Диего, Калифорния) или SAS (версия 9.4, SAS Institute, Кэри, Северная Каролина). Анализ множественных сравнений проводился с учетом глобальных значений обилия транскриптов для транскриптов, обнаруженных в каждом из пятен биологической жидкости с течением времени (до 360 дней для крови и до 180 дней для спермы, слюны и VS).

Корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона был выполнен для сравнения длины популяции транскриптов со скоростью их исчезновения из результатов RNA-seq. В это исследование были включены транскрипты, обычно экспрессируемые в жидкостях организма (всего 31 транскрипт гена) по сравнению с группой, экспрессируемой только кровью (14 транскриптов генов), семенной жидкостью (14 транскриптов) или VS (14 транскриптов) с сопоставимым содержанием T0.

Результаты

Секвенирование

РНК различных пятен биологической жидкости в T0 (в течение 12 часов после сбора) выявило около 12000 различных генов, представленных в экстракте мРНК из крови и спермы, тогда как только около 4000 генов были представлены в транскриптах из экстрактов из слюны и вагинальной жидкости ( Таблица 2, Рисунок 2).Хотя мы признаем, что используемая здесь платформа NGS может не обладать способностью захватывать весь транскриптом в каком-либо из окрашенных жидкостей тела, мы, тем не менее, смогли воспроизвести последовательность РНК из тысяч генов, экспрессируемых в различных красителях, и оценить их долговечность во время старение. Резкое сокращение количества транскриптов, отображаемых в геноме человека во влагалищной жидкости и слюне, вероятно, связано с большим количеством видов микробов, которые населяют ротовую полость и свод влагалища и чья РНК коизолирована с РНК человека и впоследствии секвенирована.Микробные транскрипты будут конкурировать с человеческими транскриптами во время получения кДНК и последующей амплификации библиотеки, а стохастические эффекты во время реакций амплификации, необходимых для секвенирования, могут исключить обнаружение менее распространенных человеческих мРНК.

Таблица 2 Уменьшение количества транскриптов с течением времени в пятнах биологических жидкостей a

Примечания: a Значения, выраженные в% от нулевого времени на основе молекул log2.

Сокращение: NT, не тестировался.

Рис. 2 Профили стенограммы в различных пятнах биологических жидкостей в нулевой момент времени.

Примечания: На этой диаграмме Венна представлено количество человеческих транскриптов, обнаруженных в экстрактах РНК из различных красителей жидкостей организма. Для каждого типа ткани существуют транскрипты генов, экспрессия которых ограничена одной или несколькими тканями. Кроме того, существует 1 901 транскрипт, общий для всех красителей.Числа в скобках представляют собой общее количество транскриптов, обнаруженных в каждом пятне биологической жидкости.

Совмещение считываний секвенирования из крови и спермы привело к совпадению 80–90% с геномом человека HG19. Напротив, только 5–10% секвенирования считываются из слюны и VS, сопоставленных с HG19. Невыровненные считывания для слюны и влагалищной жидкости были запрошены по базе данных Human Oral Microbial Database (HOMD) 15 и Refseq, 16 соответственно, и было обнаружено, что более 90% невыровненных считываний совпадают с микробными организмами (не показано ).Данные на рисунке 2 также подчеркивают совпадение экспрессии генов в различных жидкостях организма. Тысяча девятьсот один различные гены были экспрессированы до обнаруживаемых уровней во всех пятнах жидкости тела в момент T0, в то время как удвоенное количество транскриптов было ограничено экспрессией одним или другим типом жидкости тела (рис. 2). Распространенность транскриптов для обычно экспрессируемых генов варьировала в зависимости от окраски жидкости организма. В целом, значения содержания T0 для общих транскриптов, проанализированных в пятнах крови, были ниже, чем их уровни содержания T0 в сперме, вагинальной жидкости и слюне.Самым распространенным транскриптом в крови была ограниченная тканью мРНК, кодирующая β-цепь гемоглобина с содержанием 32 log2 молекул / мкл. Напротив, уровни распространенности транскриптов в сперме, VS и слюне превышали 80–100 log2 молекул / мкл для наиболее распространенных транскриптов.

Воспроизводимость результатов РНК-секвенирования среди технических повторов для каждого образца в каждый момент времени оценивалась путем нанесения значений содержания для каждого транскрипта в каждом цикле секвенирования на отдельных осях для получения диаграммы разброса.Чем ближе друг к другу повторяющиеся значения численности, тем выше значение R 2 для диагонального разброса данных (рис. 3). Наименьшее значение R 2 для технических повторений наблюдалось для слюны (рис. 3). Причина большей изменчивости значения R 2 для слюны по сравнению со значением для вагинальной жидкости неясна. Технические копии всех других образцов тела показали значения R 2 не менее 99%, демонстрируя хорошую воспроизводимость результатов секвенирования (рис. 3).Воспроизводимость результатов секвенирования также может быть оценена по разбросу повторных количественных оценок для молекул РНК с всплеском ERCC, показанных на рисунке 1.

Рис. 3 Воспроизводимость результатов секвенирования РНК NGS между повторами.

Примечания: Сравнивались значения Log2 RPKM для каждого гена в каждый момент времени 0 (свежих) повторов для каждой жидкости организма. Реплика 1 для каждого типа образца находится на оси абсцисс, а реплика 2 — на оси ординат.Если две реплики имеют точно такое же количество определенного гена, точка для этого гена будет на линии. Значение R 2 для каждого из типов образцов отображается на графике. Чем ближе к 1 значение R 2 , тем точнее воспроизводятся реплики.

Сокращения: NGS, секвенирование следующего поколения; RPKM, число считываний на килобазу транскрипта на миллион последовательностей.

Значения численности для технических повторений каждого типа образца в каждый момент времени были усреднены.Среднее содержание (как log2 молекул / мкл) каждого отдельного транскрипта сравнивали по всем временным точкам для каждого типа пятен биологической жидкости. Все окрашенные жидкости организма производили последовательность из тысяч транскриптов, присутствующих в точке T0. Поскольку эти транскрипты начинают исчезать ниже диапазона примерно 200 оснований (предположительно из-за случайной деградации), их уровни упадут ниже уровня обнаружения с помощью нашего анализа, который полагается на фрагменты кДНК ~ 200 пар оснований для подготовки библиотеки. Среднее значение распределения размеров фрагментов в сериях секвенирования составило 168 + 18 пар оснований (не показано).Контролируя изменение количества отдельных транскриптов с течением времени с помощью стандартной кривой ERCC, можно разработать профиль деградации для каждого транскрипта мРНК в каждом красителе.

На рис. 4 показаны глобальные изменения количества транскриптов для каждого транскрипта, обнаруженного в каждом пятне биологической жидкости в каждый момент времени. Над каждой временной точкой нанесено до ~ 12000 точек для пятен крови и пятен спермы, и до ~ 4000 точек для слюны и VS, нанесенных над каждой временной точкой на рисунке 4.Каждая точка на графике представляет собой отдельный транскрипт и его среднюю численность (ось y) в заданный момент времени (ось x). В этих наборах данных присутствуют как широко выраженные (т. Е. Общие), так и ограниченные тканями (т. Е. Ограниченные) транскрипты. Когда для этих данных был проведен анализ множественных сравнений, разница в общей численности транскриптов в каждой из точек времени хранения относительно T0 была значительной ( p <0,0001), подтверждая, что количество транскриптов изменяется со временем хранения и, по-видимому, уменьшается. в каждом пятне биологической жидкости.

Рис. 4 Изменения в общем количестве транскриптов со временем хранения.

Примечания: Относительная численность каждого транскрипта (ограниченного и широко выраженного) нанесена на график в каждый момент времени. Таким образом, высота столбца наложенных точек данных дает общее представление об изобилии транскриптов в каждом пятне биологической жидкости в каждый момент времени. Анализ множественных сравнений указывает на значительное уменьшение между каждым из моментов времени ( p <0.0001 для всех сравнений).

Хотя на рисунке 4 представлен глобальный снимок содержания мРНК в каждом образце в каждый момент времени, данные также можно фильтровать, чтобы изучить изменение отдельных транскриптов во времени. Таким образом, мы можем проверить набор молекул мРНК в каждом красителе, чтобы идентифицировать конкретные транскрипты или группы транскриптов, которые исчезают с кинетикой, которая может коррелировать с возрастом образца.

Время исчезновения или выпадения транскриптов в красителях исследовали в зависимости от начального количества в момент времени 0.Данные на рисунке 5 предполагают, что существует взаимосвязь между количеством транскрипта, присутствующим в момент времени 0, и продолжительностью его обнаружения по мере того, как пятна стареют. Например, среднее количество времени 0 для транскриптов крови, которые выпали к 30 дням, составляет 4,77 log2 молекул / мкл, тогда как количество T0 для транскриптов, которые не исчезают после 360 дней хранения, составляет ~ 14 log2 молекул / мкл (Рисунок 5). . От T0 до 60 дней хранения (T60) 322 транскрипта исчезли из пятен крови (Таблица 2).Потеря транскриптов для каждого окрашивания жидкости тела была проанализирована и показана в таблице 2 и выражена в процентах от содержания T0. Примечательно быстрое исчезновение транскриптов из слюны, достигающее кульминации через 180 дней только с 5% начального числа транскриптов. Сперма и кровь сопоставимы с точки зрения общего выпадения транскриптов за 180 дней хранения, а количество VS-транскриптов уменьшается с промежуточной скоростью. Из ~ 1900 транскриптов, обнаруженных в крови, сперме и влагалищной жидкости в T0, ~ 2.3% исчезли в течение 60 дней хранения и около 50% исчезли через 180 дней во всех пятнах (не показаны). Из ~ 12000 транскриптов, обнаруженных в крови, ~ 15% оставались обнаруживаемыми в течение 360 дней хранения (таблица 2).

Рис. 5 Зависимость между обилием транскриптов в момент времени 0 и временем выпадения.

Примечания: Значения обилия стенограммы в момент времени 0 образцов были отсортированы на основе возможного времени выпадения стенограммы.Транскрипты с более высоким исходным содержанием транскриптов, как правило, выпадают поздно или вообще не выпадают. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения повторных количественных измерений.

Среднее содержание T0 для транскриптов, которые остаются обнаруживаемыми в течение 180 дней хранения, составляет 11,41 ± 2,81 log2 молекул / мкл, что соответствует транскриптам, обнаруженным с помощью RNA-seq почти из 2000 генов (таблица 3). Данные в таблице 3 также перекликаются с выводами, обсужденными на рисунке 5, в том, что существует взаимосвязь между исходной численностью для типичного транскрипта и временем, когда он больше не может быть обнаружен с помощью RNA-seq.

Таблица 3 Время выпадения транскрипта в зависимости от содержания Т0 в пятнах крови a

Примечание: a Показанные значения выражены в log2 молекул / мкл.

В то время как результаты на Рисунке 5 и в Таблице 3 указывают на положительную корреляцию (большее количество T0 равняется большей средней продолжительности жизни) между исходным количеством транскрипта и временем выпадения для среднего транскрипта, транскриптом содержит группы мРНК сравнимой исходной численности. , скорость исчезновения которых варьируется, что позволяет предположить, что на деградацию мРНК влияют другие факторы, помимо численности.В таблице 4 показаны группы транскриптов генов, общих для крови, спермы и VS, значения обилия которых в момент T0 сравнимы и все же исчезают из результатов RNA-seq в разное время. (Данные, представленные в таблице 4, были взяты для пожилых VS). Эти транскрипты также присутствуют в пятнах крови и спермы в момент T0, и некоторые из них демонстрируют сходные скорости исчезновения пятен. Присутствие транскриптов, которые имеют одинаковую начальную численность, но выпадают в разные моменты времени во время хранения, предполагает, что на скорость деградации мРНК могут влиять факторы, отличные от начального количества.Такие факторы, как длина транскрипта и особенно вторичная структура в молекуле мРНК, могут влиять на скорость деградации.

Таблица 4 Потеря общих транскриптов с аналогичным содержанием T0 a

Примечания: a Показанные значения выражены в log2 молекул / мкл и представляют собой значения содержания в семенной жидкости. Значения содержания во влагалищной жидкости и сперме были сопоставимы, но были ниже в крови. р <0.001 для сравнения между двумя последовательными временными точками.

транскриптов мРНК из генов домашнего хозяйства также были проанализированы на предмет обилия в различных типах окрашивания жидкостей тела в разные моменты времени. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ( GAPDH ), β-2-микроглобулин ( B2M ) и β-актин ( ACTB ) представляют собой три широко изучаемых транскрипта гена домашнего хозяйства, исчезновение которых из пятен судебно-медицинской экспертизы оценивалось как индикатор образца. возраст.Уровни содержания T0 для транскриптов гена домашнего хозяйства GAPDH и ACTB в пятнах крови и спермы были репрезентативными для среднего содержания T0 типичного транскрипта, обычно экспрессируемого во всех тканях (таблицы 3 и 5). Количество этих транскриптов в слюне и влагалищной жидкости несколько уменьшилось. Все транскрипты были обнаружены в течение 180-дневного периода хранения во всех жидкостях организма, кроме слюны, где транскрипты B2M и GAPDH выпали в течение 180 дней (Таблица 5).В крови, семенной жидкости и VS, GAPDH , ACTB, и B2M количество транскриптов упало примерно на 50% за 180-дневное хранение, как и многие другие обычно выраженные транскрипты. Различное количество T0 генов домашнего хозяйства в разных жидкостях организма плюс их разная скорость исчезновения в слюне подчеркивают еще одну проблему, связанную с деградацией транскриптов в разных жидкостях организма, которую необходимо учитывать при попытке использовать деградацию РНК для оценки возраста образца.Идеальный анализ позволит количественно определить общий набор транскриптов, которые исчезают аналогичным образом при окрашивании стареющих жидкостей организма. Наши попытки идентифицировать один или несколько транскриптов, которые соответствуют идеальному маркеру возраста выборки, пока не увенчались успехом. В таблице 6 показаны транскрипты, присутствующие в пятнах крови и спермы, которые исчезают при обоих типах пятен с несколько схожей кинетикой. Однако время исчезновения не совсем сопоставимо (Таблица 6). Например, группа транскриптов, которые исчезают на Т120 в сперме, в основном исчезают из пятен крови к Т60.Таким образом, даже если данный транскрипт присутствует во всех жидкостях организма, скорость его исчезновения из пятен старения может варьироваться в зависимости от ткани. Это наблюдение, вероятно, усложнит разработку любого количественного метода оценки возраста, который нацелен на один или ограниченное количество транскриптов, общих для всех окрашенных жидкостей тела.

Таблица 5 Изобилие и стабильность транскриптов GAPDH, ACTB и B2M в пятнах жидкости организма

Примечания: a Значения изобилия представляют собой молекулы log2 и представляют собой средние повторяющиеся значения.

Сокращения: ГАДФН, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; ACTB, β-актин; B2M, β-2-микроглобулин.

Таблица 6 Исчезновение транскриптов мРНК, общих для пятен крови и спермы, с течением времени при хранении a

Примечания: a В таблице показаны уровни численности во время хранилище транскриптов, указанных в столбце «Ген.Группы транскриптов не обнаруживаются при указанном времени хранения (после T60, T120 или T180).

Возможная корреляция между размером транскрипта и скоростью деградации была исследована среди выбранных транскриптов, общих для всех жидкостей организма или ограниченных среди жидкостей организма. Двусторонний корреляционный анализ Пирсона был проведен для сравнения деградации транскриптов, ограниченных в их присутствии кровью, спермой или VS, или транскриптами, общими для всех окрашенных жидкостей тела, с длиной транскрипта, как сообщается в GenBank.Результаты анализа показали, что нет значимой корреляции между длиной транскрипта и скоростью деградации ( p > 0,05). Кроме того, анализ предсказанных вторичных структур мРНК транскриптов с короткими или длинными периодами полужизни в результатах RNA-seq не показал значительных различий, предполагающих, что вторичная структура не может придавать долговечность транскриптам в пятнах старения. Следует иметь в виду, что данные, подвергнутые этому анализу, представляют собой повторяющиеся наборы данных последовательностей, полученные от двух неродственных доноров для каждого пятна биологической жидкости.Для дальнейшего изучения возможной взаимосвязи между длиной транскрипта и кинетикой распада необходимы более подробные исследования большего числа доноров образцов и большего количества транскриптов.

Обсуждение

Аналитика ДНК часто спрашивают на стенде для свидетелей, может ли он / она дать показания о том, как долго биологические доказательства находятся на месте преступления. РНК-анализ может быть полезен при оценке возраста выборки. Анализ РНК использовался для идентификации тканей, оценки времени с момента осаждения, посмертного интервала и определения болезненного состояния, употребления наркотиков и механизма смерти. 2–4,6,8,9–11,18,19 В противоположность убеждению, что РНК (и особенно мРНК) является лабильной молекулой и исчезнет из засохших красок с коротким периодом полураспада, Кольмайер и Шнайдер были способен обнаруживать и профилировать РНК, выделенную из пятна крови 23-летнего возраста. 5 Об аналогичном успехе в обнаружении РНК в пятнах крови в возрасте до 16 лет сообщили Zubakov et al. 6 Помимо образцов крови, исследования слюны, спермы, семенной жидкости, ТС, пота и кожи демонстрируют, что РНК можно выделить из многих типов образцов, имеющих отношение к судебной медицине. 7–10 Однако до настоящего времени не было разработанной валидированной методологии для оценки возраста выборки.

Распад транскриптов из генов домашнего хозяйства, таких как GAPDH , ACTB или B2M , был изучен в качестве временного механизма для оценки возраста образцов и имел переменный успех. Частично проблема с такими анализами, как qPCR или RNA-seq, используемыми для анализа деградации транскриптов, заключается в вариабельности оценок количества транскриптов, которая связана с техническими причинами от одного цикла к другому.При исследовании деградации двух транскриптов, специфичных для спермы, SEMG1 и PRM1 с использованием анализа Taqman с кПЦР, широкая вариабельность результатов пороговых значений цикла была получена не среди трехкратных анализов каждой экстракции РНК из каждой временной точки, а скорее от одного момента времени (и события извлечения РНК) к следующему (рукопись в стадии подготовки). В исследовании, представленном здесь, технические реплики данных RNA-seq согласовывались очень хорошо (рисунки 1 и 3), но воспроизводимость разнообразия и количества транскриптов между временными точками действительно различалась, особенно для транскриптов, у которых количество T0 было низким.Вероятно, этому изменчивости могут способствовать несколько факторов. Во-первых, пятна или мазки, приготовленные из разных жидкостей организма, могут отличаться. Это особенно верно для пятен спермы (из-за скопления сперматозоидов) и мазков из влагалища (из-за количества депонированных эпителиальных клеток). Таким образом, восстановление РНК может варьироваться от образца к образцу. Стохастические эффекты, которые должна учитывать судебно-медицинская лаборатория, занимающаяся типированием с короткими тандемными повторами (STR), вероятно, также имеют отношение к исследованиям количества РНК, которые полагаются на амплификацию на любом этапе процесса подготовки библиотеки.По этим причинам мы ограничили наш анализ изменениями количества транскриптов для генов с умеренной и высокой степенью экспрессии.

Среди проанализированных пятен различных жидкостей тела 12 000–13 000 транскриптов генов были обнаружены в пятнах крови и спермы, тогда как только около 4000 транскриптов генов были обнаружены в VS и слюне. Сильное уменьшение количества человеческих транскриптов в этих тканях, скорее всего, связано с большим количеством микробов, населяющих эти полости тела. Если большая часть РНК, выделенной из щечного или вагинального мазка, имеет микробное происхождение, микробные транскрипты предположительно будут превосходить человеческие транскрипты из-за стохастических эффектов во время синтеза кДНК и амплификации библиотеки.Также возможно, что физиологические процессы, которые происходят в этих полостях тела из-за резидентного микробиома (ов), ускоряют деградацию человеческих транскриптов, извлеченных из этих тканей. Интересно, что пятна слюны и VS, хотя и содержат множество видов микробов, демонстрируют такую ​​разную кинетику исчезновения транскриптов. Исчезновение транскриптов при окрашивании слюны было наиболее выраженным: 73% транскриптов исчезли к Т60. За тот же период влагалищная жидкость потеряла только около 25% транскриптов.Возможно, микробиом полости рта более разнообразен, чем среда влагалища, или содержит определенные виды, которые участвуют в ранних стадиях расщепления пищи и, следовательно, более катаболичны по отношению к биологическому материалу из клеток ротовой полости. Другой возможный фактор, способствующий быстрому исчезновению транскриптов из слюны, — это разница pH в двух компартментах. Кислая среда влагалища может препятствовать оптимальной активности РНКаз, которые способствуют исчезновению транскрипта.

Транскрипты, общие для крови, спермы и VS, исчезли с различной кинетикой.Даже когда содержание T0 для группы транскриптов было сопоставимым, члены исчезнувшей группы легко идентифицировались по каждой из точек времени хранения. Из всех транскриптов, обнаруженных в каждом из типов окрашивания, наиболее распространенная категория транскриптов содержала транскрипты, которые не исчезали в течение 180 дней хранения. В пятнах крови около 15% всех транскриптов оставалось обнаруживаемым даже после 360 дней хранения.

Можно разделить транскрипты, которые исчезают со сходной кинетикой, как группы с коротким, средним и долгоживущим периодом, и можно включить количественный анализ нескольких транскриптов в каждой группе в качестве более воспроизводимого подхода к оценке возраста.Например, пятно крови, обнаруженное с места преступления, на котором отсутствуют поддающиеся обнаружению стенограммы в группе, исчезающей через 60 дней, но все еще сохраняющие обнаруживаемые стенограммы из группы, исчезнувшей в течение 120 дней, а также группа, выжившая 180 дней хранения, может быть помещена в оценку возраста. <120 дней. Выполняя RNA-seq с более короткими интервалами, группы транскриптов с общим временем исчезновения могут все больше сужать методологию оценки возраста. Рассмотрение деградации множественных транскриптов как эффективного способа оценки возраста не является новой концепцией.Андерсон и др., 12 обнаружили, что наиболее надежная оценка возраста включает многомерный анализ, в котором учитываются уровни численности множества видов РНК (различных размеров). Хотя большая часть опубликованной литературы по деградации РНК сосредоточена на исчезновении определенных транскриптов, возможно, более эффективным подходом было бы изучение групп транскриптов, которые ведут себя предсказуемым образом. Другими словами, анализируйте лес более внимательно, а не отдельные деревья.

О характеристиках деградации РНК в старых пятнах крови сообщалось и раньше, но эти исследования были ограничены изучением нескольких выбранных транскриптов РНК. 7,12,17,18 Тем не менее, результаты этих исследований действительно предполагают, что существует связь между возрастом образца ex vivo и состоянием деградации транскриптома. Применяемый здесь подход дробовика демонстрирует глобальное снижение содержания мРНК в пятнах старения. Благодаря подробному анализу поведения транскриптов в пятнах жидкости организма ex vivo, возможно, удастся лучше понять процесс деградации РНК и применить это понимание для разработки надежного метода измерения возраста образца или посмертного интервала.В будущих исследованиях будет изучено влияние различных условий хранения на кинетику исчезновения РНК из результатов RNA-seq (температура, воздействие солнечного света, влажность и т. Д.).

Благодарности

Работа поддержана грантом Национального института юстиции № 2014-DN-BX-K025. Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов в отношении представленной работы.

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

Список литературы

1.

Fordyce SL, Kampmann ML, van Doorn NL, Gilbert MT. Долгосрочная персистенция РНК в посмертном контексте. Investig Genet. 2013; 4 (1): 7.

2.

Андерсон С., Ховард Б., Хоббс Г.Р., Бишоп С.П. Метод определения возраста пятна крови. Судебная медицина Инт. . 2005; 148: 37–45.

3.

Бауэр М. РНК в судебной медицине. Судебная медицина Int Genet . 2007; 1 (1): 69–74.

4.

Lindenbergh A, de Pagter M, Ramdayal G, et al. Мультиплексная (m) система профилирования РНК для судебно-медицинской идентификации биологических жидкостей и следов контакта. Foren Sci Int Genet . 2012; 6: 565–577.

5.

Kohlmeier F, Schneider PM. Успешное профилирование мРНК пятен крови 23-летнего возраста. Судебная медицина Int Genet .2012; 6: 274–276.

6.

Зубаков Д., Коксхорн М., Клоостерман А., Кайзер М. Новые маркеры старых пятен: стабильные маркеры мРНК для идентификации крови и слюны от пятен возрастом до 16 лет. Int J Legal Med. 2009; 123: 71–74.

7.

Бауэр М., Ползин С., Патцельт Д. Количественная оценка деградации РНК полуколичественным дуплексом и конкурентной ОТ-ПЦР: возможный индикатор возраста пятен крови? Forensic Sci Int. 2003; 138: 94–103.

8.

Haas C, Muheim C, Kratzer A, Bär W., Maake C. Профилирование мРНК для идентификации спермы и семенной плазмы. Forensic Sci Int Genet Supp. 2009; 2: 534–535.

9.

Сакурада К., Акуцу Т., Фукусима Х, Ватанабе К., Йошино М. Обнаружение дермцидина для идентификации пота с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени и ELISA. Forensic Sci Int. 2010; 194: 80–84.

10.

Сакурада К., Акуцу Т., Ватанабе К., Фудзинами Ю., Йошино М. Экспрессия мРНК и белка статерина в назальных и вагинальных выделениях. Legal Med. 2011; 13: 309–313.

11.

Виссер М., Зубаков Д., Баллантайн К., Кайзер М. Идентификация кожи на основе мРНК для судебно-медицинских исследований. Int J Legal Med . 2011; 125: 253–263.

12.

Андерсон С.Е., Хоббс Г.Р., Бишоп С.П. Многомерный анализ для оценки возраста пятна крови. J Forensic Sci. 2011; 56: 186–193.

13.

Jiang L, Schlesinger F, Davis CA, et al. Синтетические вспомогательные стандарты для экспериментов с последовательностью РНК. Genome Res. 2011; 21: 1543–1551.

14.

Мортазави А., Уильямс Б.А., МакКью К., Шеффер Л., Уолд Б.Картирование и количественная оценка транскриптомов млекопитающих с помощью RNA-Seq. Нат. Методы. 2008; 5: 621–628.

15.

Чен Т., Ю.Х.Х., Изард Дж., Баранова О.В., Лакшманан А., Дьюхерст Ф. База данных ; 2010. Доступно по адресу: http://www.homd.org.

16.

Татусова Т., Чиуфо С., Федоров Б., О’Нил К., Толстой И. Обновленная информация о ресурсах микробных геномов RefSeq. Nucleic Acids Res. 2014; 43: D553 – D559.

17.

Vass A, Fleming R, Harbison S, Curran J, Williams E. Оценка использования деградации ДНК и РНК для оценки посмертного интервала. Nat. Уголовное правосудие Ref. Сервисный ; 2013 . Доступно по адресу: https://www.ncjrs.gov/App/Publications/abstract.aspx?ID=264275.

18.

Янг С.Т., Уэллс Д.Д., Хоббс Г.Р., Бишоп С.П.Оценка посмертного интервала с использованием деградации РНК и морфологических изменений пульпы зуба. Forensic Sci Int. 2013; 229: 163.e1 – e6.

19.

Ричард М.Л., Харпер К.А., Крейг Р.Л., Онорато А.Дж., Робертсон Дж. М., Донфак Дж. Оценка специфичности маркера мРНК для идентификации пяти жидкостей человеческого тела с помощью капиллярного электрофореза. Forensic Sci Int Genet. 2012; 6: 452–460.

Механизмы сплайсинга, лежащие в основе эритропоэза при здоровье и болезнях

Версия 1.F1000Res. 2018; 7: F1000 факультет Rev-1364.

, Концептуализация, Визуализация, Написание — Подготовка оригинального проекта, Написание — Рецензирование и редактирование 1 и, Концептуализация, Финансирование Приобретение, Надзор, Написание — Подготовка оригинального проекта, Написание — Обзор и Редактирование a, 1

Кирстен А. Реймер

1 Молекулярная биофизика и биохимия, Йельский университет, Нью-Хейвен, Коннектикут, 06520, США

Карла М. Нойгебауэр

1 Молекулярная биофизика и биохимия, Йельский университет, Нью-Хейвен, Коннектикут, 06520, США

1 Молекулярная биофизика и биохимия, Йельский университет, Нью-Хейвен, Коннектикут, 06520, США

Никаких конкурирующих интересов не раскрыто.

Авторские права: © 2018 Reimer KA и Neugebauer KM

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Во время эритропоэза гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники переходят в эритробласты на пути к терминальной дифференцировке в энуклеированные эритроциты.Изменения в масштабе транскриптома лежат в основе различных морфологических и функциональных характеристик при каждом делении клетки во время этого процесса. Многие исследования экспрессии генов исторически проводились в эритробластах, а биогенез мРНК β-глобина — наиболее высоко экспрессируемого транскрипта в эритробластах — был в центре внимания многих основополагающих исследований механизмов сплайсинга пре-мРНК. Теперь мы понимаем, что сплайсинг пре-мРНК играет важную роль в формировании транскриптома развивающихся эритробластов.Недавние достижения позволили понять роль альтернативного сплайсинга и удержания интронов как важных регуляторных механизмов эритропоэза. Однако нарушение регуляции сплайсинга во время эритропоэза также является причиной нескольких гематологических заболеваний, включая β-талассемию и миелодиспластические синдромы. С растущим пониманием роли, которую сплайсинг играет в этих заболеваниях, мы готовы разработать методы редактирования генов. В этом обзоре мы сосредоточены на изменениях в развивающемся транскриптоме эритробластов, вызванных альтернативным сплайсингом, молекулярной основе заболеваний крови, связанных со сплайсингом, и терапевтических достижениях в лечении заболеваний с использованием редактирования генов CRISPR / Cas9.

Ключевые слова: эритропоэз, ß-талассемия, миелодиспластический синдром (МДС), глобин, сплайсинг пре-мРНК, сплайсосома, нонсенс-опосредованный распад (NMD), удержание интронов, RNA-seq, CRISPR / Cas

Введение

Эритропоэз — это путь развития, по которому красные кровяные тельца (эритроциты) — специализированные гемоглобинсодержащие клетки, доставляющие кислород по всему телу — производятся из гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC). Морфологически это включает потерю ядра клетки и приобретение характерной дискообразной формы ( ).Ранние молекулярные биологи определили паттерны экспрессии генов, связанные с эритропоэзом, так что гены глобина являются одними из наиболее изученных эукариотических генов. β-глобин был одним из первых белков, которые были секвенированы, и первым белком, структурно охарактеризованным с помощью рентгеновской кристаллографии. Ген β-глобина и мРНК также были клонированы одними из первых. Эти достижения способствовали ранним открытиям в регуляции генов, таких как транскрипционный контроль глобиновых генов с помощью энхансерных и репрессорных элементов дальнего действия, присутствующих в области контроля локуса. 1 .Эта система регуляции транскрипции в настоящее время используется для выяснения того, как взаимодействуют хромосомные области и как петля хроматина может быть терапевтической мишенью при заболеваниях эритроцитов. 2, 3 .

Рисунок 1.

Изменения в экспрессии генов и сплайсинге происходят во время терминальной дифференцировки эритроидов.

Эритропоэз характеризуется изменениями морфологии клеток, включая размер ядра, цвет (из-за гемоглобинизации) и конденсацию хроматина, которые координируются с изменениями экспрессии генов.Во время терминальной дифференцировки эритроидов клетки переходят от проэритробластов (PRO) к базофильным эритробластам (EARLY и LATE BASO), к полихроматофильным эритробластам (POLY), к ортохроматическим эритробластам (ORTHO), перед энуклеацией они становятся эритроцитами (также эритроцитами). ретикулоциты). В человеческих эритробластах регуляция подмножества генов снижена — некоторые основные ассоциированные термины онтологии генов показаны справа (фиолетовая линия), в то время как подмножество генов регулируется одновременно (зеленая линия).Изменения в сплайсинге происходят на более поздних стадиях эритропоэза (в основном от позднего базо до орто), включая увеличение использования альтернативных сайтов сплайсинга и удержание интронов.

Биология РНК — это область, в которой эритропоэз, регуляция глобиновых генов и патологические мутации привели к фундаментальным открытиям. Гены глобина содержат две некодирующие промежуточные последовательности (интроны), которые удаляются сплайсосомой в процессе, называемом сплайсингом пре-мРНК. 4 . Пре-мРНК глобина была ранним модельным субстратом для исследования механизмов сплайсинга. 5, г. 6 , и мутации в генах глобина на 5 ‘и 3’ границах интронов, называемые сайтами сплайсинга (5 ‘и 3’ SS), оказались причиной различных форм талассемии. 7 .Талассемии — это недостаточность гемоглобина, возникающая в результате аберрантной экспрессии глобина. Некоторые мутации талассемии вызывают удержание интронов (IR) и приводят к нонсенс-опосредованному распаду (NMD), главному механизму регуляции генов, который разрушает транскрипты мРНК, содержащие кодоны преждевременной терминации (PTC), присутствующие в сохраненных интронах. 8, г. 9 . Наконец, другие мутации талассемии нарушают нуклеотидную последовательность, которая сигнализирует о 3′-конце расщепления и полиаденилировании мРНК β-глобина, показывая важность этого механизма процессинга РНК для здоровья и болезней.В этом обзоре основное внимание будет уделено общей роли сплайсинга при заболеваниях эритропоэза с акцентом на недавние исследования транскриптомов развивающихся эритроцитов, эффекты мутаций факторов сплайсинга, которые вызывают миелодиспластические синдромы (МДС), и текущие усилия по восстановлению нормальной экспрессии глобина в талассемии с использованием CRISPR / Cas-опосредованного редактирования генома.

Изменения транскриптома во время эритропоэза

Во время эритропоэза каждое деление клетки совпадает с основными изменениями экспрессии генов, в результате чего дочерние клетки морфологически и транскрипционно отличаются от материнской клетки 10 .Профилирование транскриптома с использованием секвенирования РНК (RNA-seq) позволило беспристрастно проанализировать изменения, происходящие на этом пути развития. 11 . Наибольшее количество изменений в экспрессии генов в эритробластах человека — повышающая или понижающая регуляция — произошло между поздней базофильной до полихромной и от полихромной до ортохроматической стадий, где примерно равное количество генов активируется и подавляется. Эти транскрипты были обогащены различными аннотированными функциями, отражающими клеточные события в процессе дифференцировки ( ), подчеркивая изменение транскрипционного ландшафта, лежащего в основе массовой экспрессии генов глобина на терминальных стадиях развития эритроидов.Напротив, когда эритробласты мышей анализировали таким же образом, подавляющее большинство генов, включая ключевые факторы транскрипции, были подавлены. Причина видоспецифических различий в изменениях транскриптомов не сразу ясна, но, вероятно, отражает различные свойства эритроцитов человека и мыши, включая различия в размере, продолжительности жизни, способности переносить кислород и метаболизме. 10 . Анализ доступности хроматина, модификаций гистонов и связывания факторов транскрипции в модели гемопоэза мышиных эмбриональных стволовых клеток выявил сложную регуляторную сеть, которая управляет изменениями транскриптома во время дифференцировки. 12 .Еще неизвестно, различаются ли эти механизмы в эритробластах человека и мыши, чтобы объяснить выраженные различия в транскриптомах.

Регуляция сплайсинга в нормальном эритропоэзе

Сплайсинг может способствовать регуляции уровней транскриптов путем активации клеточных программ, таких как NMD, для снижения уровней транскриптов. Более того, альтернативный сплайсинг приводит к экспрессии разных транскриптов и белковых продуктов из одного и того же гена. 4 . Как регуляция сплайсинга способствует разнообразию транскриптомов в развитии эритроидов? Ранняя работа с использованием микроматриц для обнаружения изменений в сплайсинге во время эритропоэза обнаружила измененное сплайсинг в известных транс-действующих факторах сплайсинга (например, SNRP70, HRNPLL и MBNL2), которые представляют собой РНК-связывающие белки, которые регулируют сборку сплайсосомы на пре-мРНК и как выбираются разные 5 ‘и 3’ SS 13 .Это указывает на регуляторную петлю обратной связи, посредством которой изменения факторов сплайсинга могут влиять на сплайсинг многих нижестоящих генов, необходимых для развития. Последующая работа была сосредоточена на выявлении специфичных для стадий изменений в сплайсинге в масштабе всего транскриптома с использованием RNA-seq, менее предвзятого подхода, который не полагается на известные границы интрон-экзон. 10 . Кроме того, картирование сетей экспрессии генов, управляемых сплайсингом при дифференцировке эритроидов, помогло определить функциональное значение регуляции сплайсинга. 14 .

Одним из первых и наиболее хорошо изученных примеров альтернативного сплайсинга при эритропоэзе является специфическое для стадии включение экзона 16 4.1R Ген, кодирующий белок, который имеет решающее значение для целостности мембраны эритроцитов. 13, г. 15 . Изменения уровней экспрессии и специфического связывания белка hnRNP A / B влияют на этот переключатель развития. 15 . С тех пор альтернативное сращивание стало более распространенным явлением. 16– 18 .Подобный мышечной слепоте белок 1 (MBNL1) представляет собой специфичный для последовательности фактор сплайсинга, который подвергается обширному альтернативному сплайсингу во время дифференцировки. 17 . Ченг и др. . показали, что специфическая изоформа Mbnl1, которая включает альтернативный экзон 5, накапливается в ядре на более поздних стадиях дифференцировки эритроидов. 17 . Изоформа включения Mbnl1 отвечает за регулирование сплайсинга нижестоящих генов, важных для дифференцировки эритроидов, поскольку нокдаун одной изоформы включения Mbnl1 блокирует дифференцировку и вызывает дефекты пролиферации.Отражая предыдущие результаты, полученные с помощью микроматриц, Pimentel и др. . сообщить о программе высокодинамичного переключения альтернативных изоформ в эритробластах человека на поздней стадии с использованием RNA-seq 19 . Повышение стационарных уровней транскриптов, содержащих PTC, которые, вероятно, запускают NMD этих транскриптов, наблюдалось на более поздних стадиях дифференцировки, предполагая, что альтернативный сплайсинг, связанный с NMD, может быть новым, специфичным для каждой стадии регуляторным механизмом гена.

Удержание интрона является регуляторным механизмом во время гематопоэза

IR представляет собой класс альтернативного сплайсинга, при котором интрон не удаляется сплайсосомой, потенциально вводя PTC и нацеливая транскрипт для NMD.Альтернативно, возможно, что определенные сохраняемые интроном транскрипты остаются в ядре и подвергаются сплайсингу с замедленной кинетикой. 20– 23 . IR только недавно был признан широко распространенным явлением. 24, г. 25 , и развивающиеся эритроидные клетки демонстрируют устойчивый ИК. Пиментель и др. . показали, что поздние эритробласты человека накапливают сотни транскриптов, содержащих сохраненные интроны, и что эти IR-транскрипты обогащены факторами сплайсинга и факторами гомеостаза железа. 26 .Эти результаты были подтверждены на одноклеточном уровне в иммортализованных клетках миелогенного лейкоза человека K562. 27 . Согласно анализу генной онтологии, тремя главными категориями ядерных IR-транскриптов были метаболизм РНК, сплайсинг РНК и сплайсосома C-комплекса. Сохраненные интроны, обнаруженные в поздних эритробластах человека, с большей вероятностью будут обнаружены рядом с альтернативными экзонами, содержащими ПТК. 26 , в соответствии с предыдущими исследованиями, предполагающими, что IR, сопровождаемый NMD, является важным механизмом, который регулирует уровни факторов сплайсинга 28 .

Как запускается ИР во время эритропоэза? Ключевые выводы получены из исследований транскриптов, кодирующих важный фактор сплайсинга ядра SF3B1. Экспрессия SF3B1 также подвержена IR во время дифференцировки эритроидов, предполагая, что регуляция SF3B1 с помощью IR может составлять регуляторный центр, ведущий к подавлению транскриптов, кодирующих другие факторы сплайсинга. 26 . Действительно, ряд высококонсервативных криптических SS был идентифицирован по их активности в продвижении IR в транскриптах SF3B1. 29 .Идентифицированных интронных последовательностей достаточно для стимулирования IR в SF3B1, а также они могут способствовать удерживанию при вставке в другие интроны. Предполагается, что криптические экзоны, генерируемые этими SS, действуют как ловушки для сплайсинга, изолируя компоненты сплайсосомы и в конечном итоге предотвращая продуктивный сплайсинг, блокируя соответствующие межинтронные взаимодействия, необходимые для определения интрона для сплайсинга. Альтернативно, пониженные уровни SF3B1 могут предпочтительно влиять на эффективность сплайсинга или период полужизни (пре-) мРНК, кодирующих факторы сплайсинга, или на то и другое.Хотя мы предполагаем, что большинство из этих случаев отражает подавление транскриптов IR, возможность того, что определенные события сплайсинга задерживаются, остается. Интересно, что задержка экспрессии генов посредством ИР физиологически актуальна для других типов клеток, включая развивающиеся сперматоциты, нейрональные клетки, тромбоциты, гранулоциты и стимулированные макрофаги. 24, г. 30– 33 . В случае дифференцировки эритроидов еще предстоит полностью понять, как интроны сохраняются, по-видимому, специфичным для стадии и типа клетки.

Неправильная регуляция сплайсинга при заболеваниях эритропоэза

Неправильная регуляция сплайсинга лежит в основе растущего числа заболеваний человека 34– 37 . Как правило, мутации цис или транс могут повлиять на результаты сплайсинга. Мутации Cis могут нарушать внутренние последовательности, которые разграничивают SS ​​в транскрипте (5 ‘и 3’ SS). Напротив, мутации в любом количестве основных сплайсосомных механизмов могут приводить к дефектам сплайсинга в транс, что вызывает вредные эффекты для большого количества нижележащих субстратов сплайсинга.Оба типа дефектов сплайсинга были охарактеризованы в эритроидной линии. 38 .

β-талассемия

β-талассемии — это семейство заболеваний, определяемых мутациями в гене β-глобина, вызывающими снижение мРНК β-глобина, недостаточную гемоглобинизацию созревающих эритроцитов и анемию 39 . β-талассемия — одно из наиболее распространенных заболеваний, вызываемых соматическими мутациями во всем мире, однако в настоящее время единственным доступным лечебным средством является аллогенная трансплантация HSPC от подходящего донора.Этот вариант недоступен для многих пациентов из-за стоимости лечения и ограниченного количества подходящих доноров. Несмотря на то, что мы обладаем достаточно глубоким пониманием молекулярных основ и патофизиологии этого заболевания, все еще крайне необходимы более эффективные методы лечения. Многие пациенты с β-талассемией зависят от переливаний крови доноров для поддержания надлежащего уровня здоровых циркулирующих эритроцитов. Однако такая терапия часто приводит к осложнениям, связанным с перегрузкой железом, включая повреждение органов.Большинство аллелей β-глобина, вызывающих талассемию, содержат точечные мутации ( ). Эти мутации могут повлиять практически на любой этап правильной экспрессии мРНК β-глобина от инициации транскрипции ( ), до стыковки ( ), к 3′-концу отщепления и полиаденилирования ( ). Из-за этого β-талассемия является привлекательной мишенью для применения инструментов редактирования генома для корректировки процессинга и экспрессии мРНК β-глобина, обеспечивая потенциальное лекарство от β-талассемии.

Рисунок 2.

Однонуклеотидные мутации в ключевых регуляторных областях гена β-глобина нарушают экспрессию при β-талассемии.

Точечные мутации в различных областях гена β-глобина показаны схематически, а частоты этих мутаций указаны в базе данных HbVar ( http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html) показаны в скобках слева. РНК-полимераза показана желтым. Генные области делятся на a ) промоутер, b ) места стыковки, c ) другие интронные области, d ) экзонов и e ) сайт полиаденилирования. Эти мутации (красные крестики) имеют различные эффекты, проиллюстрированные ниже в каждом примере, но все они приводят к снижению или отмене экспрессии транскрипта β-глобина.AS, альтернативная сварка; NMD, распад, опосредованный нонсенсом; PTC, кодон преждевременной терминации.

Сообщалось о нескольких методах восстановления экспрессии мРНК β-глобина у пациентов с β-талассемией и серповидно-клеточной анемией. 40 . Один метод, который обеспечил некоторый успех в обеспечении независимости пациентов от переливания крови, заключается в использовании лентивирусного вектора для случайной интеграции в геном копии гена β-глобина дикого типа. Однако случайная интеграция вирусного вектора сопряжена с риском нарушения других частей генома.Используя CRISPR / Cas9, исследователи смогли специфически отредактировать точечную мутацию в гене β-глобина в HSPC человека, чтобы восстановить последовательность дикого типа. 41 . Что немаловажно, они также смогли специально обогатить редактируемые ячейки. Обогащение является препятствием для этих типов подходов к редактированию генома, поскольку отредактированные HSPC должны быть расширены. ex vivo перед переливанием обратно пациенту. Аналогичный прогресс был достигнут с использованием CRISPR / Cas9 для редактирования HSPC, чтобы исправить единственный нуклеотид, вызывающий серповидно-клеточную анемию. 42 .Альтернативно, некоторые подходы к редактированию генома нацелены на редактирование дистальных регуляторных областей для увеличения экспрессии гемоглобина плода, происходящего из гена γ-глобина, который обычно отключается сразу после рождения; при экспрессии во взрослых клетках γ-глобин может компенсировать недостаток функционального β-глобина. 40, г. 43, 44 . Благодаря достижениям в эффективности редактирования и ex vivo , редактирование генов обещает вскоре стать возможным лечением β-талассемии и других генетически кодируемых заболеваний крови.

Миелодиспластические синдромы

МДС характеризуются неэффективным эритропоэзом и предрасположенностью к развитию острого миелолейкоза, несмотря на широкую фенотипическую гетерогенность 45– 47 . Недавно сообщалось о рекуррентных мутациях, связанных с МДС, в основных сплайсосомных белках. 48– 52 . Хотя эти белки участвуют в нормальном сплайсинге пре-мРНК, эти мутантные аллели MDS могут давать различные результаты при аберрантном сплайсинге. Забавно представить, как мутации в основных факторах сплайсинга, которые осуществляют сплайсинг в каждой ткани тела, вызывают злокачественные новообразования, особенно в родословной. 53, г. 54 .Кроме того, неизвестно, каким образом эти неоморфные аллели обеспечивают преимущество мутантным клеткам для управления лейкемогенезом. Аллели MDS во всех случаях являются взаимоисключающими между факторами сплайсинга, и пораженная ткань всегда гетерозиготна. 35, г. 48 . Наиболее часто встречающиеся мутации фактора сплайсинга, связанные с МДС, обнаруживаются в белках SF3B1, U2AF и SRSF2 ( ), а мутации реже встречаются в других факторах сплайсинга (ZRSR2, U2ASF65, PRP40B и SF1) 48 .Аллели MDS вызывают неперекрывающиеся паттерны альтернативного сплайсинга, предполагая, что сложный механизм аберрантного сплайсинга способствует MDS или же прогрессированию болезни способствует альтернативная активность этих РНК-связывающих белков, не связанных со сплайсингом. 55 .

Рисунок 3.

Драйверные мутации при миелодиспластических синдромах вносят изменения одной аминокислоты в основные факторы сплайсинга.

Соматические мутации в общих факторах сплайсинга U2AF1, SRSF2 и SF3B1 участвуют в миелодиспластических синдромах.Хотя эти белки участвуют в распознавании последовательностей сайтов сплайсинга во всех пре-мРНК, тканеспецифические дефекты сплайсинга наблюдаются в клетках крови. Эти мутации приводят к аберрантному сплайсингу в эритробластах в широком диапазоне транскриптов. ESE, энхансер экзонного сплайсинга; СС, сайт стыковки.

SF3B1

SF3B1 является важным компонентом U2 snRNP, который связывает последовательность точки ветвления интрона (BPS) во время сборки сплайсосомы и помогает идентифицировать SS, которые используются в катализе.Мутации SF3B1 обычно связаны с заболеванием, и наиболее частым точечным мутантом, обнаруживаемым при подтипах МДС, является SF3B1 K700E 49, г. 56– 59 . Мутации, обнаруженные в MDS, способствуют распознаванию неконсенсусных BPS и активируют загадочные 3′-SS. 60– 62 ; однако механизм того, как измененный выбор сплайсинга приводит к гематологическому злокачественному новообразованию, все еще обсуждается. В CD34 + клеток пациентов с мутациями SF3B1, гены, участвующие в регуляции клеточного цикла, гомеостазе железа, повреждении ДНК и процессинге РНК, нарушены. 63 .Чтобы объяснить связь между аберрантным сплайсингом и экспрессией генов, в двух исследованиях изучались данные последовательности РНК из образцов пациентов с мутантным SF3B1. 64, г. 65 . Наиболее частым событием аберрантного сплайсинга было использование загадочного 3′-SS посредством распознавания альтернативного BPS выше канонического BPS, и около половины затронутых транскриптов были мишенями для NMD. 64 . В Sf3b1 K700E «нокаутированных» мышей, наблюдалось альтернативное использование 3′-SS, а также неэффективность кроветворения. 66, г. 67 .Однако у этих мышей не развились другие фенотипы МДС, такие как кольцевые сидеробласты, наблюдаемые у людей, и это могло быть потенциально связано с различиями в механизмах заболевания у человека и мыши. Кроме того, аберрантно сплайсированные транскрипты в этих мышиных моделях показали небольшое перекрытие с изменениями, наблюдаемыми у пациентов-людей, возможно, из-за снижения сохранности последовательностей интронов между видами. Несколько исследований также изучали роль SF3B1 вне сплайсинга. Было обнаружено, что SF3B1 ассоциируется с мононуклеосомами в клетках HeLa, предпочтительно над экзонами, а ассоциация SF3B1 с хроматином влияет на сплайсинг. 68 .Однако недавняя работа Мурти и др. . также обнаружили ассоциацию SF3B1 с экзонами в хроматине, но эта ассоциация не предсказывала результаты сплайсинга. 69 . Эти результаты указывают на роль SF3B1 как модификатора хроматина.

SRSF2

SRSF2 является членом семейства белков, богатых серином / аргинином (SR), которые участвуют в регуляции отбора SS как для конститутивного, так и для альтернативного сплайсинга путем связывания энхансера экзонной последовательности. Множество доказательств подтверждают роль мутанта SRSF2 в управлении миелодисплазией, способствуя изменениям в альтернативном сплайсинге.В клеточной линии K562, экспрессирующей наиболее распространенную мутацию P95H, события альтернативного сплайсинга напрямую коррелировали с измененной способностью мутанта P95H связывать конкретный мотив РНК. 70 . SRSF2 необходим для кроветворения и Srsf2 Нокаут гена у мышей приводит к летальному исходу для эмбриона 71 . В одном исследовании было обнаружено, что мутант P95H нарушает распознавание участков энхансера экзонного сплайсинга, а в случае онкогена Ezh3 , это привело к включению токсичного экзона и снижению Еж3 расшифровка уровней 72 .Аналогичным образом было показано, что мутант P95H, экспрессируемый в клеточной линии MDS, специфически влияет на альтернативный сплайсинг генов, которые важны для развития рака и апоптоза. 71 . Эти результаты, как правило, подтверждались с помощью модели условного нокаута на мышах, чтобы смотреть на стационарные эффекты, а не в регенеративном контексте смертельно облученных мышей, как в предыдущих моделях мышей. 73 . Кон и др. . обнаружили повышенное количество случаев альтернативного сплайсинга примерно в 20% транскриптов. 73 .Однако у этих мышей было всего несколько дифференциально сплайсированных генов, которые были мишенями для NMD, и никаких изменений в экспрессии Ezh3 , подтверждая, что контекст регенеративного стресса может оказывать влияние на роль SRSF2 в продвижении аберрантного альтернативного сплайсинга. Используя методику измерения белок-РНК-взаимодействий по всему геному, было обнаружено, что SRSF2 P95H по-разному связывает альтернативные экзоны, но, что интересно, это не предсказывает результат альтернативного сплайсинга. 74 .Наиболее затронутыми генами были факторы процессинга РНК, что свидетельствует о каскадном эффекте, когда мутантный SRSF2 способствует неправильной регуляции факторов сплайсинга и, таким образом, вызывает аберрантный сплайсинг и подавление активности хозяина нижестоящих мишеней.

U2AF1

U2AF1 (также известный как U2AF35) связывается с большинством 3’SS, помогая собирающейся сплайсосоме в идентификации 3’SS, который будет использоваться во время катализа сплайсинга. Беспристрастное полногеномное секвенирование выявило мутацию S34F примерно у 9% из 150 пациентов с de novo MDS, и эта мутация способствовала пропуску экзонов в репортере минигена 75 .Данные РНК-секвенирования пациентов с той же мутацией снова показали небольшое увеличение пропускания экзонов, а нуклеотид прямо перед 3′-SS был предиктором использования экзона для сплайсинга мутантного, но не дикого типа. 76 . Эти результаты были подтверждены с использованием данных РНК-seq у 167 пациентов с острым миелоидным лейкозом, подтверждающих, что мутанты U2AF1 S34F / Y демонстрируют предпочтение CAG по сравнению с 3 ‘SS UAG, вызывая последующие аберрантные события сплайсинга. 77 . Однако в обоих этих случаях нижележащие мишени с измененным сплайсингом были переменными и не имели большого перекрытия.

Для исследования эффектов экспрессии мутанта S34F U2AF1 на животной модели, Shirai et al. разработал индуцируемую доксициклином трансгенную мышь, несущую аллель миелоидных, лимфоидных, стволовых и клеток-предшественников. 78 . После трансплантации трансгенного костного мозга смертельно облученным мышам общее количество лейкоцитов в периферической крови снизилось, как и в случае В-клеток и моноцитов. 78 . Однако не было изменений в количестве эритроцитов или тромбоцитов, и у мышей не было доказательств дисплазии костного мозга, и у них не развился МДС или острый миелоидный лейкоз после одного года трансгенного лечения. U2af1 S34F выражение.Путем анализа последовательностей транскриптомов миелоидных предшественников от индуцированных трансгенных мышей они идентифицировали 742 случая альтернативных соединений сплайсинга, и в основном это были альтернативные использования 3′-SS с обогащением 3′-SS-последовательностью CAG по сравнению с UAG в контроле дикого типа. Наконец, в попытке связать измененные паттерны сплайсинга с причиной миелоидного заболевания, Парк и др. . производные линии клеток с мутацией S34F и показали, что, помимо аберрантного альтернативного сплайсинга, многие транскрипты поочередно процессируются на 3′-конце, в частности, за счет использования дистального сайта расщепления и полиаденилирования. 79 .Они показывают, что одна такая альтернативно обработанная стенограмма, Atg7 , вызывает дефект аутофагии, который может объяснить, как изменения в сплайсинге и процессинге РНК могут управлять онкогенными трансформациями. Пациенты с МДС, несущие мутацию S34F, имели повышенный уровень Atg7 мРНК с дистальным сайтом расщепления и полиаденилирования. Важно отметить, что авторы показывают, что использование дистального сайта приводит к репрессии трансляции и что соответствующее снижение уровней белка ATG7 достаточно для трансформации клеток.

Недавнее открытие факторов сплайсинга как часто мутирующих белков при МДС было неожиданным. Хотя эти мутации влияют на белки общим путем, результатом в каждом случае является отдельный образец измененного сплайсинга. Кроме того, эти мутации связаны с различными прогнозами и подклассами МДС. SF3B1 тесно связан с фенотипом кольцевых сидеробластов и имеет относительно положительный прогноз, тогда как U2AF1 и SRSF2 связаны с более распространенным миеломоноцитарным лейкозом и с худшими исходами. 52 .Один объединяющий механизм, предложенный Ченом et al. заключается в том, что, хотя мутации в факторах сплайсинга вызывают явные дефекты сплайсинга, они вызывают общий стресс репликации, вызывая повышенное образование R-петли. 80 . Авторы показывают, что увеличение количества R-петель нарушает кроветворение и что разрешение R-петель за счет сверхэкспрессии РНКазы H частично предотвращает пролиферацию. Это интригующий механизм, с помощью которого факторы сплайсинга могут играть вспомогательные роли в регуляции транскрипции.Они предполагают, что это нарушение стабильности генома может быть общим механизмом, который делает более вероятным прогрессирование более тяжелых фенотипов заболевания при сосуществовании других мутаций. Было высказано предположение, что удерживаемые интроны действуют как субстраты для образования R-петли, способствуя нестабильности генома и повреждению ДНК в случае тяжелой спинальной мышечной атрофии. 81 . Потребуется дополнительная работа, чтобы понять вклад как сплайсинга, так и дефектов геномной стабильности мутантных аллелей факторов сплайсинга на МДС.

Было высказано предположение, что мутации в нескольких других РНК-связывающих белках вносят вклад в неправильную регуляцию сплайсинга во время эритропоэза. Например, было показано, что RBM38 регулирует альтернативный сплайсинг в терминальном эритропоэзе, специфически активируя включение экзона 16 4.1R расшифровка 82 , знаковое альтернативное мероприятие по сращиванию при разработке RBC (см. Выше). Встречающиеся в природе варианты экспрессии RBM38 у человека были обнаружены посредством высокопроизводительного скрининга ассоциативных исследований в масштабе всего генома и подтверждены, чтобы показать изменения в подмножестве генов, которые альтернативно сплайсируются во время терминального эритропоэза. 83 .Интересно, что было дополнительно показано, что RBM38 взаимодействует с eIF4G в цитоплазме для усиления трансляции субнабора мРНК при терминальной дифференцировке. 84 . Более того, альтернативно сплайсированная изоформа репрессора транскрипции GFI1B, продуцируемая естественным вариантом, вызывает дефекты мегакариопоэза, но не эритропоэза, предполагая, что вариации среди людей могут играть роль в динамике развития. 85 . Будущие исследования должны пролить свет на дальнейшие связи между альтернативным сплайсингом, транскрипцией и трансляцией во время гематопоэза.

Выводы

Эритропоэз представляет собой отличную модель для изучения сплайсинга РНК как в здоровом, так и в болезненном состоянии. Недавние работы по выявлению альтернативных вариантов сварки 19 и ИК 26, г. 29 в качестве основных регуляторных механизмов, связанных с дифференцировкой, без сомнения, даст представление о сложности того, как тканеспецифические изменения в сплайсинге передаются, чтобы влиять на экспрессию генов. Мутации, затрагивающие основные сплайсосомные белки (SF3B1, U2AF1 и SRSF2), а также гены, важные для функции зрелых эритроцитов (например, β-глобин), выявили аберрантный сплайсинг, который приводит к затрудненному эритропоэзу, часто неожиданным образом.В частности, многообещающие методы лечения МДС основаны на модуляции сплайсинга как на механизме целенаправленного воздействия на дефектный сплайсинг в миелоидном клоне. 86– 88 . Остается много вопросов относительно того, как мутации в повсеместных факторах сплайсинга специфически вызывают дефекты миелоидного клона и каков молекулярный механизм того, как нижестоящие мишени этих альтернативно сплайсированных транскриптов вносят вклад в прогрессирование заболевания.

Сокращения

BPS, последовательность точек ветвления; HSPC, гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники; IR — удержание интрона; MBNL1, белок 1, подобный мышечным слепым; МДС, миелодиспластический синдром; NMD, распад, опосредованный нонсенсом; PTC, кодон преждевременной остановки; Эритроциты, эритроциты; RNA-seq, секвенирование РНК; SS, сайт сращивания

Благодарности

Мы благодарим Стефани Хален и Маноджа Пиллаи за многие плодотворные обсуждения и Такера Карроччи за помощь с рисунками и комментариями к рукописи.

Примечания

[версия 1; рецензенты: 3 одобрены]

Заявление о финансировании

Наша работа была поддержана Национальным институтом диабета, болезней органов пищеварения и почек в рамках гранта U54DK106857 и Национальным институтом сердца, легких и крови в рамках гранта R01HL133406. Его содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Кирстен. А. Реймер получает стипендию для получения докторской степени от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады.

Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Примечания

Редакционная заметка о процессе проверки

Обзоры факультетов F1000 заказываются членами престижной F1000 Faculty и редактируются как услуга для читателей. Чтобы сделать эти обзоры как можно более полными и доступными, рецензенты вносят свой вклад перед публикацией, и публикуется только окончательная, исправленная версия.Рецензенты, одобрившие окончательную версию, перечислены с их именами и принадлежностью, но без их отчетов по более ранним версиям (любые комментарии уже будут учтены в опубликованной версии).

Рецензенты, одобрившие эту статью:

  • Карлес Сунье , Отдел молекулярной биологии, Институт паразитологии и биомедицины Лопес-Нейра, Гранада, Испания

    Информация о конкурирующих долях участия не раскрыта.

  • Джон Дж. Конбой , Биологические системы и инженерия, Национальная лаборатория Лоуренса Беркли, Беркли, США

    Информация о конкурирующих долях участия не раскрыта.

  • Виджай Г. Шанкаран , Отделение гематологии / онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Гарвардская медицинская школа, Бостон, США

    Информация о конкурирующих долях участия не раскрыта.

Ссылки

1. Grosveld F, van Assendelft GB, Greaves DR, et al. : Позиционно-независимая, высокая экспрессия гена бета-глобина человека у трансгенных мышей. Cell. 1987. 51 (6): 975–85. 10.1016 / 0092-8674 (87)

-8 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5.Конкель Д.А., Тилгман С.М., Ледер П. Последовательность главного гена хромосомного бета-глобина мыши: гомология сайтов кэппинга, сплайсинга и поли (А). Cell. 1978. 15 (4): 1125–32. 10.1016 / 0092-8674 (78)

-5 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Лернер М.Р., Бойл Дж.А., Маунт С.М. и др. : Участвуют ли snRNP в сплайсинге? Природа. 1980. 283 (5743): 220–4. 10.1038 / 283220a0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Макват Л.Е., Киннибург А.Дж., Бич Л.Р. и др. : Обработка предшественника мРНК бета-глобина человека в мРНК является дефектной у трех пациентов с бета + -талассемией. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980. 77 (7): 4287–91. 10.1073 / pnas.77.7.4287 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Chang JC, Temple GF, Trecartin RF и др. : Подавление нонсенс-мутации при гомозиготной бета 0 талассемии. Природа. 1979. 281 (5732): 602–3. 10.1038 / 281602a0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Maquat LE, Kinniburgh AJ, Rachmilewitz EA, et al. : Нестабильная мРНК бета-глобина при недостаточности мРНК бета-талассемии. Cell. 1981; 27 (3 Pt 2): 543–53.10.1016 / 0092-8674 (81)

-2 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Ямамото М.Л., Кларк Т.А., Джи С.Л. и др. : Альтернативные переключатели сплайсинга пре-мРНК модулируют экспрессию генов в позднем эритропоэзе. Кровь. 2009. 113 (14): 3363–70. 10.1182 / кровь-2008-05-160325 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Хоу В.К., Лерш Р., Джи С.Л. и др. : Снижение экспрессии hnRNP A / B во время эритропоэза опосредует переключение сплайсинга пре-мРНК. EMBO J. 2002. 21 (22): 6195–204.10.1093 / emboj / cdf625 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Ченг А.В., Ши Дж., Вонг П. и др. : Muscleblind-like 1 (Mbnl1 ) регулирует альтернативный сплайсинг пре-мРНК во время терминального эритропоэза. Кровь. 2014. 124 (4): 598–610. 10.1182 / кровь-2013-12-542209 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Вонг ACH, Rasko JEJ, Wong JJ: Переходим к работе: альтернативный сплайсинг при нормальном и злокачественном миелопоэзе. Лейкемия. 2018; 32 (5): 1081–93.10.1038 / с41375-018-0021-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Boothby TC, Zipper RS, van der Weele CM и др. : Удаление сохраненных интронов регулирует трансляцию в быстро развивающемся гаметофите Marsilea vestita . Dev Cell. 2013; 24 (5): 517–29. 10.1016 / j.devcel.2013.01.015 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] Рекомендация F1000 23. Mauger O, Lemoine F, Scheiffele P: Целенаправленное удержание и удаление интронов для быстрой регуляции генов в ответ на нейрональную активность. Neuron. 2016; 92 (6): 1266–78. 10.1016 / j.neuron.2016.11.032 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] Рекомендация F1000 25. Брауншвейг У., Барбоса-Мораис Н.Л., Пан К. и др. : Широко распространенное удержание интронов у млекопитающих функционально настраивает транскриптомы. Genome Res. 2014. 24 (11): 1774–86. 10.1101 / гр.177790.114 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Abdelmoez MN, Iida K, Oguchi Y, et al. : SINC-seq: корреляция временных экспрессий генов между ядром и цитоплазмой отражает физиологию отдельной клетки. Genome Biol. 2018; 19 (1): 66. 10.1186 / s13059-018-1446-9 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Фаустино Н.А., Купер Т.А.: Сплайсинг пре-мРНК и болезнь человека. Genes Dev. 2003. 17 (4): 419–37. 10.1101 / gad.1048803 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Хан Ч.Н., Венугопал П., Скотт Х.С. и др. : Мутации фактора сплайсинга и альтернативный сплайсинг как движущие силы злокачественных опухолей кроветворения. Immunol Rev. 2015; 263 (1): 257–78. 10.1111 / imr.12241 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 43.Антониани К., Менегини В., Латтанци А. и др. : Индукция синтеза гемоглобина плода посредством CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования локуса β-глобина человека. Кровь. 2018; 131 (17): 1960–73. 10.1182 / кровь-2017-10-811505 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] Рекомендация F1000 45. Шаллис Р.М., Ахмад Р., Зейдан А.М.: Генетический и молекулярный патогенез миелодиспластических синдромов. Eur J Haematol. 2018. 10.1111 / ejh.13092 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Пеллагатти А, Боултвуд Дж .: Молекулярный патогенез миелодиспластических синдромов. Eur J Haematol. 2015; 95 (1): 3–15. 10.1111 / ejh.12515 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 47. Уолтер М.Дж., Шен Д., Шао Дж. И др. : Клональное разнообразие рекуррентно мутировавших генов при миелодиспластических синдромах. Лейкемия. 2013. 27 (6): 1275–82. 10.1038 / leu.2013.58 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 49. Хаферлах Т., Нагата Ю., Гроссманн В. и др. : Пейзаж генетических поражений у 944 пациентов с миелодиспластическими синдромами. Лейкемия. 2014; 28 (2): 241–7.10.1038 / leu.2013.336 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Иноуэ Д., Брэдли Р.К., Абдель-Вахаб О. Мутации сплайсосомных генов при миелодисплазии: молекулярные связи с клональными аномалиями кроветворения. Genes Dev. 2016; 30 (9): 989–1001. 10.1101 / gad.278424.116 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 51. Шукла Г.К., Сингх Дж.: Мутации факторов сплайсинга РНК при гематологических злокачественных новообразованиях. Cancer Lett. 2017; 409: 1–8. 10.1016 / j.canlet.2017.08.042 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 52. Макисима Х., Висконте В., Сакагучи Х. и др. : Мутации в аппарате сплайсосом, новый и повсеместный путь лейкемогенеза. Кровь. 2012. 119 (14): 3203–10. 10.1182 / кровь-2011-12-399774 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 54. Папаэммануил Э., Герстунг М., Мальковати Л. и др. : Клинические и биологические последствия мутаций драйвера при миелодиспластических синдромах. Кровь. 2013. 122 (22): 3616–27; Виктория 3699.10.1182 / кровь-2013-08-518886 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 57. Папаэммануил Э., Каццола М., Боултвуд Дж. И др. : Соматическая мутация SF3B1 при миелодисплазии с кольцевыми сидеробластами. N Engl J Med. 2011; 365 (15): 1384–95. 10.1056 / NEJMoa1103283 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 58. Кесада В., Конде Л., Вилламор Н. и др. : Секвенирование экзома выявляет повторяющиеся мутации гена фактора сплайсинга SF3B1 при хроническом лимфолейкозе. Nat Genet. 2011; 44 (1): 47–52. 10,1038 / нг.1032 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 62. Тан К., Родригес-Сантьяго С., Ван Дж. И др. : Мутации HEAT-мотива SF3B1 / Hsh255 влияют на взаимодействие со сплайсосомной АТФазой Prp5, что приводит к изменению селективности сайтов разветвлений при сплайсинге пре-мРНК. Genes Dev. 2016; 30 (24): 2710–23. 10.1101 / гад.2

.116 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] Рекомендация F1000 63. Долатшад Х., Пеллагатти А., Фернандес-Меркадо М. и др. : Нарушение SF3B1 приводит к нарушению регуляции экспрессии и сплайсингу ключевых генов и путей в гемопоэтических стволовых стволовых и клетках-предшественниках миелодиспластического синдрома. Лейкемия. 2015; 29 (8): 1798. 10.1038 / leu.2015.178 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 64. Дарман Р.Б., Зайлер М., Агравал А.А. и др. : Связанные с раком мутации горячих точек SF3B1 вызывают выбор места для криптографии 3 ‘за счет использования другой точки разветвления. Cell Rep. 2015; 13 (5): 1033–45. 10.1016 / j.celrep.2015.09.053 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] Рекомендация F1000 67. Обенг Э.А., Чаппелл Р.Дж., Сейлер М. и др. : Физиологическое проявление Sf3b1 K700E Вызывает нарушение эритропоэза, аберрантное сплайсинг и чувствительность к терапевтической модуляции сплайсосом. Cancer Cell. 2016; 30 (3): 404–17. 10.1016 / j.ccell.2016.08.006 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] Рекомендация F1000 68. Кфир Н., Лев-Маор Г., Глайх О. и др. : Ассоциация SF3B1 с хроматином определяет результаты сплайсинга. Cell Rep. 2015; 11 (4): 618–29. 10.1016 / j.celrep.2015.03.048 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 69. Мурти Т., Блюмн Т., Гупта А.К. и др. : Циклинзависимая киназа 1 (CDK1) и CDK2 играют противоположные роли в регулировании взаимодействий фактора сплайсинга 3B1 с хроматином. J Biol Chem. 2018; 293 (26): 10220–34. 10.1074 / jbc.RA118.001654 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 71. Комено Й., Хуанг Й. Дж., Цю Дж. И др. : SRSF2 необходим для гемопоэза, и его мутации, связанные с миелодиспластическим синдромом, нарушают регуляцию альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Mol Cell Biol. 2015; 35 (17): 3071–82. 10.1128 / MCB.00202-15 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 75. Грауберт Т.А., Шен Д., Дин Л. и др. : Рецидивирующие мутации в U2AF1 Фактор сплайсинга при миелодиспластических синдромах. Nat Genet. 2011; 44 (1): 53–7. 10.1038 / нг.1031 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 76. Przychodzen B, Jerez A, Guinta K и др. : Паттерны неправильного повторения из-за соматических мутаций U2AF1 в миелоидных новообразованиях. Кровь. 2013; 122 (6): 999–1006. 10.1182 / кровь-2013-01-480970 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 78. Shirai CL, Ley JN, White BS и др. : Экспрессия мутанта U2AF1 изменяет гемопоэз и сплайсинг пре-мРНК В естественных условиях . Cancer Cell. 2015; 27 (5): 631–43. 10.1016 / j.ccell.2015.04.008 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 82. Хайнике Л.А., Набе Б., Шен С. и др. : РНК-связывающий белок RBM38 (RNPC1) регулирует сплайсинг во время поздней дифференцировки эритроидов. PLoS One. 2013; 8 (10): e78031. 10.1371 / journal.pone.0078031 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 84. Альварес-Домингес-младший, Чжан X, Ху В.: Широко распространенный и динамичный трансляционный контроль развития красных кровяных телец. Кровь. 2017; 129 (5): 619–29. 10.1182 / кровь-2016-09-741835 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 85. Полфус Л.М., Хаджурия Р.К., Шик У.М. и др. : Секвенирование всего экзома выявляет локусы, связанные с признаками клеток крови, и выявляет роль альтернативы GFI1B Варианты сплайсинга в гемопоэзе человека. Am J Hum Genet. 2016; 99 (3): 785. 10.1016 / j.ajhg.2016.08.002 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

вампиров против Бронкса (2020) Сценарий фильма

Группа молодых друзей из Бронкса борется за спасение своего района от джентрификации…и вампиры.

— Спокойной ночи.
— Спасибо.

Ох, входите.

Спасибо вам большое за то, что зажали меня.

О, конечно.

Я так счастлив, что нашел это место.

— Я только что переехал сюда.
— В Нью-Йорк?

Нет, в Бронкс.
Я получил цену вне моего старого района.

О, я вас слышу.
Здесь происходило то же самое.

Знаете, мне
предложили дурацкую сумму денег за мой салон.

— Агх.
— Ага, вот и забрал.

Эй! Ух ты, здорово.

Фактически, это последний манифест Бекки.

Этот толкатель для кутикулы
вот-вот прекратит работу… сейчас.

Это лучший маникюр, который у меня когда-либо был.
Не продавайте.

Добрый вечер. Фрэнк Полидори.

Уже поздно.

Мы заканчиваем
всю бумажную работу сегодня вечером.

— Давай, Фрэнк. Пойдем.
— Давай.

А теперь прямо здесь.

Хорошо.И… отлично.

Теперь у вас есть деньги
для вас и вашего мужа,

— если вы хотите …
— Ааа.

Я не женат, Фрэнк.
У меня тоже нет парня.

— Мне не нужен мужчина, чтобы знать меня.
— Конечно, нет.

Значит, это только ты.

Да, это только я.

Что ж, Бекки,
, давай отправимся в пригород.

Да!

Ты тоже можешь иногда приходить, если хочешь.
Вы можете прийти в гости.

Конечно буду.

— Вот и все?
— Мм-хм.

Ага, уезжаю в Подмосковье!

Стреляй! Стрелять!

Привет, маленький мэр!

Эй, Lil Mayor, как дела?

— Эй, как дела, Карл? Рад вас видеть.
— Что такое, малыш?

— Идете на вечеринку блока?
— Вы это знаете!

Как дела, Перес?

Как дела, папочка?

Вы знаете, в чем дело!

Что такое, вы все?
Это твоя девушка Глория, живая,

в этот прекрасный 95-градусный день,

но поверьте мне, это не пот.
Это свечение. Возьми.

Мигель!

Лето почти закончилось,
, так что не забудьте выйти за пределы

и поймать этот загорелый
, пока можете, вы слышали?

О, и если вы видите ребенка, который едет на
на велосипеде, на два размера больше для него,

, это всего лишь Лил Майор, пытающийся
спасти район в одиночку.

А, кстати говоря,
о спасении района,

, что там
со всеми этими листовками о пропавших без вести?

Я думал, что эта новая конструкция
должна сделать его более безопасным.

Есть о чем подумать, вы все.

Бобби!

Lil Cool, где ты был, чувак?

Плакаты для развешивания. Я сейчас уйду.

Что ты думаешь, Тони?

— Выглядит хорошо, братан. Вы хороший художник.
— Спасибо.

Послушайте, я ценю
то, что вы пытаетесь сделать,

— но если быть правдой…
— Нет, не говори так. Это сработает.

— Хорошо, Маленький мэр. Мм-хм.
— Вот увидишь.

Человек…

ты когда-нибудь захочешь избавиться
от этой летучей мыши Сэмми Соса,

дай мне знать.

Братан, не могли бы вы попросить
короля Артура о его мече?

Отпустить? Это барахло отправляется на eBay
после того, как меня отключили.

Можете поставить это на мою вкладку?

И это на твоей вкладке.

Да, я уже знаю.

— Не волнуйтесь. Я верну тебе деньги.
— Конечно. Вперед, продолжать.

— Что ты делаешь, Мигель? Выходи наружу.
— Бобби, что хорошего, братан?

— Тони. Как дела?
— Попадая в беду?

Нет.

— Убирайся отсюда.
— Пока.

Позже, брат.

Нам пора, Бобби.

Луис ждет, и я получил
еще кучу плакатов, которые нужно повесить.

— Привет, Рита.
— Что случилось, Маленький мэр?

А, да.

Ребенок пытается продолжить игру. Бьюсь об заклад,
пива, он вылит. Смотри.

Мигель, я рассказывал этим дамам

о той вечеринке
, которую мы устраивали в пятницу вечером.

Ср?

Да, ваш мальчик сказал
, что собирался соединить нас

с некоторыми VIP-пропусками.

VIP? Какой VIP?

Рита, пошли. Я закончил с этими детьми.

Йоу, Маленький мэр, я хочу оставить себе пиво!

Эй, подожди!

Гм, я посмотрю насчет VIP. Просто…

внести что-то в фонд винного погреба.
Это важно для общества.

Вы все обожаете это место.

Да, в основном мы там выросли.

Итак …

увидимся там?

Мигель!

Не приходи домой поздно.

Это твоя мама?

Нет.

Почему ты меня игнорируешь?

Кажется, она тебя знает.

Нет, это просто случайная леди.

Сегодня я работаю допоздна. Вы уверены, что
, вы не хотите, чтобы я вызывала няню?

Йо.

И ударь тройку!

Малыш, тебя нет.

Давай пивом, детка. Выпей это пиво.

Эй, мы должны пригласить тех девчонок
, чтобы они пришли на вечеринку.

Бру, они вроде 16.
Они нас не чувствовали.

Они бы почувствовали нас
, будь у нас немного денег, чувак.

— Мы бы не выглядели такими разоренными.
— Эй, что это за хрень?

— Еще один.
— У них тоже есть Бекки.

Эй, держу пари, ей чертовски заплатили, мужик.

Все обналичивают.

Все дело в том, чтобы получить
макиато и джелато.

Угу.

Эти парни из Мурнау
жуют наш район.

Что это было?

— Вы что-нибудь видите?
— Ничего.

— Эй, давай, чувак.
— Холод.

Ты сейчас по-настоящему?

— Просто темно.
— Вы можете показать мне?

— Ага!
— Блин, девочка. Что за черт?

Что с тобой?
Вы чуть не устроили нам сердечный приступ.

— Вот как стреляют в капюшон.
— Вы никого не стреляете, Малый мэр.

— Бобби, с другой стороны…
— Заткнись, Глория.

— Знаешь, что случилось с Бекки?
— Она окунулась. Ага.

Получил хорошие деньги и ушел отсюда,

и теперь мы получаем
вкусных капучино за девять долларов.

Нравится…

— Вы живете сейчас?
— Двадцать девятьсот подписчиков,

— что тут нового, GloTV?
— Эй! Блочная вечеринка, вечер пятницы.

— Десять приемов …
— Убирайся отсюда, ботаник.

Эй, Дрейк будет там.

— Знаешь, о чем я говорю?
— Дрейк?

Ага. Дрейк будет там
с тобой в пятницу вечером!

Не слушайте этих дураков.

Дрейк никуда не пойдет
рядом с этой группой.Карди тоже.

Это твоя девушка Глория подписывает контракт. Возьми.

Йоу!

Наконец. Я ждал час.

Relax, Тампа.

Нет, не начинай с этого.
Вы знаете, я не хотел уходить.

Не вижу ребенка полгода,
вот как он говорит привет. Бац!

Ну-ну-ну.

Привет, отец Джексон. Как дела?

Луис.

Я вижу, в хорошей компании.

«Не вступайте на путь злых,
и не ходите путем злых людей.

— Так драматично.
— Мигель …

Ладно, Бобби попал в несовершеннолетнюю,

мелкую ссору по биологии и …

— Отец Джексон выгнал его из школы.
— Тебя выгнали?

— Дэймон начал это.
— Ты только сейчас мне говоришь?

Мы не хотели, чтобы ты волновался.

Послушай, ты слишком беспокоишься.
Я имею в виду, посмотри на себя.

Ты ест вашу руку

Вот и все. Наконец-то это произошло

Я не в команде.

Теперь все по-другому.
Мигель политик.

Голос Бобби внезапно изменился.

Теперь он звучит как Дензел.

Готов поспорить, у тебя даже на ногах волосы.

Ага.

Кто это?

Как дела, ребята?

Бобби, я от тебя ничего не слышал.
Мы это делаем, что ли?

Нет. Я сейчас в порядке.

Хорошо.
Вы передумали, дайте мне знать.

Эй, эй, эй, йоу.

Это мило, сынок.Какого они размера?

Ээ… девять.

Это немного сложно,
, но я думаю, что мы можем заставить это работать.

— На самом деле, может, восемь с половиной.
— Давай.

— Просто оставьте его в покое.
— Никто с тобой не разговаривает.

Я говорю
пуэрториканцу Гарри Поттеру.

Оставь его, Слим.
Хорошо, мальчики. Увидимся.

Ах, из-за этого стресса
мой сахар в крови сходит с ума.

— О чем все это было?
— Луис, ты действительно заставляешь нас выглядеть мягкими.

Бобби?

Хенни попросил меня кое-что сделать.
Я сказал нет. Вот и все.

Забудем об этом.

Луис, мне жаль, что я скучал по тебе.

Давай.

— Готовы?
— Ага.

— Слушай. Я немного плюну.
— Хорошо.

— Хорошо?
— Хорошо.

— Нет. Нет. Плохо.
— О боже!

Мне очень жаль. Простите.

Вы, должно быть, заблудились.

Нет, я только что переехал сюда.

В Бронкс?

Да. Почему все так говорят?

О, я знаю. Ты думаешь, я собираюсь, типа

,

позвонить в полицию и сказать, что это слишком громко,
, но это не я.

Я хочу познакомиться со своими соседями.
Я Вивиан.

Мигель Мартинес. Рад встрече.

Вы должны прийти
на нашу вечеринку в пятницу вечером.

Мы собираем деньги на винный погреб Тони.

Арендодатель поднял арендную плату,
, поэтому мы пытаемся помочь.

Вот флаер.

О, черт возьми. Вот это да.

Дайте мне еще листовки,

, и я могу раздать их своим соседям,
, и мы оставим этот винный погреб открытым.

— Получите связку. Спасибо. Это значит многое.
— Хорошо.

Cool. Что ж, было приятно познакомиться.

Ты тоже. Приятно познакомиться.

Ты же знаешь, что она вызовет полицию, верно?

Никто не говорит, что они не позвонят в службу
, если только они не позвонят в полицию.

— Ты параноик, чувак.
— Давай.

— Поехали.
— Эта белая женщина — плохие новости.

— Йо. Проверьте здание суда.
— Что случилось с этим красным светом?

Превращают в квартиры?

Вы все знаете, как это начинается.
Эти белые люди с холщовыми сумками?

Это всегда первый знак.

Это были те же парни, которые забрали и Бекки.

— Вы получили это для этих парней, а?
— Ага.

Вы поможете мне
развесить эти плакаты, что ли?

Наш мальчик вернулся в город
, чтобы сбежать из ада, которым является Тампа,

и мы собираемся переночевать
, развешивая плакаты за безнадежное дело?

Безнадежная причина? Это не безнадежное дело.

Делай свое дело.

Луис. Xbox у Тони?

Делай, что хочешь.

Давай. Все будет хорошо. Пойдем.

Ух ты!

Извините!

— Что за …?
— Извини!

Маленький мэр тебя испортил.

Йоу, мужик. Это не смешно!
Эй, я тебя убью!

Педаль жесткая, Lil Mayor. Он с ума сошел!

Я тебя позже пойму.

Лучше берегись.

Привет. Что ты здесь делаешь, братан?

Йо, Гамильтон.

Вы потеряли что ли?

Просто гуляю.

Эй, во что ты, черт возьми, одет?

Это?

Жакет с ручной вышивкой в ​​стиле Прекрасной эпохи
.

Большое спасибо.

Не сказал, что понравилось.

Эй, остановись, Моцарт.

Слишком поздно сопротивляться.

Мы уничтожим вас

, как паразитов, которыми вы являетесь.

Бля!

Оххх.

— Позорить вас в собственном доме.
— Братан, это буйный контрабандист.

— Сделано в Узбекистане или что-то в этом роде.
— Неважно.

Где Мигель?

Кто знает, мужик? Этот чувак ведет себя как сумасшедший.

Он не сумасшедший. Он просто страстный,
с большими идеями. Тебе известно?

Он плыл! О мой Бог.

Он парил,

и … а потом он убил Слима!

Эй, вы понимаете, о чем я?

В воздухе, как… как… как…
а потом он укусил его клыками,

как будто он был каким-то, эээ…

Вперед! Получать! Получать! Получать!

Эй, какого черта, мужик?

Добро пожаловать в Primo Bodega.

Чем могу вам помочь?

Просто смотрю.

Какой прекрасный винный погреб.

Ага. Знаешь, мне нравится содержать его в чистоте.

Вы отсюда?

— Новое в районе.
— Хорошо.

Чем вы занимаетесь по работе?

Недвижимость.

Мурнау Недвижимость.

Подождите.

Ач.

Вот оно.

Дезинфицирующее средство для рук. Ага.

Это грязный капюшон, братан.
Четыре пятьдесят.

Оставьте сдачу себе.

Йо.

У нас есть вампиры в Бронксе.

Там ничего нет, тупица.

— Что?
— Да, иди проверь.

Что?

Нет, он был там.

Он был… он был… он был здесь.

— Я знал, что ты лжешь.
— Я, черт возьми, видел, как он кусал его в воздухе.

— Вы тоже это видели в зеркале.
— Я не знаю.

Хорошо? У меня низкий уровень сахара в крови.

Моим глазам нельзя доверять.

И лет, это зеркало чертовски грязное.

Мое зеркало?

— У вас есть деньги на новое зеркало?
— Посмотри…

Во-вторых, мой отец подарил мне
то зеркало, когда он открывался еще в 1978 году.

Мне жаль, что я обидел твое зеркало.

— Слушай. Вампир убил его.
— Мой дедушка приехал в …

Надо кому-нибудь рассказать.

Никого не волнует, что Слим исчез.

Почему? Потому что он бандит?

Нет, дружище.
Потому что он из Бронкса, как и мы.

Эй, позволь мне отвезти тебя домой.

Уже поздно, ты подслушиваешь,

, и твоя мать будет выкрикивать
твою задницу и мою задницу. А я взрослый мужчина,

, и я не могу наносить
чанклетазо в лицо.

Хорошо? Стыдно.
Пойдем отсюда.

Вы думаете, что командир
будет доволен?

Он приносит сюда тела, мистер Маркус,

, когда он знает, что нам нужно все имущество, приобретенное
, не вызывая подозрений…

Заткнись, Фрэнк.

Да, сэр.

Восход солнца.

Давайте вернемся внутрь.

Разберись с телом, Фрэнк.

Что тут нового?
Это твоя девушка Глория, живая,

, и я надеюсь, ты приготовила рогалики,
, потому что я подаю чай. Возьми.

Бекки, которая использовала
моих ногтей на 165, ушла.

Чувак, который продавал эмпанада
в Зале, ушел.

Я не знаю, что происходит,
, но послушай меня,

спи с одним открытым глазом,
и не получишь.Возьми.

Привет.

А?

Ага.

— Во сколько вы были вчера вечером?
— Я думаю о девятке.

Ой, это забавно, потому что я был дома,

бодрствовал после этого,
, а тебя здесь не было.

О.
Вы говорили о прошлой ночи.

Гм…

Я … там были эти старушки,

эти, ммм, слепые старушки.

Тони мне все рассказал.

Все, все?

Я всегда на шаг впереди вас.

Послушайте, я знаю, как сильно вы, ребята, любите Тони,

, но все меняется.

Окрестности меняются.

Теперь наша очередь.

Это просто то, что происходит.

Но я почти уверен, что они не вампиры.

Мама! Это серьезное дело.

Ты что, убираешься в этой комнате?

Мигель Антонио Мартинес!

Вы сказали, что убирали
эти мерзкие шорты и нижнее белье!

— Эй, мама дикарь!
— Эй, она сказала, что у тебя мерзкое нижнее белье!

Она злится на тебя.

— Sup, Lil Mayor?
— Sup, Lil Mayor?

Я знаю, да?
Это магазин одежды или ресторан?

Lil Mayor, я знаю, что вы
дадите мне крутиться завтра вечером, верно?

Вы знаете, что я понял…

Послушайте, стой.

Сейчас в этом районе много всего происходит
.

Держите глаза открытыми.

— Хорошо.
— Это было безумно смутно, собака.

Эй, а где Бобби?

Не махайте ему рукой.

— Почему вы возитесь с Хенни?
— Расслабься, чувак.

Я защищал нас.

Вы должны меня поблагодарить.
Он хотел знать, где Слим.

Он не видел его
с тех пор, как он улетел после тебя прошлой ночью.

Ну, разве ты не сказал ему
, что его убил летающий вампир?

Правый. Вся эта история с вампирами.

Послушайте, не волнуйтесь.

Я прикрыл твою сумасшедшую задницу.

Сказал, что вы пошли прямо к Тони.

Братан, у нас все хорошо.

Давай, чувак.

Что это за дерьмо, лет?

Эй, ты за это заплатишь?

Йоу, Тони. Где кот?

У меня нарушение санитарии, брат.
Они забрали Вишу.

У вас здесь копия Blade?

У вас есть 14,99 доллара?

Оххх!

Вы видите, что он сделал?
Он попал туда. Он вставил его.

Я не могу позволить вам это посмотреть.
Твоя мать убьет меня.

Луис, ты эксперт по вампирам.
Вы должны рассказать нам все, что знаете.

Основы.

Вампиры — бессмертные нежити
, которые выживают за счет крови живых.

Они могут выйти на улицу только ночью.
Солнечный свет убивает их.

Чем они занимаются днем?

Закройтесь внутри
защитного гроба в полной темноте.

Обычно вампиры
группируют свои гробы

в секретном и безопасном месте
, называемом гнездом.

Гнездо.

Вампира можно убить
серебряным или деревянным колом в…

— В голову. Чу-ху.
-… сердце. Они распадутся.

Вы знаете эти маленькие круглые печенья

, которые на вкус
не похожи на все, что раздают в церкви?

Вы имеете в виду Евхаристию?

Ты маленький язычник. Если бы вы были в церкви
время от времени, вы бы это знали.

Вставьте один из тех евхаристов
в рот вампиру, и он поджарится.

Хорошо.

Также чеснок. Что об этом?

— Нет, это не так.
— Да, вещь.

Чеснок репеллент от вампиров.

То же с распятием.

Святая вода также является репеллентом,

, но вы также можете использовать ее
как детектор вампиров

, потому что святая вода закипает
, когда вампир приближается.

О чем вы, ребята?

— Вампиры.
— Ничего.

Вы действительно не должны связываться с
с подобными вещами.

Добро пожаловать в Primo Bodega.

Большая сексуальная.

Вот и все.
Это происходит прямо перед нами.

Вампир может войти в
к вам, только если его пригласили.

Тони впустил вампира вчера вечером
, когда он сказал: «Добро пожаловать в Примо Бодега».

Правый, правый.
Ладно, ладно. Они не могут войти в винный погреб.

— Хорошо.
— Нет, нет.

Им нужно приглашение для входа,

, и это не только винный погреб.
Это может быть дом или что-то в этом роде.

Сообщение от меня. Скажи ему
, что сезон открыт для всех болванов.

Хорошо.

Мне не нравится этот взгляд.
Вы собираетесь сказать глупость.

Мы туда не пойдем.

Сейчас день.

Не о чем беспокоиться.
Они все спят, да?

Я, должно быть, сошел с ума.

Давайте, ребята. Нам нужны доказательства.
Мы получили это. Мы Клинки.

— Здравствуйте.
— Чем могу помочь?

Да, я хотел бы поговорить с вашим менеджером
о возможности спонсорства.

Серьезно?

Гм…

Здесь.

Это ваша визитная карточка?

Это на благотворительность.

Вы с ума сошли?

— Нам нужно убираться отсюда прямо сейчас.
— Я ищу доказательства.

Знаете, я думаю, что
вы слишком сильно верите в дерьмо

, которое он прочитал в комиксе.

Это графический роман.

Заткнись.

Давай.

Он скоро будет с вами.

Он будет?

Полуденное солнце может быть убийцей.

Фрэнк Полидори. Приятно познакомиться.

Ты тоже.

Заходите в мой офис.

Итак, что я могу сделать для вас, мальчики?

Ну, мы …

проводим это мероприятие, чтобы принести пользу винному погребу Тони,

и …

— Нам нужно спонсорство …
— Я остановлю вас прямо здесь.

Как звук за 2000 долларов?

— Ты серьезно?
— Знаешь, ты прав.

Сделаем три.

Вы знаете, Мурнау…

очень стремится сделать Bronx
лучшим местом для всех нас.

Это очень заботливо с вашей стороны.

Говоря прямо,

это место — забытое место.

Каждый из вас может исчезнуть до единого,

, и никто этого даже не заметит.

Хотя, я должен сказать,

не все ценят
то, что мы пытаемся здесь сделать.

Вы бы поверили, что кто-то приклеил листовку

вот так к нашей вывеске

возле здания суда?

Вы, ребята, сейчас ничего не знаете об этом
, не так ли?

Нет, нет, нет.

Луис?

— Что здесь происходит?
— У него низкий уровень сахара в крови.

— Может, нам позвонить его маме.
— Никто не выходит из этой комнаты.

Но он собирается…

Эй.

Что вы, ребята, здесь делаете?

О, черт возьми. Ты в порядке?

Ну…

Гм…

Мне вдруг стало намного лучше.

Мы только что говорили с мистером Полидори
о спонсировании вечеринки, и …

Тебе действительно стоит.Эти дети замечательные.

У нас назначена встреча.
Мне очень жаль. На мой взгляд…

Хорошо, спасибо.
Рад вас видеть. Приятно познакомиться.

Мы действительно должны идти.

Поехали.

Эм…
Спасибо за очень щедрое пожертвование.

Это действительно поможет. Ой.

— Вперед! Идти!
— Берегись!

Что это, черт возьми?

Огромное вампирское гнездо.

Тринадцать этажей. Двенадцать гробов на этаже.

— Это 300 а…
— Сто пятьдесят шесть вампиров.

— Бобби!
— Достаточно близко.

Что?

Угу. Не смей так со мной разговаривать.

Я должен ударить тебя по голове.

И ты тоже.

Вы никого не обманете.

Я знаю, что ты делаешь.

Я проверю ваши куки.

Куда ты, мама?

Я пойду к этому человеку
в риэлтерской компании.

Фрэнк Полидори.

Он приходил вчера вечером,
хотел узнать, продаем ли мы!

Вы не можете с ним разговаривать.

Какого черта ты делаешь?

— Не ходи туда, ма.
— Он… он действительно плохой человек.

Конечно, он. Он в сфере недвижимости,

, но если его деньги также настоящие,

— я его выслушаю.
— Почему?

Где ты взял эту шляпу?

Купил.

шт.
Хенни, лучше не давай этого тебе.

Я вижу, что он пытается сделать.

Пытаться сбить тебя
по той же дороге в ад, что и твой папа.

Этот Фрэнк Полидори,
, он вытащит нас из этого дома,

удержит вас от этой жизни.

Мисс Глэдис, пожалуйста, поверьте нам.

Не ходи туда.

Но мы оставим
этот беспорядок, пока ты не облажался.

Вы можете вернуться
назад к поиску обнаженных людей. Хм.

Итак, Хенни дал тебе эту шляпу?

Итак?

Здесь есть планы
на несколько десятков построек.

Я … я говорю, мы отнесем все это в полицию.

— Мы не можем.
— Он прав.

— Недостаточно доказательств.
— Не то, что я думал, ты скажешь.

Если вы еще не верите в вампиров,
вы не поверите в это.

Нам нужно кое-что еще.

Нам нужно то, что никто не может отрицать.

Нам нужно найти гнездо.

Кроме того, я украл это,
, так что мы должны расслабиться с разговорами о полицейских.

Не трогайте это.

Почему ваш телефон не вибрирует?

Кто ты?

Что такое, вы все? Это GloTV.
Похоже, они начали работу

в здании суда. Они взбесили грузчиков,
, и там это выглядит чертовски круто.

Мол, у них люстры.
Давай проверим.

Простите. Что в этих коробках?

Эээ, нули.

Мне пытаются сказать
, что эти большие коробки — холодильники Sub-Zero.

Черт, эти квартиры
будут чертовски хороши.

Дай угадаю.

Это не холодильники.

Думаю, мы только что нашли гнездо.

Эй, я подслушиваю,
или эти коробки похожи на гробы?

Давай.

Эй, он заперт.

— Эй, посмотри на следы.
— Слово, брат.

Мм-хм.

Вот и все.
Это определенно оно.

Это плохо. Это определенно плохо.

Можем ли мы, пожалуйста … мы можем просто пойти?

Мы можем просто вытащить отсюда наши задницы?

Не делай этого, чувак. Не …

Тсс.

И мы открываем гробы.

Кажется ненужным.

Ух ты.

— Сказал.
— Мы получили. Мы можем просто пойти?

Это тот самый чувак, который убил Слима.
Я помню его дурацкую одежду.

— Вперед!
— О боже!

Вперед!

Что?

Выходи!

Открой дверь!

Вперед!

Вперед! Идти!

Угу.

Йо. Мы их получили.

Эй, Бобби, как ты не выключаешь свой телефон?
Ты чуть не убил нас там.

Вы трое в дерьме.

Отличный план, Маленький мэр.
Я сказал вам, что копы ни на что не помогут.

Простите?

Эм, Сандерс,
похоже, что они хотят попасть в тюрьму.

Мы ожидали от вас большего, Lil Mayor.

Эм…

Что мы здесь делаем?

Нам нужно посмотреть, собирается ли
мистера Полидори выдвинуть обвинения против вас троих.

— Может ли этот день стать хуже?
— Да.

Что с тобой не так? Хм?

Что тут нового? Это твоя девушка Глория.
Мы живы и на месте,

, так что позвольте мне рассказать вам все подробности.

Lil Mayor и его маленькие друзья
были пойманы со счетом 5: 0 за вторжение.

Такие хорошие мальчики, не правда ли?

Его мама была на нем
по поводу грязного нижнего белья,

, а теперь он сидит на заднем сиденье полицейской машины.

Держу пари, это была твоя идея, а?

Вы взломали. Как вы могли это сделать?
Вы знаете, как я много работаю?

У этого человека есть несколько сумасшедших
теорий заговора иллюминатов

, которые он бросит вместе с ним и его мальчиками,
, и я готов к этому.

Lil Mayor собирается сказать дикое дерьмо.
Пойдем посмотрим, что он скажет.

Хорошо, я знаю, как это выглядит,
, но поверьте мне.

Все будет иметь смысл
после того, как вы это увидите.

Видите это?

Это вампирское гнездо.

Внутри здания суда.

Теперь приготовьтесь.

Это деталь
, когда я открываю гроб.

Можем ли мы, пожалуйста…
мы можем просто пойти?

Ух ты!

Эээ, что мы должны были видеть?

— Вампиры.
— Что?

— Вампиры?
— Что?

Давай.

— Это дико, братан.
— Lil Mayor, что ты куришь, мужик?

Есть еще?

Я не понимаю.

У вампиров нет души.

У них нет отражения.

Вы не можете увидеть их
в зеркалах, на фотографиях или видео.

Знаете что?
Забудьте о видео. У нас есть планы

построить смертоносные вампирские гнезда
повсюду в этом районе.

Взгляните на это.

Где ты это взял?

Хорошо, мы могли одолжить его,

, но я с радостью верну его
мистеру Полидори, если …

и только если он придет сюда

и докажет, что он не вампир.

Ах, детки.

У них самые дикие фантазии.

Я поймал этих трех
нарушителей границы в здании суда,

, и они признались в краже вашего дела.

Эй, эй, подожди секунду.

Я могу поручиться за этих детей, братан.
Они хорошие дети.

Их просто перепутали
с какой-то безумной вампирской идеей. Это все.

Ну вот, файл вернули.
Полагаю, вреда не было.

Верно, мальчики?

Не нужно рассматривать это в рамках закона.

Большое спасибо.

Нам очень жаль.

— Мы не знаем, что случилось с нашими мальчиками.
— Мальчики будут мальчиками.

Что с тобой не так? Ты не в своем уме?

Держу пари, это была твоя идея.
Ты закончишь, как твой папа.

На кого ты смотришь? Ответь мне!

Давай. Пойдем.

Спасибо.

Эй, эй, эй, Кармен.

Вы позволили ему смотреть Blade, не так ли?

Лезвие? Что это такое?

Я Блэйд! Вампиры…

Осторожно!

Он заплатил за это.

Так это
, откуда у него эти безумные идеи?

Вы больше не пойдете
в этот винный погреб.

Что? Нет, нет, мама.

Ма, Тони ничего не делал.

Иди с мамой.
Послушайте ее. Она знает лучше, понятно?

— Я лучше знаю.
— Забудьте про вампиров.

Командир.

Мы идем в церковь, чтобы вас исправить.
И убери в этой комнате!

Эй, открой эти ворота.

Хенни, дружище.
Спасибо за встречу со мной.

Какие возможности для бизнеса
у вас есть для меня?

Итак, мой работодатель

обеспокоен тем, что люди
по соседству не отвечают…

достаточно быстро
на наши финансовые предложения.

Итак, мне нужно, чтобы вы сделали немного…

давайте просто назовем это «шумом»
по соседству.

Достаточно значительные беспорядки

, чтобы дать последним удерживающим
толчок к продаже.

Ага. Меня не интересует служба
во внимании полиции.

‘Потому что это отрицательно повлияет на ваш бизнес
. Я это понимаю. Я могу копать его.

Однако

то, что я готов предложить вам сегодня вечером …

— это больше денег за пару дней работы
, чем вы заработали за всю свою жизнь.

Верно.

Кроме того, есть дело
небольшого личного имущества

, которое было украдено у нас
группой соседских мальчиков.

Мы бы хотели вернуть украденные вещи

и устранить виновных…

.

Ты …

Эй, почему ты игнорируешь меня?

— Что? Я звал тебя.
— Луис?

Ага. Слушать.
Разобрался. Чувак их знакомый.

Кто их что?

Франк.Жуткий парень с недвижимостью.
Он знакомый вампиров.

— Что это? Например, солнечный вампир?
— №

Фамильяр — это человек-слуга

, который защищает своего хозяина-нежить
в дневное время.

Он делает ставку вампира в обмен на
за то, что в конечном итоге сам станет вампиром.

Он совершает все сделки днем ​​
, пока вампиры спят в гнезде.

— Совершенно верно.
— Мигель!

— Ты идешь в церковь сегодня вечером?
— Да.

Убежденный
Тити Я одержим эль-диабло.

El diablo! Верно.
Вот почему он сегодня вечером идет в церковь.

Бог спасет его. Господь ему поможет.

Сказал.

Увидимся там. У меня есть план.

Давай, чувак.

Суп, человечек?

Эй, послушай, тебе лучше пойти
, пока моя мама тебя не заметила.

Я кое-что понял.
Настроил вас и ваших мам очень хорошо.

— Да, не знаю.
— Я пытаюсь тебе помочь, братан.

У вас заканчиваются деньги, которые остались у вашего народа,
выгнали из школы.

Ты собираешься «продолжать играть в
со своими маленькими друзьями»,

или ты, наконец, вырастешь,
станешь хозяином в доме, заслужишь уважение?

— Что?
— Встреть меня и Луиса в церкви прямо сейчас.

— №
— У меня есть план по уничтожению этих вампиров.

Но ты нам нужен!

Последний шанс.

Я больше не спрашиваю.

— Эй, это Хенни?
— Это твой мальчик Мигель?

Позвольте мне окликнуть его.

— Мне пора.
— Нет! Бобби, не надо!

— Вы знаете, чем это с ним кончится.
— Покончить с ним?

А что с тобой?

В последний день ты втянул меня в
еще больше дерьма, чем Хенни когда-либо мог.

Я закончил со всем этим.
И я с тобой покончил!

Йо, Мигель.

— Бобби идет?
— №

Он с Хенни.

Но … мы справимся и без него.

А что мы делаем?

Ну, ну, ну…

заблудших барашка возвращаются в стадо.

Я не часто вижу вас двоих
на мессе в четверг.

Ээ…

Это сложно с нашими обязанностями
в обществе и так далее и …

Верно, верно, верно.
А где другой? Хм?

Тот, кто любит устраивать рукопашные схватки
и дружит с известными торговцами наркотиками?

Он не смог этого сделать.

Итак, мы можем …

, пожалуйста, идите?

Ой…

Обязательно.

Я буду наблюдать за вами двумя.

Близко.

Мигель.

Что мы делаем?

Тссс.

Привет, как дела?
Добро пожаловать в Primo Bodega.

Чем могу вам помочь?

Это знаменитый винный погреб
Lil Mayor пытается спасти?

Да, это так. Вы знаете Мигеля?

— Не все?
— Да, это правда.

На самом деле, я хочу помочь
с блокировкой.

Я подумывал сделать лепешки из клена.

— Кленовые лепешки?
— Ага.

Да, это крутая идея.

— Он хромой?
— Нет, нет.

Кленовые лепешки дурманские.

Он … он здесь?

Мигель? Нет, парень, этот мальчик подслушивает.

Я научил его лучше, чем это.
Я практически вырастил их мальчиков, чувак.

— Я этого не знал.
— Ага, чувак.

Когда их родители работали,
они были здесь, в винном погребе, гуляли,

делали домашнее задание, играли в видеоигры,
не попадали в неприятности.

Вы поклонник бейсбола?

О, это прямо здесь?

Это летучая мышь, которую Сэмми Соса,
гордость Сан-Педро-де-Макорис,

использовал, чтобы совершить 60 хоумранов за один сезон.

— Вау.
— Что было сделано только четыре раза

в истории бейсбола.
Вы знаете, сколько лет бейсболу?

Старый как дерьмо.

Но это было до того, как он начал отбеливать
свою кожу, выглядя как граф Чокула

и один из этих вампиров
, который, по мнению Мигеля, находится по соседству,

сосет у людей шеи.

Я слышал об этом.

Ага.

Но да.
Проверьте магазин. Ознакомьтесь с моими товарами,

, знаете?
Я получил кое-что новое. У меня есть капуста.

У меня другой сорт капусты,
льняное семя.

Знаете? Немного органического алоэ,

, все, что вам нужно, понимаете?

Мне это просто нужно.

— Вот и все? Просто хумус?
— Угу.

Хорошо. Гм…

Знаете что? На дом.

Настоящий разговор?

Ага.Ты пришел с лепешками,
Я пришел с хумусом.

Спасибо.

Я понимаю, почему Мигель
считает это место таким особенным.

Я принесу вам сумку. Я не хочу, чтобы ты,
, ходил с голым хумусом.

Что за…?

У меня кончились сумки.

Увидимся на вечеринке.

Мм-хм.

О, э …

Скажи Мигелю, что я его ищу.

Хорошо.

Вы достигли Lil Mayor.
Оставьте сообщение.

Эй, малышка на самом деле вампир, собака.
Я посмотрел на штуку …

Вот дерьмо.

Вы их никогда не получите.

Тело Христа.

Тело Христа.

Тело Христа.

Я тебя заметил.

Тело Христа.

Тело Христа.

Давайте все помолимся.

Привет.

Это как грех пятерки.

Да! Святая вода.

Как нам его отсюда вытащить?

Ну вот.

Тссс. Кто-то идет.

Эти дерьмо украли мой Спрайт.

У нас есть святая вода,
Евхаристия, а теперь … Ох.

Привет, привет. Привет, Рита. Привет.

Я видел, как вы двое заходили в ризницу.

— Что вы там делали?
— Что? Нет. Эм…

— Мы были заняты…
— Мы пытались…

-… церковные вещи.
— Да.

Церковный инвентарь.

— Почему вы двое несете эти бутылки?
— Это? Ой…

У меня…

— низкий уровень сахара в крови.
— Низкий уровень сахара в крови.

— Можно?
— Нет!

Нет, не надо.

Смотри, лучше скажи мне
, что здесь происходит на самом деле

, прежде чем я приведу сюда отца Джексона.

Эм…

Ты подумаешь, что я сумасшедший.

Попробуй.

Хорошо.

Итак…

мы говорили о том, что я занимаюсь…

вещами типа мессенджера.

Мы сделали.

Тогда действительно ли нам все это нужно?

Как ты думаешь, что это будет, братан?

Вы хотите заниматься бизнесом,
быть крупным человеком и получать деньги,

вот как это выглядит.

Не пытайтесь говорить мне, что я в порядке.

Хорошо, сегодня вечером мы пойдем по
в каждый магазин в квартале.

Если они откроются, ограбьте
на кассе. Если нет,

,

разнесут это место,
разграбят, расстреляют.

— Фрэнк хочет, чтобы их разбили.
— Фрэнк?

Мы работаем на Фрэнка?

— Типа, парень Мурнау?
— Ага, у тебя с этим проблемы?

Нет.

Иди сюда.

У меня для тебя специальная работа.

Где младший мэр
и этот пуэрториканский ребенок?

— Зачем это нужно знать?
— Зачем мне это нужно знать?

Это не демократия, сынок.

Я говорю вам, что мне нужно,
, а вы мне это даете, понимаете?

Ага.

А теперь узнайте, где они.

Ремень.

Гм…

Мне нужно быстро сходить в ванную.

Мальчик уже мочился в штаны?

О.

— Вампиры? Ты серьезно?
— Я знаю, как это звучит, но…

Нет, я говорю,
ты серьезно гуляешь ночью

, когда вокруг бегают вампиры?

На самом деле это пять вампиров
, судя по количеству гробов, которые мы видели.

Итак, вы мне верите?

Мы гаитяне, дружище.

Моя бабушка готовила меня к этому
всю мою жизнь.

Как вы думаете, я знал
, почему ничего не было в ваших видео?

Нам прямо сейчас понадобятся чеснок
и деревянные колья

.

Эй, что случилось с Тони?

О, нет.

Давайте сделаем это.

Привет.

Что ты здесь делаешь?

Помогаю вам. Что думаешь?

О, нет. Я думал, ты был с Хенни.

Поднимись, как твой отец,
застрелен на улице.

Йоу!

Не говори о моих папах.

Пока ты играл в гангста,
эти вампиры захватили Тони.

Йоу! Что вы двое делаете?

Мы должны быть лучшими друзьями.

Эм… все готово?

Потому что я хотел бы попасть внутрь
, прежде чем вампиры попытаются нас съесть.

Вы можете открыть чертову дверь?

Боже мой.

Может … может, его просто забрали.

Вампиры не берут заложников.

Это моя вина.

Я замешал в этом Тони.

Я принес их сюда.

Не говори так.

Слушай, чувак.

Это не твоя вина…

Вовсе нет.

Ребята.

А, посмотрите, кто только что подъехал к нам.

Эй, нам пора.
Хенни работает на Мурнау,

и Фрэнк нанял его, чтобы найти вас.

Боже мой, однажды вечером с вами, ребята,

и у меня уже есть вампиры
и головорезы, пытающиеся меня убить?

Поехали.

Я тебя вижу.

Вот дерьмо.

Сюда.

Вивиан. Там есть вампиры.
Пойдем с нами.

Приходите.

Рано на Хэллоуин, не так ли?

Кем вы все должны быть?

Почему бы вам, четверо маленьких уродов
, не пустить нам карманы?

Один…

два…

Я про!
Мы их дураков курили!

Вот в чем дело!

Бля!

Скоро!

Мне очень жаль.Я положу музыку.

Луис, Бобби…

Позвоните своей матери и своей тиа.
Они заболели.

И маме позвони. Хорошо?

Мне очень жаль, что они сделали.

О, они не сделали ничего плохого.
Я как раз привел их домой.

О. Вот это да.

— Впервые за все.
— О, мне нравится твой дом.

Спасибо.

Все эти цвета такие милые.

О, спасибо.

Это такой красивый дом.

Вы слишком добры, мисс…

О, Вивиан. Вивиан. Ага.

Мне очень жаль.
Я чувствую себя так глупо, просто стоя здесь.

Могу я войти?

— Нет!
— Луис Акоста де ла Вега!

Мама, не впускай ее.

Она не может атаковать без приглашения.

Lil Mayor,
зачем мне нападать на вас?

Потому что ты вампир!

— Бобби!
— Эта женщина вампир, мисс Мартинес.

Вот почему она не может войти.
Ей нужно приглашение.

Мне нужен ключ, Мигель.

Отдай мне, пока я не осушу тебя
, как я сделал твоего покойного друга Тони.

Что ты?

Я Вивиан Тирелл,

первенец Мастера Мурнау,

командир экспедиции вампиров.

Экспедиция? Что за экспедиция?

Чтобы найти дом для моих людей.

Видишь ли, я такой же, как ты, Мигель.

Я не хочу, чтобы Бронкс изменился.

Легче жить где-нибудь
, где никого не волнует, когда люди исчезают.

Я совсем не похож на тебя!

Если вы вернете мне мой ключ,

Я обещаю ускорить вашу смерть.

Хорошо.

Я дам тебе ключ.

Мамочка, не волнуйся.
Мы в безопасности, пока остаемся здесь.

Я звоню в полицию.

Вы уже видели с Фрэнком.
Полиция на их стороне.

Нам нужно оставаться здесь
, пока не взойдет солнце.

Позвоните своим семьям.
Мы остаемся здесь сегодня вечером.

Утром мы выезжаем из Бронкса.

Не стоит.

Командир.

— Это сделано?
— Да, командир.

Нам пришлось выйти за пределы рынка,
, и это была сделка за наличные,

, но здание ваше.

Приглашение не требуется
в детскую квартиру.

Гм…

Командир…

Я был просто…

Мне было интересно,
, когда я получу подарок.

Вы знаете, я чувствую
, как будто я … я готов к этому.

Сделайте еще одну ошибку,

вы никогда не получите подарок.

Ты никогда не будешь одним из нас.

— Так хорошо.
— Йо.

Йоу, что ты делаешь?

Собираемся в гнездо.

Я вырублю
всех до единого.

Мы должны защищаться.

Мы должны показать им
, что Тони и все остальные имеют значение.

Если мы сделаем это вместе,
у нас может быть шанс.

Ставка.

Мы идем с вами.

Мне надоело бояться.

Эй, что ты делаешь с этой палкой?

Эй, вернись с этой штукой, чувак!

Привет.

Спасибо за приглашение.

— Мы этого не знали …
— Здесь.

Добро пожаловать в команду.

Спасибо. А теперь пошли поубивать болванов.

Сюда.

— Это гнездо.
— Да, я знаю.

Вот ее саркофаг.
Если мы ударим ее, мы ослабим остальных.

А?

Вы, ребята, знали это, верно?

Вот почему я сказал вам,
, не возиться с этим.

Хорошо, три, два…

— Какого черта?
— Они знали, что мы идем.

Они могут быть где угодно.

Вы дали это Вивиан.

Надо вернуться и всех предупредить.

— Бобби!
— Воздушные шары.

Блин.

Что это?

Бурлит.

— Они должны быть здесь.
— Мигель, это слишком опасно.

Не ходи туда.

У нас 30 минут до заката.
Если мы сможем найти их укрытие,

мы сможем прыгнуть на них.

Ну, мы тоже идем.

Ну, кто-то должен всех предупредить.

Я пойду и позову отца Джексона.

Послушайте, просто пообещайте мне, что
не войдете в эту комнату без нас, хорошо?

Хорошо.

Эй!

Можете ли вы сказать моей маме, что я люблю ее…

и что я сожалею о…

ммм, о моей комнате,

о лжи,

обо всем?

Послушай, ты ей скажи …

, когда увидишь ее.

Йо, Рита. А как насчет остальных из нас?

Мы все получили сообщения, понимаете?

Я полагаю, вам не нужно было
, чтобы использовать эти VIP-пропуска, в конце концов, Плайя.

Поехали.

Вот и все.

— Готовы?
— Ага.

Поехали.

Где они, черт возьми?

Ребята.

Что ты делаешь?

Мы определенно умираем сегодня.

— А!
— А-а!

Не умен, Маленький мэр.

— Что нам теперь делать?
— Гм…

Открой шторы! Впустите дневной свет!

Да ладно тебе!

Что у нас здесь?

Какая ты заботливая.

Я купил ваше здание
, чтобы я мог войти и получить этот ключ,

, но вы просто избавили меня от неприятностей.

Что это?

Это останки первого вампира.

Мой создатель.

Создатель всех нас.

Его прах

обладает способностью создавать новых вампиров.

Одна горстка из этих

на лице вашей матери,

укус на ее шее,

и она становится одной из нас.

Ач.

Тело Христа.

Луис! Луис! Ну давай же. Пойдем.

Йоу! Вы только что растопили лицо этого парня?

— Ага. Это было безумно!
— Вперед!

Давай, давай, давай, давай!

Мальчики!

Ух ты! Остынь, чувак. Холод.

Бобби, Бобби, ты куда?

Послушай, Фрэнк.

Они лгут тебе, чувак.

Вы можете быть богатым…

и бессмертным,

, но вы никогда не станете одним из них.

Я знаю это точно.

Ты будешь их младшим братом, верно?

Значит, ты будешь их сукой.

Вроде на вечность.

Вот в чем дело?

Перейти.

Вперед!

Вперед! Идти!

Опять бесполезно.

Вы голодны?

Давай найдем этих мальчиков.

— Педаль быстрее, Мигель!
— Я пытаюсь!

Вампир! Идти!

— Луис!
— Вперед!

Красться вокруг
, где тебе не место.

Крысочка.

Аххх!

Как тебе это нравится, придурок?

Давайте прорежем здесь и возьмем Луиса.
Давай.

Мигель.

Бобби, Лил Майор, Бобби,

Мигель, Мигель, Мигель, Бобби…

Мигель…

Бобби…

Бобби! Ты в порядке? Ого!

Мигель, закрой глаза!

У вас действительно не было шансов.

Я пережил
семь веков, бесчисленные нападения.

Мигель!

Я
самое грозное существо на земле.

А ты?

Вы просто сборище бедных детей

из этой дырки, которую вы называете Бронксом.

Эй, йоу!

Эй, хрен ты говоришь про Бронкс?

Я знаю
, что вы просто не назвали Бронкс засранью!

— Вот дерьмо.
— Вот дерьмо.

Да, но, девочка,
ты видел его девушку?

— Хотя, она уродливая.
— Посмотри на нее.

Это она?

— Волосы у нее ровные!
— Псс!

— Черт, да, у нее плетение.
— Мм-хм. Она никого не обманывает.

— Ей нужно забрать обратно. Как глупо.
— Псс! Psst!

— Дженни и Кендра!
— Она …

— Кто эта сука?
— Не знаю, но она некрасивая.

— Надо идти!
— Аааа!

Аааа!

Это мерзко.

Кто-нибудь пошевелится, и я сверну ему шею!

Пришло время для подкрепления.

А теперь последние штрихи.

О.

Вивиан!

Спасибо за биту, Тони.

Эй, не связывайся с Бронксом!

Вот и все! Ага!

Пошумите для Lil Mayor, вы все!

Мы их получили!

— Ты такой хороший мальчик!
— Мама!

Эй, вы все это видите?

Lil Mayor и его команда
сделали какое-то настоящее дерьмо с героями боевиков!

Привет.

Подождите. Ждать. Что ты делаешь?

О.

— Это не то?
— №

Извините. Думал…

Ничего страшного.Это … все в порядке.

— Извините.
— Пока.

Хорошо, любовник.

— Притормози, чувак. Ей 16.
— Не знаю. Я…

— Только не забывай своих мальчиков, хорошо?
— Мужик, ты шутишь?

Я люблю вас, ребята.

Ах да!

Боже мой!

Ах да!
Давайте ударим. Вы знаете, что делаете?

— Бей их им.
— Мы их ударим.

— Готовы? Ты готов?
— Угу. Пойдем.

— Готовы? Они не готовы.
— Ага.

— Ага. Думаю, они готовы.
— Готовы? Ты готов?

— Рэп.
— Хорошо.

Давайте удостоверимся, что
человек хорошо проводят время,

, но мы должны оставаться начеку.

Мы, дневные ходоки
должны убедиться, что все в безопасности.

— Путешественники?
— Ага.

Это банально, йоу.

Daywalker, как в Blade the Daywalker
и величайший охотник на вампиров всех времен?

На все времена.

Не знаю, сколько времени,
, но мы чертовски хороши в этом.

— Ад, да!
— Черт, да!

Что такое, вы все? Это твоя девочка
Глория с последним обновлением GloTV.

В Бронксе снова все хорошо,
, но мы продолжим шлифовать,

сиять и прижимать друг друга.

О, и всем будущим захватчикам,

, вы не хотите курить с BX.

Получите.

OpenSubtitles рекомендует использовать Nord VPN
из 3.49 USD / месяц —-> osdb.link/vpn

Скрипт на экран: «Se7en» | пользователя Scott Myers

EXT. МАРШЛЕНДЫ, ПРОМЫШЛЕННАЯ ДОРОГА — РАННИЙ ВЕЧЕР

Сомерсет пятится назад, прочь от открытого ящика. Он
белый как полотно, глаза полны онемевшего страха. Он опирается на
свою машину для поддержки, несчастные, больные, держит тыльную сторону руки
ко рту.

SOMERSET
№ …

EXT. МАРШЛЕНД — РАННИЙ ВЕЧЕР

Миллс наблюдает за Сомерсетом, хватает Джона Доу за рубашку.

MILLS
Вставай. Встаньте! Пойдем!

Самка стоит, пытается идти. Миллс быстро идет к
Сомерсет. Доу не успевает.

JOHN DOE
Ты сделал себе хорошую жизнь …

MILLS
Заткнись!

Доу падает, и Миллс начинает тащить его через камыши.

доб. МАРШЛАНДЫ, ПРОМЫШЛЕННАЯ ДОРОГА — РАННИЙ ВЕЧЕР

Сомерсет вытирает слюну с губ и слезы с глаз. Он
глубоко вздыхает, смотрит, как Миллс тащит Доу.

СОМЕРСЕТ
Бля, нет …

Сомерсет выпрямляется, пытается взять себя в руки. Он
глотает, достает пистолет.

SOMERSET
(в скрытый микрофон)
Послушай … послушай меня. Что бы вы ни делали …
не заходите сюда. Держись подальше. Независимо от того, что вы слышите
, не въезжайте!
(начинает к Миллсу)
Джон Доу берет верх.

Сомерсет поднимает нож и вставляет его обратно.
Он входит в болото.

доб.МАРШЛЕНД — РАННИЙ ВЕЧЕР

Миллс видит приближающегося Сомерсета и тянет Доу так, чтобы Доу встал.

ДЖОН ДОУ
(тихо, смотрит)
Вот он.

MILLS
(кричит Сомерсету)
Что, черт возьми, происходит?

ДЖОН ДОУ
(Миллсу)
Я хочу, чтобы вы знали, я бы хотел, чтобы
жил, как вы.

Сомерсет бежит к Миллсу, разбрызгивая грязь.

SOMERSET
Mills … положи пистолет! Выброси это!

Миллс оставляет Доу позади, идет к Сомерсету с пистолетом.

МЕЛЬНИЦЫ
Что?

Сомерсет находится в пятидесяти ярдах и приближается.

SOMERSET
Бросьте пистолет прямо сейчас!

MILLS
О чем ты говоришь? Что случилось?

ДЖОН ДОУ
Вы меня слушаете, детектив Миллс?
Я пытаюсь сказать вам, как сильно я восхищаюсь вами …
и вашей хорошенькой женой Трейси.

Миллс замирает, превращается в Доу. Доу улыбается. Сомерсет близко.

СОМЕРСЕТ
Бросьте оружие, детектив! Теперь!

MILLS
(Джону Доу)
Что ты сказал?

ДЖОН ДОУ
Удивительно, насколько легко член прессы службы
может приобрести информацию у мужчин
в вашем участке.

СОМЕРСЕТ
Дэвид … пожалуйста …

ДЖОН ДОУ
Я был у вас дома сегодня утром, после того, как вы
ушли.

Миллс охвачен ужасом.

ДЖОН ДОУ
Я пыталась сыграть мужа … пыталась попробовать
жизнь простого человека, но у
ничего не вышло. Итак, я взял сувенир.

Миллс поворачивается и смотрит на Сомерсет умоляющими глазами. Сомерсет
протягивает руку.

СОМЕРСЕТ
Дайте мне пистолет.

ДЖОН ДОУ
Ее красивая голова.

Миллз
Сомерсет …

ДЖОН ДОУ
Потому что я завидую твоей нормальной жизни. Зависть — это мой грех.

Сомерсет не может сдержать слез.

Ярость поднимается на Милл, и он поворачивается, чтобы направить пистолет на Джона Доу.

Сомерсет поднимает пистолет и направляет его на Миллса.

СОМЕРСЕТ
Нет!

Миллс видит пистолет Сомерсета, поднимает его в сторону Сомерсета.

MILLS
Скажите мне, что это неправда.

SOMERSET
Я не могу вам этого позволить…

Миллс в ярости выходит вперед.

MILLS
Опусти пистолет !!

SOMERSET
Не делайте этого … пожалуйста …

MILLS
Положите пистолет, Сомерсет!

Пауза. Рука Сомерсета с пистолетом дрожит.
ветер хлестает по ним. ВЕРТОЛЕТ можно СЛЫШАТЬ на расстоянии. Сомерсет
бросает пистолет.

СОМЕРСЕТ
Дэвид, послушай меня …

Миллс идет, чтобы схватить Джона Доу за горло и приставляет пистолет
Доу ко лбу, ослепший от ярости.

Сомерсет держит руку за спиной, открывает нож.

СОМЕРСЕТ
Он хочет это! Он хочет, чтобы вы это сделали!

Доу смотрит Миллсу в глаза с диким ожиданием.

ДЖОН ДОУ
Убей меня.

Доу опускает голову, ожидая казни.

Миллс держит пистолет у головы Доу, нерешительный, разъяренный.

Сомерсет направляется к ним.

MILLS
(смотрит на Сомерсет)
Прекрати! Держись подальше!

Сомерсет перемещает лезвие так, чтобы держать его за лезвие,
готовый бросить, скрывая его.

SOMERSET
Я не могу вам этого позволить!

Миллс бьет Доу ногой и бросает его на землю. ВЕРТОЛЕТ
БЛИЖЕ.

Миллс стоит над Доу и направляет пистолет.

ДЖОН ДОУ
Она умоляла о ее жизни и о жизни
вашего ребенка внутри нее.

Лицо Миллса наполняется смятением — затем волна ужаса.

Глаза Доу отражаются в шоке.

ДЖОН ДОУ
Вы не знали.

СОМЕРСЕТ
НЕТ!

Сомерсет протягивает руку, чтобы бросить лезвие, но Миллс
реагирует на движение, включает Сомерсет и стреляет — БАМ!

Сомерсет летит назад в воздухе, пуля попадает в его плечо
, прямо над отверстием бронежилета.

Сомерсет падает на землю, крича, окровавленный, корчась.

Миллс направляет пистолет на Джона Доу.

ИНТ. ВЕРТОЛЕТ ПОЛИЦИИ — РАННИЙ ВЕЧЕР

Вертолет над болотом. Калифорния высовывается из
со своей винтовкой. Он съеживается от звуков, когда ИЗ ЕГО ГАРНИТУРЫ
СЛЫШАН: БАМ — БАМ — БАМ — ПУХ — БАМ.

Профилирование транскриптов в периферической Т-клеточной лимфоме, если не указано иное, и диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме позволяет идентифицировать различные сигнатуры профиля опухоли

Реферат

Для выявления биологических различий и сходства периферической Т-клеточной лимфомы — не указано иное [PTCL -NOS] для распространения крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL) анализ транскриптосом был проведен на пяти пациентах с PTCL-NOS и четырех пациентах с DLBCL и подтвержден количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени на 10 выбранных генах.Нормальные Т-клетки периферической крови, В-клетки периферической крови и лимфатический узел использовали в качестве контроля. Полученный в результате профиль экспрессии гена очертил различные «сигнатуры профиля опухоли» для PTCL-NOS и DLBCL. Несколько генов с высокой сверхэкспрессией как в PTCL-NOS, так и в DLBCL включают каскады иммунной сети, стромы, ангиогенеза и выживания клеток, которые вносят важный вклад в лимфомагенез. Воспалительные хемокины и их рецепторы, вероятно, играют центральную роль в этих сложных взаимосвязанных путях: CCL2 и CXCR4 в PTCL-NOS и CCL5 и CCR1 в DLBCL.Онкогены с высокой сверхэкспрессией, уникальные для PTCL-NOS, — это SPI1, STK6, α-PDGFR и Sh3D1A , тогда как в DLBCL это PIM1, PIM2, LYN, BCL2A1 и RAB13 . Онкогены, общие для обеих лимфом, — это MAFB, MET, NF-κB2, LCK и LYN . Некоторые опухолевые супрессоры также подавляются ( TPTE, MGC154, PTCH, ST5 и SUI1 ). Это исследование иллюстрирует актуальность иммунного трафика опухоль-строма и выявило новые потенциальные прогностические маркеры и цели для терапевтического вмешательства.[Mol Cancer Ther 2005; 4 (12): 1867–79]

Ключевые слова:
  • лейкемии и лимфомы
  • неходжкинская лимфома
  • профиль экспрессии гена
  • периферическая Т-клеточная лимфома
  • диффузная большая В-клеточная лимфома

Введение

ВОЗ классифицирует неходжкинские лимфомы на В-клеточные и Т-клеточные подтипы. В-клеточные неходжкинские лимфомы составляют около 85%, а Т-клеточные неходжкинские лимфомы составляют около 15%. Среди неходжкинских Т-клеточных лимфом, периферическая Т-клеточная лимфома — не указанная иначе [PTCL-NOS] составляет от ~ 6% до 10% (1).Это редкие опухоли, патологический диагноз которых затруднен из-за отсутствия иммунофенотипических маркеров клональности, морфологической гетерогенности и плохой корреляции между цитоморфологией и прогнозом (2). Крупные проспективные исследования показали, что PTCL-NOS имеет более высокую частоту рецидивов и худшую выживаемость, чем диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (DLBCL; ссылки 3–5). Независимо от различий в исходе, оба типа лимфомы в значительной степени лечатся одинаково, поскольку нет никаких биологических данных, позволяющих дифференцировать эти опухоли.Химиорезистентность PTCL-NOS по сравнению с DLBCL объясняется повышенной экспрессией белков множественной лекарственной устойчивости и p53 (6, 7).

Клеткой происхождения PTCL-NOS обычно являются Т-клетки CD4 + и очень редко Т-клетки CD8 + . Экспрессия одного или нескольких пан-Т-клеточных антигенов (CD45RO, CD2, CD3, CD5 и CD7), отсутствие пан-В-клеточных антигенов и гистопатологические данные объединяются для постановки диагноза (8). На Западе преобладает узловой PTCL-NOS, тогда как на Востоке более распространен экстранодальный PTCL, особенно назальный тип.Кильская классификация подразделяет PTCL-NOS на группы с низкой и высокой степенью злокачественности. Внутри каждой группы были идентифицированы различные паттерны генетических аномалий (9, 10). Второй подход проанализировал паттерны экспрессии хемокинов и их рецепторов. На основании экспрессии CCR4, CXCR3, CD134 и ST2 (L), PTCL-NOS был разделен на две прогностические группы (11).

Профили экспрессии генов с использованием кДНК (12–14) и олигонуклеотидных микрочипов (15) классифицировали DLBCL на три подгруппы: зародышевый центр B-подобный, активированный B-подобный и тип III.Три подгруппы имели заметно разные кривые выживаемости после химиотерапии на основе циклофосфамида-адриамицина-винкристина-преднизона (CHOP), предоставляя прогностическую информацию в дополнение к международному прогностическому индексу и независимо от клинических особенностей. Был идентифицирован набор из 9 генов, которых достаточно для прогнозирования трех подгрупп и общей выживаемости на основе иммуногистохимии (16, 17) и количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР; ссылка 18). Такой подход, применяемый к PTCL-NOS, также даст основанную на экспрессии генов диагностическую классификацию, прогностические подгруппы и новые мишени, которые могут поддаваться терапевтическому вмешательству.

Цели настоящего исследования состояли в том, чтобы выполнить профилирование транскриптов PTCL-NOS и DLBCL, чтобы получить биологическое представление о сходствах и различиях, которые существуют между B-клеточными и T-клеточными злокачественными новообразованиями. Предыдущие исследования (12, 14) использовали клеточные линии неходжкинской лимфомы в качестве контроля; однако в этом исследовании в качестве контроля использовались нормальные В-клетки периферической крови, Т-клетки и лимфатический узел. Классификация профиля экспрессии гена на шесть признаков рака (19) дала различные «сигнатуры профиля опухоли» для PTCL-NOS и DLBCL, соответственно.Это исследование проанализировало и оценило сигнатуру профиля экспрессии генов двух фенотипически различных (Т-клетки по сравнению с В-клетками) неходжкинских лимфом и предоставило основу для более обширных исследований для диагностической классификации и определения прогностических подгрупп.

Материалы и методы

Пациенты

Всего было изучено девять пациентов [четыре DLBCL и пять PTCL-NOS]. Ткань опухоли фиксировали в виде быстро замороженных образцов и хранили при -80 ° C. Их также фиксировали забуференным формалином, заливали парафином и окрашивали H&E.Все слайды были просмотрены (C.M.S.), и первоначальный гистологический диагноз был подтвержден. Эти исследования были одобрены пациентами или их законными опекунами, а также были получены соответствующие письменные согласия до проведения биопсии. Это исследование не распространяется на институциональный обзорный совет.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия была проведена для определения клонов опухоли на образцах тканей мгновенно замороженных или фиксированных формалином, залитых парафином, с использованием набора моноклональных антител, направленных как против В-клеток (CD19, CD20, CD21 и CD22), так и против Т-клеток. (CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5 и CD8).Также определяли статус легкой (κ и λ; Becton Dickinson Corp., Сан-Хосе, Калифорния) и тяжелой (IgM, IgG, IgA и IgD; Becton Dickinson) цепи иммуноглобулина. Кроме того, использовали Ki-67 (DAKO, Carpinteria, CA; для пролиферации) и CD30 (анапластическая Т-клеточная лимфома и активированные В-клетки; DAKO). Для замороженных тканей использовался непрямой иммунопероксидазный метод с использованием 3,3′-диаминобензидина в качестве хромогена (20), а для парафиновых срезов — Ventana ES или эталонный прибор (Ventana Medical Systems, Тусон, Аризона; исх.21). Однако все образцы пациентов прошли достаточное тестирование для подтверждения происхождения и клонального статуса. Аберрантная потеря пан-Т-клональных антигенов и / или субнаборов Т-клеток использовалась вместо перестройки рецепторных генов для Т-клеточных поражений, когда такое тестирование было недоступно или ткани для исследования было недостаточно.

Выделение РНК и олигонуклеотидные микрочипы

Суммарную РНК экстрагировали из каждого замороженного образца PTCL-NOS и DLBCL с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen, Валенсия, Калифорния).Количество общей РНК, выделенной из клеток, определяли количественно с использованием спектрофотометрических измерений A 260 с выходами ≥25 мкг / образец. Контрольную РНК получали из нормальных периферических В-клеток (AllCells, Беркли, Калифорния), нормальных периферических Т-клеток (AllCells) и быстро замороженных нормальных лимфатических узлов (Департамент патологии, Университет Аризоны). мРНК (5 мкг) использовали для создания кДНК первой цепи с использованием праймера олиго (dT), связанного с Т7. После синтеза второй цепи in vitro транскрипция (Ambion, Austin, TX) была проведена с биотинилированным UTP и CTP (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY), что привело к 40-80-кратной линейной амплификации РНК.Биотинилированную РНК (40 мкг) фрагментировали до размера от 50 до 150 нуклеотидов перед гибридизацией в течение ночи при 45 ° C с массивом HG-U133A 2.0 Affymetrix (Санта-Клара, Калифорния), содержащим около 18 400 транскриптов и 22 000 наборов зондов. После промывки матрицы окрашивали стрептавидин-фикоэритрином (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA) и сканировали на сканере Hewlett-Packard (Роли, Северная Каролина). Интенсивность для каждого признака массива регистрировалась с помощью программного обеспечения GeneChip (Affymetrix), и единый необработанный уровень экспрессии для каждого гена был получен из 10-20 пар зондов, представляющих каждый ген, с использованием алгоритма усеченного среднего.Значения интенсивности были масштабированы таким образом, чтобы общая интенсивность для каждого чипа одного и того же типа была эквивалентной. Среднее значение ± стандартное отклонение между масштабными коэффициентами всех GeneChips составило 0,75 ± 0,15. Другие дополнительные меры качества, процент присутствующего гена (55,0 ± 2,5), отношение актина 3 ‘к 5’ (1,25 ± 0,15) и соотношение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 3 ‘к 5’ (1,02 ± 0,10) свидетельствует о высоком общем качестве образцов и анализов. Хорошо измеренные гены представляли собой определенные гены, которые имели отношение интенсивности сигнала к фоновому шуму> 2 в> 80% гибридизированных образцов.

Анализ и визуализация данных

Для каждого пациента PTCL-NOS или DLBCL по сравнению с контрольным образцом (нормальные В-клетки или Т-клетки или нормальный лимфатический узел) с помощью Affymetrix были сгенерированы списки «устойчивых повышающих факторов» или «устойчивых понижающих факторов». Программа анализа данных (MAS 5.0). Руководство по основам использовалось для импорта этих списков в GeneSpring версии 5.0 и получения пересечения устойчивых повышающих или понижающих коэффициентов для всех пациентов PTCL-NOS или DLBCL, соответственно. Увеличивающие или понижающие факторы, общие для нормальных Т-клеток и лимфатических узлов или нормальных В-клеток и лимфатических узлов, сравнивали с пациентами с PTCL-NOS или DLBCL.Кроме того, также сравнивали повышающие или понижающие факторы, общие для нормальных Т-клеток и В-клеток или лимфатических узлов для PTCL-NOS и DLBCL. Профили экспрессии генов для PTCL-NOS или DLBCL были дополнительно классифицированы в соответствии с признаками рака (19) для определения характерных особенностей профиля опухоли, специфичных для лимфомы. Это гены, участвующие в ( a ) самодостаточности сигналов роста, включая онкогены; ( b ) нечувствительность к сигналам подавления роста, включая отсутствие опухолевых супрессоров; ( c ) уклонение от апоптоза; ( d ) безграничный репликативный потенциал; ( e ) устойчивый ангиогенез; и ( f ) инвазия и метастазирование.Наконец, был проведен поиск потенциальных терапевтических мишеней по ключевым словам (например, протеинкиназы для создания списков генов для каждого желаемого типа мишени). Было получено пересечение списков генов для каждой мишени с обычно активируемыми и подавляющими генами в образцах пациентов. Это также было сделано на пересечении списков генов с повышенной и пониженной регуляцией с помощью GeneSpring «Упрощенная онтология GO» в качестве еще одного метода классификации генов. Для четырех пациентов с DLBCL измерение 9 прогностических генов ( LMO2, BCL6, FN1, SCYA3, BCL2, CD10, MUM1, FOXP1 и CYCLIN D2 ; исх.22, 23) были применены, чтобы установить, к какому подклассу они принадлежали, на основе сравнения с нормальными В-клетками или лимфатическим узлом.

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени

Общую РНК (100 нг) использовали для реакций обратной транскрипции (общий объем 20 мл), проводимых с использованием обратной транскриптазы платины SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). Реакции инкубировали при 42 ° C в течение 50 минут с последующей инкубацией при 37 ° C с РНКазой H в течение 20 минут. Для выполнения ПЦР с детектированием флуоресценции в реальном времени использовалась программа Opticon DNA Engine (MJ Research, Reno, NV).кДНК (1 мкл), полученную в результате реакций обратной транскрипции, добавляли к 12,5 мкл Platinum SYBR Green для количественной ПЦР SuperMix-UDG (Invitrogen), 1 мкл ген-специфичной или β-актин-специфической пары праймеров (дизайн праймеров см. ниже) и 10,5 мкл. мкл дистиллированной H 2 O (конечный объем 25 мкл). Амплификацию (95 ° C в течение 15 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд) повторяли в течение 44 циклов. После реакции ПЦР проводили анализ кривой плавления для определения чистоты амплифицированного продукта.Данные были предоставлены как значение порогового цикла ( C T ) для каждого образца, которое указывало на цикл, при котором впервые было обнаружено статистически значимое увеличение флуоресценции. Затем эти данные были нормализованы к β-актину, который служил в качестве незатронутого контрольного гена, для каждой точки данных и сравнен с нормальным контролем Т-клеток для определения относительных соотношений экспрессии. Каждое измерение проводилось в трех экземплярах.

Дизайн праймеров

Праймеры

для ПЦР были сконструированы с использованием MacVector (Accelrys, Сан-Диего, Калифорния) для получения ампликонов длиной от 80 до 250 п.н. для оптимизации эффективности количественной ПЦР.Последовательности: 5′-TGGGCTCTTTTGAAGGATTGG-3 ‘и 5′-GCAGTCTGGCTATCTGATTGAAGC-3’ для Lumican , 5′-CTCCTGGCAGATTCCACAAAAG-3 ‘и 5′-CACTTCTTATTACGGGGTCAG90, 5′-CACTTCTATTACGAGGGTC90, 5′-CACTTCTATTGAGGGTCAG90, 5′-CACTTCTTATTACGAGGGTC90, и 5’-TTCCCGTCCAGTGTCAGGTTATCC-3 ‘для CD14 , 5′-TGTCCCCCTCAAAAGTCATCC-3′ и 5′-TTGCTCAGTTCATACACCTTCCG-3 ‘для CD54 , 5′-GAATGGGTGCTACTGCCC-3’TACTC’ и 900CTACTGCCCT 900 и 3CACTC’TGACT89 CD163 , 5′-CACACACAGGTGGGACACAAATAAG-3 ‘и 5′-GCAAGTCAATGAGACGGAGTCAC-3’ для CD106 , 5′-TGAAGTCCAAGTTCCTCCAGGTC-3 ‘и 5’-TGTTGCTGTTTGTGAG89 для и 5′-AAATAAGCCCCCCCTCAACCTTGG-3 ‘для α-PDGFR , 5′-CGCTTTGCTCCTTGTTTTTTCC-3′ и 5′-CGTCTCTTTCTCCTACCCCTTGAC-3 ‘для -ABCA1 и 3’CACCACCACCCCACCACCA-3′ -TACCACCACCACCA-3 и 3′-GACCC ′ Для ТЭМ6 .Праймеры для β-актина из QuantumRNA β-Actin Internal Standards (Ambion) использовали для нормализации количественных данных ПЦР.

Результаты

Морфологический и иммуногистохимический анализ

Все пять пациентов с PTCL-NOS были крупноклеточными лимфомами. Все были de novo. Каждый образец содержал> 50% опухолевых клеток. Четыре были узлового происхождения, а один возник как образование мягких тканей в колене. Все пациенты с PTCL-NOS были отрицательными по CD1 и CD5 и положительными по CD2, CD3 и CD7.Ki-67 колеблется от 30% до 50%. Из четырех пациентов с DLBCL три были узловыми по происхождению, а одна возникла в виде образования мягких тканей в правой груди. У всех четырех фолликулярных участков не было; имели крупную клеточную морфологию, однородную экспрессию CD20 и моноклонального иммуноглобулина легкой цепи; и содержал> 50% опухолевых клеток. Пролиферация по Ki-67 для четырех пациентов составила 10%, 35%, 60% и 76% соответственно. Не было обнаружено аберрантной экспрессии антигена, в частности коэкспрессии CD5.Рисунок 1A показан типичный пациент с PTCL-NOS, а на фиг. 1B показан пациент с DLBCL с иммуногистохимическим анализом, различающим два подтипа лимфомы и обеспечивающим меру вовлечения опухоли.

Рисунок 1.

A, типичный пациент с PTCL-NOS, показывающий окрашивание H&E для морфологии и иммуногистохимии для определения фенотипа Т-клеток ( CD2 ), отрицательный на CD8 (окрашивание связано с инфильтрирующими опухоль лимфоцитами) с поражение опухоли (> 50%) и агрессивность (Ki-67). B, типичный пациент с DLBCL, показывающий окрашивание H&E для морфологии и иммуногистохимии для определения фенотипа B-клеток ( CD20 ), отрицательный по CD8 (окрашивание связано с инфильтрирующими опухоль лимфоцитами) с поражением опухоли (> 50%) и агрессивностью (Ki-67).

Профилирование экспрессии генов PTCL-NOS и DLBCL

Программное обеспечение Affymetrix MAS 5.0 использовалось для расчета среднего, стандартного отклонения, медианы и межквартильного размаха [например, 25 лучших увеличиваются или уменьшаются; PTCL-NOS по сравнению с нормальными Т-клетками или нормальным лимфатическим узлом].Изменчивость между образцами хорошо коррелировала с количественными данными ОТ-ПЦР в реальном времени. Например, пять пациентов с PTCL-NOS для сигналов экспрессии гена CD14 и были 1034,6, 3371,4, 4720,3, 3451,1 и 3130,5. Среднее значение составило 3141,5, стандартное отклонение — 1330,46, медиана — 3371,4, межквартильный размах — 320,6. На основании этих данных было вычислено, что среднее кратное изменение составляет 88 раз по сравнению с нормальной Т-клеточной РНК периферической крови. Хорошо измеренные гены были определены как гены, которые имели отношение интенсивности сигнала к фоновому шуму> 2 в> 80% гибридизованных образцов.

Гены с устойчивой активацией и общие для всех пяти пациентов с PTCL-NOS сравнивают с нормальными Т-клетками периферической крови или нормальными лимфатическими узлами (Таблица 1 ). Похоже, что сравнение пациентов с PTCL-NOS с нормальными Т-клетками периферической крови показывает, что большинство сверхэкспрессированных генов вовлечены в опухолевую инвазию ( COL1A1, FN1, CTGF, COL1A2, CCL2, CLU, C1S, LUM и LYS ), антиапоптоз ( CD14 ), пролиферация ( CCL18, CXCL13 и IGFBP7 ) и ангиогенез ( TEM6 ).Точно так же, когда PTCL-NOS сравнивается с нормальным лимфатическим узлом, большинство генов, которые активируются и сверхэкспрессируются, участвуют в инвазии опухоли ( CHI3L1, CCL5 и CORO1A ) и пролиферации ( Sh3D1A, FLI1, AIF1, CRIP1, MAP4K1 и Rac2 ). Гены, которые, как известно, являются причиной туморогенеза, явно экспрессируются, что указывает на то, что Т-клетки периферической крови и лимфатические узлы предоставляют ценную информацию относительно эволюции опухоли из нормальных Т-клеток и лимфатических узлов.Гены с сильной подавляемой регуляцией сюда не включены, но будут обсуждаться ниже в отношении сигнатуры профиля опухоли. Таблица 1. клетки или нормальный лимфатический узел (Таблица 2 ). Сравнение пациентов с DLBCL с нормальными В-клетками периферической крови показывает, что гены, которые активируются и сверхэкспрессируются, также участвуют в опухолевой инвазии ( LYS, CCL5, CHI3L1, CHIT1, MMP9 и ADAMDEC1 ), трафике иммунных клеток. или ответ клетки-хозяина на опухоль ( CCL18, RGS13, CXCL9 и VNN1 ) и пролиферацию ( PLA2G2D и PLA2G7 ).Точно так же, когда пациентов с DLBCL сравнивают с нормальным лимфатическим узлом, большинство генов, которые активируются и сверхэкспрессируются, участвуют в опухолевой инвазии ( CCL5, CORO1A и CHI3L1 ), антиапоптозе ( BCL2A1 ), иммунной трафик ( CCL18, CD79B, CD52 и POU2AF1 ) и распространение ( CD20, MAP4K1 и Rac2 ). Опухолевые ткани экспрессируют гены, которые способствуют и поддерживают онкогенный процесс, и профили, полученные на основе нормальных В-клеток периферической крови и лимфатических узлов, помогут уточнить механизм инициации и развития.Гены с сильной подавляющей регуляцией не включены и будут обсуждаться в отношении сигнатуры профиля опухоли.

Таблица 2.

Гены со сверхэкспрессией в DLBCL по сравнению с нормальными В-клетками периферической крови или лимфатическим узлом

Таблица 3 показаны гены с высокой активностью, которые являются общими для PTCL-NOS и DLBCL, по сравнению с нормальными Т-клетками периферической крови и В-клетками или лимфатическим узлом, соответственно. Есть только три общих гена для PTCL-NOS и DLBCL по сравнению с нормальными Т-клетками и В-клетками периферической крови, и это CCL18, UBD и RARRES1 .Однако существует 11 генов, общих для PTCL-NOS и DLBCL по сравнению с лимфатическим узлом, и это CCL18, CD52, MAP4K1, CORO1A, PPP1R16B, PSMB8, UBD, LYZ, TCRβ, RAC2 и CCL5 . Эти сравнения дают представление о важности профилей дифференциальной экспрессии генов, общих для обоих типов лимфомы. Путем включения отдельной клетки (В-клетки или Т-клетки периферической крови), а также сложной ткани (лимфатический узел) теперь можно получить представление об относительной важности взаимоотношений между клетками иммунного транспорта опухоли и стромы.

Таблица 3.

Избыточная экспрессия генов, общих для PTCL-NOS и DLBCL, по сравнению с нормальными Т-клетками периферической крови, В-клетками периферической крови и лимфатическим узлом

Сигнатуры профиля опухоли PTCL-NOS и DLBCL

Далее мы сделали анализ, основанный на шести признаках рака (19), при котором опухоль обладает следующими приобретенными способностями: ( a ) самодостаточность в сигналах роста, ( b ) нечувствительность к сигналам, препятствующим росту, ( c ) уклонение апоптоза, ( d ) безграничный репликативный потенциал, ( e ) устойчивый ангиогенез и ( f ) тканевая инвазия и метастазирование.Гены были отсортированы по каждой из этих категорий, общих для всех пяти пациентов с PTCL-NOS, по сравнению с Т-клетками периферической крови, лимфатическим узлом и / или обоими (таблица 4). ). Аналогичный анализ был проведен для четырех пациентов с DLBCL по сравнению с В-клетками периферической крови, лимфатическим узлом и / или обоими (Таблица 5 ). Это обеспечивает подпись профиля опухоли для PTCL-NOS и DLBCL. PTCL-NOS идентифицировал гены, связанные с пролиферацией ( IGFBP7, Sh3D1A, RAC2 и TCIRG1 ), опухолевыми супрессорами ( RARRES3, GAS1 и CDKN1A ), инвазией ( COL1A, FN1 900L90 и CC ), неограниченная репликация ( CTGF, CYR61 и NEK2 ), ангиогенез ( VEGF, PDGFR, CSF1R и HGF ), антиапоптоз ( CD14 и NF-κB ) и онкогены ( FLI1, MAFB, SPI1, STK6 и MET ).DLBCL идентифицировал гены, связанные с пролиферацией ( IGFBP7, CD20, CD72, CRIP1 и RAB13 ), опухолевыми супрессорами ( GPNMB, CD63, BTG2 и RARRES3 ), инвазией ( LUM, FN1, MMP1 , и COL6A3 ), неограниченная репликация ( CCR1 и CCL5 ), ангиогенез ( VEGF, PDGF, PDGFR и FGF13 ) и антиапоптоз ( CD14 и BCL2A1 ). Таким образом, очевидно, что нормальные Т-клетки периферической крови или В-клетки и лимфатический узел в сочетании обеспечивают согласованные результаты экспрессии генов, которые теперь можно детально оценить и попытаться расположить их в сигнальных путях, которые сделают взаимосвязь более очевидной.

Таблица 4.

Признаки рака для DLBCL: DLBCL по сравнению с В-клетками периферической крови и лимфатическим узлом

Таблица 5.

Признаки рака для PTCL-NOS: PTCL-NOS по сравнению с Т-клетками периферической крови и лимфой node

Девятигенная прогностическая модель DLBCL

Тканевая микроматрица с использованием иммунопероксидазного окрашивания для прогнозирующих маркеров для точного разделения DLBCL на прогностически значимые подгруппы и коррелировала с микрочипом кДНК как золотым стандартом (22).Было идентифицировано шесть белков: CD10, BCL2, BCL6, MUM1 / IRF4, CYCLIN D2 и FOXP1. Аналогичным образом количественный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени выявил шесть генов, имеющих прогностическое значение: BCL2, BCL6, FN1, LMO2, CCND2 и SCYA3 / CCL3 (23). В этом исследовании мы объединили гены, которые использовались в тканевом микрочипе и ОТ-ПЦР, для оценки четырех пациентов с DLBCL и пяти пациентов с PTCL-NOS. Когда четырех пациентов с DLBCL сравнивали с нормальными В-клетками периферической крови, три из девяти генов были активированы ( FN1 в 140 раз, CCL3 4.9-кратно и BCL6 2,2-кратно), и по сравнению с лимфатическим узлом, семь из девяти генов были активированы ( MUM1 28-кратно, CCL3 11,4-кратно, CCND2 10,4-кратно , BCL6 6,7 раза, LMO2 5,3 раза, BCL2 4,6 раза и FN1 2,3 раза). Эти данные помещают этих четырех невыбранных пациентов с DLBCL в подгруппу B-клеток, активированных не зародышевым центром. Кроме того, подчеркивается важность контрольной РНК, подразумевая, что лимфатический узел может быть более информативным из-за своей сложной природы и что опухоль действительно имеет признаки рака.

Открытие новых терапевтических мишеней

В исследовании также были проанализированы некоторые ключевые терапевтические мишени, на которые можно воздействовать либо низкомолекулярными ингибиторами, либо моноклональными антителами. Для пациентов с PTCL-NOS новыми мишенями являются следующие: низкомолекулярные ингибиторы протеинкиназ ( STK6, NEK2, c-MET, SYK и α-PDGFR ), моноклональные антитела к циркулирующим лигандам ( CCL2, VEGF, HGF, CTGF, PDGF, FGF7 и IGFBP7 ) и низкомолекулярный ингибитор Rac2 , член семейства малых GTP-связывающих белков Ras.Для пациентов с DLBCL новыми мишенями являются следующие: низкомолекулярные ингибиторы протеинкиназ ( LCK, LYN, PIM1, PIM2, MET и SYK ), низкомолекулярные ингибиторы новых мишеней ( PSMA, BCL2A1 и NF-κB2 ), моноклональные антитела к циркулирующим лигандам ( CCL2, CCL5 и VEGF ) и маркеры клеточной поверхности ( CD72, ICAM2 и CD52 ).

Проверка с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени на 10 отобранных, сверхэкспрессированных, функционально значимых генах ( Lumican, CCL18, CD14, CD54, CD106, CD163, α-PDGFR, HCK, ABCA1 и TEM6 ), общий для всех пяти пациентов с PTCL-NOS, подтвердили данные профиля экспрессии генов (рис.2 ). Показан уровень экспрессии для каждого пациента, усредненный по трем запускам ОТ-ПЦР. Они хорошо коррелировали с изменчивостью между образцами, наблюдаемой по сигналам экспрессии генов, полученным с ДНК-микрочипа.

Рисунок 2.

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени 10 выбранных генов, общих для пяти пациентов с PTCL-NOS ( 1–5 ). Ось Y, уровень экспрессии по сравнению с контролем.

Обсуждение

Пациенты с PTCL-NOS имеют худший исход по сравнению с пациентами с DLBCL (24).Чтобы различать биологические свойства этих двух фенотипических вариантов крупноклеточной лимфомы, мы провели исследование профиля экспрессии генов PTCL-NOS и DLBCL с использованием платформы Affymetrix. Исследование выявило несколько ключевых элементов биологии лимфомы и привело к исследованиям, генерирующим гипотезы, которые должны помочь в выяснении основных онкогенных явлений в PTCL-NOS и DLBCL. Сложность этих опухолей представлена ​​25-30 активированными генами рака и несколькими подавляющими супрессорами опухолей, которые обеспечивают преимущество роста и повышают способность к вторжению и метастазированию.

Подпись профиля опухоли PTCL-NOS

Прогностическая модель профиля опухоли PTCL-NOS очерчена на основе шести отличительных признаков рака (рис. ). Хемокины вызывают направленную миграцию лейкоцитов по химическому градиенту лиганда. Многие виды рака, включая лимфомы, имеют сложную хемокиновую сеть, которая влияет на инфильтрацию иммунных клеток, рост опухолевых клеток, выживаемость, миграцию и ангиогенез. Эти клетки сами экспрессируют хемокиновые рецепторы и могут отвечать на хемокин по аутокринному и / или паракринному механизму (25).Многие различные виды рака, включая PTCL-NOS (26), имеют разные профили экспрессии хемокинов и хемокиновых рецепторов, но чаще всего встречается CXCR4 .

Рисунок 3.

Прогностическая модель, описывающая сигнатуру профиля опухоли PTCL-NOS. Активация онкогенных факторов транскрипции ( MAFB, FLI1 и SPI1 ) способствует сверхэкспрессии хемокинов ( CCL2 и CCL5 ) и рецепторов хемокинов ( CCR1 и CXCR4 ).Они, действуя аутокринным и паракринным образом, привлекают стромальные фибробласты, воспалительные иммунные клетки и эндотелиальные клетки, чтобы сформировать сложную сеть опухолевой ткани. Сверхэкспрессия интегринов ( LFA1 и VLA4 ) на опухолевых клетках и их партнерах по связыванию на стромальных клетках ( ICAM1, ICAM2 и VCAM1 ) способствует перекрестному обмену между опухолью и стромой, который активирует пролиферативные сигнальные пути (). JAK / STAT ), образование ECM ( FN1, COL1A1, COL1A2, CHI3L1 и emilin ) и цитокины / факторы роста стромального происхождения ( CTGF и CYR61 ).Некоторые промоторы ангиогенеза опухолевого происхождения ( VEGF, PDGF-CC, FGF7, PDGFR и CSF1R ) сверхэкспрессируются, что помогает поддерживать сложный ангиогенный процесс. Привлечение воспалительных иммунных клеток, которые усиливают рост опухоли и продукцию инвазивных факторов ( HGF, MET, CTGF и IGFBP7 ), предвещают развитие агрессивной Т-клеточной лимфомы. Более того, сверхэкспрессия пролиферативных факторов, управляемых NF-κB ( TCIRG1, CD14, CD52, TNFRSF25 и CCR1 ), ингибирует многие формы апоптоза и способствует химиорезистентности.Сверхэкспрессия NEK2 и STK6 вносит вклад в нарушение регуляции клеточного цикла и, как следствие, анеуплоидию. Некоторые маркеры пролиферации также сверхэкспрессируются ( Sh3D1A, LCK, Rac2 и MAP4K1 ), что способствует общей выживаемости и антиапоптотическим путям.

Было показано, что c-MAF может изменять функцию клеток множественной миеломы путем активации CCR1 , рецептора хемокина MIP-1. Три гена-мишени MAF сверхэкспрессируются при множественной миеломе: CYCLIN D2, интегрин β7 и CCR1 .Повышенная экспрессия CYCLIN D2 усиливает пролиферацию, тогда как повышенный уровень интегрина β7 способствует адгезии к строме костного мозга и увеличивает выработку VEGF (27). В PTCL-NOS MAFB сверхэкспрессируется в 80 раз и важен для экспрессии гена IL-4 клетками Th3. Некоторые из генов-мишеней, активируемых c-MAF при множественной миеломе, также активируются в PTCL-NOS, которые включают VEGF (84-кратный), ITGA4 (88-кратный) и CCR1 ( В 39 раз), что подразумевает аберрантную пролиферацию, повышенную адгезию к окружающей строме, ангиогенез опухоли и нарушение иммунной регуляции (рис.3). Некоторые другие хемокины также сверхэкспрессируются и, вероятно, управляются MAFB и / или двумя другими сильно сверхэкспрессируемыми онкогенными факторами транскрипции FLI1 (100-кратно) и SPI1 (29-кратно). FLI1 способствует прогрессированию клеточного цикла путем подавления экспрессии ингибитора CDK p27kip1 (28), тогда как SPI1 обычно экспрессируется во всех линиях кроветворных клеток, кроме линий Т-клеток (29), но его аберрантная экспрессия может быть дополнительной механизм, который поддерживает размножение злокачественных лимфоцитов.

CCL2 сверхэкспрессируется в 100 раз и является мощным хемоаттрактантом для моноцитов, Т-лимфоцитов памяти и естественных клеток-киллеров. CCL2 является промотором опухоли (30), способным рекрутировать лейкоциты и обеспечивает ростовые сигналы для ангиогенеза опухоли. Некоторые ангиогенные рецепторы и лиганды сверхэкспрессируются в PTCL-NOS, который включает VEGF (84-кратный), α-PDGFR (26-кратный), CSF1R (19-кратный), β-PDGFR (19 -складывание), c-MET (7-кратное), HGF (24-кратное), PDGF-CC (5-кратное) и FGF7 (2.В 5 раз), все они, по-видимому, способствуют росту опухоли. CCL5 представляет собой хемоаттрактант с 120-кратной сверхэкспрессией, который связывается с несколькими рецепторами, включая CCR1 (39-кратный), CCR3, CCR4 и CCR5. CCL5 активирует транскрипцию MMP9 , что может способствовать ангиогенезу. Кроме того, полученный из опухоли CCL5 может подавлять Т-клеточный ответ и усиливать рост опухолей in vivo (31). CXCR4 сверхэкспрессируется в 79 раз и участвует в передаче лимфоцитов.При активации CXCR4 способствует инвазии клеток лимфомы в ткани через активированный LFA1 , который, в свою очередь, активирует киназы JAK и, как было показано, имеет важное значение для инвазии и метастазирования лимфомы (32).

Взаимодействие опухоль-строма играет важную роль в выживании лимфомных клеток. В PTCL-NOS IGFBP7 сверхэкспрессируется в ~ 130 раз, усиливает активность IGF и влияет на адгезию и миграцию клеток (33), потенциальный механизм инвазии опухоли. CTGF / CCN2 более чем в 100 раз, а CYR61 / CCN1 сверхэкспрессируется более чем в 70 раз и принадлежит к богатому цистеином секретируемому белку семейства CCN (34), который связывается с интегринами и модулирует инвазивное поведение раковых клеток.Некоторые компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ) увеличены и включают CHI3L1 (200-кратное), COL1A1 (177-кратное), FN1 (108-кратное), COL1A2 (103-кратное) и emilin (44-кратный), скорее всего, опосредованный CTGF / CYR61 (рис. 3). CYR61 , как было показано, усиливает онкогенность за счет активированной интегрин-связанной киназы для стимуляции путей передачи сигналов β-catenin-TCF / Lef и Akt (34).

Аберрантная клеточная пролиферация из-за нарушения регуляции клеточного цикла, по-видимому, опосредуется серин / треонинкиназой NEK2 , которая сверхэкспрессируется в 58 раз (рис.3) и располагается на центросоме. Сверхэкспрессия активного NEK2 вызывает расщепление центросом, тогда как пролонгированная экспрессия активного или неактивного NEK2 ведет к рассредоточению центросомного материала и потере сфокусированной активности зарождения микротрубочек (35). NEK2 также сверхэкспрессируется в трансформированной фолликулярной лимфоме и de novo DLBCL (36). STK6 (Aurora kinase-A) сверхэкспрессируется в 17 раз и играет роль в регуляции клеточного цикла во время анафазы и / или телофазы в отношении функции области полюса центросомы / веретена во время сегрегации хромосом.Дефект в STK6 отвечает за численные аберрации центросом, включая анеуплоидию, которая связана с его ролью в формировании и / или стабилизации микротрубочек (37).

Представлено несколько маркеров пролиферации, из которых Sh3D1A сверхэкспрессируется в 120 раз и связывается со специфическим мотивом в цитоплазматических доменах нескольких членов подсемейства CD2 рецепторов клеточной поверхности, где он блокирует рекрутирование тирозинфосфатазы SHP. -2 и предотвращает ингибирование сигнальных путей, активируемых тирозинкиназой (38). Rac2 сверхэкспрессируется в 107 раз и регулирует множество разнообразных клеточных событий, таких как рост клеток, реорганизация цитоскелета и активация протеинкиназ. Rac2 экспрессируется в тимоцитах и ​​активированных Т-клетках и может играть роль в контроле роста и гибели Т-клеток (39). LCK сверхэкспрессируется в 35 раз и фосфорилирует митоген-активированную протеинкиназу и L-селектин с последующей ассоциацией Grb2 / Sos с L-селектином. Эта ассоциация коррелирует с активацией p21ras, митоген-активируемой протеинкиназы и Rac2 и временным увеличением синтеза O 2 .Последний общий путь может включать L-селектин-ассоциированный CD3, управляемый ζ-цепью Т-клеточного рецептора антигена, пролиферацию клеток (40). TCIRG1 / TIRC7 сверхэкспрессируется в 54 раза, это новый белок вакуолярной протонной помпы, охватывающий семь трансмембран, который активируется на ранних стадиях активации Т-клеток в ответ на аллоантигены. Ингибирование TIRC7 подавляет пролиферацию активированных Т-клеток (41) и поддерживает идею о том, что он может играть важную роль в пролиферации PTCL.

В PTCL-NOS подавляется активность нескольких опухолевых супрессоров. TPTE кодирует родственную PTEN тирозинфосфатазу, подавляется в 99 раз и играет важную роль в подавлении передачи сигналов через тирозин-фосфорилированные белки (42). MGC15419 подавляется в 20 раз и может иметь решающее значение для контролируемой деградации клеточных регуляторных белков (43). PTCH подавляется в 6 раз и является рецептором sonic hedgehog, участвующим в формировании эмбриональных структур и онкогенезе.Мутации этого гена были связаны с синдромом невоидной базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномой, трихоэпителиомами и переходно-клеточной карциномой (44). ST5 подавляется в 5 раз и содержит COOH-концевую область, которая имеет сходство с семейством Rab3 малых GTP-связывающих белков. Этот белок преимущественно связывается с доменом Sh4 киназы c-Abl и действует как регулятор митоген-активируемой протеинкиназы 1 / киназы 2, регулируемой внеклеточными сигналами, что может способствовать ее способности снижать туморогенный фенотип в клетках (45). .

Несколько антиапоптотических белков представлены в PTCL-NOS. CD14 сверхэкспрессируется в 88 раз и действует через MyD88, TIRAP и TRAF6, что приводит к активации NF-κB, секреции цитокинов и воспалительной реакции (46). NF-κB2 сверхэкспрессируется в 44 раза и представляет собой фактор транскрипции, содержащий домены rel-polyG-анкирина. Перестройки гена NF-κB2 / p52 наблюдались у пациентов с лимфомой и, как было показано, вносят вклад в онкогенез, подавляя апоптоз и увеличивая пролиферацию в ответ на воспалительные цитокины (47–49).Недавнее исследование профилей экспрессии показало, что сигнальный путь NF-κB нарушен в PTCL-NOS (50), что указывает на участие этого воспалительного фактора транскрипции в поддержании путей выживания клеток. IL-18 сверхэкспрессируется в 39 раз и индуцирует продукцию IFN-γ в Т-клетках, а нарушение регуляции IL-18 и / или IL-18R при хронических В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях может способствовать ускользанию опухоли от хозяина. иммунная система за счет снижения экспрессии лиганда Fas. Более того, было показано, что он действует как новый ангиогенный медиатор, способствуя миграции эндотелиальных клеток (51).

Несколько проапоптотических генов подавлены. c-Jun представляет собой онкопротеин с пониженной регуляцией в 27 раз, который блокирует убиквитинирование опухолевого супрессора p53 и, таким образом, увеличивает стабильность p53 в нестрессированных клетках. Исследования мышиного аналога этого гена предполагают ключевую роль в дифференцировке Т-клеток (52). CED-6 подавляется в 22 раза и представляет собой эволюционно консервативный адаптерный белок, необходимый для эффективного поглощения апоптотических клеток и способствующий запрограммированной гибели клеток.Инактивирующие мутации в генах поглощения увеличивают частоту выживания клеток (53, 54). TNFRSF25 подавляется в 12 раз, экспрессируется преимущественно в тканях, обогащенных лимфоцитами, и играет роль в регуляции гомеостаза лимфоцитов. Было показано, что этот рецептор стимулирует активность NF-κB и регулирует апоптоз клеток. Альтернативный сплайсинг этого гена в В-клетках и Т-клетках сталкивается с запрограммированным изменением активации Т-клеток, которое преимущественно продуцирует полноразмерные мембраносвязанные изоформы и, как полагают, участвует в контроле пролиферации лимфоцитов, вызванной активацией Т-клеток ( 55).Следовательно, потеря функции приведет к неконтролируемой пролиферации Т-клеток.

Подпись профиля опухоли DLBCL

Модель прогнозирования профиля опухоли DLBCL очерчена на основе шести признаков рака (рис. ). Сеть хемокинов, по-видимому, действует и, вероятно, модулируется факторами транскрипции MAFB (гиперэкспрессия в 83 раза), FLI1, (сверхэкспрессия в 86 раз) и CRIP1 (сверхэкспрессия в 67 раз), богатая цистеином кишечный белок 1, содержащий мотив двойного цинкового пальца.Сверхэкспрессия CRIP у мышей вызывает дисбаланс в структуре цитокинов в пользу цитокинов Th3: низкий IFN-γ и высокий IL-6 и IL-10, которые изменяют иммунный ответ и, вероятно, способствуют избеганию иммунной атаки (56). CCL5 сверхэкспрессируется в 147 раз и связывает свой рецептор CCR1 , который сверхэкспрессируется в 82 раза. CCL5 , полученный из опухоли, может подавлять ингибирующий Т-клеточный ответ и усиливать рост лимфомы in vivo . Сверхэкспрессируется несколько проангиогенных лигандов и рецепторов, включая VEGF (66-кратный), PDGF-AA (15-кратный), CSF1R (14-кратный), β-PDGFR (11-кратный), MET (7-кратный), FGF13 (6-кратный) и PSMA (4-кратный), и, вероятно, индуцируется CCL5-CCR1 .Факторы, происходящие из стромы опухоли, такие как IGFBP7 , который сверхэкспрессируется в 107 раз (33) и, вероятно, вырабатывает несколько компонентов ECM, таких как CHI3L1 (84 раза), FN1 (60 раз), COL6A3 (49 раз), COL18A1 (47 раз) и ICAM2 (30 раз).

Рисунок 4.

Прогностическая модель, описывающая сигнатуру профиля опухоли DLBCL. Активация онкогенных факторов транскрипции ( MAFB, FLI1 и CRIP1 ) способствует сверхэкспрессии хемокинов ( CCL3, CCL5 и CXCL9 ) и рецептора хемокинов ( CCR1 ).Хемокиновая сеть, действующая аутокринным и паракринным образом, привлекает стромальные фибробласты, воспалительные иммунные клетки и эндотелиальные клетки, чтобы сформировать сложную сеть опухолевой ткани. Сверхэкспрессия интегрина LFA1 на опухолевых клетках и их партнеров по связыванию на стромальных клетках ( ICAM2 и ICAM3 ) способствует перекрестному взаимодействию опухоль-строма, которое активирует пролиферативные сигнальные пути ( JAK / STAT ) и образование ECM ( Lumican, FN1, COL6A3, COL18A1 и CHI3L1 ).Некоторые промоторы ангиогенеза опухолевого происхождения ( VEGF, PDGF-AA, FGF13, PDGFR, CSF1R и PSMA ) сверхэкспрессируются, что помогает поддерживать сложный ангиогенный процесс. Привлечение воспалительных иммунных клеток, которые усиливают рост опухоли и продукцию инвазивных факторов ( MET и IGFBP7 ), предвещает активированный B-подобный DLBCL. Более того, сверхэкспрессия пролиферативных факторов, управляемых NF-κB ( CD14, CD20, CD52, CD72 и CCR1 ), ингибирует многие формы апоптоза и способствует химиорезистентности.Сверхэкспрессия CCND2 и MUM1 способствует нарушению регуляции клеточного цикла и неконтролируемой пролиферации. Некоторые маркеры пролиферации также сверхэкспрессируются ( PIM1, PIM2, BCL2A1, RAB13 и MAP4K1 ), которые вносят вклад в общую выживаемость и антиапоптотические пути.

Представленные маркеры пролиферации включают CD20 (99-кратный), член семейства трансмембранных генов 4A, который функционирует как канал Ca 2+ , резидентный на B-лимфоцитах и ​​играет роль в развитии и дифференцировке В-клетки в плазматические клетки.Он является мишенью для ритуксимаба при В-клеточной неходжкинской лимфоме и демонстрирует отличную корреляцию между профилем экспрессии генов и иммуногистохимией (57). CD72 представляет собой 83-кратно сверхэкспрессируемый мембранный белок типа II суперсемейства лектинов С-типа и лиганд для CD5. Он играет роль в пролиферации и дифференцировке пре-B-клеток и B-клеток. Среди 83 злокачественных неходжкинских лимфом, оцененных с помощью иммуногистохимии, все 54 B-клеточные лимфомы, включая предшественники B-клеточных лимфом, были CD72-положительными, но окрашивание Т-клеточных лимфом не наблюдалось.Следовательно, CD72 является пролиферативным маркером, который кооперируется с CD20 и в DLBCL (58). RAB13 , GTPase, сверхэкспрессируется в 29 раз и регулирует сборку функциональных плотных контактов эпителия. Экспрессия GTP-связанной формы RAB13 ингибирует протеинкиназу A-зависимое фосфорилирование и рекрутирование плотных контактов стимулируемого вазодилататорами фосфопротеина, белка ремоделирования актина и, таким образом, может играть роль в инвазии и метастазировании (59).

В DLBCL два опухолевых супрессора подавляются. TPTE представляет собой 100-кратно подавляемую PTEN-родственную тирозинфосфатазу, которая, если она активна, отключает онкогенные пути, управляемые тирозинкиназой (42). SUI1 / MOF2 имеет 25-кратную понижающую регуляцию и функционирует как модулятор точности как на фазах инициации, так и на фазах удлинения трансляции (60). Трансфекция SUI1 человека в клетки гепатокарциномы HepG2 подавляла рост клеток в культуре в мягком агаре и частично подавляла образование опухоли у голых мышей (61).

Из антиапоптотических белков, которые сверхэкспрессируются, CD14 сверхэкспрессируется в 141 раз и, как известно, активирует NF-κB, что приводит к секреции воспалительных цитокинов (46) и воспалительной реакции, которая, вероятно, помогает избежать иммунной атаки. BCL2A1 сверхэкспрессируется в 107 раз, образует гетеродимеры или гомодимеры и участвует в широком спектре клеточных активностей, таких как эмбриональное развитие, гомеостаз и туморогенез. BCL2A1 является мишенью прямой транскрипции NF-κB в ответ на медиаторы воспаления и активируется различными внеклеточными сигналами, такими как гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор, CD40 и воспалительные цитокины ( TNF и IL-1 ), который обеспечивает цитопротекторную функцию, которая может иметь важное значение для активации лимфоцитов и выживания клеток (62).Мыши со сверхэкспрессией BCL2A1 продемонстрировали увеличенную выживаемость с измененным развитием B-клонов, что привело к экспансии субнабора про-B-клеток за счет пре-B-клеток, что свидетельствует о нарушении про-B-клеток до пре-B-клеток. клеточный переход (63). В патогенез DLBCL вовлечены несколько генов, которые, по-видимому, имеют прогностическое значение. Пациенты с зародышевым центром B-подобным DLBCL имеют наиболее благоприятный показатель излечения, тогда как пациенты с активированным B-подобным DLBCL или типом III имеют худшую выживаемость, что частично может быть связано со способностью пути NF-κB ингибировать внутренний апоптоз. и / или апоптоз, опосредованный химиотерапией (64).

Транскриптосомный анализ пациентов с PTCL-NOS и DLBCL выявил профиль молекулярной сигнатуры опухоли, который отличает В-клеточную от Т-клеточной неходжкинской лимфомы. В обоих типах неходжкинской лимфомы сигнальные пути воспалительных хемокинов, управляемые MAFB , играют критическую роль в стимулировании пролиферации, ангиогенеза, взаимодействий опухоль-строма и иммунного бегства, хотя различные ключевые игроки, скорее всего, отражают специфичность клонов. В настоящее время возможны клинические испытания фазы I, нацеленные на PDGFR (Gleevec), MET (Mab на HGF ), STK6 (ингибиторы АК) и CD52 (CAMPATH-1H) в этих условиях.

Благодарности

Мы благодарим Эллен Чейз за координацию этого проекта и Нихила Ширахатти за техническую помощь в подготовке статьи.

Сноски

  • Грантовая поддержка: Southwest Oncology Group грант CA-32102, субподряд 03041.

  • Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому данная статья должна быть обозначена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

    • Принято 27 сентября 2005 г.
    • Получено 10 мая 2005 г.
    • Исправление получено 21 июля 2005 г.
  • Американская ассоциация исследований рака

Ссылки

  1. Harris Jaffe NL, Vardiman JW, Stein H. Патология и генетика: новообразования кроветворной и лимфоидной тканей. В: Kleihues P, Sobin L, редакторы. Классификация опухолей ВОЗ.Лион: IARC Press; 2001.

  2. Chan JK. Периферические Т-клеточные и NK-клеточные новообразования: комплексный подход к диагностике. Мод Патол 1999; 12: 177–99.

  3. Lippman SM, Miller TP, Spier CM, Slyman DJ, Grogan TM. Прогностическое значение иммунотипа при диффузной крупноклеточной лимфоме: сравнительное исследование Т-клеточного и В-клеточного фенотипа. Кровь 1988; 742: 436–41.

  4. Coiffier B, Brousse N, Peuchmaur M, et al.Периферические Т-клеточные лимфомы имеют худший прогноз, чем В-лимфомы: проспективное исследование 361 иммунофенотипированного пациента, получавшего схему LNH-84. Энн Онкол 1990; 1: 45–50.

  5. Gisselbrecht C, Gaulard P, Lepage E, et al. Прогностическое значение Т-клеточного фенотипа при агрессивных неходжкинских лимфомах. Кровь 1998; 92: 76–82.

  6. Drenou B, Amiot L, Lamy T., LePrise PY, Fauchet R. Множественная лекарственная устойчивость при агрессивных лимфопролиферативных заболеваниях Т и генов естественных киллеров.Лимфома Лейка 1988; 30: 381–7.

  7. Pescarmona E, Pignoloni P, Santangelo C и др. Экспрессия гена р53 и ретинобластомы в узловых периферических Т-клеточных лимфомах высокой степени злокачественности. Иммуногистохимические и молекулярные данные свидетельствуют о различных патогенных путях и возможных клинических последствиях. Дж. Патол 1999; 1188: 400–6.

  8. Gorczyca W, Weisberger J, Liu Z, et al. Подход к диагностике лимфопролиферативных нарушений Т-лимфоцитов с помощью проточной цитометрии.Cytomtery 2002; 50: 177–90.

  9. Greer JP. Лимфопролиферативные нарушения Т-клеток и NK-клеток. Следует ли лечить периферическую Т-клеточную лимфому иначе, чем большую В-клеточную лимфому. Am Soc Hematol Educ Program Book 2001: 268–81.

  10. Цеттл А., Рудигер Т., Конрад М.А. и др. Геномное профилирование периферической Т-клеточной лимфомы, неуточненной и анапластической большой Т-клеточной лимфомы позволяет выявить новые повторяющиеся хромосомные изменения. Ам Дж. Патол 2004; 164: 1837–48.

  11. Tsuchiya T., Ohshima K, Karube K и др. Th2, Th3 и маркер активированных Т-клеток и клинический прогноз при периферической Т-клеточной лимфоме неуточненный: сравнение с AILD, ALCL, лимфобластной лимфомой и ATLL. Кровь 2004; 103: 236–41.

  12. Ализаде А.А., Эйзен М.Б., Дэвис Р.Э. и др. Определенные типы диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, идентифицированные с помощью профилирования экспрессии генов. Природа 2000; 403: 503–11.

  13. Розенвальд А., Райт Г., Чан В.С. и др.Использование молекулярного профилирования для прогнозирования выживаемости после химиотерапии диффузной В-крупноклеточной лимфомы. N Engl J Med 2002; 346: 1937–47.

  14. Райт Г., Тан Б., Розенвальд А. и др. Основанный на экспрессии генов метод диагностики клинически различных подгрупп диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 9991–6.

  15. Шипп М.А., Росс К.Н., Тамайо П. и др. Распространение прогноза исхода крупноклеточной В-клеточной лимфомы с помощью профилирования экспрессии генов и контролируемого машинного обучения.Нат Мед 2002; 8: 68–74.

  16. Hans CP, Weisenberger DD, Greiner TC, et al. Подтверждение молекулярной классификации диффузной В-крупноклеточной лимфомы с помощью иммуногистохимии с использованием тканевого микрочипа. Кровь 2004; 103: 275–82.

  17. Chang CC, McClintock S, Cleveland RP, et al. Иммуногистохимические паттерны экспрессии зародышевого центра и маркеров активированных B-клеток коррелируют с прогнозом при диффузной большой B-клеточной лимфоме. Am J Surg Pathol 2004; 28: 464–70.

  18. Лоссос И.С., Червински Д.К., Ализаде А.А. и др. Прогнозирование выживаемости при диффузной В-крупноклеточной лимфоме на основе экспрессии шести генов. N Engl J Med 2004; 350: 1828–37.

  19. Ханахан Д., Вайнберг, РА. Признаки рака. Cell 2000; 100: 57–70.

  20. Jaramillo M, Rangel C, Grogan T. Иммуногистохимия лейкозов и лимфом. Методы Мол Мед 2000; 55: 301–19.

  21. Grogan TM, Rangel C, Rimsza L, Rybski J, Zehab R.Клинические и исследовательские применения быстрой автоматизированной иммуногистохимии с двойной меткой в ​​кинетическом режиме и гибридизации in situ и . Adv Pathol Lab Med 1995; 8: 79–99.

  22. Hans CP, Weisenburger DD, Greiner TC, et al. Подтверждение молекулярной классификации диффузной В-крупноклеточной лимфомы с помощью иммуногистохимии с использованием тканевого микрочипа. Кровь 2004; 103: 275–82.

  23. Лоссос И.С., Червински Д.К., Ализаде А.А. и др.Прогнозирование выживаемости при диффузной В-крупноклеточной лимфоме на основе экспрессии шести генов. N Engl J Med 2004; 350: 1828–37.

  24. Gisselbrecht C, Gaulard P, Lepage E, et al. Прогностическое значение Т-клеточного фенотипа при агрессивных неходжкинских лимфомах. Groupe d’Etudes des Lymphomes de l’Adulte (GELA). Кровь 1998; 92: 76–82.

  25. Балквилл Ф. Рак и сеть хемокинов. Нат Рев Рак 2004; 4: 540–50.

  26. Ohshima K, Karube K, Kawano R, et al.Классификация отдельных подтипов неуточненной периферической Т-клеточной лимфомы, идентифицированных по экспрессии хемокинов и хемокиновых рецепторов: анализ прогноза. Инт Дж. Онкол 2004; 25: 605–13.

  27. Hurt EM, Wiestner A, Rosenwald A, et al. Избыточная экспрессия c-maf является частым онкогенным явлением при множественной миеломе, которое способствует пролиферации и патологическим взаимодействиям со стромой костного мозга. Cancer Cell 2004; 5: 191–9.

  28. Мацунобу Т., Танака К., Мацумото Ю. и др.Прогностическое и терапевтическое значение p27kip1 в семейных опухолях Юинга. Clin Cancer Res 2004; 10: 1003–12.

  29. Delgado MD, Hallier M., Meneceur P, Tavitian A, Moreau-Gachelin F. Ингибирование пролиферации клеток Friend антисмысловыми олигодезоксинуклеотидами spi-1. Онкоген 1994; 9: 1723–7.

  30. Conti I, Rollins BJ. CCL2 (хемоаттрактантный белок-1 моноцитов) и рак. Semin Cancer Biol 2004; 14: 149–54.

  31. Adler EP, Lemken CA, Katchen NS, Kurt RA.Двойная роль хемокина RANTES (CCL5), полученного из опухоли. Immunol Lett 2003; 90: 187–94.

  32. Opdam FJ, Kamp M, de Bruijn R, Roos E. Активность киназы Jak необходима для инвазии и метастазирования лимфомы. Онкоген 2004; 23: 6647–53.

  33. Chen Y, Abraham DJ, Shi-Wen X и др. CCN2 (фактор роста соединительной ткани) способствует адгезии фибробластов к фибронектину. Mol Biol Cell 2004; 15: 5635–46.

  34. Xie D, Yin D, Tong X и др.Cyr61 сверхэкспрессируется в глиомах и участвует в путях передачи сигналов Akt и β-catenin-TCF / Lef, опосредованных интегрин-связанной киназой. Cancer Res 2004; 64: 1987–96.

  35. Фрай AM, Meraldi P, Nigg EA. Центросомная функция протеинкиназы Nek2 человека, члена семейства регуляторов клеточного цикла NIMA. EMBO J 1998; 17: 470–81.

  36. de Vos S, Hofmann WK, Grogan TM, et al. Профиль экспрессии генов серийных образцов трансформированных В-клеточных лимфом.Lab Invest 2003: 83: 271–85.

  37. Vankayalapati H, Bearss DJ, Saldanha JW, et al. Ориентация на киназу aurora2 в онкогенезе: подход структурной биоинформатики к целевой валидации и рациональному дизайну лекарств. Mol Cancer Ther 2003; 2: 283–94.

  38. Льюис Дж., Эйбен Л. Дж., Нельсон Д. Л. и др. Отчетливые взаимодействия продукта гена Х-сцепленного лимфопролиферативного синдрома SAP с цитоплазматическими доменами членов семейства рецепторов CD2. Clin Immunol 2001; 100: 15–23.

  39. Lores P, Morin L, Luna R, Gacon G. Усиленный апоптоз в тимусе трансгенных мышей, экспрессирующих конститутивно активированные формы Rac2GTPase человека. Онкоген 1997; 15: 601–5.

  40. Бреннер Б., Гулбинс Э., Шлоттманн К. и др. L-селектин активирует путь Ras через тирозинкиназу p56lck. Proc Natl Acad Sci U S. A 1996; 93: 15376–81.

  41. Kumamoto Y, Tomschegg A, Bennai-Sanfourche F, et al.Моноклональные антитела, специфичные к TIRC7, вызывают специфическую для донора анергию и предотвращают отторжение сердечных аллотрансплантатов у мышей. Am J Transplant 2004; 4: 505–14.

  42. Tapparel C, Reymond A, Girardet C и др. Семейство генов TPTE: клеточная экспрессия, субклеточная локализация и альтернативный сплайсинг. Джин 2003; 323: 189–99.

  43. Пауэлл Дж. А., Гарднер А. Е., Байс А. Дж. И др. Секвенирование, идентификация транскриптов и количественное определение профиля экспрессии генов при потере области гетерозиготности раком груди 16q24.3 выявляют три потенциальных гена-супрессора опухоли. Геномика 2002; 80: 303–10.

  44. Taipale J, Cooper MK, Maiti T, Beachy PA. Patched действует каталитически, подавляя активность Smoothened. Природа 2002; 418: 892–7.

  45. Majidi M, Gutkind JS, Lichy JH. Делеция COOH-конца превращает белок p70 ST5 из ингибитора передачи сигналов RAS в активатор с трансформирующей активностью в клетках NIH-3T3. J. Biol Chem. 2000; 275: 6560–5.

  46. Базил В., Баудис М., Хильгерт И. и др. Структурная взаимосвязь между растворимыми и мембраносвязанными формами поверхностного гликопротеина моноцитов человека CD14. Мол Иммунол 1989; 26: 657–62.

  47. Neri A, Chang CC, Lombardi L, et al. Хромосомная транслокация, связанная с В-клеточной лимфомой, включает онкоген-кандидат lyt-10, гомологичный NF-κB p50. Cell 1991; 67: 1075–87.

  48. Greten FR, Eckmann L, Greten TF и ​​др.IKKβ связывает воспаление и онкогенез на мышиной модели рака, ассоциированного с колитом. Cell 2004; 118: 285–96.

  49. Пикарский Э., Порат Р.М., Штейн И. и др. NF-κB функционирует как промотор опухоли при раке, ассоциированном с воспалением. Природа 2004; 431: 461–6.

  50. Мартинес-Дельгадо Б., Мелендес Б., Куадрос М. и др. Профили экспрессии Т-клеточных лимфом позволяют дифференцировать периферические и лимфобластные лимфомы и определять гены, связанные с выживанием.Clin Cancer Res 2004; 10: 4971–82.

  51. Park CC, Morel JC, Amin MA, Connors MA, Harlow LA, Koch AE. Доказательства того, что IL-18 является новым ангиогенным медиатором. J Immunol 2001; 167: 1644–53.

  52. Юн Х.С., Ким Х.А. Прологация N-концевой киназы c-Jun связана с гибелью клеток, вызванной фактором некроза опухоли α в хондроцитах человека. J Korean Med Sci 2004; 19: 567–73.

  53. Лю QA, Хенгартнер, штат Миссури. CED-6 человека кодирует функциональный гомолог белка поглощения Caenorhabditis elegans CED-6.J Curr Biol 1999; 9: 1347–50.

  54. Reddien PW, Cameron S, Horvitz HR. Фагоцитоз способствует запрограммированной гибели клеток у C. elegans . Природа 2001; 412: 198–202.

  55. Screaton GR, Xu XN, Olsen AL и др. LARD: новый лимфоид-специфический домен смерти, содержащий рецептор, регулируемый альтернативным сплайсингом пре-мРНК. Proc Natl Acad Sci U S. A 1997; 94: 4615–9.

  56. Lanningham-Foster L, Green CL, Langkamp-Henken B, et al.Сверхэкспрессия CRIP у трансгенных мышей изменяет структуру цитокинов и иммунный ответ. Am J Physiol Endocrinol Metab 2002; 282: 1197–203.

  57. Плоскер Г.Л., Фиггитт Д.П. Ритуксимаб: обзор его использования при неходжкинской лимфоме и хроническом лимфолейкозе. Наркотики 2003; 63: 803–43.

  58. Швартинг Р., Кастелло Р., Молденхауэр Г. и др. CD72, гомолог Lyb-2 человека, является маркером предшественников В-клеточных лейкозов. Am J Hematol 1992; 41: 151–8.

  59. Колер К., Лувард Д., Захрауи А. Rab13 регулирует передачу сигналов PKA во время плотного соединения. J Cell Biol 2004; 165: 175–80.

  60. Cui Y, Dinman JD, Kinzy TG, Peltz SW. Белок Mof2 / Sui1 является общим монитором точности трансляции. Mol Cell Biol 1998; 18: 1506–16.

  61. Лиан З., Пан Дж., Лю Дж. И др. Фактор инициации трансляции hu-Sui1 может быть мишенью антигена гепатита B X в гепатоканцерогенезе.Онкоген 1999; 18: 1677–87.

  62. Wang CY, Guttridge DC, Mayo MW, Baldwin AS, Jr. NF-κB индуцирует экспрессию гомолога Bcl-2 A1 / Bfl-1 для преимущественного подавления апоптоза, индуцированного химиотерапией. Mol Cell Biol 1999; 19: 5923–9.

  63. Chuang PI, Morefield S, Liu CY, Chen S, Harlan JM, Willerford DM. Нарушение развития В-клеток у мышей, сверхэкспрессирующих гомолог A1 Bcl-2. Кровь 2002; 99: 3350–9.

  64. Шаффер А.Л., Розенвальд А., Штаудт Л.М.Лимфоидные злокачественные новообразования: темная сторона дифференцировки В-клеток. Нат Рев Иммунол 2002; 2: 920–32.

Новый транскрипт LncRNA, RBAT1, ускоряет онкогенез за счет взаимодействия с HNRNPL и цис-активацией E2F3 | Молекулярный рак

  • 1.

    Батиста П.Дж., Чанг Х.Й. Длинные некодирующие РНК: клеточные адресные коды в развитии и болезни. Клетка. 2013; 152: 1298–307.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 2.

    Чех TR, Steitz JA. Революция некодирующей РНК меняет старые правила и создает новые. Клетка. 2014; 157: 77–94.

    CAS PubMed Google ученый

  • 3.

    Guttman M, Rinn JL. Модульные принципы регуляции больших некодирующих РНК. Природа. 2012; 482: 339–46.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 4.

    Канеко С., Бонасио Р., Салдана-Мейер Р., Йошида Т., Сон Дж., Нишино К., Умедзава А., Рейнберг Д.Взаимодействия между JARID2 и некодирующими РНК регулируют рекрутирование PRC2 на хроматин. Mol Cell. 2014; 53: 290–300.

    CAS PubMed Google ученый

  • 5.

    МакХью С., Чен С., Чоу А., Сурка С., Тран С., Макдонел П., Пандья-Джонс А., Бланко М., Бургхард С., Морадиан А. и др. ДнРНК Xist взаимодействует напрямую с SHARP, чтобы заглушить транскрипцию через HDAC3. Природа. 2015; 521: 232–6.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 6.

    Schmitt AM, Chang HY. Длинные некодирующие РНК в путях рака. Раковая клетка. 2016; 29: 452–63.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 7.

    Gutschner T, Diederichs S. Признаки рака: точка зрения на длинную некодирующую РНК. RNA Biol. 2012; 9: 703–19.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 8.

    Юэ Б, Цай Д.Л., Лю С.К., Фанг Ц.Й., Ян Д.В.Linc00152 действует как конкурирующая эндогенная РНК, обеспечивая устойчивость к оксалиплатину и имеет прогностическую ценность при раке толстой кишки. Mol Ther. 2016; 24: 2064–77.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 9.

    Клингенберг М., Гросс М., Гоял А., Поликарпу-Шварц М., Мирш Т., Эрнст А.С., Леупольд Дж., Патил Н., Варнкен Ю., Аллгайер Х и др. ДнРНК CASC9 и РНК-связывающий белок HNRNPL образуют комплекс и совместно регулируют гены, связанные с передачей сигналов AKT.Гепатология. 2018; 68: 1817–32.

  • 10.

    Чен З.З., Хуанг Л., Ву ЙХ, Чжай В.Дж., Чжу П.П., Гао Ю.Ф. LncSox4 способствует самообновлению клеток, инициирующих опухоль печени, посредством Stat3-опосредованной экспрессии Sox4. Nat Commun. 2016; 7: 12598.

  • 11.

    Чай П., Цзя Р., Цзя Р., Пан Х, Ван С., Ни Х, Ван Х, Чжоу С., Ши И, Ге С. и др. Динамическая хромосомная настройка нового драйвера GAU1 lncing на chr12p13.32 ускоряет онкогенез. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 6041–56.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 12.

    Sheng L, Wu J, Gong X, Dong D, Sun X. SP1-индуцированная активация днРНК PANDAR предсказывает неблагоприятные фенотипы в ретинобластоме и регулирует рост клеток и апоптоз in vitro и in vivo. Ген. 2018; 668: 140–5.

    CAS PubMed Google ученый

  • 13.

    Ортиз М.В., Дункель И.Дж. Ретинобластома. J Child Neurol. 2016; 31: 227–36.

    PubMed Google ученый

  • 14.

    Добрух Дж., Данешманд С., Фиш М., Лотан Ю., Нун А. П., Резник М. Дж., Шариат С.Ф., Злотта А.Р., Бурджян С.А. Пол и рак мочевого пузыря: совместный обзор этиологии, биологии и результатов. Eur Urol. 2016; 69: 300–10.

    PubMed Google ученый

  • 15.

    Sun M, Nie F, Wang Y, Zhang Z, Hou J, He D, Xie M, Xu L, De W, Wang Z, Wang J. LncRNA HOXA11-AS способствует пролиферации и инвазии рака желудка путем создания каркаса факторов модификации хроматина PRC2, LSD1 и DNMT1.Cancer Res. 2016; 76: 6299–310.

    CAS PubMed Google ученый

  • 16.

    Chu C, Chang HY. Понимание взаимодействий РНК-хроматин с использованием выделения хроматина путем очистки РНК (ChIRP). Методы Мол биол. 2016; 1480: 115–23.

    CAS PubMed Google ученый

  • 17.

    Chu C, Chang HY. ChIRP-MS: РНК-направленное протеомное открытие. Методы Мол биол. 1861; 2018: 37–45.

    Google ученый

  • 18.

    Чу К., Куинн Дж., Чанг Х.Й. Выделение хроматина путем очистки РНК (ChIRP). J Vis Exp. 2012; 61: 1–6.

  • 19.

    Чанг SW, Юэ Дж, Ван BC, Чжан XL. miR-503 подавляет пролиферацию клеток и индуцирует апоптоз в клетках колоректального рака, воздействуя на E2F3. Int J Clin Exp Pathol. 2015; 8: 12853–60.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 20.

    Yang B, Du K, Yang C, Xiang L, Xu Y, Cao C, Zhang J, Liu W. Кольцевая РНК CircPRMT5 способствует пролиферации колоректального рака посредством размягчения miR-377 для индукции экспрессии E2F3. J Cell Mol Med. 2020; 24: 3431–7.

  • 21.

    Feng Z, Peng C, Li D, Zhang D, Li X, Cui F, Chen Y, He Q. E2F3 способствует росту рака и сверхэкспрессируется из-за изменения количества копий в меланоме человека. Onco Targets Ther. 2018; 11: 5303–13.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Луан В., Чжоу З., Ни Х, Ся Й, Ван Дж, Ян Y, Сюй Б. Длинная некодирующая РНК h29 способствует метаболизму глюкозы и росту клеток в злокачественной меланоме через ось miR-106a-5p / E2F3. J Cancer Res Clin Oncol. 2018; 144: 531–42.

    CAS PubMed Google ученый

  • 23.

    Noguchi S, Mori T, Otsuka Y, Yamada N, Yasui Y, Iwasaki J, Kumazaki M, Maruo K, Akao Y. Антионкогенная микроРНК-203 индуцирует старение путем воздействия на белок E2F3 в клетках меланомы человека.J Biol Chem. 2012; 287: 11769–77.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 24.

    Xia Y, Zhou Y, Han H, Li P, Wei W, Lin N. lncRNA NEAT1 способствует пролиферации, миграции и инвазии клеток меланомы посредством регуляции miR-495-3p и E2F3. J. Cell Physiol. 2019; 234: 19592–601.

    CAS PubMed Google ученый

  • 25.

    Зехави Л., Шайек Х., Якоб-Хирш Дж., Сиди Й., Лейбовиц-Амит Р., Авни Д.MiR-377 нацелен на E2F3 и изменяет сигнальный путь NF-kB через MAP 3K7 при злокачественной меланоме. Молочный рак. 2015; 14:68.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 26.

    Фебер А., Кларк Дж., Гудвин Дж., Додсон А.Р., Смит П.Х., Флетчер А., Эдвардс С., Флор П., Фалконер А., Роу Т. и др. Амплификация и сверхэкспрессия E2F3 при раке мочевого пузыря человека. Онкоген. 2004; 23: 1627–30.

    CAS PubMed Google ученый

  • 27.

    Huang L, Luo J, Cai Q, Pan Q, Zeng H, Guo Z, Dong W, Huang J, Lin T. MicroRNA-125b подавляет развитие рака мочевого пузыря, воздействуя на E2F3. Int J Cancer. 2011; 128: 1758–69.

    CAS PubMed Google ученый

  • 28.

    Oeggerli M, Schraml P, Ruiz C, Bloch M, Novotny H, Mirlacher M, Sauter G, Simon R. E2F3 является основным целевым геном ампликона 6p22 с высокой специфичностью для рака мочевого пузыря человека. Онкоген. 2006; 25: 6538–43.

    CAS PubMed Google ученый

  • 29.

    Oeggerli M, Tomovska S, Schraml P, Calvano-Forte D, Schafroth S, Simon R, Gasser T, Mihatsch MJ, Sauter G. Амплификация и сверхэкспрессия E2F3 связаны с инвазивным ростом опухоли и быстрой пролиферацией опухолевых клеток при раке мочевого пузыря. Онкоген. 2004. 23: 5616–23.

    CAS PubMed Google ученый

  • 30.

    Леуччи Э, Вендрамин Р., Спинацци М., Лоретт П., Фиерс М., Воутерс Дж., Радаэлли Э., Эйкерман С., Леонелли С., Вандерхейден К. и др. Пристрастие меланомы к длинной некодирующей РНК САММСОНА. Природа. 2016; 531: 518–22.

    CAS PubMed Google ученый

  • 31.

    Geisler S, Coller J. РНК в неожиданных местах: длинные некодирующие функции РНК в различных клеточных контекстах. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14: 699–712.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Ли З, Чао Т.К., Чанг К.Ю., Линь Н., Патил В.С., Шимицу К., руководитель СР, Бернс Дж.К., Рана TM. Длинная некодирующая РНК THRIL регулирует экспрессию TNFalpha посредством взаимодействия с hnRNPL. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111: 1002–7.

    CAS PubMed Google ученый

  • 33.

    Гупта Р.А., Шах Н., Ван К.С., Ким Дж., Хорлингс Х.М., Вонг Ди-джей, Цай М.К., Хунг Т., Аргани П., Ринн Дж. Л. и др. Длинная некодирующая РНК HOTAIR перепрограммирует состояние хроматина, способствуя метастазированию рака.Природа. 2010; 464: 1071–6.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Tripathi V, Ellis JD, Shen Z, Song DY, Pan Q, Watt AT, Freier SM, Bennett CF, Sharma A, Bubulya PA, et al. Сохраняющаяся в ядре некодирующая РНК MALAT1 регулирует альтернативный сплайсинг путем модуляции фосфорилирования фактора сплайсинга SR. Mol Cell. 2010; 39: 925–38.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 35.

    Улицкий I, Бартель ДП. lincRNA: геномика, эволюция и механизмы. Клетка. 2013; 154: 26–46.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 36.

    Klattenhoff CA, Scheuermann JC, Surface LE, Bradley RK, Fields PA, Steinhauser ML, Ding H, Butty VL, Torrey L, Haas S и др. Braveheart, длинная некодирующая РНК, необходимая для привязки к сердечно-сосудистой системе. Клетка. 2013; 152: 570–83.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 37.

    Zhu Y, Rowley MJ, Bohmdorfer G, Wierzbicki AT. Комплекс SWI / SNF, ремоделирующий хроматин, действует в некодирующем РНК-опосредованном подавлении транскрипции. Mol Cell. 2013; 49: 298–309.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 38.

    Чатурведи Л.С., Ван К., Мор С.К., Фомхоф-Декрей Е.Е., Бассон М.Д. Schlafen 12 опосредует эффекты бутирата и повторяющейся механической деформации на дифференцировку кишечного эпителия в эпителиальных клетках кишечника человека Caco-2.Hum Cell. 2019; 32: 240–50.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Коваленко П.Л., Фазон М.Д. Экспрессия Schlafen 12 модулирует дифференцировку клеток рака простаты. J Surg Res. 2014; 190: 177–84.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 40.

    Паумард-Эрнандес Б., Кальвете О, Инглада Перес Л., Техеро Х., Аль-Шахрур Ф., Пита Дж., Баррозу А., Карлос Тривино Дж., Уриосте М., Вальверде С. и др.Полное секвенирование экзома идентифицирует PLEC, EXO5 и DNAH7 как новые гены предрасположенности к раку яичек. Int J Cancer. 2018; 143: 1954–62.

    CAS PubMed Google ученый

  • 41.

    Manley JL, Tacke R. SR белки и контроль сплайсинга. Genes Dev. 1996; 10: 1569–79.

    CAS PubMed Google ученый

  • 42.

    Фэй Т., Чен И, Сяо Т., Ли В., Като Л., Чжан П., Коттер М.Б., Боуден М., Лис Р.Т., Чжао С.Г. и др.Полногеномный CRISPR-скрининг определяет HNRNPL как зависимость от рака простаты, регулирующую сплайсинг РНК. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017; 114: E5207-15.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 43.

    Никнафс Ю.С., Хан С., Ма Т., Шпирс К., Чжан С., Уайлдер-Романс К., Айер М.К., Пичиая С., Малик Р., Хосоно И. и др. Пейзаж lncRNA рака молочной железы показывает роль DSCAM-AS1 в прогрессировании рака молочной железы. Nat Commun.2016; 7: 12791.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 44.

    Wu L, Timmers C, Maiti B, Saavedra HI, Sang L, Chong GT, Nuckolls F, Giangrande P, Wright FA, Field SJ, et al. Факторы транскрипции E2F1-3 необходимы для пролиферации клеток. Природа. 2001; 414: 457–62.

    CAS PubMed Google ученый

  • 45.

    Humbert PO, Verona R, Trimarchi JM, Rogers C, Dandapani S, Lees JA.E2f3 имеет решающее значение для нормальной клеточной пролиферации. Genes Dev. 2000; 14: 690–703.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 46.

    Olsson AY, Feber A, Edwards S, Te Poele R, Giddings I, Merson S, Cooper CS. Роль экспрессии E2F3 в модулировании скорости клеточной пролиферации в клетках рака мочевого пузыря и простаты человека. Онкоген. 2007; 26: 1028–37.

    CAS PubMed Google ученый

  • 47.

    Триха П., Шарма Н., Пена К., Рейес А., Пекот Т., Хуршид С., Раване М., Моффит Дж., Стивенс Дж. А., Фернандес С. А. и др. E2f3 в опухолевых макрофагах способствует метастазированию в легкие. Онкоген. 2016; 35: 3636–46.

    CAS PubMed Google ученый

  • 48.

    Grasemann C, Gratias S, Stephan H, Schuler A, Schramm A, Klein-Hitpass L, Rieder H, Schneider S, Kappes F, Eggert A, Lohmann DR. Прирост и сверхэкспрессия идентифицируют DEK и E2F3 как мишени прироста хромосомы 6p в ретинобластоме.Онкоген. 2005; 24: 6441–9.

    CAS PubMed Google ученый

  • 49.

    Lujambio A, Calin GA, Villanueva A, Ropero S, Sanchez-Cespedes M, Blanco D, Montuenga LM, Rossi S, Nicoloso MS, Faller WJ, et al. Сигнатура метилирования ДНК микроРНК для метастазов рака человека. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2008; 105: 13556–61.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 50.

    Xu T, Zhu Y, Xiong Y, Ge YY, Yun JP, Zhuang SM. МикроРНК-195 подавляет онкогенность и регулирует G1 / S-переход клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека. Гепатология. 2009. 50: 113–21.

    CAS PubMed Google ученый

  • 51.

    Ван И, Хе Л, Ду И, Чжу П, Хуан Г, Ло Дж, Ян Х, Йе Б, Ли Ц, Ся П и др. Длинная некодирующая РНК lncTCF7 способствует самообновлению стволовых клеток рака печени человека посредством активации передачи сигналов Wnt.Стволовая клетка. 2015; 16: 413–25.

    CAS PubMed Google ученый

  • 52.

    Lohmann DR, Gallie BL. Ретинобластома: новый взгляд на прототип модели наследственного рака. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2004; 129С: 23–8.

    PubMed Google ученый

  • 53.

    Goodrich D, Wang N, Qian Y, Lee E, Lee W. Продукт гена ретинобластомы регулирует прохождение фазы G1 клеточного цикла.Клетка. 1991; 67: 293–302.

    CAS PubMed Google ученый

  • 54.

    Димарас Х., Хетан В., Халлидей В., Орлик М., Пригода Н.Л., Пиовесан Б., Маррано П., Корсон Т.В., Игл Р.С. Младший, Сквайр Д.А., Галли Б.Л. Потеря RB1 вызывает непролиферативную ретиному: увеличение нестабильности генома коррелирует с прогрессированием ретинобластомы. Hum Mol Genet. 2008; 17: 1363–72.

    CAS PubMed Google ученый

  • 55.

    Chong JL, Wenzel PL, Saenz-Robles MT, Nair V, Ferrey A, Hagan JP, Gomez YM, Sharma N, Chen HZ, Ouseph M, et al. E2f1-3 переключается с активаторов в клетках-предшественниках на репрессоры в дифференцирующихся клетках. Природа. 2009; 462: 930–4.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 56.

    Xing Z, Lin A, Li C, Liang K, Wang S, Liu Y, Park PK, Qin L, Wei Y, Hawke DH и др. lncRNA направляет кооперативную эпигенетическую регуляцию ниже хемокиновых сигналов.Клетка. 2014; 159: 1110–25.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • (PDF) Экспрессия транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином, в поджелудочной железе европейского бизона

    Med. Weter. 2019, 75 (11), 669-672672

    и уменьшение секреции глюкагона (1). Кроме того,

    были продемонстрированы некоторые защитные свойства CART по отношению к бета-клеткам крысы

    (19).Какое значение

    означает обнаружение того, что в эндокринной поджелудочной железе

    европейского бизона отсутствуют CART-экспрессирующие эндокринные клетки

    , в настоящее время является предметом спекуляций, но предполагает

    , что некоторые виды диких животных могут иметь разные

    Патогенез диабета 2 типа, связанного с CART.

    В заключение, мы впервые продемонстрировали

    регион-специфические паттерны экспрессии CART

    поджелудочной железы европейского бизона.Полученные результаты показывают, что

    у этого вида животных CART может влиять на

    как эндокринную, так и экзокринную функции. Отсутствие

    эндокринных клеток CART-IR у европейского бизона вызывает

    новых вопросов, касающихся физиологической и

    патологической роли (ей) этого нейропептида у животных

    , живущих в дикой природе.

    Ссылки

    1. Абельс М., Рива М., Беннет Х., Ахлквист Э., Дьячок О., Нагарадж В.,

    Щербина Л., Фред Р.Г., Пун В., Серхеде-Винцелл М., Фадиста Дж.,

    Линдквист А., Каск Л., Сатаноори Р., Деккер-Нитерт М., Кухар М.Дж., Арен Б. ,

    Wollheim CB, Hansson O., Tengholm A., Fex M., Renström E., Groop L.,

    Lyssenko V., Wierup N .: CART сверхэкспрессируется в островках диабета 2 типа

    человека и ингибирует глюкагон. секреция и увеличивает секрецию инсулина. Диабетология

    2016, 59, 1928-1937.

    2. Арцишевский М.B., Barabasz S., Skobowiat C., Maksymowicz W., Majewski M .:

    Иммунодетекция транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином, в

    рубце, сетке, омасуме и сычуге овец. Анат. Histol.

    Эмбриол. 2009, 38, 62-67.

    3. Arciszewski M. B., Całka J., Majewski M .: Регулируемый транскрипт кокаина и амфетамина

    (CART) экспрессируется в поджелудочной железе овцы. Анна. Анат.

    2008, 190, 292-299.

    4. Брук-Смит М.Е., Карати К. Дж., Бхандари М., Тоули Дж., Сакконе Г. Т .:

    Галанин в регуляции перфузии сосудов поджелудочной железы. Поджелудочная железа 2008,

    36, 267-273.

    5. Коулз Р. А., Сегура Б. Дж., Малхолланд М. В. Стимуляция экзокринной секреции поджелудочной железы крысы

    с помощью транскриптного пептида, регулируемого кокаином и амфетамином.

    Рег. Pept. 2001, 99, 61-68.

    6. Доленшек Ю., Рупник М. С., Стожер А. Структурные сходства и различия

    между поджелудочной железой человека и мыши.Islets 2015, 7: e1024405

    7. Дуглас Дж., Маккинзи А. А., Кусейро П.: дифференциальный дисплей ПЦР идентифицирует

    мРНК головного мозга крысы, которая транскрипционно регулируется кокаином и амфет-

    амином. J. Neurosci. 1995, 15, 2471-2481.

    8. Fujita T .: Гистологические исследования нервно-островкового комплекса поджелудочной железы

    некоторых млекопитающих. Zeitschrift für Zellforschung 1959, 50, 94-109.

    9. Густавсен К. Р., Пиллэй Н., Хеллер Р. С.: Иммуногистохимическое исследование

    эндокринной поджелудочной железы африканской ледяной крысы, Otomys sloggetti robertsi.Acta

    Histochem. 2008, 110, 294-301.

    10. Holst JJ, Fahrenkrug J., Knuhtsen S., Jensen SL, Poulsen SS, Nielsen

    OV: вазоактивный кишечный полипептид (VIP) в поджелудочной железе свиньи: роль

    VIPergic нервов в контроле жидкости и бикарбоната секреция. Regul. Pept.

    1984, 8, 245-259.

    11. Иванусик Дж. Дж., Гулдинг К. Э., Квок М. М., Дженнингс Э. А .: Нейрохимическая

    классификация и проекция мишеней пептидных иммунореактивных нейронов CART

    в сенсорных и парасимпатических ганглиях головы.Нейропептиды 2012, 46,

    55-60.

    12. Янюк И., Млынек К.: Иммунодетекция регулируемого кокаином и амфетамином транскрипта

    в поджелудочной железе крупного рогатого скота. Acta Histochem. 2015, 117, 545-550.

    13. Касацка И., Янюк И., Левандовска А., Бекиш А., Лебковски В.: Распределение

    паттернов CART-содержащих нейронов и клеток в поджелудочной железе человека. Acta

    Histochem. 2012, 114, 695-659.

    14. Kasacka I., Janiuk I., Piotrowska Z .: Оценка CART-, глюкагона и

    инсулинореактивных клеток в поджелудочной железе экспериментальной крысы модели

    одностороннего стеноза почечной артерии.Histol. Histopathol. 2015, 30, 445-452.

    15. Киба Т .: Взаимосвязь вегетативной нервной системы и поджелудочной железы

    , включая регуляцию регенерации и апоптоза: последние разработки.

    Поджелудочная железа 2004, 29, 51-58.

    16. Кирхгесснер А. Л., Гершон М. Д .: Иннервация поджелудочной железы нейронами

    в кишечнике. J. Neurosci. 1990, 10, 1626–1642.

    17. Кирквуд К. С., Ким Э. Х., Хе X. Д., Калаустро Э. К., Домуш К., Йошими

    С.К., Грейди Э. Ф., Маа Дж., Баннетт Н. В., Дебас Х. Т .: Вещество P подавляет экзокринную секрецию

    поджелудочной железы посредством нервного механизма. Являюсь. J. Physiol. 1999,

    277, G314-G320.

    18. Кристенсен П., судья М.Э., Тим Л., Рибель У., Кристьянсен К.Н., Вульф Б.С.,

    Клаузен Дж.Т., Дженсен П.Б., Мадсен О.Д., Вранг Н., Ларсен П.Дж., Хаструп С.:

    Гипоталамический CART — это новый аноректический пептид, регулируемый лептином. Природа

    1998, 393, 72-76.

    19. Sathanoori R., Olde B., Erlinge D., Göransson O., Wierup N .: Транскрипт, регулируемый кокаином и амфетамином

    (CART), защищает бета-клетки от токсичности глюко-

    и увеличивает пролиферацию клеток. J. Biol. Chem. 2013, 288, 3208-3218.

    20. Виеруп Н., Гуннарсдоттир А., Экблад Э., Сандлер Ф .: Характеристика CART-

    , содержащего нейроны и клетки свиной поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта,

    надпочечников и щитовидной железы.BMC Neurosci. 2007, 8, 51.

    21. Виеруп Н., Кухар М.Дж., Нильссон Б.О., Малдер Х., Экблад Э., Сандлер Ф .:

    Кокаин и транскрипт, регулируемый амфетамином (CART), экспрессируется на нескольких островках

    типы клеток во время развития крысы. J. Histochem. Cytochem. 2004, 52,

    169–177.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Вся информация, размещенная на сайте, носит ознакомительный характер и не является руководством к действию. Перед применением любых лекарств и методов лечения необходимо обязательно проконсультироваться с врачом. Администрация ресурса osteohondroz24.ru не несет ответственность за использование материалов, размещенных на сайте. Копирование материалов разрешается только с указанием активной ссылки на сайт.