Дифтерийный токсин это: Diphtheria Toxin (DT) — Дифтерийный токсин

Содержание

Diphtheria Toxin (DT) — Дифтерийный токсин

Московский государственный университет

Исследовательский центр им.Алмазова

НЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Институт медико-биологических проблем РАН

Институт Цитологии и Генетики СО РАН

Институт физиологии им. Павлова

Сеченовский Университет

МНТК Микрохирургии глаза им.Федорова

МФТИ

Институт экспериментальной медицины

Исследовательский центр им. Дмитрия Рогачева

НИЦ Курчатовский институт

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова

НИИ глазных болезней им. Гельмгольца

НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им.Кулакова

ИЭФБ РАН им.

Сеченова

Национальный исследовательский университет Лобачевского

Томский научный исследовательский медицинский центр

Казанский Федеральный Университет

СЗГМУ им.Мечникова

Балтийский федеральный университет

Научный центр неврологии

Северо-Кавказский федеральный университет

Дальневосточный федеральный университет

ФНКЦ физико-химической медицины

ФНКЦ реаниматологии и реабилитологии

Сибирский федеральный университет

Институт биологии гена РАН

ФИЦ Питания и биотехнологий

Сибирский медицинский университет

Институт биофизики клетки РАН

НИПИ им. Бехтерева

Институт Фундаментальных Проблем Биологии РАН

Институт токсикологии ФМБА России

НИИ Акушерства и гинекологии им. Отта

НИИ Психического здоровья

РМАПО

Красноярский медицинский университет им. Войно-Ясенецкого

Алтайский медицинский университет

Ниармедик

Волгоградский медицинский университет

Новосибирский медицинский университет

РНИОИ

ИБХ РАН им. акад. Шемякина и Овчинникова

Петровакс Фарм

Южно-Уральский государственный университет

ПИМУ

ФНЦ Пищевых систем им.Горбатова РАН

Дифтерийный токсин — Справочник химика 21


    Наиболее мощные из известных токсинов являются белками микробного происхождения. По уровню токсичности не имеют себе равных ботулинический, столбнячный и дифтерийный токсины и ряд энтеротоксинов. Среди растительных токсичных белков хорошо [c.21]

    Токсичные белки дифтерийный токсин  [c.305]

    Дифтерийный токсин ферментативно активный фрагмент +про-никающий фрагмент [c.73]

    Использование изотопных меток при изучении цикла трикарбоновых кислот, т. 2, стр. 322 Сильный яд грибов а-аманитин т. 3, стр. 211 Токсичные белки дифтерийный токсин г. 3, стр. 305. См. также гл. 12, разд. И, 4 [c.380]

    Необходимо отметить, что исходные молекулы дифтерийного токсина не обладают таким ингибиторным действием на белковый синтез они скорее являются зимогеном, превращаемым в каталитически активный белок(А-фрагмент) лишь после расщепления. С другой стороны, сам фрагмент А не обладает цитотоксическим действием, так как не может проникнуть в интактную клетку. 

[c.215]

    Эта реакция в такой же степени специфична, как и действие ферментов. Антитела, защищающие организм, например, от дифтерийного токсина, неэффективны против стрептококковых инфекций. Антитело способно распознавать различия, существующие между антигенами. Специфичность указанной реакции, точно так же как и ферментативная специфичность, объясняется теорией замка и ключа (фиг. 95). [c.349]

    В качестве продуцента при производстве вакцин используют особые, адаптированные на специальных питательных средах культуры вирусов и бактерий. Работая с живыми вакцинами надо следить за тем, чтобы под воздействием мутагенных факторов культура не восстановила свою вирулентность или не потеряла свои антигенные свойства. Важно подобрать такую питательную среду, чтобы облегчить дальнейшую очистку препарата. В производстве вакцин широко используют среду, приготовленную из гидролизата казеина с добавками глюкозы, дрожжевого автолизата или кукурузного экстракта. При получении дифтерийного токсина или вакцин кишечных заболеваний, культивируя глубинным методом аэробные бактерии, используют обычные системы аэрации. При культивировании анаэробных бактерий, например возбудителя столбняка, для удаления кислорода из среды через нее пропускают инертный газ, например азот.

[c.125]

    Фактор коагуляции Дифтерийный токсин [c.361]

    К другим ингибиторам белкового синтеза относятся дифтерийный токсин, инактивирующий один из факторов элонгации, и рицин, чрезвычайно токсичный белок из клещевины обыкновенной, который инактивирует 608-суб-частицу эукариотических рибосом. 

[c.947]

    Дифтерийный токсин представляет собой белок с мол. весом 62 ООО. Его минимальная летальная доза для морской свинки составляет всего лишь 0,16 мг/кг. Исследования, проведенные на культуре клеток, показали, что токсин блокирует включение аминокислот в белки в результате инактивации-фактора элонгации EF-2, необходимого для транслокацин в рибосомах млекопитающих. Токсин действует аналогично ферменту, переносящему ADP-рибозильную группу от NAD» » к фактору EF-2  [c.305]


    Каково происхождение гена tox и почему он переносите вирусом Паппенхеймер и Джил высказали предположение что этот ген каким-то образом образовался из гена эукариотической клетки, кодирующего функциональный белок. Этот ген внедрился в вирус и в ходе эволюции трансформировался в ген, детерминирующий синтез белкового токсина. Наличие в клеточном ядре поли (ADP-рибозы) (разд. И, 3) позволяет предложить одну из возможностей появления гена tox. NAD+ служит субстратом при синтезе этого ядерного полимера, а синтетаза катализирует разрыв рибозилникотинамидной связи с образованием новой гликозидной связи между 1-углеродом рибозы и 2-гидроксильной группой аденозина следующей мономерной единицы. Возможно, что именно ген синтетазы в результате модификации трансформировался в ген дифтерийного токсина. 
[c.306]

    Имеется целый рад белковых токсинов бактериального и растительного происхождения, которые являются мощными ингибиторами эукариотической (животной) белоксинтезирующей системы. Эти токсины блокируют элонгационную фазу трансляции. Все они обладают каталитическим (энзиматическим) механизмом действия. Мишенью их действия оказалась стадия транслокации элонгационного цикла эукариотической рибосомы.

Наиболее изученным примером является дифтерийный токсин. [c.214]

    Дифтерийный токсин. Это белок с молекулярной массой около 60000 дальтон. Он секретируется клетками oryneba terium diphtheriae, содержащими геном лизогенного бактериофага Р белок есть продукт фагового, а не собственно бактериального, генома. Молекула белка представляет собой одну ковалентно-непрерывную полипептидную цепь, организованную по крайней мере в два, довольно [c.214]

    Некоторые другие бактериальные токсины. Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa обладает подобным же механизмом действия, что и дифтерийный токсин. Этот белок с молекулярной массой 71500 дальтон тоже взаимодействует с поверхностью эукариотической клетки своим лектиновым доменом, погружается в мембрану, там расщепляется на фрагменты А и В с молекулярными массами 27000 [c.216]

    Уже первые опыты дали обнадеживающие результаты. Используя простую процедуру дисульфидного обмена, оказалось возможным сшивать энзиматический А-фрагмент дифтерийного токсина или А-субъединицу рицина с нетоксическим растительным лектином (например, с конканавалином А или с лектином Wistaria floribunda) и получать цитотоксический эффект очевидно, лектиновая часть химерного белка была ответственна за доставку ингибиторного компонента в клетку. Однако, как и в случае исходных токсинов, эффект был мало тканеспецифичен. Высокую тканеспецифичность химерного токсина удается получать, сшивая А-фрагмент дифтерийного токсина 218 [c.218]

    Действительно, недавно в нормальных клетках млекопитающих была открыта эндогенная АДФ-рибозилтрансфераза, которая специфически модифицирует дифтамидный остаток в ЕР-2. Фермент ассоциирован с полирибосомами, т. е. присутствует в том же клеточном компартменте, который содержит факторы элонгации ( в случае эукариотической клетки). Функция эндогенного АДФ-рибозилирования ЕР-2, возможно, состоит в воздействии на активность ЕР-2, отличную от катализа транслокации. Известно, что АДФ-рибозилирование ЕР-2 дифтерийным токсином приводит к утрате неспецифической РНК-связывающей способности ЕР-2 и, следовательно, к 

[c.219]

    Интересно, что дифтерийный и холерный токсины наделены энзиматической активностью, вызывая АДФ-рибозилирование (соответственно инактивацию) ключевых клеточных ферментов или белков. Дифтерийный токсин выключает синтез белкового фактора 2 стадии элонгации синтеза белка, а холерный-специфического О-белка и как следствие вызывает массивную потерю воды. [c.154]

    Данные о специфичности транспорта аминокислот через биомембраны клеток были получены при анализе наследственных дефектов всасывания аминокислот в кишечнике и почках. Классическим примером является цистинурия, при которой резко повышено содержание в моче цистина, аргинина, орнитина и лизина. Это повышение обусловлено наследственным нарушением механизма почечной реабсорбции. Цистин относительно нерастворим в воде, поэтому он легко выпадает в осадок в мочеточнике или мочевом пузыре, в результате чего образуются цистиновые камни и нежелательные последствия (закупорка мочевыводящего тракта, развитие инфекции и др.). Аналогичное нарушение всасывания аминокислот, в частности триптофана, наблюдается при болезни Хартнупа. Доказано всасывание небольших пептидов. Так, в опытах in vitro и in vivo свободный глицин всасывался значительно медленнее, чем дипептид глицилглицин или даже трипептид, образованный из трех остатков глицина.

Тем не менее во всех этих случаях после введения олигопептидов с пищей в портальной крови обнаруживали свободные аминокислоты это свидетельствует о том, что олигопептиды подвергаются гидролизу после всасывания. В отдельных случаях отмечают всасывание больших пептидов. Например, некоторые растительные токсины, в частности абрин и рицин, а также токсины ботулизма, холеры и дифтерии всасываются непосредственно в кровь. Дифтерийный токсин (мол. масса 63000), наиболее изученный из токсинов, состоит из двух функциональных полипептидов связывающегося со специфическим рецептором на поверхности чувствительной клетки и другого — проникающего внутрь клетки и оказывающего эффект, который чаще всего сводится к торможению внутриклеточного синтеза белка. Транспорт этих двух полипептидов или целого токсина через двойной липидный слой биомембран до настоящего времени считается уникальным и загадочным процессом. [c.426]


    Весьма интересен молекулярный механизм действия дифтерийного токсина. Он оказался наделенным способностью катализировать реакцию АДФ-рибозилирования фактора элонгации эукариот (eEF-2), выключая тем самым его из участия в синтезе белка. Резистентность многих животных к дифтерийному токсину, вероятнее всего, обусловлена трудностью или полным отсутствием проникновения (транспорта) токсина через мембрану клеток. [c.542]

    Подобные иммунопрепараты обладают достаточно высокой эффективностью, что позволяет применять их в низких дозах и свести к минимуму побочное действие на иммунную систему. Кроме того, они могут оказаться полезными для лечения различных новообразований, а иногда и заменять химиотерапию. На пораженные клетки можно нацелить и другие цитотоксич-ные белки, например дифтерийный токсин или растительный токсин рицин. Впрочем, даже при [c.223]

    Токсины и анатоксины. Отдельные виды болезнетворных микроорганизмов образуют экзотоксины, которые могут быть отнесены к «факторам агрессии . Они представляют собою высокополимерные термолабильные белки — продукты матричного синтеза, секретирующиеся в окружающую среду. При попадании в организм человека экзотоксины вызывают серьезные повреждения функций определенных тканей или систем. Например, столбнячный токсин относят к числу нейротоксинов, нарушающих функцию нервно-мышечного аппарата гангренозные токсины являются некротоксинами, индуцирующими повреждение тканей экзотоксины определенных штаммов кишечной палочки повреждают кишечник и т. д. По механизму действия на ткани они сходны с ферментами. Некоторые токсины применяют для диагностики соответствующих заболеваний. Например, токсин дифтерийный рекомендуют для постановки внутрикожной реакции Шика. Токсин изготавливают по обычной схеме выделения экзобелков из жидких питательных сред после выращивания определенных штаммов дифтерийных бактерий. Препарат для реакции Шика готовят из очищенного дифтерийного токсина, разводя его глице-рино-желатиновой смесью до необходимой концентрации (1/40 часть одной смертельной дозы для морских свинок — одна Шик-доза). Выпускаемый препарат — бесцветная прозрачная жидкость в ампулах по 1 мл. Срок годности — 2 года, хранят при 3—10°С. [c.468]

    Токсичные вешества и факторы питания, способные вызывать болезни, связанные с демиелинизацией, могут иметь самую разнообразную природу это может быть дифтерийный токсин, гексахлорофен или свинец. Голодание ведет к нарушению миелинизации, особенно в определенные критические периоды развития центральной нервной системы. У человека это бывает в первый год жизни, так как при рождении процесс миелинизации центральной нервной системы еще не закончен. [c.107]

    Хотя в настоящее время имеется несколько тест-систем для выявления гена экзотоксина С. сИрЫкепае с помощью ПЦР, ВОЗ рекомендует применять праймеры для амплификации фрагмента, кодирующего синтез субъединицы А токсина. Выявление гена дифтерийного токсина у нетоксигенных штаммов представляется особенно важным при оценке эпидемиологической ситуации, поскольку репрессированный полноценный ген при определенных условиях способен восстановить экспрессию и выработку токсина, что свидетельствует о потенциальной опасности таких штаммов.[c.203]

    Серологическое исследование. В диагностике дифтерии это исследование имеет вспомогательное значение. Антитела при токсических и гипертоксических формах могут не образовываться. Поэтому определение антитоксических антител осуществляется только у вакцинированных для выявления напряженности иммунитета. Для этой цели вместо ранее применявшейся пробы Шика с дифтерийным токсином ставится РНГА с эритроцитарным диагностикумом (на поверхности эритроцитов находится дифтерийный анатоксин). [c.204]

    Архебактерии отличаются от эубактерий по составу ДНК-зависимых РНК-полимераз эти ферменты состоят у них из более чем четырех субъединиц и нечувствительны к антибиотикам рифампицину и стрепто-лидигину. Рибосомные нуклеиновые кислоты (16S и 5S) существенно отличаются по последовательности нуклеотидов. Трансляция нечувствительна к хлорамфениколу, однако тормозится дифтерийным токсином, [c.108]

    Из приведенного материала явствует, что синтез специфического белка можно продемонстрировать в опытах in vitro. Однако опубликованные данные о таком синтезе немногочисленны [12, 73—76, 124]. Чаш,е всего ссылаются на синтез в бесклеточной системе гемоглобина, белков чехла фага, Р-галактозидазы, дифтерийного токсина, триптофансинтетазы, а-амилазы и запасного глобулина семян гороха. Один из самых интересных примеров синтеза специфического белка обнаружен у личинки синей мухи alliphora erythro ephala, у которой под действием особого гормона, экдизона, на хромосомах слюнных желез образуются вздутые участки, называемые пуффами (стр. 239). Считают, что гормон этот активирует специфические локусы гена, в результате чего на цепях ДНК пуффа образуется специфическая щ-РНК. [c.277]

    Способность ганглиозидов восстанавливать электровозбудимость мозговой ткани, а также специфически связывать (например, токсин столбняка) или инактивировать некоторые (например, дифтерийный токсин) бактериальные яды указывает иа различные пути участия ганглиозидов в жизнедеятельности животного организма.[c.109]

    Биологические эффекты высокого давления. Д. в 17 500 Ksj M в течение 45 мин разрушает дифтерийный токсин и яд кобры. Токсин столбняка разрушается при 13 500 кг/см туберкулезная палочка погибает при 6000 ке/см , чувствительны к Д. клетки нек-рых злокачественных опухолей. Д. в 7000 кг/см убивает бактерии молочнокислого брожения и стерилизует мясные прод) кты, что может быть использовано для консервирования без нагрева. [c.346]

    Как показали В. С. Деркач, Ф. Д. Повелииа и Л. В. Болдырева пиоцианин обладает способностью нейтрализовать токсины чувствительных к нему бактерий (дифтерийный токсин), но он [c.74]

    Известна так называемая реакция Джонса Мота, которую нередко трактуют как переходную от реакций быстрого типа к ГЗТ [1]. Она появляется в ответ на введение растворимых белковых антигенов (дифтерийный токсин, пыльцовые, эпидермальные аллергены) или конъюгатов через 6—8 ч после внутрикожной реакции и стихает через 1—2 сут. Внешне проявляется эритемой и припухлостью, на срезах кожи видна лимфоидная инфильтрация вокруг мелких сосудов и капилляров. Реакция Джонса Мота исчезает по мере накопления в крови циркулирующих антител. [c.21]


Биохимия Том 3 (1980) — [ c.305 ]

Молекулярная биология Структура рибосомы и биосинтез белка (1986) — [ c.214 , c.216 ]

Принципы структурной организации белков (1982) — [ c.73 , c.217 ]

Принципы структурной организации белков (1982) — [ c.73 , c.217 ]

Основы биохимии Т 1,2,3 (1985) — [ c.139 , c.947 ]

Общая микробиология (1987) — [ c. 108 ]

Биология Том3 Изд3 (2004) — [ c.132 , c.180 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) — [ c.107 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) — [ c.107 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) — [ c.162 ]

Биологическая химия (2004) — [ c.153 , c.395 ]

Биохимия Т.3 Изд.2 (1985) — [ c.155 ]


Дифтерия. Прививка от дифтерии

На протяжении истории дифтерия была одной из наиболее опасных детских болезней, характеризующейся опустошительными эпидемиями.

Заболевание вызывается Corynebacterium diphteriae (коринебактерия дифтерия).

Самым грозным оружием микроба является особый токсин. Дифтерийный токсин – один из сильнейших бактериальных ядов, действующих губительно на сердце, почки, нервную систему человека. Дифтерийный токсин убивает клетки организма-хозяина, блокируя в них выработку белка.

Суть болезни в том, что палочка дифтерии, попадая к человеку воздушно-капельным путем, начинает активно размножаться на слизистой оболочке глотки, образуя пленки. В переводе с греческого языка diphtherion – пленка.

В ротоглотке, где слизистая оболочка покрыта многослойным эпителием, дифтеритические пленки прочно спаяны с тканями, и токсин в большом количестве всасывается в кровь, приводя к гибели человека, по сути, путем отравления.

Там же, где слизистая выстлана однослойным эпителием, пленки прикреплены не так прочно, а токсин всасывается не так интенсивно. Однако, этот эпителий расположен в гортани и трахее, и нарастая там, эти пленки попросту удушают человека. Эта ситуация называется истинным крупом. У детей такая форма встречается несколько чаще.

История знает немало примеров, когда до изобретения современных методов борьбы с этим заболеванием, врачи через трубочку отсасывали эти дифтеритические пленки. Порой, это заканчивалось весьма печально для доктора.

История взаимоотношений человечества и дифтерии имеет несколько поворотных моментов.

В древних, незапамятных временах, когда не существовало методов эффективной борьбы  с дифтерией, эпидемии были колоссальными,  смертность от дифтерии доходила до 80%.

Ситуация изменилась, когда в 1894 году Behring создал противодифтерийную сыворотку, т.е. своего рода противоядие. Лошадям в кровь вводились специальные дифтерийные компоненты. Спустя некоторое время в организме животного образовывались антитела, способные нейтрализовать дифтеритический токсин. Из этой крови и готовили антитоксическую противодифтерийную сыворотку.

Введение этой сыворотки подчас переносится человеком достаточно тяжело.

Так Михаил Булгаков, во времена своей работы лекарем, отсасывая дифтеритические пленки у ребенка, почувствовал, что одна из них попала ему в рот. Булгаков решился на инъекцию противодифтерийной сыворотки. Как известно из писем, лицо его распухло, а зуд стал нестерпимым. Чтобы хоть как то облегчить свое состояние, Булгаков потребовал дать морфию. В последующем, это пристрастие к наркотику долго преследовало писателя.

Трудно поверить, однако, и в настоящее время, основным методом лечения остается введение этой антитоксической противодифтерийной сыворотки.

Антибиотики, как средство борьбы с заболеванием, имеют небольшое значение, так как они не влияют на всосавшийся в кровь человека токсин. Антибактериальная терапия лишь ограничивает дальнейший рост бактерий и продолжительность носительства возбудителя, которое нередко сохраняется даже после стихания симптомов болезни.

В 1923 году Рамоном был предложен метод введения дифтерийного анатоксина человеку, т.е. вакцинация от дифтерии. Анатоксин – это бактериальный токсин, лишенный химическим путем своих патогенных свойств.

Прошло без малого сто лет, а технология приготовления противодифтерийной вакцины принципиально не изменилась. В основе современных препаратов также содержится обезвреженный токсин дифтерийной палочки – анатоксин.

Массовая вакцинация против дифтерии в СССР началась в 30-х годах. Со временем, широкий охват прививками позволил снизить заболеваемость до единичных случаев.

Однако, падение уровня жизни, сокращение программы вакцинации, привели в 90-х годах к эпидемии дифтерии на постсоветском пространстве. Людей, умерших от молниеносной формы дифтерии, находили в подъездах и на улице.

Еще одна особенность микроорганизма заключается в том, что даже после перенесенного заболевания не формируется достаточный уровень иммунной защиты. Поэтому людям, выздоравливающим от дифтерии, даже в процессе поправки проводится курс вакцинации.

Таким образом, только вакцинация против дифтерии является эффективным, надежным и безопасным методом борьбы с этой инфекцией.

Дифтерийный анатоксин в комбинации с вакцинами против столбняка и коклюша используется в рамках программы иммунизации с 1974 года во многих странах мира.

В Российской Федерации данную вакцинацию рекомендовано проводить детям, начиная с 3-х месячного возраста.

К настоящему времени по данным Всемирной Организации Здравоохранения, анафилактические реакции (т.е. тяжелые аллергические процессы) на дифтерийный компонент вакцины не описаны.

Дифтерийный анатоксин – противодифтерийная вакцина признана одной из наиболее безопасных прививок.

Подробнее о вакцинации против дифтерии можно прочитать в статье Современная тактика вакцинации против коклюша, дифтерии, столбняка. 

Corynebacterium diphtheriae, антитела

Антитела к возбудителю дифтерии (C. diphtheriae) – это специфические антитоксические белки-иммуноглобулины, вырабатываемые иммунной системой в ответ на инфицирование возбудителем дифтерии или вакцинацию дифтерийным анатоксином.

Синонимы русские

Суммарные антитела к возбудителю дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), противодифтерийные антитела, антитела к дифтерийному анатоксину.

Синонимы английские

Anti-Corynebacterium diphtheriae antibodies, Anti-Diphtheria toxin antibodies, Corynebacterium diphtheriae toxoid antibody.

Метод исследования

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Дифтерия – это передающееся воздушно-капельным путем острое инфекционное заболевание, возбудителем которого являются Corynebacterium diphtheriae (BL, бациллы Леффлера), вырабатывающие дифтерийный токсин. Источник инфекции – больной человек или бактерионоситель.

Инкубационный период составляет в среднем 2-5 дней. Клиническая картина заболевания характеризуется фибринозным воспалением слизистых оболочек ротоглотки и дыхательных путей и явлениями общей интоксикации. При токсической форме дифтерии могут поражаться еще сердце и нервная система.

В ответ на инфицирование возбудителем дифтерии или на вакцинацию дифтерийным анатоксином иммунной системой на 1-3-й день заболевания в крови вырабатываются антитоксические антитела, высокий титр которых сохраняется на протяжении нескольких недель.

Для чего используется исследование?

  • Чтобы диагностировать дифтерию.
  • Чтобы оценить напряженность противодифтерийного иммунитета при определении целесообразности ревакцинации и контроле за ее эффективностью.
  • В качестве дифференциальной диагностики (наряду с другими исследованиями) при заболеваниях, протекающих со сходными симптомами, таких как ангины различной этиологии, паратонзиллярный абсцесс, инфекционный мононуклеоз, острый ларинготрахеит, эпиглоттит, бронхиальная астма.

Когда назначается исследование?

  • При симптомах дифтерийной инфекции – двукратно (на 1-3-й и 7-10-й день заболевания).
  • При определении показаний к вакцинации или ревакцинации.
  • Если необходимо оценить эффективность вакцинации против дифтерии – до и после введения вакцины с оценкой титра антител в динамике.

Что означают результаты?

Референсные значения

Титр: > 1:80.

Причины положительного результата:

  • текущая или перенесенная дифтерийная инфекция,
  • проведенная вакцинация против дифтерии.

Причины отрицательного результата:

  • слабый иммунитет (или его отсутствие) к дифтерии из-за большой давности вакцинации против дифтерии или из-за того, что пациент никогда не болел дифтерией,
  • отсутствие иммунного ответа или слабый иммунный ответ на возбудителя дифтерии вследствие нарушений в иммунной системе.

ФС.3.3.1.0043.15 Сыворотка противодифтерийная лошадиная | Фармакопея.рф

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Сыворотка противодифтерийная                          ФС.3.3.1.0043.15

лошадиная                                                         Взамен ГФ Х, ст. 6О9,

                                                                                     ФС 42-3813-99

Настоящая фармакопейная статья распространяется на сыворотку противодифтерийную лошадиную, которая представляет собой иммуноглобулиновую фракцию сыворотки крови лошади, содержащую специфические антитела, нейтрализующие дифтерийный экзотоксин. Сыворотка противодифтерийная лошадиная предназначена для экстренной профилактики и лечения дифтерии.

ПРОИЗВОДСТВО

Производство сыворотки дифтерийной лошадиной должно быть валидировано с целью подтверждения установленных требований, гарантирующих её качество и безопасность применения.

Сыворотку получают из плазмы крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным анатоксином. Для получения очищенной, концентрированной иммуноглобулиновой фракции плазмы крови лошади, содержащей антитела (антитоксины), нейтрализующие дифтерийный токсин, применяют методы солевого фракционирования, ферментолиза, мембранной фильтрации.

ИСПЫТАНИЯ

Описание

Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость с желтоватым оттенком, без осадка. Определение проводят визуально.

Подлинность

Сыворотка должна нейтрализовывать действие дифтерийного токсина. Определение проводят, как описано в разделе «Специфическая активность».

Прозрачность

Показатель оптической плотности не должен превышать 0,05. Определение проводят фотометрическим методом в соответствии с ОФС  «Прозрачность и степень мутности жидкостей» при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 3 мм по сравнению с водой очищенной, если нет других указаний в нормативной документации.

Цветность

Показатель оптической плотности не должен превышать 0,15. Определение проводят фотометрическим методом в соответствии с  ОФС «Степень окраски жидкостей» при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 3 мм по сравнению с водой очищенной, если нет других указаний в нормативной документации.

Механические включения

Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».

рН

От 6,8 до 7,2. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Содержание белка

От 8 до 12 %. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Определение белка».

Стерильность

Должна быть стерильной. Испытания проводят методами прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС «Стерильность».

Пирогенность

Должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Вводят 1 мл неразведенной сыворотки на 1 кг массы кролика. В нормативной документации указывают допустимые пределы изменений температуры животных и тест-дозу.

Аномальная токсичность

Должна быть нетоксичной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность», если в нормативной документации нет других указаний.

Специфическая активность

Не менее 1500 МЕ (международных единиц) в 1 мл. Специфическую активность противодифтерийной сыворотки определяют в тесте нейтрализации дифтерийного токсина на морских свинках по методу Рёмера и выражают в МЕ/мл. (1 МЕ дифтерийного антитоксина – это специфически нейтрализующая активность антитоксической сыворотки в отношении дифтерийного токсина, которая содержится в определенном количестве международного стандартного образца, представляющего собой противодифтерийную лиофилизированную лошадиную сыворотку).

Определение опытной некротической дозы дифтерийного токсина. Опытная дермонекротическая доза (Ln/50) дифтерийного токсина представляет собой наименьшее количество токсина, которое в смеси с 1/50 ME противодифтерийной сыворотки при внутрикожном введении морским свинкам в объеме 0,05 мл вызывает некроз кожи к 4 — 5 сут.

При определении Ln/50 дифтерийного токсина используют стандартный образец (СО) активности противодифтерийной сыворотки, калиброванный в МЕ, который разводят 0,9 % раствором натрия хлорида с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 2/5 МЕ (соответственно в 0,05 мл 1/50 МЕ). Готовят несколько (не менее 5) разведений дифтерийного токсина, различающихся между собой по активности на 10 – 20 %. Для разведения дифтерийного токсина используют 0,9 % раствор натрия хлорида.

За 1 сут до проведения теста участки кожи на боках морских свинок освобождают от шерсти и подшерстка, не допуская ее повреждения. Свинок черной масти и альбиносов не используют. При определении Ln/50 дифтерийного токсина 1 морской свинке делают не более 4 инъекций.

Смешивают 1 мл противодифтерийной лошадиной сыворотки и 1 мл одного из разведений дифтерийного токсина. Смеси выдерживают при температуре (37 ± 1) ºС в течение (30 ± 1) мин и вводят по 0,1 мл внутрикожно не менее чем 2 морским свинкам массой (425 ± 25) г. Для инъекций используют шприцы с иглами, имеющими угол скоса не менее 30 º. Результаты реакции учитывают ежедневно в течение 5 сут. В зависимости от количества дифтерийного токсина, оставшегося не связанным с противодифтерийной сывороткой, на месте введения смеси токсина и сыворотки может возникнуть эритема, инфильтрат или некроз. При полной нейтрализации дифтерийного токсина антитоксином реакция на месте инъекции должна отсутствовать.

Определение специфической активности (титра) противодифтерийной сыворотки. Исходя из предполагаемой активности, сыворотку разводят 0,9 % раствором натрия хлорида до концентрации 0,4 МЕ/мл (2/5 МЕ в 1 мл). Готовят несколько разведений, отличающихся друг от друга по активности на 10 – 20 %.

По 1 мл каждого разведения сыворотки смешивают с 1 мл рабочего разведения дифтерийного токсина. Полученные смеси осторожно перемешивают, избегая пенообразования и после выдерживания при температуре (37 ± 1) ºС в течение (30 ± 1) мин вводят 2 морским свинкам массой (425 ± 25) г подкожно в объеме 0,1 мл.

Для контроля опытной некротической дозы каждой морской свинке вводят 0,1 мл смеси, содержащей 1 Ln/50 дифтерийного токсина и 1/50 МЕ стандартного образца активности противодифтерийной сыворотки. За животными наблюдают 5 сут, отмечая развитие кожных реакций.

Специфическую активность (титр) сыворотки следует рассчитывать по наибольшему ее разведению, которое при внутрикожном введении в смеси с дифтерийным токсином не вызывает у морских свинок кожной реакции к 4 – 5 сут.

Удельная активность

Не менее 1300 МЕ на 0,1 г белка. Удельную активность (Х) вычисляют по формуле:

где

Т – титр сыворотки, МЕ/мл;

С – концентрация белка, г/мл;

10 – постоянный коэффициент.

Сульфат-ионы

Не более 0,025 %. Определение проводят колориметрическим методом. К 5 мл испытуемого образца и к 5 мл рабочего эталонного раствора прибавляют по 0,5 мл 5 % раствора бария хлорида и перемешивают. Через 15 мин пробы перемешивают и измеряют оптическую плотность суспензий при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора, содержащего 5 мл образца и 0,5 мл воды очищенной, для эталонного раствора – вода очищенная (5 мл).

Испытание проводят в 2 повторностях. Для расчета используется среднее значение.

Расчет содержания сульфат-ионов  (X) в процентах  проводят по формуле:

где

Аопыт – значение оптической плотности испытуемого образца;

Аэталон – значение оптической плотности рабочего эталонного раствора.

Примечания.

  1. Приготовление основного раствора калия сульфата (1 мг/мл сульфат-ионов). В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяю 1,8140 г калия сульфата, высушенного до постоянной массы при температуре 100 – 105 °C, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 1 года.
  2. Приготовление рабочего эталонного раствора калия сульфата (0,002 % сульфат-ионов). В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл основного раствора калия сульфата, доводят водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

 

Натрия хлорид

От 0,85 до 0,95 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Количественное определение хлоридов методом обратного осадительного титрования в иммунобиологических лекарственных препаратах».

Хлороформ

Не более 0,1 %. Определение проводят колориметрическим методом, основанным на способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, которое дает цветную реакцию.

В пробирки вносят по 0,1 мл испытуемого образца и образца сравнения (0,1 % раствор хлороформа), добавляют 0,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, 2 мл 20 % раствора натрия гидроксида, 1 мл 10 % раствора резорцина и перемешивают. Содержимое пробирок перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 мин. Пробы осторожно охлаждают до температуры 15 – 18 0С, затем измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, состоящим из 1 мл воды очищенной, 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и 2 мл 20 %  раствора натрия гидроксида. Раствор резорцина в контрольный раствор не добавляют, т.к. продукты его окисления окрашиваются в зеленый цвет.

Расчет содержания хлороформа проводят путем сравнения оптической плотности испытуемого образца и образца сравнения (0,1 % раствор хлороформа).

Содержание хлороформа (Х) в процентах в испытуемом образце вычисляют по формуле:

где

Аисп – значение оптической плотности испытуемого образца;

Аст – значение оптической плотности образца сравнения — 0,1 % раствора хлороформа.

Примечания.

  1. Приготовление 0,1 % раствора хлороформа. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,1 мл хлороформа, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор используют через 24 часа.
  2. Приготовление 10 % раствора резорцина. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5 г резорцина, растворяют в 30 мл воды очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Извлекаемый объем

Не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объём лекарственных форм для парентерального применения».

Упаковка и маркировка

В соответствии сОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».

Транспортирование и хранение

При температуре от 2 до 8 ºС, если не указано иначе в нормативной документации. Замораживание не допускается.

Скачать в PDF ФС. 3.3.1.0043.15 Сыворотка противодифтерийная лошадиная

Поделиться ссылкой:

Определение антител к возбудителю дифтерии (Corynebacterium diphtheriae) в крови

Определение уровня антител к дифтерийному анатоксину преимущественно используют для оценки эффективности вакцинации против. Однако рост титров антител может служить дополнительным диагностическим признаком. Для серологического подтверждения диагноза дифтерии применяют ретроспективную диагностику определения антител. Определяют антитела в начале заболевания (1−3-й день) и через 7−10 суток, диагностическим считают увеличение концентрации антител не менее чем в 4 раза. 

Общая информация об инфекции

Дифтерия — острое инфекционное воспаление верхних дыхательных путей и кожных покровов, характеризующееся общей интоксикацией организма с преимущественным поражением сердца, почек, неравной системы и образованием фиброзных пленок.
Возбудитель дифтерии — коринебактерии дифтерии (бацилла Леффлера), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин). Коринебактерии дифтерии длительно выживают в окружающей среде: в пыли они сохраняют свою жизнеспособность до 5 недель; в сухой дифтерийной пленке — до 7 недель; на одежде, постельных принадлежностях, на предметах в окружении больного — до 15 дней; на игрушках — до двух недель; в воде и молоке — до 6 — 20 дней. Источником инфекции является больной или носитель токсигенных Corynebacterium diphtheriae. Механизм передачи — аэрозольный, путь передачи — воздушно-капельный и воздушно-пылевой.

Инкубационный период заболевания длится от 2-х до 10 дней. Клиническими симптомами являются: 
повышение температуры;
бледность кожных покровов;
выраженная слабость;
отёк мягких тканей шеи;
увеличение нёбных миндалин;
плёнчатый налёт (может быть любого цвета, но чаще всего бывает серо-белым), покрывающий нёбные миндалины и иногда распространяющийся на нёбные дужки, мягкое нёбо, боковые стенки глотки, гортань;
увеличение шейных лимфоузлов.

По формам и вариантам течения различают:
1. Дифтерия ротоглотки:
локализованная — с катаральным, островчатым и плёночным воспалением;
распространённая — с налётами за пределами ротоглотки;
субтоксическая, токсическая (I, II и III степени), гипертоксическая.
2. Дифтерийный круп:
локализованный — дифтерия гортани;
распространённый — дифтерия гортани и трахеи;
нисходящий — дифтерия гортани, трахеи, бронхов.
3. Дифтерия других локализаций: носа, глаз, кожи, половых органов.

Диагноз дифтерии может устанавливаться при наличии одного или нескольких характерных клинических признаков.
Диагностика дифтерии основана на клинических и эпидемиологических данных. Для подтверждения диагноза используют бактериологический метод исследования, предусматривающий выделение токсигенных C.diphtheriae с клинически подозрительных поражений слизистых оболочек ротоглотки, носоглотки, носа и гортани, глаз, гениталий, а также кожи (рана, корочки и др.). Возбудитель дифтерии можно выделить через 8−12 часов в том случае, если больной не принимал антибактериальных препаратов.
Однако следует учитывать, что при лечении антибиотиками (особенно пенициллином или эритромицином) до взятия материала на бактериологическое исследование роста бактерий можно не получить в течение 5 дней (либо роста не бывает совсем). В этих случаях используют серологические методы диагностики.

Главным в лечении всех форм дифтерии является введение антитоксической противодифтерийной сыворотки (ПДС), которая подавляет дифтерийный токсин. Антибиотики не оказывают существенного действия на возбудителя дифтерии.После перенесённого заболевания формируется нестойкий иммунитет, и приблизительно через 10-11 лет человек может заболеть вновь. Повторное заболевание носит нетяжёлый характер и переносится легче.
Основное значение в борьбе с дифтерией имеет активная плановая вакцинация населения вакцинами, содержащими адсорбированный дифтерийный анатоксин (АКДС-вакцина, АКДС-анатоксин, АДС—М-анатоксин), которая проводится в соответствии с календарём профилактических прививок, что позволяет создать длительный и напряжённый антитоксический иммунитет.

Показания для назначения данного исследования:

1. В совокупности с бактериологическими методами диагностики при клинических симптомах дифтерии.
2. Оценка напряженности поствакцинального иммунитета.
Главная цель активной иммунизации — выработка специфического иммунитета. Анатоксин служит непреодолимым барьером для дифтерийного токсина и защищает организм от интоксикации.
Литература:
1. Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник / В.И. Покровский, С.Г. Пак, Н.И. Брико, Б.К. Данилкин. -2-е изд. — М.: ГЭОТАР — Медиа, 2007. 
2. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. — М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2009. С. 428-434.
3. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2.3109-13 «Профилактика дифтерии» (  утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 9 октября 2013 года №54, введены в действие 20 мая 2014 года).

Дифтерия

В Донецкой Народной Республике возникла реальная угроза завоза и распространения дифтерийной инфекции в связи с регистрацией случаев заболевания дифтерией в Украине, в т.ч. приграничных Луганской и Харьковской областях.

На начало ноября 2019 г. в Украине зарегистрирован 21 случай дифтерии и более 30 случаев подозрения на дифтерию, которые находились в стадии подтверждения диагноза. Наибольшее количество случаев дифтерии (90%) пришлось на октябрь, заболели преимущественно взрослые лица (95%). По прогнозу ВОЗ, в настоящее время Украине угрожает вспышка дифтерии.

В ДНР в течение более 5 лет случаи не регистрировались, однако данные эпиднадзора свидетельствуют о продолжающейся циркуляции возбудителей дифтерии и недостаточном уровне популяционного иммунитета, который не обеспечивает прерывание передачи инфекции в коллективах в случае заноса.

Учитывая непрерывные миграционные процессы среди населения, в т.ч. в приграничные области Украины, где зарегистрированы случаи заболевания дифтерией и наличие прослойки населения, восприимчивой к дифтерийной инфекции, возможно  обострение эпидемической ситуации в ДНР в ближайшее время.

Дифтерия — это опасное для жизни, острое инфекционное заболевание, характеризующееся воспалительным процессом верхних дыхательных путей или кожи в местах порезов, ссадин или воспаления.

Опасна дифтерия не столько локальными поражениями, сколько явлениями общей интоксикации и токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем. Течение заболевания у непривитых особенно тяжелое.

Заболевание передается воздушно-капельным путем от больных дифтерией или от здоровых бактерионосителей, в редких случаях — через инфицированные предметы. При заражении дифтерией тяжесть заболевания и вероятность смертельного исхода определяются в основном количеством образующегося в очаге инфекции токсина. Дифтерийный токсин разносится током крови по всему организму и поражает прежде всего клетки сердечной мышцы, почек и нервной систем

Заболевание обычно начинается с невысокой температуры и выделений из очага воспаления. Дифтерия глотки (наиболее опасная форма заболевания) часто сопровождается образованием характерных, содержащих коринебактерии фибринозных пленок сероватого цвета на поверхности слизистой оболочки. Увеличение размеров этих пленок может привести к затруднению дыхания. Через неделю или более от начала заболевания начинает проявляться действие токсина на удаленные от очага инфекции органы. У грудных детей заболевание прежде всего поражает полость носа (дифтерия носа), дети постарше чаще заболевают дифтерией зева. Особенностью дифтерии (в отличие от ангины) является отсутствие боли в горле и высокой температуры.

Не занимайтесь самолечением. Обязательно вызывайте врача при малейших подозрениях на ангину или дифтерию. Главное – своевременное обращение! Правильный диагноз может поставить только врач после внимательного обследования. Больные дифтерией, а также больные с подозрением на дифтерию подлежат немедленной изоляции и эвакуации в инфекционное отделение больницы. Если у вас или ваших близких в последнее время был контакт с человеком, который заболел дифтерией, незамедлительно сообщите об этом своему лечащему врачу.

Единственный надежный способ профилактики дифтерии — иммунизация дифтерийным анатоксином (анатоксин — это безвредное производное токсина, которое способно индуцировать выработку антител к исходному токсину). Он входит в состав применяемых для иммунизации детей поливакцин, например в АКДС, и весьма надежно предупреждает дифтерию. Однако чтобы постоянно поддерживать иммунитет, необходимо каждые десять лет проводить ревакцинацию дифтерийным анатоксином. Зачастую это не делается, поэтому значительная часть пожилого населения восприимчива к дифтерии.

Дифтерийный токсин – обзор

АКТИВНОСТЬ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ МИШЕНЬ

Дифтерийный токсин убивает клетки, ингибируя синтез эукариотического белка, и его механизм действия подробно охарактеризован. Этот сильнодействующий токсин инактивирует фактор элонгации (EF-2), необходимый для синтеза белка (Collier, 1967). В частности, дифтерийный токсин переносит фрагмент АДФ-рибозы НАД на EF-2 (впервые продемонстрировано с использованием меченого радиоактивным изотопом НАД) (Honjo et al. , 1968).Дифтерийный токсин был первым идентифицированным членом группы бактериальных белковых токсинов, которые действуют путем АДФ-рибозилирования целевого белка. АДФ-рибозилирующая активность дифтерийного токсина полностью определяется А-фрагментом, и для каталитической активности не требуется часть В-фрагмента.

Внутриклеточная токсичность А-фрагмента дифтерийного токсина сохраняется, даже если он производится независимо от В-фрагмента. Следовательно, тканеспецифическая внутриклеточная экспрессия фрагмента дифтерийного токсина А может быть использована для уничтожения определенных типов клеток.Этот метод широко использовался для изучения эукариотического развития. Вкратце, последовательность, кодирующую фрагмент А дифтерийного токсина, помещают под транскрипционный контроль тканеспецифического эукариотического промотора, и полученное слияние промотор-ген интегрируют в эмбриональные клетки. По мере развития организма активируется тканеспецифический промотор, и экспрессия фрагмента дифтерийного токсина А приводит к гибели всех клеток, в которых активен тканеспецифический промотор. С помощью этого метода была определена роль в развитии нескольких типов клеток, в том числе участвующих в развитии глаза, поджелудочной железы, почек и крышной пластинки у мышей (Breitman et al. , 1987; Ли и др. , 2000; Пальмитер и др. , 1987; Пентц и др. , 2004). Этот метод применим к большому количеству растений, животных и насекомых, включая Drosophila , радужную форель и Arabidopsis (Han et al. , 2000; Kalb et al. , 1993; Tsugeki and Fedoroff). , 1999; Узбекова и др. , 2003). В некоторых случаях продукция фрагмента А дикого типа приводит к летальности на ранних стадиях развития, поэтому мутантные формы фрагмента А, которые менее активны и, следовательно, менее токсичны, чем фрагменты дикого типа, использовались для более медленного и более позднего уничтожения клеток. в развитии.Характеристика активного центра фрагмента А послужила основой для разработки менее токсичных форм дифтерийного токсина.

Аминокислоты, составляющие активный центр фрагмента А, были охарактеризованы несколькими методами. Существует только один аминокислотный остаток, Glu148, который полностью консервативен в семействе токсинов АДФ-рибозилтрансфераз. Glu148 необходим для активности рибозилирования АДФ фрагмента А и расположен рядом с карманом связывания НАД в кристаллической структуре (Carroll and Collier, 1984; Choe et al., 1992; Тветен и др. , 1985). His21 также необходим для каталитической активности и важен для связывания NAD (Papini et al. , 1990; Papini et al. , 1989). Еще один аминокислотный остаток, Tyr65, первоначально был идентифицирован биохимическими исследованиями как важный для связывания НАД (Papini et al. , 1991), а сайт-направленные мутации подтвердили его важность в катализе (Blanke et al. , 1994). . Кроме того, Tyr50 необходим для полной ферментативной активности.Замена Try50 на Ala резко снижала ферментативную активность (в 105 раз), но замена Phe имела очень небольшой эффект. Это предполагает роль ароматического остатка в положении 50 (Wilson et al. , 1994).

Внутриклеточная мишень рибозилирования АДФ дифтерийным токсином, EF-2, опосредует стадию транслокации в удлинении пептидной цепи, способствуя переносу пептидил-тРНК из А в Р-участок рибосомы. Аминокислотный остаток EF-2, который АДФ-рибозилирован дифтерийным токсином, представляет собой посттрансляционно модифицированный гистидин, называемый дифтамидом . Остаток дифтамида уникален для EF-2 эукариот и архей и не обнаружен ни в одном другом белке (Bodley et al. , 1984; Collier, 2001). Синтез дифтамида представляет собой сложный процесс, требующий участия как минимум семи различных генных продуктов (Liu and Leppla, 2003; Liu et al. , 2004; Mattheakis et al. , 1993; Schultz et al. , 1998). Сохранение пути биосинтеза дифтамида эукариотами и археями предполагает значительную функцию дифтамида помимо его инактивации дифтерийным токсином, хотя мутантные клеточные линии, которые не могут продуцировать дифтамид, остаются жизнеспособными и устойчивыми к дифтерийному токсину (Phan et al., 1993). Было высказано предположение, что АДФ-рибозилирование дифтамида в EF-2 может происходить как регуляторное событие в нормальной клеточной физиологии (Fendrick et al. , 1992), но доказательства точной физиологической роли дифтамида у эукариот остаются неуловимыми.

Биология и молекулярная эпидемиология токсина дифтерии и гена tox | Журнал инфекционных болезней

Аннотация

Дифтерийный токсин (DT) представляет собой внеклеточный белок Corynebacterium diphtheriae , который ингибирует синтез белка и убивает восприимчивые клетки.Ген, кодирующий DT (tox) , присутствует у некоторых коринефагов, а DT продуцируется только изолятами C. diphtheriae , содержащими фаги tox + . Репрессор дифтерийного токсина (DtxR) представляет собой глобальный регуляторный белок, который использует Fe 2+ в качестве корепрессора. Holo-DtxR подавляет продукцию DT, коринебактериального сидерофора, гемоксигеназы и некоторых других белков. Диагностические тесты на токсигенность C. diphtheriae основаны либо на иммуноанализе, либо на биоанализе на DT. Молекулярный анализ tox и генов dtxR в недавних клинических изолятах C. diphtheriae выявил несколько аллелей tox , которые кодируют идентичные белки DT, и несколько аллелей dtxR , которые кодируют пять вариантов белка DtxR. Таким образом, недавние клинические изоляты C. diphtheriae продуцируют один антигенный тип DT, и дифтерийный анатоксин продолжает оставаться эффективной вакциной для иммунизации против дифтерии.

Ранняя история дифтерийного токсина

Несколько превосходных обзоров освещают раннюю историю дифтерийного токсина [1–5]; избранные основные моменты будут представлены здесь без ссылок на первоисточники.

В 1820-х годах респираторная дифтерия была идентифицирована как отдельное заболевание и клинически отличалась от других форм ангины. Corynebacterium diphtheriae был визуализирован в 1883 г. Клебсом в окрашенных образцах дифтерийных псевдомембран, а в 1884 г. микроорганизм был выделен Леффлером, и было показано, что он является причиной дифтерии. В 1888 году Ру и Йерсен продемонстрировали, что фильтраты культур C. diphtheriae содержат сильнодействующий термолабильный токсический белок, называемый дифтерийным токсином (ДТ).Очень малые дозы DT, вводимые внутрикожно восприимчивым животным, таким как морские свинки или кролики, вызывают эритему, уплотнение и дермонекроз. Более высокие дозы ДТ, введенные парентерально восприимчивым животным, вызывают типичные для дифтерии системные поражения, в том числе миокардиты, очаговые некрозы в органах, таких как надпочечники, почки, печень, полиневриты. Напротив, некоторые другие животные, такие как мыши и крысы, обладают высокой устойчивостью к DT. Смертельная доза ДТ для человека и восприимчивых животных оценивается примерно в 0,000 л.1 мкг/кг массы тела.

В 1890 г. фон Беринг и Китасато продемонстрировали, что восприимчивых животных можно иммунизировать инъекциями градуированных доз бацилл дифтерии, и сыворотка таких иммунизированных животных защищает других восприимчивых животных от токсического действия DT. Только год спустя, в 1891 г., антитоксин, приготовленный на экспериментальном животном, был успешно использован для лечения дифтерии у ребенка. Интервал от открытия C. diphtheriae и DT до введения фон Берингом антитоксиновой терапии для лечения дифтерии был очень коротким.В 1901 году фон Беринг получил первую Нобелевскую премию по физиологии и медицине за выдающийся вклад в разработку сывороточной терапии дифтерии и других инфекционных заболеваний, опосредованных токсинами.

В 1909 году Теобальд Смит предложил использовать нетоксичные смеси DT и дифтерийного антитоксина при эквивалентности для активной иммунизации людей против дифтерии. Успешное крупномасштабное испытание токсин-антитоксиновой вакцины было проведено в 1922 году в Нью-Йорке компанией WH Park.В 1923 году Рамон обнаружил, что обработка формалином устраняет токсичность ДТ, не нарушая ее иммуногенности. Обработанная формалином DT, теперь называемая дифтерийным анатоксином, быстро стала предпочтительной вакциной против дифтерии и дифтерийного анатоксина (обычно в комбинированных вакцинах, таких как вакцина против дифтерийно-столбнячного анатоксина и коклюша [DTP] или вакцина против дифтерийно-столбнячного анатоксина и бесклеточной коклюшной вакцины [DTaP]. ] для детей и вакцина противостолбнячно-дифтерийный анатоксин для взрослых [Td]) до сих пор используется во всем мире для активной иммунизации против дифтерии.Штамм PW8 C. diphtheriae, , который был выделен Парком и Уильямсом в 1896 году и продуцирует исключительно большое количество DT, также используется во всем мире для получения DT для производства дифтерийного анатоксина для вакцины.

Иммунитет против дифтерии можно приобрести либо путем активной иммунизации дифтерийным анатоксином, либо путем выздоровления от клинической или субклинической инфекции токсиногенным штаммом C. diphtheriae. В 1913 г. Schick ввел простой тест, основанный на реакции на внутрикожную инъекцию небольшой дозы DT, чтобы различать людей, восприимчивых к дифтерии, и тех, у кого иммунитет.У восприимчивых людей (Шик-положительные) развивается длительная эритема и уплотнение в месте инъекции токсина, а у иммунных людей (Шик-отрицательные) этого не происходит. Тест Шика применяли как для определения распространенности иммунитета к дифтерии среди лиц разного возраста, так и для оценки эффективности различных схем вакцинации в выработке протективного антитоксического иммунитета. В течение последних нескольких десятилетий прямое измерение анти-DT-антител в сыворотке заменило тест Шика в качестве основы для оценки иммунитета против дифтерии у отдельных лиц или групп населения.

Генетика токсиногенеза у

C. diphtheriae

Понимание генетики токсиногенеза у C. diphtheriae началось в 1951 г., когда Freeman сообщил, что нетоксиногенный штамм становится токсигенным после инфицирования специфическим коринефагом [6]. В большинстве ранних исследований 1950-х годов, посвященных взаимодействиям фаг-хозяин и генетике токсиногенеза, использовались нелизогенные штаммы C. diphtheriae C4 или C7, tox + коринефаг β, tox мутантный коринефаг γ. бактерии или производные от них фаги [7–9] (и обзоры в [10, 11]).Эти исследования показали, что отдельные штаммы коринефагов относятся либо к tox + , либо к tox ; + фаг и приобретение способности продуцировать ДТ, а элиминация (лечение) профага tox + приводит к потере способности продуцировать ДТ. Эти данные установили, что токсигенность в C.diphtheriae определяется фаговой конверсией (называемой также лизогенной конверсией, т. е. способностью бактерии вносить изменения ДТ в результате заражения конкретным фагом).

Когда в конце 1960-х годов стала доступна генетическая система для анализа рекомбинации между близкородственными, но гетероиммунными коринефагами β и γ, были обнаружены маркер tox + β и маркер tox γ. сегрегировать как аллели в дискретном генетическом локусе [12].Нетоксигенные мутанты фага β были выделены в начале 1970-х годов, и было показано, что некоторые мутантные аллели tox определяют продукцию нетоксичных белков, перекрестно реагирующих материалов (CRM), имеющих ту же молекулярную массу, что и DT, и реагирующих с антигенами. Антитела к ДТ [13]. Это открытие убедительно продемонстрировало, что детерминанта tox фага β является структурным геном DT. C. diphtheriae C7 может продуцировать DT не только тогда, когда β присутствует в виде профага, но и когда он присутствует либо в виде вегетативно реплицирующегося фага, либо в виде нереплицирующегося экзогенота в бактерии с гомологичным лизогенным иммунитетом [14–16]. Эти данные показали, что экспрессия структурного гена DT у фага β не регулируется координированно с другими фаговыми генами, которые необходимы только для вегетативного роста или лизогении.

В середине 1970-х картирование тонкой структуры мутантных tox аллелей фага β, кодирующих амино-концевые фрагменты DT различной длины, показало, что ген tox коллинеарен DT, и установило ориентацию транскрипции гена tox относительно генетической карты фага β [17, 18].Было показано, что генетическая карта профага β циклически пермутирована по отношению к вегетативной генетической карте фага β; и tox, , занимающий центральное положение на вегетативной карте, расположен на одном конце профаговой карты, непосредственно примыкающем к месту прикрепления фага ( att P) [17, 19]. Существует два разных, но функционально эквивалентных бактериальных сайта прикрепления ( att B) для интеграции β-профага в хромосому C. diphtheriae [20], причем сайты att B расположены внутри Arg-тРНК 2 , который присутствует в двух разных местах хромосом [21]. Тот факт, что ген tox расположен в конце генетической карты профага, позволяет предположить, что он мог быть включен в нетоксигенный предок фага β в результате нелегитимной рекомбинации, аналогичной тем, которые участвуют в формировании специализированных трансдуцирующих фагов в других фагах. -хост-системы.

В течение 1980-х годов были определены рестрикционные карты для геномов фагов β и γ [22–24], а также клонировано и секвенировано tox аллелей из нескольких tox + коринефагов и мутантов фага β, кодирующих нетоксические или гипотоксические варианты ДТ [25–28].Аллели tox + из этих коринефагов кодировали DT с той же выведенной аминокислотной последовательностью. Эти исследования подготовили почву для последующего анализа структуры и функции DT с помощью случайного и сайт-направленного мутагенеза клонированных аллелей tox , путем отбора в бактериальных или эукариотических системах мутантов tox с интересующими специфическими фенотипами, а также путем очистки и характеристика различных рекомбинантных форм DT после их получения в бактериальных или бесклеточных системах экспрессии.

Большинство токсиногенных штаммов C. diphtheriae содержат последовательности ДНК, родственные фагу β [29, 30]. Кроме того, в коллекции из шести tox + коринефагов с различными фенотипами, включая β, гибридизация ДНК показала, что все они связаны с β, за исключением токсиногенного фага δ, который, по-видимому, представляет другую фаговую линию [31, 32]. ]. Текущие данные подтверждают гипотезу о том, что все токсикогенные изоляты C. diphtheriae содержат конвертирующие фаги, хотя некоторые из конвертирующих фагов могут быть дефектными или неспособными образовывать бляшки на имеющихся C.diphtheriae индикаторных штаммов.

Большинство нетоксигенных изолятов C. diphtheriae и большинство tox коринефагов не содержат каких-либо обнаруживаемых последовательностей ДНК, родственных tox . В нескольких исследованиях изучались редкие tox изоляты C. diphtheriae или коринефаги из них, которые имеют последовательности ДНК, родственные tox , но не кодируют функциональную DT [29, 33, 34]. В случае коринефага γ tox an ∼1.Присутствует вставка размером 5 т.п.н., которая прерывает кодирующую область для сигнальной последовательности DT и предотвращает трансляцию tox [33]. Нуклеотидная последовательность концов этого элемента указывает на то, что это, вероятно, инсерционная последовательность, но транспозиция предполагаемой инсерционной последовательности напрямую не продемонстрирована. Использование вставочной последовательности в качестве ДНК-зонда в экспериментах по Саузерн-гибридизации показывает, что она присутствует в различных количествах копий среди различных изолятов C.diphtheriae [35]. Фаг γ отличается от фага β специфичностью иммунитета, но коиммунен к коринефагу π tox + [31].

Среди 14 нетоксигенных изолятов C. diphtheriae с последовательностями ДНК, родственными tox , которые были выделены в Соединенных Штатах в конце 1970-х годов, 12 из Южной Дакоты продуцируют ферментативно активные, но нетоксичные амино-концевые фрагменты DT и, по-видимому, быть повторяющимися изолятами одного штамма с точечной мутацией, обрывающей цепь, в его аллеле tox . Фаг Adp из 1 из этих 12 изолятов коиммунен к γ и π, а рестрикционные фрагменты его ДНК идентичны по размеру рестрикционным фрагментам коринефага π. На основании этих данных фаг Adp представляется tox мутантом фага π. Два других нетоксигенных изолята C. diphtheriae из этого набора были выделены на Аляске и во Флориде [34]. Фаг tox 787, выделенный из аляскинского изолята 787, содержит последовательности ДНК, родственные tox , а также коиммунен к γ и π.Ни лизоген C. diphtheriae 787, ни лизоген C. diphtheriae C7(787), полученный в лаборатории, не давал фрагмента DT, обнаруживаемого с помощью очень чувствительного вестерн-блоттинга с дифтерийным антитоксином, а рестрикционные фрагменты ДНК фага 787 не были идентичными. по размеру с таковыми из γ или π. Из нетоксигенного изолята C. diphtheriae 788 из Флориды инфекционный коринефаг не был выделен, хотя в этом изоляте может присутствовать дефектный геном фага. Нетоксигенные фенотипы фагов Adp и 787 и C. diphtheriae 788 были цис -доминантными, что свидетельствует о том, что мутации либо в DT-кодирующей области, либо в промоторе tox определяли фенотипы, но потребуются дополнительные данные для определить точные молекулярные дефекты в локусах tox из этих штаммов C. diphtheriae и их фагов. Существование загадочных генов tox в клинических изолятах C.diphtheriae , однако, возникает теоретическая возможность того, что функциональные аллели tox + могут время от времени возникать в природе в результате рекомбинации между генетически родственными коринефагами, которые содержат tox -родственные последовательности ДНК, но разные аллели tox с неперекрывающимися аллелями tox . .

Механизм действия и структура дифтерийного токсина

DT является одним из наиболее изученных среди всех бактериальных токсинов (обзоры в [4, 36, 37]). Как нативные, так и рекомбинантные формы DT доступны в высокоочищенной форме. Определена аминокислотная последовательность DT. Кристаллическая структура ДТ установлена ​​рентгеноструктурным анализом. Большинство аспектов механизма действия DT, включая его связывание с клеточными рецепторами, его проникновение в эукариотические клетки и ферментативный механизм его внутриклеточной токсичности, охарактеризованы на молекулярном уровне и интерпретированы с точки зрения известной структуры. Охарактеризовано множество вариантов ДТ с аминокислотными заменами, влияющими на его биологическую активность.В этом разделе будут кратко рассмотрены избранные основные моменты этих обширных исследований.

Понимание молекулярной основы внутриклеточного действия ДТ началось с наблюдения в 1959 г., что ингибирование синтеза белка является первым эффектом ДТ на культурах восприимчивых эукариотических клеток [38]. DT также ингибирует синтез белка в бесклеточных экстрактах эукариотических клеток, и такие бесклеточные системы синтеза белка были идеальными для анализа биохимических требований и целей действия DT. Было показано, что никотинамидадениндинуклеотид (НАД) необходим для ингибирования синтеза белка в клеточных экстрактах [39], а компонент механизма синтеза белка, ингибируемый ДТ, был идентифицирован как фактор элонгации 2 (EF-2) [40, 41]. . Наконец, было продемонстрировано, что DT действует каталитически, перенося часть аденозиндифосфатрибозы (ADPR) от NAD к EF-2, тем самым инактивируя EF-2 и ингибируя удлинение цепи во время синтеза белка [42].

Исследования, проведенные в 1970-х годах, показали, что DT является проферментом, который должен быть обработан для активации его латентной активности NAD: EF-2 ADPR-трансферазы.Зрелый внеклеточный DT, продуцируемый C. diphtheriae , представляет собой полипептид с молекулярной массой ~58 кДа, состоящий из 535 аминокислотных остатков. Он содержит четыре остатка цистеина (C) и две внутренние дисульфидные связи, которые связывают C186 с C201 и C461 с C471. Обработка DT трипсином селективно расщепляет пептидную связь, расположенную на карбоксиконцевой стороне остатка аргинина (R), экспонированного на поверхности R190, R192 или R193, с образованием аминоконцевого фрагмента A (DT-A) и карбокси-конца. концевой фрагмент B (DT-B), которые остаются ковалентно связанными дисульфидной связью между C186 и C201 [43, 44].Восстановление этой дисульфидной связи приводит к образованию свободного DT-A, который соответствует каталитическому домену (C-домен) DT, и свободного DT-B, который соответствует транслокационному и рецептор-связывающему доменам (T-домен и R-домен, соответственно) ДТ [45, 46]. Интоксикация клеток является прямым следствием рибозилирования АДФ и инактивации EF-2 в цитоплазме, катализируемых DT-A. Когда одну молекулу DT-A вводят непосредственно в цитоплазму, этого достаточно, чтобы убить эукариотическую клетку [47].Следовательно, DT-A должен быть достаточно стабильным в цитоплазме эукариотических клеток.

Исследования, проведенные в 1980-х годах, показали, что реакция NAD : EF-2 ADPR-трансфераза, катализируемая DT-A, включает инверсию конфигурации от β-аномера NAD к α-аномеру в АДФ-рибозилированном EF-2 [48]. Акцепторный сайт для АДФ-рибозилирования с помощью DT-A представляет собой посттрансляционно модифицированный остаток гистидина, 2-[3-карбоксиамидо-3-(триметиламмонио)пропил]гистидин, называемый дифтамидом, который встречается только в одном консервативном положении в EF-2 эукариот. и архей [49, 50].Кинетический анализ реакции НАД : EF-2 ADPR-трансферазы демонстрирует последовательный механизм, в котором DT-A должен сначала связываться с НАД, прежде чем он сможет взаимодействовать с EF-2 [51]. Остаток дифтамида в EF-2 не является существенным для жизнеспособности эукариотических клеток и мутантов DT-чувствительных клеток, которые не могут производить дифтамид [52–54] или которые имеют вариантные формы EF-2, которые не могут быть АДФ-рибозилированы [55]. устойчивы к токсическому действию ДТ.

Хотя клетки различных видов животных резко различаются по восприимчивости к DT, синтез белка в бесклеточных экстрактах всех видов ингибируется DT-A.Это открытие указывает на то, что клетки устойчивых видов не поглощают и не интернализуют DT таким же образом, как клетки восприимчивых видов. Исследования, проведенные в 1970-х годах, показали, что высокочувствительные клетки имеют большее количество высокоаффинных рецепторов DT на своих плазматических мембранах, чем клетки с более низкой чувствительностью, и что DT-резистентные клетки не имеют высокоаффинных рецепторов для DT [56-58]. Исследования 1990-х годов привели к клонированию гена, кодирующего рецептор DT, и идентификации продукта гена как предшественника гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (предшественник HB-EGF) [59, 60], очистке белка рецептора DT [61]. , локализация активности рецептора DT во внеклеточном домене EGF предшественника HB-EGF [62, 63] и демонстрация того, что ассоциация рецептора с DRAP27/CD9 в плазматической мембране увеличивает активность рецептора и восприимчивость к DT [64, 65]. .Анализ различий между EGF-доменами предшественников HB-EGF из восприимчивых клеток человека или обезьяны и резистентных клеток мыши вместе с конструированием и анализом химерных и мутантных форм предшественника HB-EGF показал, что остаток E141 является существенным, а остатки R115 и L127 важны для функции предшественника HB-EGF в качестве DT-рецептора [66, 67].

Связывание DT с предшественником HB-EGF запускает рецептор-опосредованный эндоцитоз токсина через ямки, покрытые клатрином, и комплексы DT-рецептор направляются по эндосомальному пути [56, 68]. Большая часть ДТ, поступающего в клетки по этому пути, направляется в лизосомы для деградации, и лишь небольшая часть отвечает за интоксикацию [68, 69]. Транслокация требует воздействия на ДТ кислых условий, сравнимых с подкисленными эндосомами [70, 71], что вызывает конформационные изменения и позволяет транслокационному домену ДТ внедряться в мембраны и формировать канал, через который происходит транслокация А-фрагмента [72–71]. 75]. Если клетки с DT-рецепторными комплексами на плазматической мембране подвергаются воздействию кислого внеклеточного pH, транслокация происходит непосредственно через плазматическую мембрану с интоксикацией клетки-мишени [70, 71].Недавние данные указывают на то, что транслокация DT происходит преимущественно из ранних эндосом посредством АТФ-зависимого процесса, которому способствуют клеточные белки, включая βCOP, тогда как DT, который достигает поздних эндосом, разрушается лизосомным путем [69, 76]. Замена отдельных аминокислот в различных положениях по всему транслокационному домену DT оказывает сильное влияние на активность мембранных каналов, образованных DT в клетках Vero, что указывает на то, что активность каналов является неотъемлемым свойством DT и не вызвана активацией DT эндогенных клеточных каналов. [77].Интоксикацию клеток DT можно предотвратить, вмешиваясь в любой из ранних этапов этого эндоцитарного пути, включая вмешательство в эндоцитоз через покрытые клатрином ямки (путем гиперэкспрессии динамина) или блокируя закисление эндосом (различными фармакологическими агентами) [69, 78, 79]. Кроме того, мутантные клетки, лишенные способности закислять эндосомы, устойчивы к интоксикации ДТ [80].

В настоящее время методом рентгеновской кристаллографии определены структуры свободного ДТ, ДТ в комплексе с эндогенным нуклеотидом ApUp, ДТ в комплексе с НАД и каталитического домена ДТ [81–86].DT имеет три различных домена: амино-концевой С-домен, ответственный за АДФ-рибозилирование EF-2; центрально расположенный Т-домен, ответственный за внедрение в мембраны при кислом рН, образование каналов и транслокацию С-домена через эндосомальные мембраны для доставки в цитозоль; и карбоксиконцевой R-домен, ответственный за связывание DT с предшественником HG-EGF, который действует как рецептор DT на восприимчивых клетках. ДТ и несколько других хорошо изученных АДФ-рибозилирующих токсинов имеют общий НАД-связывающий мотив с высококонсервативными остатками, которые необходимы для каталитической активности, и была предложена подробная модель механизма катализа АДФ-рибозилирования под действием ДТ [85, 87, 88].Структурная основа для связывания NAD с помощью DT хорошо определена, и модель взаимодействия комплекса NAD-DT с EF-2, которая согласуется как с последовательным ферментативным механизмом, так и с кристаллической структурой, включает замещение NAD-связыванием петлевой последовательности. от остатка 32 до 54 с последующим взаимодействием переориентированной последовательности петли с EF-2 [85]. Сайт-направленный мутагенез и анализ полученных мутантных форм DT в настоящее время широко используются для тестирования конкретных моделей каталитических, транслокационных и рецепторсвязывающих функций DT, которые основаны на кристаллических структурах, но анализ этого интересного и быстрого растущая область исследований выходит за рамки настоящего обзора.

Регулирование производства дифтерийного токсина

На продукцию ДТ токсигенными изолятами C. diphtheriae сильно влияют состав культуральной среды и условия культивирования (обзор в [89–91]). Наиболее изученным эффектом, который будет подробно рассмотрен здесь, является роль железа в токсиногенезе. Исследования, проведенные в 1930-х годах, показали, что продукция DT максимальна, когда C. diphtheriae выращивают в условиях с ограниченным содержанием железа, и резко подавляется в условиях роста с высоким содержанием железа [92].Обширные ранние исследования фенотипических различий между C. diphtheriae , выращенными в условиях с низким и высоким содержанием железа, рассмотрены в другом месте [2, 3].

Молекулярные исследования регуляции синтеза ДТ начались в 1970-х годах. Было показано, что ДНК из tox + коринефага β управляет синтезом DT и других кодируемых фагом белков в системе транскрипции/трансляции in vitro из Escherichia coli, и добавлением экстрактов из C. diphtheriae к этой системе ингибировал синтез DT, не влияя на продукцию других белков, кодируемых фагом [93]. Последующие исследования выявили мутанты C. diphtheriae C7(β), нечувствительные к ингибирующему действию железа на продукцию ДТ, и показали, что этот фенотип определяется бактериальным геномом, а не геномом фага β [94]. Также были выделены мутантные β-фаги, которые позволили лизогенов C. diphtheriae , содержащих их, продуцировать DT в условиях с высоким содержанием железа, хотя они демонстрировали плейотропные фенотипы, которые влияли на максимальное количество продуцируемого DT, а также на регуляцию продукции DT железом [95]. –97].Эти фаговые мутанты демонстрировали -цис--доминантный фенотип [96, 97], и картирование тонкой структуры показало, что мутация tox -201, выбранная для детального анализа, располагалась непосредственно рядом со структурным геном DT на стороне, соответствующей его транскрипционное происхождение [95]. Анализ остаточной биосинтетической способности DT C. diphtheriae C7(β) после добавления рифампина или железа к культурам, продуцирующим DT, в качестве меры функциональной DT-специфичной мРНК предоставил доказательства того, что регуляция железом продукции DT происходит в уровень транскрипции и подавление продукции DT-специфичной мРНК [98].В совокупности эти данные подтверждают гипотезу о том, что хромосома C. diphtheriae кодирует репрессор, который может использовать железо в качестве корепрессора для ингибирования транскрипции гена tox и снижения продукции DT в условиях роста с высоким содержанием железа. 99, 100].

Характеристика дополнительных мутантов C. diphtheriae C7(β), которые продуцируют DT во время роста в среде, содержащей достаточное количество железа для подавления продукции DT диким типом C7(β), привела к открытию сидерофор-зависимой системы поглощения железа в г.diphtheriae [101, 102]. Способность этих мутантов продуцировать DT во время роста в условиях с высоким содержанием железа связана с их неспособностью ассимилировать железо, связанное с сидерофорами, что, по-видимому, вызывает дефицит железа во внутриклеточной среде, даже когда среда для выращивания богата железом. Было показано, что система поглощения железа является специфичной для ионов трехвалентного железа, высокоаффинной, зависимой от сидерофоров, энергозатратной системой, которая зависит от протондвижущей силы [101]. Выделен и охарактеризован мутант C. diphtheriae , неспособный продуцировать сидерофор (коринебактин), и коринебактин частично очищен [101, 103].Структура коринебактина из C. diphtheriae не была определена, и неясно, связана ли недавно определенная структура сидерофора (также называемого коринебактином) из Corynebacterium glutamicum [104] с коринебактином из C. diphtheriae. Штамм Park-Williams 8 (PW8), который продуцирует очень большое количество DT и используется во всем мире для производства дифтерийного анатоксина, представляет собой встречающийся в природе дефицитный по коринебактину вариант C.дифтерии [105]. Это открытие представляет значительный интерес из-за возможности того, что дефицит сидерофора может способствовать высокотоксигенному фенотипу штамма PW8. Недавние исследования показали, что C. diphtheriae также может использовать экзогенный гем или гемоглобин в качестве источника железа посредством пути, который использует гемоксигеназу коринебактерий для деградации гема и не зависит от сидерофор-зависимого пути поглощения железа [106–108].

Клонирование структурного гена дифтерийного токсина и непосредственно примыкающих выше регуляторных последовательностей было выполнено в 1980-х годах [25–28].Вскоре после этого был охарактеризован промотор tox , и с помощью нуклеазного картирования S1 было показано, что транскрипция DT-специфичной мРНК происходит как в C. diphtheriae , так и в E. coli в нуклеотидных положениях -41 и -40 выше по течению от начало трансляции GTG для структурного гена tox [33]. Последовательность, аналогичная консенсусу для области -35 промоторов σ70 в E. coli , была расположена, начиная с положения -74 от структурного гена tox , и две возможные последовательности -10 были расположены, начиная с положений -54 и — 48. Последующие исследования с использованием сайт-направленного мутагенеза показали, что последовательность, начинающаяся в положении -48, является первичной областью промотора -10, хотя последовательность, начинающаяся в положении -54, может функционировать с умеренной эффективностью в качестве области промотора -10, если первичная последовательность была инактивирована. 109].

Прямая характеристика репрессора дифтерийного токсина (DtxR), существование которого предсказывалось с 1970-х годов, за последнее десятилетие быстро прогрессировала. Во-первых, сырые экстракты из C.diphtheriae , выращенных в условиях с высоким, но не низким содержанием железа, как было показано, содержит фактор, который связывается с предполагаемым оператором tox и защищает специфическую нуклеотидную последовательность от расщепления ДНКазой I [110]. Вскоре после этого 2 группы независимо клонировали ген (dtxR) , который кодирует DtxR, путем скрининга библиотек хромосомных генов из C. diphtheriae C7 в E. coli на предмет железозависимого ингибирования репортерного гена, экспрессируемого под контролем промотор tox из коринефага β [111, 112].Предсказанный продукт dtxR представляет собой полипептид из 226 аминокислот, а транскрипция гена dtxR в C. diphtheriae конститутивно происходит на низком уровне в условиях роста с низким и высоким содержанием железа [112]. Хотя физиологическая функция DtxR в C. diphtheriae аналогична функции регулятора поглощения железа Fur из E. coli и других грамотрицательных бактерий [113], Fur не регулирует промотор tox , а DtxR не регулирует Fur-зависимые промоторы.Таким образом, DtxR и Fur являются прототипами двух различных типов бактериальных железозависимых регуляторных белков. Секвенирование аллеля dtxR из мутанта C7(β)hm723, который производит DT в условиях высокого содержания железа [94], показало, что он содержит единственную нуклеотидную замену, приводящую к замене гистидина на аргинин в остатке 47 DtxR (обозначенном как R47H). [114, 115]. Аллель dtxR от PW8 идентичен аллелю от C7, но dtxR от C.diphtheriae 1030 биотип belfanti лишь на 91,6% идентичен аллелю из С7 и кодирует вариант DtxR, отличающийся от C7 DtxR 6 аминокислотными заменами в карбоксиконцевой области [115].

Рекомбинантный белок DtxR был экспрессирован в E. coli, , очищен различными методами, включая аффинную хроматографию на ионах металлов, и испытан in vitro на взаимодействие с фрагментами ДНК, содержащими промоторную/операторную область tox , с помощью гель-сдвигов, ДНКазы I футпринтинг гидроксильных радикалов и другие методы [116–119].Эти исследования показали, что для связывания DtxR с промотором/оператором tox требуются двухвалентные катионы (Cd 2+ , Co 2+ , Fe 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ или ). Zn 2+ ), что комплексы DtxR-ДНК проявляют более медленную электрофоретическую подвижность, чем свободные фрагменты ДНК, что специфическая последовательность длиной ~30 п. н. защищена DtxR от расщепления ДНКазой I, что защищенная последовательность содержит последовательность из 27 п.н. с инвертированными повторами длиной 9 п.н. на каждом конце, и что белок симметрично взаимодействует с двумя половинами палиндромной последовательности промотора/оператора.Они также показали, что DtxR не связывается с фрагментом ДНК, содержащим промотор/оператор fur , аллель tox -201, проявляющий цис -доминантную устойчивость к подавлению синтеза DT железом, или мутантный tox . промоутер/оператор, из которого удалено одно плечо палиндрома. Последующие исследования показали, что общим признаком DtxR-регулируемых операторов является палиндромное ядро ​​из 19 п.н. с консенсусной последовательностью TTAGGTTAGCCTAACCTAA [120–122] и нуклеотидные замены, ответственные за оператор-конститутивные фенотипы мутантных аллелей tox -201. и tox -202 расположены внутри этой последовательности ядра [123].Связывание Ni 2+ с DtxR имеет кажущуюся константу диссоциации от 9 х 10 -7 М до 2 х 10 -6 М, является кооперативным и приводит к гашению собственной флуоресценции W104 в DtxR [124, 125]. Мономерный апо-DtxR находится в слабом равновесии с димерами, но димеры стабилизируются за счет взаимодействия с двухвалентными катионами, активирующими репрессорную активность [125].

Структуры голо-DtxR дикого типа в комплексе с Cd 2+ , Co 2+ , Fe 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ 7 или Zn 23 4 909; апо-DtxR дикого типа; и C102D-вариант голо-DtxR в комплексе с Ni 2+ были определены методом рентгеновской кристаллографии [126–131].Самые высокие разрешения, доступные в настоящее время, составляют 1,85 Å для голо-DtxR в комплексе с Co 2+ [130] и 2,2 Å для апо-DtxR [131]. Димеры apo-DtxR и holo-DtxR могут кристаллизоваться в любой из двух форм [131]. В кристаллической форме 1 асимметричным звеном является мономер DtxR, а ось димера соответствует кристаллографической двойной оси; в кристаллической форме 2 димер DtxR представляет собой асимметричную единицу, а ось димера не является кристаллографической осью.

Каждый мономер DtxR имеет три домена. Домен 1 (остатки 1–73) расположен на аминоконце и содержит мотив спираль-поворот-спираль, который является сайтом связывания ДНК. Домен 2 (остатки 74–144) представляет собой домен димеризации и связывания металлов. Он имеет два сайта связывания двухвалентных катионов, которые могут активировать DtxR, и структуры с высоким разрешением показывают, что сайт 1 связывает сульфатный или фосфатный анион в дополнение к двухвалентному катиону [129, 130]. В сайте 1 лигандами для связывания металла DtxR дикого типа являются боковые цепи H79, E83 и H98 и анион, а дополнительными лигандами для связывания аниона являются боковые цепи R80, S126 и N130.В сайте 2 лигандами для связывания металла DtxR дикого типа являются карбонильный кислород C102, боковые цепи E105 и h206 и молекула растворителя. Домен 3 (остатки 145–226) проявляет большую гибкость, чем домены 1 и 2, и неупорядочен в структурах DtxR при более низких разрешениях. При высоком разрешении домен 3 демонстрирует Sh4-подобную складку [129, 130], но функция домена 3 неизвестна. Сообщается, что в варианте C102D DtxR боковые цепи остатков D102 и M10 служат дополнительными металлсвязывающими лигандами в сайте 2 [128].

На основании небольших различий в структуре димеров апо-DtxR и голо-DtxR, наблюдаемых со структурами с низким разрешением, была предложена модель, согласно которой связывание ионов металлов активирует DtxR, изменяя его четвертичную структуру и вызывая калипероподобное вращение мономеров относительно друг друга [127, 128]. Недавно были определены структуры высокого разрешения апо-DtxR и голо-DtxR в обеих кристаллических формах 1 и 2, которые позволяют анализировать структурные различия в DtxR, вызванные связыванием металлов, а также кристаллической упаковкой [131].Эти исследования показывают, что связывание ионов металлов вызывает изменение третичной, а не четвертичной структуры DtxR с переориентацией домена 1 и сегмента из 20 остатков на карбоксильном конце домена 2 каждого мономера по отношению к инвариантному димерному ядру, образованному остаток домена 2 обоих мономеров. Как следствие, расстояние между некоторыми реперными точками в мотивах спираль-поворот-спираль короче до 1,7 Å, а угол между осями ДНК-связывающих спиралей в этих мотивах больше до 6° в голографическом режиме. -DtxR, чем в апо-DtxR.Эти структурные изменения дают представление о вероятном механизме активации DtxR Fe 2+ или другими двухвалентными катионами. Однако в большинстве структур холо-DtxR заселенность позиции 1 ионами металлов высока, точка 2 не занята или имеет низкую заселенность ионами металлов, а сульфгидрильная группа C102 модифицирована окислением или вероятным образованием смешанного дисульфида. [126, 127, 129–131]. Напротив, в кристаллах C102D-варианта holo-DtxR сайт 2 характеризуется большей заселенностью ионами металлов, чем сайт 1 [128].

Дополнительную информацию предоставляет недавно опубликованная частичная структура с разрешением 3 Å активированного DtxR-C102D в комплексе с сегментом ДНК длиной 33 п.н., содержащим оператор tox [132]. Удивительно, но два димера DtxR, которые не взаимодействуют друг с другом, связываются с противоположными сторонами ДНК в положениях, отстоящих друг от друга на 5 п. н., но симметрично расположенных относительно центра оператора tox . Остатки 3-120 димеров DtxR обнаруживают конформационные отличия от апо-DtxR, которые сходны по типу, но несколько больше по величине, чем описанные выше для holo-DtxR.Кроме того, остатки 3-6 на амино-конце претерпели переход от спирали к спирали, что может дополнительно облегчить связывание DtxR с ДНК. Мотивы спираль-поворот-спираль в каждом мономере активированного DtxR ориентированы так, что боковые цепи Gln43 могут взаимодействовать с основаниями в большой бороздке, а множество других аминокислот могут взаимодействовать с фосфатными группами в основной цепи ДНК.

Функция DtxR также была проанализирована путем введения мутаций в клонированный ген dtxR и анализа их влияния на экспрессию репортерных генов, регулируемых DtxR, в E.коли. Важная роль C102 была установлена ​​путем демонстрации того, что все возможные аминокислотные замены для C102, кроме аспартата, отменяли активность DtxR, в то время как вариант C102D был значительно менее активен, чем DtxR дикого типа [133]. Случайный бисульфитный мутагенез dtxR с последующим фенотипическим скринингом и секвенированием нуклеотидов идентифицировал 20 мутаций, затрагивающих одиночные кодоны, из которых 18 приводили к заменам одиночных аминокислот в DtxR, а 2 были терминирующими цепь [124].Два варианта DtxR с аминокислотными заменами в домене 1 имели фенотип дикого типа, а все остальные варианты DtxR проявляли пониженную репрессорную активность от незначительной до резкой.

Среди вариантов DtxR со сниженной активностью десять замен и одно усечение были расположены в домене 1, 5 замен и одно усечение произошло в домене 2, и только 1 замена была в домене 3. Большинство этих замен затрагивали остатки в или непосредственно прилегающие к ДНК-связывающему мотиву, интерфейсу димера или сайту связывания металла 2 [124, 126].Единичные замены аланина для каждой из аминокислот, которые служат лигандами для связывания металлов в сайте 1 (H79, E83 и H98) и сайте 2 (C102, E105 и h206), продемонстрировали, что замены в сайте 1 мало или совсем не влияют на репрессорной активности, но замены в сайте 2 отменяют репрессорную активность [128, 133]. Кроме того, одиночные замены аланином остатков E6, D9, M10, R13 и E17 в домене 1, которые прямо или косвенно взаимодействуют с аминокислотами в домене 2, участвующими в связывании металлов, приводили к снижению репрессорной активности.Исследователи пришли к выводу, что сайт 2 является основным сайтом связывания металлов, который непосредственно участвует в активации DtxR, а сайт 1 играет в лучшем случае незначительную роль в активации DtxR [128].

В недавнем исследовании были повторно исследованы одиночные аланиновые замены для связывающих металл остатков в сайтах 1 и 2 и расширен анализ, чтобы включить замены для анион-связывающих остатков R80, S126 и N130, а также остатка E20 в домене 1, который взаимодействует напрямую с R80 в домене 2 через две водородные связи [134].Результаты подтвердили, что замены остатков, связывающих металл, в сайте 1 не снижали активность DtxR так сильно, как замены в сайте 2, но, напротив, замена R80, S126, N130 или E20 на аланин снижала активность DtxR почти так же, как замена в сайте 2. сайт 2 замены. Эти находки демонстрируют, что остатки, участвующие в связывании аниона в сайте 1 и взаимодействии R80-E20, необходимы для репрессорной активности, и подтверждают вывод, что и сайт связывания аниона с катионом 1, и сайт связывания катиона 2 важны для функции DtxR.

DtxR функционирует как железозависимый глобальный регулятор метаболизма у C. diphtheriae, , и в настоящее время проводится характеристика семейства генов в регулоне DtxR и их продуктов. Продукция ДТ и сидерофора координированно регулируется при переходе от железодефицитных к железодефицитным условиям роста [135]. Продукция как DT, так и сидерофора дерепрессируется в C. diphtheriae C7(β)hm723, который лишен функции DtxR, а комплементация аллелем dtxR + дикого типа восстанавливает репрессивность продукции как DT, так и сидерофора при высоких -условия роста железа [112].Клонирование хромосомных локусов из C. diphtheriae C7(-) и скрининг промоторов, которые функциональны в E. coli и репрессируются DtxR в условиях роста с высоким содержанием железа, привели к идентификации пяти различных регулируемых железом промоторов/операторов. обозначены от IRP1 до IRP5 [120, 122, 136]. Липопротеин массой 38 кДа, который функционирует как предполагаемый рецептор сидерофора железа, кодируется ниже IRP1 [136], белок массой 15 кДа, гомологичный нескольким бактериальным регуляторным белкам семейства AraC, кодируется ниже IRP3 [122], и кадры, кодирующие белок массой 15 кДа и предполагаемый полипептид из 67 аминокислот с неизвестными функциями, кодируются ниже IRP4 и IRP5 соответственно [122].DtxR также регулирует ген hmuO C. diphtheriae , который кодирует гемоксигеназу [106, 108]. Кроме того, было идентифицировано по крайней мере 14 белков, которые предпочтительно экспрессируются C. diphtheriae в условиях низкого содержания железа, но не установлено, регулирует ли их DtxR [137].

DtxR в настоящее время признан прототипом семейства гомологичных железозависимых регуляторных белков (обычно называемых IdeR), обнаруженных у ряда бактерий вне рода Corynebacterium, , включая Brevibacterium lactofermentum [138], Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium Tuberculosis [136, 139, 140], Streptomyces Lividans и Streptomyces и , Staphylococcus Epidermidis и Staphylococcus Aureus [142] и Treponema Pallidum [143]. Аминокислотные последовательности этих белков высококонсервативны (общая идентичность с DtxR составляет 50–60%), хотя домены 1 и 2 демонстрируют гораздо более высокую консервативность, а домен 3 демонстрирует гораздо большую изменчивость. Поразительно, аминокислоты, которые считаются важными для функционирования в сайте связывания аниона и катиона 1 и в сайте связывания металла 2, идентичны среди всех этих гомологов DtxR, за исключением предполагаемой замены H79D в белке IdeR, кодируемом . B. lactofermentum 138].

Молекулярная эпидемиология

tox и dtxR Гены в C. diphtheriae

Клонирование и секвенирование гена tox в начале 1980-х гг. и гена dtxR в начале 1990-х гг. позволило непосредственно изучить эволюцию этих генов среди штаммов C. diphtheriae , выделенных в разное время и в разные локации. В то же время эпидемия дифтерии, начавшаяся в 1990 г. в Российской Федерации и ставшая крупнейшей вспышкой дифтерии в развитых странах мира с 1960-х гг. , предоставила уникальную возможность определить, могут ли специфические аллели tox или dtxR быть полезными в качестве молекулярные маркеры для конкретных клонов C.diphtheriae , которые циркулируют или развиваются в ходе крупной эпидемии. Родственные молекулярные методы использовались для определения того, почему некоторые нетоксигенные изоляты C. diphtheriae несут последовательностей генов tox , но не продуцируют DT, как обсуждалось в предыдущем разделе этого обзора.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием специфических прямых и обратных праймеров в пределах гена tox , соответствующего сегменту домена А DT, была исследована как быстрый метод для определения того, являются ли клинические изоляты C.diphtheriae были токсиногенными [144–146]. Точность теста выгодно отличается от теста Элека для обнаружения производства DT и является полезным дополнением к диагностическому арсеналу. Недавно были разработаны оптимизированные стандартные условия для выявления токсикогенных C. diphtheriae непосредственно из клинических образцов с помощью ПЦР с двумя наборами праймеров, специфичных для доменов А и В DT [147]. Расчетные уровни чувствительности для использования этих двух наборов праймеров составляли 50 и 500 КОЕ на смесь для ПЦР.Хотя тесты на основе ПЦР могут давать вводящие в заблуждение результаты относительно токсигенности штаммов, которые имеют последовательности генов tox , но не продуцируют биологически активный DT, такие штаммы редко встречаются среди клинических изолятов C. diphtheriae.

Традиционные методы дифференциации бактериальных штаммов, такие как биотипирование, антибиограммы, фаговое типирование и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, получили лишь ограниченное признание в качестве инструментов для молекулярно-эпидемиологических исследований C.diphtheriae , потому что им не хватало мощности для различения штаммов или они были слишком громоздкими, чтобы их можно было широко использовать (или и то, и другое). В последнее время для молекулярно-эпидемиологического сравнения изолятов C. diphtheriae из эпидемии в России и из коллекций эталонных культур с большим успехом применялись риботипирование, мультилокусный электрофорез ферментов и гель-электрофорез в пульсирующем поле [148, 149]. Эти исследования показали, что в 1990 г. в России появилась отдельная клональная группа изолятов (названная комплексом ET 8), которая по мере развития эпидемии становилась все более распространенной.

Эти исследования были расширены за счет использования ПЦР для анализа гетерогенности генов tox и dtxR среди 72 изолятов C. diphtheriae из России и Украины, которые были собраны до и в течение ранней стадии настоящей эпидемии. [150]. Праймеры были сконструированы таким образом, чтобы ампликоны из четырех наборов охватывали dtxR, ампликонов из восьми наборов охватывали tox, , и ампликоны имели подходящий размер для анализа по паттернам одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP). Все четыре области в dtxR и три области в tox показали значительные различия в размерах или количестве (или обоих) ампликонов, а dtxR и tox можно было разделить на 12 и 6 различных типов соответственно. Большинство эпидемических изолятов из России были dtxR типов 2 и 8 (все биотипы gravis), большинство эпидемических изолятов из Украины были dtxR типа 5 (все биотипы gravis), а изоляты обоих типов были tox типов 3 и 4.Изоляты биотипа mitis относились к типу dtxR 1. Таким образом, анализ ПЦР-SSCP позволил выявить четкую связь изолятов различного географического и временного происхождения с конкретными типами dtxR и tox .

Прямое секвенирование аллелей dtxR и tox проведено на 72 изолятах из России и Украины, ранее подвергнутых SSCP-анализу [151]. Одна молчащая точечная мутация была обнаружена в области tox , кодирующей домен А DT, и три молчащие мутации были обнаружены в области tox , кодирующей домен B DT, но аминокислотные последовательности всех белков DT кодируемые этими аллелями tox были идентичными. Большая изменчивость была обнаружена в dtxR. Всего было обнаружено 35 точечных мутаций, 9 из которых привели к заменам аминокислот в карбоксиконцевой половине DtxR, а 26 из них были молчащими. 9 мутаций, которые привели к аминокислотным заменам, были распределены среди 7 типов SSCP и привели к 5 различным аминокислотным последовательностям. Эти результаты показали, что вариации типов SSCP хорошо коррелируют с различиями в нуклеотидных последовательностях аллелей dtxR и tox .

В заключение, анализ SSCP является полезным методом скрининга для молекулярно-эпидемиологических исследований генов dtxR и tox , а также функциональных последствий различий в выведенных последовательностях аминокислот в DtxR среди клинических изолятов C. diphtheriae остается установить.

Благодарности

Я благодарю нынешних и бывших докторантов, студентов и техников моей лаборатории, которые внесли большой вклад в наше исследование C. diphtheriae, коринефагов, дифтерийный токсин и репрессор дифтерийного токсина. Я также благодарю своих сотрудников, Вима Дж. Дж. Хола (Вашингтонский университет, Сиэтл) и Иссара Смита (Исследовательский институт общественного здравоохранения, Нью-Йорк), а также ученых в их лабораториях, которые участвовали в наших совместных исследованиях, за их выдающийся вклад в изучение репрессор дифтерийного токсина и его микобактериальные гомологи. Наконец, я с благодарностью отмечаю наставничество и многолетнюю дружбу Лейна Барксдейла (умершего), который познакомил меня с C.diphtheriae во время учебы в аспирантуре Медицинского центра Нью-Йоркского университета (Нью-Йорк).

Каталожные номера

1.

Дифтерия: исследования по биологии инфекционного заболевания

,

Harvey Lect

,

1980

, vol.

76

 (стр. 

45

73

)2.

Corynebacterium diphtheriae и родственные ей

,

Bacteriol Rev

,

1970

, vol.

4

 (стр. 

378

422

)3., .

Патогенез дифтерии

,

Механизмы микробной патогенности. Пятый симпозиум Общества общей микробиологии

,

1955

Cambridge

Cambridge University Press

(стр.

40

56

)4.

История токсичного белка, 1888–1992

,

Protein Sci

,

1993

, vol.

2

 (стр. 

292

8

)5. , 

От миазмов к молекулам

1961

Нью-Йорк

Columbia University Press

6.

Исследования вирулентности инфицированных бактериофагами штаммов Corynebacterium diphtheriae

,

J Bacteriol

,

1951

, vol.

61

 (стр. 

675

88

)7.

Связь бактериофага с изменением Corynebacterium diphtheriae с авирулентности на вирулентность

,

Science

,

1953

, vol.

117

 (стр. 

297

9

)8.

Доказательства индуцированного характера перехода от нетоксигенности к токсигенности у Corynebacterium diphtheriae в результате воздействия специфического бактериофага

,

J Bacteriol

,

1953

, vol.

66

 (стр. 

184

91

)9,  .

Отношения фаг-хозяин в нетоксигенных и токсигенных дифтерийных бациллах

,

J Bacteriol

,

1954

, vol.

56

 (стр. 

220

32

)10,  .

Персистирующие бактериофаговые инфекции, лизогения и фаговая конверсия

28

 (стр. 

265

99

)11.

Конверсия коринефагами и ее роль в естественном развитии дифтерии

93

 (стр. 

405

17

)12,  .

Генетический анализ tox + и tox бактериофагов Corynebacterium diphtheriae

,

J Virol

9 vol

7, 1

,

3

 (стр. 

586

98

)13,  ,  .

Мутация в структурном гене дифтерийного токсина, переносимом умеренным фагом

,

Nat New Biol

,

1971

, vol.

233

 (стр.

8

11

)14,  .

Фагонаправленный синтез дифтерийного токсина в нетоксикогенных Corynebacterium diphtheriae

,

Nature

,

1966

, vol.

210

 (стр. 

911

3

)15,  .

Система для исследования бактериофаг-направленного синтеза дифтерийного токсина

,

J Bacteriol

,

1967

, том.

93

 (стр. 

722

30

)16,  ,  .

Экспрессия генов дифтерийного токсина, переносимого интегрированными и неинтегрированными фагами бета

,

Вирусология

,

1972

, vol.

50

 (стр. 

664

8

)17.

Характеристика и генетическое картирование нетоксигенных (tox) мутантов коринебактериофага бета

,

J Virol

,

1976

, vol.

19

 (стр. 

195

207

)18,  .

Ориентация гена tox в профаге коринебактериофага бета

,

J Virol

,

1976

, vol.

19

 (стр. 

228

31

)19,  .

Карта профагов конвертирующего коринебактериофага бета

,

J Virol

,

1976

, vol.

19

 (стр. 

208

19

)20,  .

Физическая карта хромосомной области Corynebacterium diphtheriae , содержащей места прикрепления коринефагов

158

 (стр.  

325

30

)21,  ,  .

Ген тРНК (2Arg) Corynebacterium diphtheriae является сайтом хромосомной интеграции для токсиногенных бактериофагов [letter]

,

Mol Microbiol

,

1997

, vol.

25

 (стр. 

1179

81

)22,  .

Физическое картирование геномов бета-конвертирующих и гамма-неконвертирующих коринебактериофагов

,

J Bacteriol

,

1981

, том.

148

 (стр. 

131

42

)23,  ,  ,  .

Рестрикционная карта коринебактериофагов бета с и бета vir и физическая локализация дифтерийного tox оперона

,

J Bacteriol

,

1981

, vol.

148

 (стр. 

124

30

)24,  ,  ,  .

Карта эндонуклеаз рестрикции нетоксигенного коринефага гамма c и ее связь с токсигенным коринефагом бета c.

,

J Virol

,

1982

, том.

42

 (стр. 

510

8

)25,  ,  , и др.

Нуклеотидная последовательность структурного гена дифтерийного токсина, переносимого коринебактериофагом бета

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1983

, vol.

80

 (стр. 

6853

7

)26,  ,  , и др.

Нуклеотидная последовательность и экспрессия гена дифтерии tox 228 в Escherichia coli

,

Science

,

1983

, vol.

221

 (стр. 

855

8

)27,  ,  .

Полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего дифтерийный токсин, в геноме коринефага омега ( tox + )

,

Nucleic Acids Res

,

1983

, vol.

11

 (стр. 

6589

95

)28,  ,  .

Аминокислотная последовательность двух нетоксичных мутантов дифтерийного токсина: CRM45 и CRM197

,

Nucleic Acids Res

,

1984

, vol.

12

 (стр. 

4063

9

)29,  ,  ,  .

Обнаружение и экспрессия ДНК, гомологичной гену tox , в нетоксикогенных изолятах Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun

,

1983

, vol.

42

 (стр. 

48

56

)30,  ,  ,  .

Обнаружение и физическая карта OMEGA TOX + -RELATED дефектный пропага в Corynebacterium Diptheriae Belfanti 1030 (-) TOX

,

J ViRol

,

1985

, Vol.

54

 (стр. 

194

8

)31,  .

Сравнительные исследования с коринебактериофагами tox plus и tox minus

,

J Virol

,

1970

, vol.

5

 (стр. 

783

94

)32,  ,  ,  ,  .

Отношения ДНК между некоторыми коринебактериофагами, содержащими tox

,

Infect Immun

,

1985

, vol.

49

 (стр. 

679

84

)33,  .

Характеристика транскрипта дифтерии tox в Corynebacterium diphtheriae и Escherichia coli

,

J Bacteriol

,

1985

, vol.

163

 (стр.

1114

9

)34,  .

Характеристика бактериофагов из tox -содержащих нетоксигенных изолятов Corynebacterium diphtheriae

,

Microb Pathog

,

1997

, vol.

22

 (стр. 

343

51

)35,  ,  .

Элемент ДНК Corynebacterium diphtheriae со свойствами вставочной последовательности и пригодностью для эпидемиологических исследований

,

J Bacteriol

,

1987

, vol.

169

 (стр. 

308

12

)36.

Дифтерийный токсин

,

Annu Rev Biochem

,

1977

, vol.

46

 (стр. 

69

94

)37.

Дифтерийный токсин: механизм действия и структура

,

Bacteriol Rev

,

1975

, vol.

39

 (стр. 

54

85

)38,  .

Влияние дифтерийного токсина на метаболизм клеток HeLa

,

J Exp Med

,

1959

, vol.

109

 (стр. 

144

63

)39,  .

Изучение механизма действия дифтерийного токсина. II. Влияние токсина на включение аминокислот в бесклеточные системы

,

J Exp Med

,

1964

, vol.

120

 (стр. 

1019

39

)40.

Влияние дифтерийного токсина на синтез белка: инактивация одного из факторов переноса

,

J Mol Biol

,

1967

, vol.

25

 (стр. 

83

98

)41,  .

Изучение механизма действия дифтерийного токсина. III. Место действия токсина в бесклеточных экстрактах

,

J Exp Med

,

1967

, vol.

126

 (стр. 

899

912

)42,  ,  .

Аденозиндифосфорибозилирование аминоацилтрансферазы II дифтерийным токсином

,

Cold Spring Harb Symp Quant Biol

,

1969

, vol.

34

 (стр. 

603

68

)43,  ,  .

Структура и активность дифтерийного токсина.II. Атака трипсином в определенном месте интактной молекулы токсина

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр. 

1504

10

)44,  .

Взаимосвязь структура-активность дифтерийного токсина

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр. 

1492

5

)45,  .

Структура и активность дифтерийного токсина. I. Тиолзависимая диссоциация фракции токсина на ферментативно активные и неактивные фрагменты

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр. 

1496

503

)46,  .

Наблюдения за структурой дифтерийного токсина

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр.  

1485

91

)47,  ,  ,  .

Одна молекула фрагмента А дифтерийного токсина, введенная в клетку, может убить клетку

15

 (стр. 

245

50

)48,  .

Дифтерийный токсин. Сайт и конфигурация АДФ-рибозилирования дифтамида в факторе элонгации 2

,

J Biol Chem

,

1981

, vol.

256

 (стр. 

8579

81

)49,  ,  .

АДФ-рибозилирование фактора элонгации 2 дифтерийным токсином. Спектры ЯМР и предполагаемые структуры рибозилдифтамида и продуктов его гидролиза

,

J Biol Chem

,

1980

, vol.

255

 (стр. 

10710

6

)50,  ,  .

Дифтамид в факторе элонгации 2: АДФ-рибозилирование, очистка и свойства

106

 (стр. 

378

87

)51,  .

Механизм АДФ-рибозилирования фактора элонгации 2, катализируемого фрагментом А дифтерийного токсина

,

Biochim Biophys Acta

,

1977

, vol.

483

 (стр. 

248

57

)52,  .

Характеристика системы устойчивости к дифтерийному токсину в клетках яичников китайского хомячка

,

Соматические клетки Genet

,

1979

, том

5

 (стр. 

453

68

)53,  ,  .

Посттрансляционная модификация фактора элонгации 2 у устойчивых к дифтерийному токсину мутантов клеток CHO-K1

77

 (стр. 

1010

4

)54,  ,  .

Устойчивые к дифтерийному токсину мутанты Saccharomyces cerevisiae

,

Mol Cell Biol

,

1985

, vol.

5

 (стр. 

3357

60

)55,  ,  .

Мутации в гене фактора элонгации 2, которые придают устойчивость к токсину дифтерии и экзотоксину Pseudomonas A.Генетические и биохимические анализы

,

J Biol Chem

,

1995

, vol.

270

 (стр. 

23218

25

)56,  ,  .

Рецептор-опосредованная интернализация и деградация дифтерийного токсина клетками почек обезьян

,

J Biol Chem

,

1979

, vol.

254

 (стр. 

11337

42

)57,  ,  .

Ассоциация дифтерийного токсина с клетками Vero. Демонстрация рецептора

,

J Biol Chem

,

1978

, vol.

253

 (стр. 

7325

30

)58,  .

Реакция культивируемых клеток млекопитающих на экзотоксины Pseudomonas aeruginosa и Corynebacterium diphtheriae: дифференциальная цитотоксичность

,

Can J Microbiol

,

1977

, vol.

23

 (стр. 

183

9

)59,  ,  .

Экспрессия функциональных рецепторов дифтерийного токсина на высокочувствительных к токсину клетках мыши, которые специфически связывают радиоактивный йодтоксин

89

 (стр. 

2170

4

)60,  ,  ,  .

Клонирование экспрессии рецептора дифтерийного токсина: идентичность с гепарин-связывающим предшественником EGF-подобного фактора роста

,

Cell

,

1992

, vol.

69

 (стр. 

1051

61

)61,  ,  ,  ,  .

Очистка рецептора дифтерийного токсина из клеток Vero

,

J Biol Chem

,

1991

, vol.

266

 (стр. 

20457

62

)62,  .

Локализация критического домена, связывающего дифтерийный токсин, на С-конце области зрелого гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста рецептора дифтерийного токсина.

206

 (стр. 

710

7

)63,  ,  ,  ,  .

Дифтерийный токсин связывается с эпидермальным фактором роста (EGF)-подобным доменом человеческого гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста/рецептора дифтерийного токсина и специфически ингибирует его митогенную активность

270

 (стр. 

1015

9

)64,  ,  ,  ,  ,  .

Гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, который действует как рецептор дифтерийного токсина, образует комплекс с мембранным белком DRAP27/CD9, который активирует функциональные рецепторы и чувствительность к дифтерийному токсину .

13

 (стр. 

2322

30

)65,  ,  , и др.

Белок с молекулярной массой 27 кДа, ассоциированный с рецептором дифтерийного токсина (DRAP27) из клеток Vero, является обезьяньим гомологом человеческого антигена CD9: экспрессия DRAP27 повышает количество рецепторов дифтерийного токсина на чувствительных к токсину клетках

J Cell Biol

1992

, том.

118

 (стр. 

1389

99

)66,  .

Глутаминовая кислота 141 рецептора дифтерийного токсина (предшественник HB-EGF) имеет решающее значение для связывания токсина и чувствительности к токсину.

220

 (стр. 

675

80

)67,  ,  , и др.

Структурно-функциональный анализ сайта связывания токсина рецептора дифтерийного токсина с помощью сайт-направленного мутагенеза

272

 (стр. 

27084

90

)68,  ,  ,  .

Рецептор-опосредованное проникновение дифтерийного токсина в клетки почек обезьян (Vero): электронная микроскопия

,

Infect Immun

,

1985

, vol.

50

 (стр. 

721

7

)69,  ,  , и др.

Мембранная транслокация фрагмента А дифтерийного токсина использует механизм перемещения эндосом от раннего к позднему

,

Mol Microbiol

,

1997

, vol.

23

 (стр.

445

57

)70,  .

Попадание дифтерийного токсина в цитоплазму клеток млекопитающих: свидетельство вовлечения лизосом

87

 (стр.  

849

54

)71,  .

Поступлению дифтерийного токсина в клетки способствует низкий рН

87

 (стр. 

828

32

)72,  .

Доказательства прямого введения фрагментов А и В дифтерийного токсина в модельные мембраны

,

J Biol Chem

,

1984

, том.

259

 (стр. 

12226

33

)73,  ,  ,  .

Гидрофобное фотомаркирование субъединиц коклюшного токсина, взаимодействующих с липидами

,

FEBS Lett

,

1986

, vol.

194

 (стр. 

301

4

)74,  ,  .

Высвобождение А-фрагмента дифтерийного токсина в клетках Vero, вызванное низким pH. Биохимические доказательства переноса в цитозоль

,

J Biol Chem

,

1988

, vol.

263

 (стр. 

2518

25

)75,  ,  .

Фрагмент дифтерийного токсина образует большие поры в фосфолипидных бислойных мембранах

78

 (стр. 

4950

4

)76,  ,  ,  .

Проникновение дифтерийного токсина в клетки. Восстановление межцепочечного дисульфидного мостика является лимитирующей стадией транслокации в цитозоле

,

J Biol Chem

,

1993

, vol.

268

 (стр. 

1567

74

)77,  ,  ,  .

Структурно-функциональная взаимосвязь ионного канала, образованного дифтерийным токсином в клеточных мембранах Vero

156

 (стр. 

141

8

)78,  ,  .

Белковые токсины, действующие на внутриклеточные мишени: клеточное поглощение и транслокация в цитозоль

182

 (стр. 

51

61

)79,  .

Поступление токсина: ретроградный транспорт по секреторному пути

,

J Cell Biol

,

1998

, vol.

140

 (стр. 

733

6

)80,  ,  ,  ,  ,  .

Дефектное закисление эндосом у мутантов клеток яичника китайского хомячка, перекрестно устойчивых к токсинам и вирусам

80

 (стр. 

5315

9

)81,  ,  , и др.

Кристаллическая структура дифтерийного токсина

,

Nature

,

1992

, vol.

357

 (стр. 

216

22

)82,  ,  .

Уточненная структура димерного дифтерийного токсина с разрешением 2,0 Å

,

Protein Sci

,

1994

, vol.

3

 (стр. 

1444

63

)83,  .

Уточненная структура мономерного дифтерийного токсина с разрешением 2,3 Å

,

Protein Sci

,

1994

, vol.

3

 (стр. 

1464

75

)84,  ,  ,  .

Структура выделенного каталитического домена дифтерийного токсина

,

Биохимия

,

1995

, том.

34

 (стр. 

773

81

)85,  .

Кристаллическая структура дифтерийного токсина, связанного с никотинамидадениндинуклеотидом

,

Биохимия

,

1996

, том.

35

 (стр. 

1137

49

)86,  .

Кристаллическая структура безнуклеотидного дифтерийного токсина

,

Биохимия

,

1997

, том.

36

 (стр. 

481

8

)87,  ,  ,  .

Общие черты NAD-связывающего и каталитического сайта АДФ-рибозилирующих токсинов

14

 (стр.  

41

50

)88,  .

Три консервативные консенсусные последовательности идентифицируют NAD-связывающий сайт АДФ-рибозилирующих ферментов, экспрессируемых эукариотами, бактериями и Т-четными бактериофагами

21

 (стр. 

667

74

)89,  .

Производство дифтерийного токсина высокой активности (100 Lf) на воспроизводимой среде

40

 (стр.

21

32

)90.

Питание дифтерийной палочки

,

Bacteriol Rev

,

1940

, vol.

4

 (стр. 

97

134

)91.

Влияние железа на выработку дифтерийного токсина

,

J Immunol

,

1941

, vol.

42

 (стр. 

343

51

)92,  .

Исследования продукции дифтерийного токсина. I. Влияние железа и меди

,

Br J Exp Pathol

,

1936

, том.

17

 (стр. 

335

41

)93,  ,  .

Синтез продуктов гена дифтерии tox в экстрактах Escherichia coli

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1974

, vol.

71

 (стр. 

11

5

)94,  ,  .

Выделение из Corynebacterium diphtheriae С7(бета) бактериальных мутантов, продуцирующих токсин в среде с избытком железа

,

Infect Immun

,

1977

, vol.

18

 (стр. 

203

9

)95,  .

Регуляция токсиногенеза у Corynebacterium diphtheriae . II. Генетическое картирование регуляторной мутации tox в бактериофаге бета

,

J Virol

,

1981

, vol.

37

 (стр. 

946

54

)96,  .

Регуляция токсиногенеза у Corynebacterium diphtheriae . I. Мутации бета-бактериофага, изменяющие действие железа на продукцию токсина

,

J Virol

,

1981

, vol.

37

 (стр. 

936

45

)97,  ,  .

Выделение и частичная характеристика коринебактериофага бета, tox оператор, конститутивно-подобный мутантный лизоген Corynebacterium diphtheriae

,

J Virol

,

1976

, vol.

18

 (стр. 

235

44

)98,  ,  .

Доказательства того, что регуляция продукции дифтерийного токсина осуществляется на уровне транскрипции

135

 (стр. 

511

6

)99. .

Генетические аспекты токсиногенеза у бактерий. .

Регулирование производства дифтерийного токсина

,

Микробиология — 1979

,

1979

Вашингтон, округ Колумбия

Американское общество микробиологии

(стр.

181

)

Первоначальная характеристика транспортной системы трехвалентного железа Corynebacterium diphtheriae

,

J Bacteriol

,

1983

, vol.

155

 (стр. 

1439

42

)102,  ,  .

Регуляция токсиногенеза у Corynebacterium diphtheriae: мутации в бактериальном геноме, которые изменяют действие железа на выработку токсина

154

 (стр. 

245

52

)103,  ,  .

Генетические и биохимические доказательства зависимой от сидерофоров системы транспорта железа у Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun

,

1984

, vol.

45

 (стр. 

143

9

)104,  ,  ,  ,  .

Коринебактин, циклический катехолат-сидерофор из Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 ( Brevibacterium sp. DSM 20411)

,

Z Naturforsch [C]

,

1997, 900vol.

52

 (стр.

551

4

)105,  .

Высокотоксигенный, но авирулентный штамм Park-Williams 8 Corynebacterium diphtheriae не продуцирует сидерофор

,

Infect Immun

,

1985

, vol.

47

 (стр. 

575

8

)106.

Использование источников железа хозяина Corynebacterium diphtheriae: идентификация гена, продукт которого гомологичен эукариотическим гемоксигеназам и необходим для получения железа из гема и гемоглобина

179

 (стр. 

838

45

)107,  .

Экспрессия и характеристика гемоксигеназы (Hmu O) из Corynebacterium diphtheriae . Для получения железа требуется окислительное расщепление макроцикла гема

,

J Biol Chem

,

1998

, vol.

273

 (стр. 

837

41

)108.

Транскрипция гена Corynebacterium diphtheriae hmuO регулируется железом и гем

,

Infect Immun

,

1997

, vol.

65

 (стр. 

4634

41

)109,  .

Анализ промотора дифтерии tox методом сайт-направленного мутагенеза

,

J Bacteriol

,

1988

, vol.

170

 (стр. 

5949

52

)110,  ,  .

Доказательства прямой регуляции транскрипции гена дифтерийного токсина Fe 2+ -зависимым ДНК-связывающим репрессором, DtoxR, в Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun

,

1989

57

 (стр. 

3221

5

)111,  ,  .

Молекулярное клонирование и анализ последовательности ДНК дифтерийного tox железозависимого регуляторного элемента (dtxR) из Corynebacterium diphtheriae

,

Proc Natl Acad Sci USA

, vol

0,099

87

 (стр.  

5968

72

)112,  .

Железозависимая регуляция экспрессии дифтерийного токсина и сидерофоров с помощью клонированного Corynebacterium diphtheriae репрессорного гена dtxR в C.diphtheriae C7 штаммы

,

Infect Immun

,

1991

, vol.

59

 (стр. 

1899

904

)113.

Регуляция транспорта трехвалентного железа в Escherichia coli K12: выделение конститутивного мутанта

,

Mol Gen Genet

,

1981

, vol.

182

 (стр. 

288

92

)114,  .

Характеристика дефектного аллеля репрессора дифтерийного токсина (dtxR) и анализ транскрипции dtxR в штаммах дикого типа и мутантных штаммах Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun 0, 1 9007

59

 (стр. 

3903

8

)115,  ,  .

последовательности ДНК и характеристика аллелей dtxR из Corynebacterium diphtheriae PW8(-), 1030(-) и C7hm723(-)

,

J Bacteriol

,

1992 ,

174

 (стр.  

1268

72

)116,  ,  .

Очистка и характеристика репрессора дифтерийного токсина

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1992

, vol.

89

 (стр.

7576

80

)117,  ,  .

Специфическое связывание регуляторного элемента дифтерии tox DtxR с оператором tox требует двухвалентных ионов тяжелых металлов и прерываемой палиндромной последовательности из 9 пар оснований

89

 (стр. 

5897

901

)118,  .

Связывание металлорегуляторного белка DtxR с оператором дифтерии tox требует двухвалентного иона тяжелого металла и защищает палиндромную последовательность от расщепления ДНКазой I

267

 (стр. 

21761

4

)119,  .

Анализ взаимодействий репрессор-оператор дифтерийного токсина и характеристика мутантного репрессора со сниженной активностью связывания двухвалентных металлов

9

 (стр. 

173

81

)120,  .

Клонирование, последовательность и анализ следов двух промоторов/операторов из Corynebacterium diphtheriae , которые регулируются репрессором дифтерийного токсина (DtxR) и железом

,

J Bacteriol

,

1994

, vol.

176

 (стр. 

1141

9

)121,  .

Определение минимальной последовательности основных нуклеотидов для связывания репрессора дифтерии tox с помощью аффинной селекции in vitro

91

 (стр. 

9646

50

)122,  ,  ,  ,  ,  .

Идентификация и характеристика трех новых промоторов/операторов из Corynebacterium diphtheriae , которые регулируются репрессором дифтерийного токсина (DtxR) и железом

,

Infect Immun

,

1997

, vol.

65

 (стр. 

4273

80

)123,  ,  ,  .

Анализ транскрипции и нуклеотидная последовательность промотора/оператора tox мутантов коринебактериофага бета

,

Microb Pathog

,

1992

, vol.

13

 (стр. 

85

92

)124,  ,  .

Характеристика мутаций, инактивирующих ген-репрессор дифтерийного токсина (dtxR)

,

Infect Immun

,

1994

, vol.

62

 (стр. 

1600

8

)125,  ,  .

Активация связывания ДНК ионами переходных металлов репрессором дифтерии tox требует образования стабильных гомодимеров

92

 (стр. 

6803

7

)126,  ,  ,  ,  ,  .

Трехмерная структура репрессора дифтерийного токсина в комплексе с корепрессорами двухвалентных катионов

3

 (стр. 

87

100

)127,  ,  ,  ,  ,  .

Структуры апо- и активируемых ионами металлов форм дифтерии tox репрессор из Corynebacterium diphtheriae

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1995

, vol.

92

 (стр. 

9843

50

)128,  ,  ,  ,  .

Идентификация основных сайтов активации ионов металлов репрессора дифтерии tox с помощью рентгеновской кристаллографии и сайт-направленного мутационного анализа

3

 (стр. 

382

7

)129,  ,  ,  .

Структура репрессора дифтерийного токсина в комплексе с кобальтом и марганцем с высоким разрешением выявляет Sh4-подобный третий домен и предполагает возможную роль фосфата в качестве ко-корепрессора

35

 (стр.  

12292

302

)130,  ,  ,  ,  .

Сравнение структур высокого разрешения репрессора дифтерийного токсина в комплексе с кобальтом и цинком в месте связывания катиона и аниона

6

 (стр. 

1114

8

)131,  ,  .

Движение ДНК-связывающего домена относительно ядра репрессора дифтерийного токсина (DtxR), обнаруженное в кристаллических структурах апо- и голо-DtxR

,

J Biol Chem

,

1998

, vol.

273

 (стр. 

22420

7

)132,  ,  ,  ,  .

Структура активируемого ионами металла репрессора дифтерийного токсина/комплекс оператора tox

,

Nature

,

1998

, vol.

394

 (стр. 

502

6

)133,  .

Цистеин-102 расположен в месте активации связывания металлов регуляторного элемента DtxR Corynebacterium diphtheriae

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1993

, vol.

90

 (стр. 

8524

8

)134,  ,  ,  .

Анион-координирующие остатки в сайте связывания 1 необходимы для биологической активности репрессора дифтерийного токсина

,

Infect Immun

,

1999

, vol.

67

 (стр. 

1806

11

)135,  ,  ,  .

Координированная регуляция продукции сидерофоров и дифтерийных токсинов железом в

9

 (стр. 

267

73

)136,  ,  ,  ,  .

Характеристика железозависимого регуляторного белка (IdeR) Mycobacterium tuberculosis как функционального гомолога репрессора дифтерийного токсина (DtxR) из Corynebacterium diphtheriae [опубликованные опечатки появляются в Infect Immun 1996; 64:681]

,

Infect Immun

,

1995

, vol.

63

 (стр. 

4284

9

)137,  .

Клонирование репрессируемого железом гена Corynebacterium diphtheriae , который имеет гомологию последовательности с субъединицей AhpC алкилгидропероксидредуктазы Salmonella typhimurium

,

J Bacteriol

,

1995,

, vol.

177

 (стр. 

3512

7

)138,  ,  ,  ,  .

Молекулярное клонирование, анализ последовательности ДНК и характеристика гомолога Corynebacterium diphtheriae dtxR из Brevibacterium lactofermentum

,

J Bacteriol

,

1995

, vol.

177

 (стр. 

465

7

)139,  ,  .

Мутант ideR Mycobacterium smegmatis имеет дерепрессию продукции сидерофоров и измененную реакцию на окислительный стресс

22

 (стр. 

535

44

)140,  ,  , и др.

Геномная организация сигма-генного кластера микобактерий

,

Ген

,

1995

, vol.

165

 (стр. 

67

70

)141,  .

Клонирование и анализ последовательности гомолога Corynebacterium diphtheriae dtxR из Streptomyces lividans и S. pilosus , кодирующего предполагаемый белок-репрессор железа

,

Gene

, vol 0.0.

166

 (стр. 

117

9

)142,  ,  ,  ,  ,  .

SirR, новый железозависимый репрессор в Staphylococcus epidermidis

,

Infect Immun

,

1998

, vol.

66

 (стр.

4123

9

)143,  ,  , и др.

Идентификация и анализ транскрипции оперона Treponema pallidum , кодирующего предполагаемую транспортную систему ABC, гомолог активируемого железом белка-репрессора и гомолог фермента гликолитического пути

197

 (стр.  

47

64

)144.

Экспресс-скрининг токсигенных Corynebacterium diphtheriae методом полимеразной цепной реакции

,

J Clin Pathol

,

1991

, vol.

44

 (стр. 

1025

6

)145,  ,  ,  .

Полимеразная цепная реакция для скрининга клинических изолятов коринебактерий на продукцию дифтерийного токсина

47

 (стр. 

353

6

)146,  ,  , и др.

Применение ПЦР для выявления токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae , выделенных во время эпидемии дифтерии в России с 1990 по 1994 гг.

33

 (стр. 

3061

3

)147,  .

Разработка прямого ПЦР-анализа для обнаружения гена дифтерийного токсина

35

 (стр. 

1651

5

)148,  ,  , и др.

Молекулярная эпидемиология Corynebacterium diphtheriae из северо-западной России и соседних стран, изученная с помощью риботипирования и гель-электрофореза в пульсирующем поле

33

 (стр.  

1080

3

)149,  ,  , и др.

Молекулярная эпидемиология дифтерии в России, 1985–1994 гг.

,

J Infect Dis

,

1996

, том.

174

 (стр. 

1064

72

)150,  ,  , и др.

Гетерогенность гена дифтерийного токсина, tox, и его регуляторного элемента, dtxR, в штаммах Corynebacterium diphtheriae , вызывающих эпидемию дифтерии в России и Украине

,

J Clin Microbiol

, 9006

34

 (стр. 

1711

6

)151,  ,  ,  .

Анализ гетерогенности гена токсина Corynebacterium diphtheriae , tox, и его регуляторного элемента, dtxR, методом прямого секвенирования

,

Res Microbiol

,

1007 90vol.

148

 (стр. 

45

54

)

Примечания автора

© 2000 Американского общества инфекционистов

Биология и молекулярная эпидемиология токсина дифтерии и гена tox | Журнал инфекционных болезней

Аннотация

Дифтерийный токсин (DT) представляет собой внеклеточный белок Corynebacterium diphtheriae , который ингибирует синтез белка и убивает восприимчивые клетки. Ген, кодирующий DT (tox) , присутствует у некоторых коринефагов, а DT продуцируется только изолятами C. diphtheriae , содержащими фаги tox + . Репрессор дифтерийного токсина (DtxR) представляет собой глобальный регуляторный белок, который использует Fe 2+ в качестве корепрессора. Holo-DtxR подавляет продукцию DT, коринебактериального сидерофора, гемоксигеназы и некоторых других белков. Диагностические тесты на токсигенность C. diphtheriae основаны либо на иммуноанализе, либо на биоанализе на DT.Молекулярный анализ tox и генов dtxR в недавних клинических изолятах C. diphtheriae выявил несколько аллелей tox , которые кодируют идентичные белки DT, и несколько аллелей dtxR , которые кодируют пять вариантов белка DtxR. Таким образом, недавние клинические изоляты C. diphtheriae продуцируют один антигенный тип DT, и дифтерийный анатоксин продолжает оставаться эффективной вакциной для иммунизации против дифтерии.

Ранняя история дифтерийного токсина

Несколько превосходных обзоров освещают раннюю историю дифтерийного токсина [1–5]; избранные основные моменты будут представлены здесь без ссылок на первоисточники.

В 1820-х годах респираторная дифтерия была идентифицирована как отдельное заболевание и клинически отличалась от других форм ангины. Corynebacterium diphtheriae был визуализирован в 1883 г. Клебсом в окрашенных образцах дифтерийных псевдомембран, а в 1884 г. микроорганизм был выделен Леффлером, и было показано, что он является причиной дифтерии. В 1888 году Ру и Йерсен продемонстрировали, что фильтраты культур C. diphtheriae содержат сильнодействующий термолабильный токсический белок, называемый дифтерийным токсином (ДТ).Очень малые дозы DT, вводимые внутрикожно восприимчивым животным, таким как морские свинки или кролики, вызывают эритему, уплотнение и дермонекроз. Более высокие дозы ДТ, введенные парентерально восприимчивым животным, вызывают типичные для дифтерии системные поражения, в том числе миокардиты, очаговые некрозы в органах, таких как надпочечники, почки, печень, полиневриты. Напротив, некоторые другие животные, такие как мыши и крысы, обладают высокой устойчивостью к DT. Смертельная доза ДТ для человека и восприимчивых животных оценивается примерно в 0,000 л.1 мкг/кг массы тела.

В 1890 г. фон Беринг и Китасато продемонстрировали, что восприимчивых животных можно иммунизировать инъекциями градуированных доз бацилл дифтерии, и сыворотка таких иммунизированных животных защищает других восприимчивых животных от токсического действия DT. Только год спустя, в 1891 г., антитоксин, приготовленный на экспериментальном животном, был успешно использован для лечения дифтерии у ребенка. Интервал от открытия C. diphtheriae и DT до введения фон Берингом антитоксиновой терапии для лечения дифтерии был очень коротким.В 1901 году фон Беринг получил первую Нобелевскую премию по физиологии и медицине за выдающийся вклад в разработку сывороточной терапии дифтерии и других инфекционных заболеваний, опосредованных токсинами.

В 1909 году Теобальд Смит предложил использовать нетоксичные смеси DT и дифтерийного антитоксина при эквивалентности для активной иммунизации людей против дифтерии. Успешное крупномасштабное испытание токсин-антитоксиновой вакцины было проведено в 1922 году в Нью-Йорке компанией WH Park.В 1923 году Рамон обнаружил, что обработка формалином устраняет токсичность ДТ, не нарушая ее иммуногенности. Обработанная формалином DT, теперь называемая дифтерийным анатоксином, быстро стала предпочтительной вакциной против дифтерии и дифтерийного анатоксина (обычно в комбинированных вакцинах, таких как вакцина против дифтерийно-столбнячного анатоксина и коклюша [DTP] или вакцина против дифтерийно-столбнячного анатоксина и бесклеточной коклюшной вакцины [DTaP]. ] для детей и вакцина противостолбнячно-дифтерийный анатоксин для взрослых [Td]) до сих пор используется во всем мире для активной иммунизации против дифтерии.Штамм PW8 C. diphtheriae, , который был выделен Парком и Уильямсом в 1896 году и продуцирует исключительно большое количество DT, также используется во всем мире для получения DT для производства дифтерийного анатоксина для вакцины.

Иммунитет против дифтерии можно приобрести либо путем активной иммунизации дифтерийным анатоксином, либо путем выздоровления от клинической или субклинической инфекции токсиногенным штаммом C. diphtheriae. В 1913 г. Schick ввел простой тест, основанный на реакции на внутрикожную инъекцию небольшой дозы DT, чтобы различать людей, восприимчивых к дифтерии, и тех, у кого иммунитет.У восприимчивых людей (Шик-положительные) развивается длительная эритема и уплотнение в месте инъекции токсина, а у иммунных людей (Шик-отрицательные) этого не происходит. Тест Шика применяли как для определения распространенности иммунитета к дифтерии среди лиц разного возраста, так и для оценки эффективности различных схем вакцинации в выработке протективного антитоксического иммунитета. В течение последних нескольких десятилетий прямое измерение анти-DT-антител в сыворотке заменило тест Шика в качестве основы для оценки иммунитета против дифтерии у отдельных лиц или групп населения.

Генетика токсиногенеза у

C. diphtheriae

Понимание генетики токсиногенеза у C. diphtheriae началось в 1951 г., когда Freeman сообщил, что нетоксиногенный штамм становится токсигенным после инфицирования специфическим коринефагом [6]. В большинстве ранних исследований 1950-х годов, посвященных взаимодействиям фаг-хозяин и генетике токсиногенеза, использовались нелизогенные штаммы C. diphtheriae C4 или C7, tox + коринефаг β, tox мутантный коринефаг γ. бактерии или производные от них фаги [7–9] (и обзоры в [10, 11]).Эти исследования показали, что отдельные штаммы коринефагов относятся либо к tox + , либо к tox ; + фаг и приобретение способности продуцировать ДТ, а элиминация (лечение) профага tox + приводит к потере способности продуцировать ДТ. Эти данные установили, что токсигенность в C.diphtheriae определяется фаговой конверсией (называемой также лизогенной конверсией, т. е. способностью бактерии вносить изменения ДТ в результате заражения конкретным фагом).

Когда в конце 1960-х годов стала доступна генетическая система для анализа рекомбинации между близкородственными, но гетероиммунными коринефагами β и γ, были обнаружены маркер tox + β и маркер tox γ. сегрегировать как аллели в дискретном генетическом локусе [12].Нетоксигенные мутанты фага β были выделены в начале 1970-х годов, и было показано, что некоторые мутантные аллели tox определяют продукцию нетоксичных белков, перекрестно реагирующих материалов (CRM), имеющих ту же молекулярную массу, что и DT, и реагирующих с антигенами. Антитела к ДТ [13]. Это открытие убедительно продемонстрировало, что детерминанта tox фага β является структурным геном DT. C. diphtheriae C7 может продуцировать DT не только тогда, когда β присутствует в виде профага, но и когда он присутствует либо в виде вегетативно реплицирующегося фага, либо в виде нереплицирующегося экзогенота в бактерии с гомологичным лизогенным иммунитетом [14–16].Эти данные показали, что экспрессия структурного гена DT у фага β не регулируется координированно с другими фаговыми генами, которые необходимы только для вегетативного роста или лизогении.

В середине 1970-х картирование тонкой структуры мутантных tox аллелей фага β, кодирующих амино-концевые фрагменты DT различной длины, показало, что ген tox коллинеарен DT, и установило ориентацию транскрипции гена tox относительно генетической карты фага β [17, 18]. Было показано, что генетическая карта профага β циклически пермутирована по отношению к вегетативной генетической карте фага β; и tox, , занимающий центральное положение на вегетативной карте, расположен на одном конце профаговой карты, непосредственно примыкающем к месту прикрепления фага ( att P) [17, 19]. Существует два разных, но функционально эквивалентных бактериальных сайта прикрепления ( att B) для интеграции β-профага в хромосому C. diphtheriae [20], причем сайты att B расположены внутри Arg-тРНК 2 , который присутствует в двух разных местах хромосом [21].Тот факт, что ген tox расположен в конце генетической карты профага, позволяет предположить, что он мог быть включен в нетоксигенный предок фага β в результате нелегитимной рекомбинации, аналогичной тем, которые участвуют в формировании специализированных трансдуцирующих фагов в других фагах. -хост-системы.

В течение 1980-х годов были определены рестрикционные карты для геномов фагов β и γ [22–24], а также клонировано и секвенировано tox аллелей из нескольких tox + коринефагов и мутантов фага β, кодирующих нетоксические или гипотоксические варианты ДТ [25–28]. Аллели tox + из этих коринефагов кодировали DT с той же выведенной аминокислотной последовательностью. Эти исследования подготовили почву для последующего анализа структуры и функции DT с помощью случайного и сайт-направленного мутагенеза клонированных аллелей tox , путем отбора в бактериальных или эукариотических системах мутантов tox с интересующими специфическими фенотипами, а также путем очистки и характеристика различных рекомбинантных форм DT после их получения в бактериальных или бесклеточных системах экспрессии.

Большинство токсиногенных штаммов C. diphtheriae содержат последовательности ДНК, родственные фагу β [29, 30]. Кроме того, в коллекции из шести tox + коринефагов с различными фенотипами, включая β, гибридизация ДНК показала, что все они связаны с β, за исключением токсиногенного фага δ, который, по-видимому, представляет другую фаговую линию [31, 32]. ]. Текущие данные подтверждают гипотезу о том, что все токсикогенные изоляты C. diphtheriae содержат конвертирующие фаги, хотя некоторые из конвертирующих фагов могут быть дефектными или неспособными образовывать бляшки на имеющихся C.diphtheriae индикаторных штаммов.

Большинство нетоксигенных изолятов C. diphtheriae и большинство tox коринефагов не содержат каких-либо обнаруживаемых последовательностей ДНК, родственных tox . В нескольких исследованиях изучались редкие tox изоляты C. diphtheriae или коринефаги из них, которые имеют последовательности ДНК, родственные tox , но не кодируют функциональную DT [29, 33, 34]. В случае коринефага γ tox an ∼1.Присутствует вставка размером 5 т.п.н., которая прерывает кодирующую область для сигнальной последовательности DT и предотвращает трансляцию tox [33]. Нуклеотидная последовательность концов этого элемента указывает на то, что это, вероятно, инсерционная последовательность, но транспозиция предполагаемой инсерционной последовательности напрямую не продемонстрирована. Использование вставочной последовательности в качестве ДНК-зонда в экспериментах по Саузерн-гибридизации показывает, что она присутствует в различных количествах копий среди различных изолятов C.diphtheriae [35]. Фаг γ отличается от фага β специфичностью иммунитета, но коиммунен к коринефагу π tox + [31].

Среди 14 нетоксигенных изолятов C. diphtheriae с последовательностями ДНК, родственными tox , которые были выделены в Соединенных Штатах в конце 1970-х годов, 12 из Южной Дакоты продуцируют ферментативно активные, но нетоксичные амино-концевые фрагменты DT и, по-видимому, быть повторяющимися изолятами одного штамма с точечной мутацией, обрывающей цепь, в его аллеле tox .Фаг Adp из 1 из этих 12 изолятов коиммунен к γ и π, а рестрикционные фрагменты его ДНК идентичны по размеру рестрикционным фрагментам коринефага π. На основании этих данных фаг Adp представляется tox мутантом фага π. Два других нетоксигенных изолята C. diphtheriae из этого набора были выделены на Аляске и во Флориде [34]. Фаг tox 787, выделенный из аляскинского изолята 787, содержит последовательности ДНК, родственные tox , а также коиммунен к γ и π.Ни лизоген C. diphtheriae 787, ни лизоген C. diphtheriae C7(787), полученный в лаборатории, не давал фрагмента DT, обнаруживаемого с помощью очень чувствительного вестерн-блоттинга с дифтерийным антитоксином, а рестрикционные фрагменты ДНК фага 787 не были идентичными. по размеру с таковыми из γ или π. Из нетоксигенного изолята C. diphtheriae 788 из Флориды инфекционный коринефаг не был выделен, хотя в этом изоляте может присутствовать дефектный геном фага.Нетоксигенные фенотипы фагов Adp и 787 и C. diphtheriae 788 были цис -доминантными, что свидетельствует о том, что мутации либо в DT-кодирующей области, либо в промоторе tox определяли фенотипы, но потребуются дополнительные данные для определить точные молекулярные дефекты в локусах tox из этих штаммов C. diphtheriae и их фагов. Существование загадочных генов tox в клинических изолятах C.diphtheriae , однако, возникает теоретическая возможность того, что функциональные аллели tox + могут время от времени возникать в природе в результате рекомбинации между генетически родственными коринефагами, которые содержат tox -родственные последовательности ДНК, но разные аллели tox с неперекрывающимися аллелями tox . .

Механизм действия и структура дифтерийного токсина

DT является одним из наиболее изученных среди всех бактериальных токсинов (обзоры в [4, 36, 37]).Как нативные, так и рекомбинантные формы DT доступны в высокоочищенной форме. Определена аминокислотная последовательность DT. Кристаллическая структура ДТ установлена ​​рентгеноструктурным анализом. Большинство аспектов механизма действия DT, включая его связывание с клеточными рецепторами, его проникновение в эукариотические клетки и ферментативный механизм его внутриклеточной токсичности, охарактеризованы на молекулярном уровне и интерпретированы с точки зрения известной структуры. Охарактеризовано множество вариантов ДТ с аминокислотными заменами, влияющими на его биологическую активность.В этом разделе будут кратко рассмотрены избранные основные моменты этих обширных исследований.

Понимание молекулярной основы внутриклеточного действия ДТ началось с наблюдения в 1959 г., что ингибирование синтеза белка является первым эффектом ДТ на культурах восприимчивых эукариотических клеток [38]. DT также ингибирует синтез белка в бесклеточных экстрактах эукариотических клеток, и такие бесклеточные системы синтеза белка были идеальными для анализа биохимических требований и целей действия DT.Было показано, что никотинамидадениндинуклеотид (НАД) необходим для ингибирования синтеза белка в клеточных экстрактах [39], а компонент механизма синтеза белка, ингибируемый ДТ, был идентифицирован как фактор элонгации 2 (EF-2) [40, 41]. . Наконец, было продемонстрировано, что DT действует каталитически, перенося часть аденозиндифосфатрибозы (ADPR) от NAD к EF-2, тем самым инактивируя EF-2 и ингибируя удлинение цепи во время синтеза белка [42].

Исследования, проведенные в 1970-х годах, показали, что DT является проферментом, который должен быть обработан для активации его латентной активности NAD: EF-2 ADPR-трансферазы.Зрелый внеклеточный DT, продуцируемый C. diphtheriae , представляет собой полипептид с молекулярной массой ~58 кДа, состоящий из 535 аминокислотных остатков. Он содержит четыре остатка цистеина (C) и две внутренние дисульфидные связи, которые связывают C186 с C201 и C461 с C471. Обработка DT трипсином селективно расщепляет пептидную связь, расположенную на карбоксиконцевой стороне остатка аргинина (R), экспонированного на поверхности R190, R192 или R193, с образованием аминоконцевого фрагмента A (DT-A) и карбокси-конца. концевой фрагмент B (DT-B), которые остаются ковалентно связанными дисульфидной связью между C186 и C201 [43, 44].Восстановление этой дисульфидной связи приводит к образованию свободного DT-A, который соответствует каталитическому домену (C-домен) DT, и свободного DT-B, который соответствует транслокационному и рецептор-связывающему доменам (T-домен и R-домен, соответственно) ДТ [45, 46]. Интоксикация клеток является прямым следствием рибозилирования АДФ и инактивации EF-2 в цитоплазме, катализируемых DT-A. Когда одну молекулу DT-A вводят непосредственно в цитоплазму, этого достаточно, чтобы убить эукариотическую клетку [47].Следовательно, DT-A должен быть достаточно стабильным в цитоплазме эукариотических клеток.

Исследования, проведенные в 1980-х годах, показали, что реакция NAD : EF-2 ADPR-трансфераза, катализируемая DT-A, включает инверсию конфигурации от β-аномера NAD к α-аномеру в АДФ-рибозилированном EF-2 [48]. Акцепторный сайт для АДФ-рибозилирования с помощью DT-A представляет собой посттрансляционно модифицированный остаток гистидина, 2-[3-карбоксиамидо-3-(триметиламмонио)пропил]гистидин, называемый дифтамидом, который встречается только в одном консервативном положении в EF-2 эукариот. и архей [49, 50].Кинетический анализ реакции НАД : EF-2 ADPR-трансферазы демонстрирует последовательный механизм, в котором DT-A должен сначала связываться с НАД, прежде чем он сможет взаимодействовать с EF-2 [51]. Остаток дифтамида в EF-2 не является существенным для жизнеспособности эукариотических клеток и мутантов DT-чувствительных клеток, которые не могут производить дифтамид [52–54] или которые имеют вариантные формы EF-2, которые не могут быть АДФ-рибозилированы [55]. устойчивы к токсическому действию ДТ.

Хотя клетки различных видов животных резко различаются по восприимчивости к DT, синтез белка в бесклеточных экстрактах всех видов ингибируется DT-A.Это открытие указывает на то, что клетки устойчивых видов не поглощают и не интернализуют DT таким же образом, как клетки восприимчивых видов. Исследования, проведенные в 1970-х годах, показали, что высокочувствительные клетки имеют большее количество высокоаффинных рецепторов DT на своих плазматических мембранах, чем клетки с более низкой чувствительностью, и что DT-резистентные клетки не имеют высокоаффинных рецепторов для DT [56-58]. Исследования 1990-х годов привели к клонированию гена, кодирующего рецептор DT, и идентификации продукта гена как предшественника гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (предшественник HB-EGF) [59, 60], очистке белка рецептора DT [61]. , локализация активности рецептора DT во внеклеточном домене EGF предшественника HB-EGF [62, 63] и демонстрация того, что ассоциация рецептора с DRAP27/CD9 в плазматической мембране увеличивает активность рецептора и восприимчивость к DT [64, 65]. .Анализ различий между EGF-доменами предшественников HB-EGF из восприимчивых клеток человека или обезьяны и резистентных клеток мыши вместе с конструированием и анализом химерных и мутантных форм предшественника HB-EGF показал, что остаток E141 является существенным, а остатки R115 и L127 важны для функции предшественника HB-EGF в качестве DT-рецептора [66, 67].

Связывание DT с предшественником HB-EGF запускает рецептор-опосредованный эндоцитоз токсина через ямки, покрытые клатрином, и комплексы DT-рецептор направляются по эндосомальному пути [56, 68].Большая часть ДТ, поступающего в клетки по этому пути, направляется в лизосомы для деградации, и лишь небольшая часть отвечает за интоксикацию [68, 69]. Транслокация требует воздействия на ДТ кислых условий, сравнимых с подкисленными эндосомами [70, 71], что вызывает конформационные изменения и позволяет транслокационному домену ДТ внедряться в мембраны и формировать канал, через который происходит транслокация А-фрагмента [72–71]. 75]. Если клетки с DT-рецепторными комплексами на плазматической мембране подвергаются воздействию кислого внеклеточного pH, транслокация происходит непосредственно через плазматическую мембрану с интоксикацией клетки-мишени [70, 71].Недавние данные указывают на то, что транслокация DT происходит преимущественно из ранних эндосом посредством АТФ-зависимого процесса, которому способствуют клеточные белки, включая βCOP, тогда как DT, который достигает поздних эндосом, разрушается лизосомным путем [69, 76]. Замена отдельных аминокислот в различных положениях по всему транслокационному домену DT оказывает сильное влияние на активность мембранных каналов, образованных DT в клетках Vero, что указывает на то, что активность каналов является неотъемлемым свойством DT и не вызвана активацией DT эндогенных клеточных каналов. [77].Интоксикацию клеток DT можно предотвратить, вмешиваясь в любой из ранних этапов этого эндоцитарного пути, включая вмешательство в эндоцитоз через покрытые клатрином ямки (путем гиперэкспрессии динамина) или блокируя закисление эндосом (различными фармакологическими агентами) [69, 78, 79]. Кроме того, мутантные клетки, лишенные способности закислять эндосомы, устойчивы к интоксикации ДТ [80].

В настоящее время методом рентгеновской кристаллографии определены структуры свободного ДТ, ДТ в комплексе с эндогенным нуклеотидом ApUp, ДТ в комплексе с НАД и каталитического домена ДТ [81–86].DT имеет три различных домена: амино-концевой С-домен, ответственный за АДФ-рибозилирование EF-2; центрально расположенный Т-домен, ответственный за внедрение в мембраны при кислом рН, образование каналов и транслокацию С-домена через эндосомальные мембраны для доставки в цитозоль; и карбоксиконцевой R-домен, ответственный за связывание DT с предшественником HG-EGF, который действует как рецептор DT на восприимчивых клетках. ДТ и несколько других хорошо изученных АДФ-рибозилирующих токсинов имеют общий НАД-связывающий мотив с высококонсервативными остатками, которые необходимы для каталитической активности, и была предложена подробная модель механизма катализа АДФ-рибозилирования под действием ДТ [85, 87, 88]. Структурная основа для связывания NAD с помощью DT хорошо определена, и модель взаимодействия комплекса NAD-DT с EF-2, которая согласуется как с последовательным ферментативным механизмом, так и с кристаллической структурой, включает замещение NAD-связыванием петлевой последовательности. от остатка 32 до 54 с последующим взаимодействием переориентированной последовательности петли с EF-2 [85]. Сайт-направленный мутагенез и анализ полученных мутантных форм DT в настоящее время широко используются для тестирования конкретных моделей каталитических, транслокационных и рецепторсвязывающих функций DT, которые основаны на кристаллических структурах, но анализ этого интересного и быстрого растущая область исследований выходит за рамки настоящего обзора.

Регулирование производства дифтерийного токсина

На продукцию ДТ токсигенными изолятами C. diphtheriae сильно влияют состав культуральной среды и условия культивирования (обзор в [89–91]). Наиболее изученным эффектом, который будет подробно рассмотрен здесь, является роль железа в токсиногенезе. Исследования, проведенные в 1930-х годах, показали, что продукция DT максимальна, когда C. diphtheriae выращивают в условиях с ограниченным содержанием железа, и резко подавляется в условиях роста с высоким содержанием железа [92].Обширные ранние исследования фенотипических различий между C. diphtheriae , выращенными в условиях с низким и высоким содержанием железа, рассмотрены в другом месте [2, 3].

Молекулярные исследования регуляции синтеза ДТ начались в 1970-х годах. Было показано, что ДНК из tox + коринефага β управляет синтезом DT и других кодируемых фагом белков в системе транскрипции/трансляции in vitro из Escherichia coli, и добавлением экстрактов из C.diphtheriae к этой системе ингибировал синтез DT, не влияя на продукцию других белков, кодируемых фагом [93]. Последующие исследования выявили мутанты C. diphtheriae C7(β), нечувствительные к ингибирующему действию железа на продукцию ДТ, и показали, что этот фенотип определяется бактериальным геномом, а не геномом фага β [94]. Также были выделены мутантные β-фаги, которые позволили лизогенов C. diphtheriae , содержащих их, продуцировать DT в условиях с высоким содержанием железа, хотя они демонстрировали плейотропные фенотипы, которые влияли на максимальное количество продуцируемого DT, а также на регуляцию продукции DT железом [95]. –97].Эти фаговые мутанты демонстрировали -цис--доминантный фенотип [96, 97], и картирование тонкой структуры показало, что мутация tox -201, выбранная для детального анализа, располагалась непосредственно рядом со структурным геном DT на стороне, соответствующей его транскрипционное происхождение [95]. Анализ остаточной биосинтетической способности DT C. diphtheriae C7(β) после добавления рифампина или железа к культурам, продуцирующим DT, в качестве меры функциональной DT-специфичной мРНК предоставил доказательства того, что регуляция железом продукции DT происходит в уровень транскрипции и подавление продукции DT-специфичной мРНК [98]. В совокупности эти данные подтверждают гипотезу о том, что хромосома C. diphtheriae кодирует репрессор, который может использовать железо в качестве корепрессора для ингибирования транскрипции гена tox и снижения продукции DT в условиях роста с высоким содержанием железа. 99, 100].

Характеристика дополнительных мутантов C. diphtheriae C7(β), которые продуцируют DT во время роста в среде, содержащей достаточное количество железа для подавления продукции DT диким типом C7(β), привела к открытию сидерофор-зависимой системы поглощения железа в г.diphtheriae [101, 102]. Способность этих мутантов продуцировать DT во время роста в условиях с высоким содержанием железа связана с их неспособностью ассимилировать железо, связанное с сидерофорами, что, по-видимому, вызывает дефицит железа во внутриклеточной среде, даже когда среда для выращивания богата железом. Было показано, что система поглощения железа является специфичной для ионов трехвалентного железа, высокоаффинной, зависимой от сидерофоров, энергозатратной системой, которая зависит от протондвижущей силы [101]. Выделен и охарактеризован мутант C. diphtheriae , неспособный продуцировать сидерофор (коринебактин), и коринебактин частично очищен [101, 103].Структура коринебактина из C. diphtheriae не была определена, и неясно, связана ли недавно определенная структура сидерофора (также называемого коринебактином) из Corynebacterium glutamicum [104] с коринебактином из C. diphtheriae. Штамм Park-Williams 8 (PW8), который продуцирует очень большое количество DT и используется во всем мире для производства дифтерийного анатоксина, представляет собой встречающийся в природе дефицитный по коринебактину вариант C.дифтерии [105]. Это открытие представляет значительный интерес из-за возможности того, что дефицит сидерофора может способствовать высокотоксигенному фенотипу штамма PW8. Недавние исследования показали, что C. diphtheriae также может использовать экзогенный гем или гемоглобин в качестве источника железа посредством пути, который использует гемоксигеназу коринебактерий для деградации гема и не зависит от сидерофор-зависимого пути поглощения железа [106–108].

Клонирование структурного гена дифтерийного токсина и непосредственно примыкающих выше регуляторных последовательностей было выполнено в 1980-х годах [25–28].Вскоре после этого был охарактеризован промотор tox , и с помощью нуклеазного картирования S1 было показано, что транскрипция DT-специфичной мРНК происходит как в C. diphtheriae , так и в E. coli в нуклеотидных положениях -41 и -40 выше по течению от начало трансляции GTG для структурного гена tox [33]. Последовательность, аналогичная консенсусу для области -35 промоторов σ70 в E. coli , была расположена, начиная с положения -74 от структурного гена tox , и две возможные последовательности -10 были расположены, начиная с положений -54 и — 48.Последующие исследования с использованием сайт-направленного мутагенеза показали, что последовательность, начинающаяся в положении -48, является первичной областью промотора -10, хотя последовательность, начинающаяся в положении -54, может функционировать с умеренной эффективностью в качестве области промотора -10, если первичная последовательность была инактивирована. 109].

Прямая характеристика репрессора дифтерийного токсина (DtxR), существование которого предсказывалось с 1970-х годов, за последнее десятилетие быстро прогрессировала. Во-первых, сырые экстракты из C.diphtheriae , выращенных в условиях с высоким, но не низким содержанием железа, как было показано, содержит фактор, который связывается с предполагаемым оператором tox и защищает специфическую нуклеотидную последовательность от расщепления ДНКазой I [110]. Вскоре после этого 2 группы независимо клонировали ген (dtxR) , который кодирует DtxR, путем скрининга библиотек хромосомных генов из C. diphtheriae C7 в E. coli на предмет железозависимого ингибирования репортерного гена, экспрессируемого под контролем промотор tox из коринефага β [111, 112].Предсказанный продукт dtxR представляет собой полипептид из 226 аминокислот, а транскрипция гена dtxR в C. diphtheriae конститутивно происходит на низком уровне в условиях роста с низким и высоким содержанием железа [112]. Хотя физиологическая функция DtxR в C. diphtheriae аналогична функции регулятора поглощения железа Fur из E. coli и других грамотрицательных бактерий [113], Fur не регулирует промотор tox , а DtxR не регулирует Fur-зависимые промоторы.Таким образом, DtxR и Fur являются прототипами двух различных типов бактериальных железозависимых регуляторных белков. Секвенирование аллеля dtxR из мутанта C7(β)hm723, который производит DT в условиях высокого содержания железа [94], показало, что он содержит единственную нуклеотидную замену, приводящую к замене гистидина на аргинин в остатке 47 DtxR (обозначенном как R47H). [114, 115]. Аллель dtxR от PW8 идентичен аллелю от C7, но dtxR от C.diphtheriae 1030 биотип belfanti лишь на 91,6% идентичен аллелю из С7 и кодирует вариант DtxR, отличающийся от C7 DtxR 6 аминокислотными заменами в карбоксиконцевой области [115].

Рекомбинантный белок DtxR был экспрессирован в E. coli, , очищен различными методами, включая аффинную хроматографию на ионах металлов, и испытан in vitro на взаимодействие с фрагментами ДНК, содержащими промоторную/операторную область tox , с помощью гель-сдвигов, ДНКазы I футпринтинг гидроксильных радикалов и другие методы [116–119].Эти исследования показали, что для связывания DtxR с промотором/оператором tox требуются двухвалентные катионы (Cd 2+ , Co 2+ , Fe 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ или ). Zn 2+ ), что комплексы DtxR-ДНК проявляют более медленную электрофоретическую подвижность, чем свободные фрагменты ДНК, что специфическая последовательность длиной ~30 п.н. защищена DtxR от расщепления ДНКазой I, что защищенная последовательность содержит последовательность из 27 п.н. с инвертированными повторами длиной 9 п.н. на каждом конце, и что белок симметрично взаимодействует с двумя половинами палиндромной последовательности промотора/оператора. Они также показали, что DtxR не связывается с фрагментом ДНК, содержащим промотор/оператор fur , аллель tox -201, проявляющий цис -доминантную устойчивость к подавлению синтеза DT железом, или мутантный tox . промоутер/оператор, из которого удалено одно плечо палиндрома. Последующие исследования показали, что общим признаком DtxR-регулируемых операторов является палиндромное ядро ​​из 19 п.н. с консенсусной последовательностью TTAGGTTAGCCTAACCTAA [120–122] и нуклеотидные замены, ответственные за оператор-конститутивные фенотипы мутантных аллелей tox -201. и tox -202 расположены внутри этой последовательности ядра [123].Связывание Ni 2+ с DtxR имеет кажущуюся константу диссоциации от 9 х 10 -7 М до 2 х 10 -6 М, является кооперативным и приводит к гашению собственной флуоресценции W104 в DtxR [124, 125]. Мономерный апо-DtxR находится в слабом равновесии с димерами, но димеры стабилизируются за счет взаимодействия с двухвалентными катионами, активирующими репрессорную активность [125].

Структуры голо-DtxR дикого типа в комплексе с Cd 2+ , Co 2+ , Fe 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ 7 или Zn 23 4 909; апо-DtxR дикого типа; и C102D-вариант голо-DtxR в комплексе с Ni 2+ были определены методом рентгеновской кристаллографии [126–131].Самые высокие разрешения, доступные в настоящее время, составляют 1,85 Å для голо-DtxR в комплексе с Co 2+ [130] и 2,2 Å для апо-DtxR [131]. Димеры apo-DtxR и holo-DtxR могут кристаллизоваться в любой из двух форм [131]. В кристаллической форме 1 асимметричным звеном является мономер DtxR, а ось димера соответствует кристаллографической двойной оси; в кристаллической форме 2 димер DtxR представляет собой асимметричную единицу, а ось димера не является кристаллографической осью.

Каждый мономер DtxR имеет три домена.Домен 1 (остатки 1–73) расположен на аминоконце и содержит мотив спираль-поворот-спираль, который является сайтом связывания ДНК. Домен 2 (остатки 74–144) представляет собой домен димеризации и связывания металлов. Он имеет два сайта связывания двухвалентных катионов, которые могут активировать DtxR, и структуры с высоким разрешением показывают, что сайт 1 связывает сульфатный или фосфатный анион в дополнение к двухвалентному катиону [129, 130]. В сайте 1 лигандами для связывания металла DtxR дикого типа являются боковые цепи H79, E83 и H98 и анион, а дополнительными лигандами для связывания аниона являются боковые цепи R80, S126 и N130.В сайте 2 лигандами для связывания металла DtxR дикого типа являются карбонильный кислород C102, боковые цепи E105 и h206 и молекула растворителя. Домен 3 (остатки 145–226) проявляет большую гибкость, чем домены 1 и 2, и неупорядочен в структурах DtxR при более низких разрешениях. При высоком разрешении домен 3 демонстрирует Sh4-подобную складку [129, 130], но функция домена 3 неизвестна. Сообщается, что в варианте C102D DtxR боковые цепи остатков D102 и M10 служат дополнительными металлсвязывающими лигандами в сайте 2 [128].

На основании небольших различий в структуре димеров апо-DtxR и голо-DtxR, наблюдаемых со структурами с низким разрешением, была предложена модель, согласно которой связывание ионов металлов активирует DtxR, изменяя его четвертичную структуру и вызывая калипероподобное вращение мономеров относительно друг друга [127, 128]. Недавно были определены структуры высокого разрешения апо-DtxR и голо-DtxR в обеих кристаллических формах 1 и 2, которые позволяют анализировать структурные различия в DtxR, вызванные связыванием металлов, а также кристаллической упаковкой [131].Эти исследования показывают, что связывание ионов металлов вызывает изменение третичной, а не четвертичной структуры DtxR с переориентацией домена 1 и сегмента из 20 остатков на карбоксильном конце домена 2 каждого мономера по отношению к инвариантному димерному ядру, образованному остаток домена 2 обоих мономеров. Как следствие, расстояние между некоторыми реперными точками в мотивах спираль-поворот-спираль короче до 1,7 Å, а угол между осями ДНК-связывающих спиралей в этих мотивах больше до 6° в голографическом режиме. -DtxR, чем в апо-DtxR.Эти структурные изменения дают представление о вероятном механизме активации DtxR Fe 2+ или другими двухвалентными катионами. Однако в большинстве структур холо-DtxR заселенность позиции 1 ионами металлов высока, точка 2 не занята или имеет низкую заселенность ионами металлов, а сульфгидрильная группа C102 модифицирована окислением или вероятным образованием смешанного дисульфида. [126, 127, 129–131]. Напротив, в кристаллах C102D-варианта holo-DtxR сайт 2 характеризуется большей заселенностью ионами металлов, чем сайт 1 [128].

Дополнительную информацию предоставляет недавно опубликованная частичная структура с разрешением 3 Å активированного DtxR-C102D в комплексе с сегментом ДНК длиной 33 п.н., содержащим оператор tox [132]. Удивительно, но два димера DtxR, которые не взаимодействуют друг с другом, связываются с противоположными сторонами ДНК в положениях, отстоящих друг от друга на 5 п.н., но симметрично расположенных относительно центра оператора tox . Остатки 3-120 димеров DtxR обнаруживают конформационные отличия от апо-DtxR, которые сходны по типу, но несколько больше по величине, чем описанные выше для holo-DtxR.Кроме того, остатки 3-6 на амино-конце претерпели переход от спирали к спирали, что может дополнительно облегчить связывание DtxR с ДНК. Мотивы спираль-поворот-спираль в каждом мономере активированного DtxR ориентированы так, что боковые цепи Gln43 могут взаимодействовать с основаниями в большой бороздке, а множество других аминокислот могут взаимодействовать с фосфатными группами в основной цепи ДНК.

Функция DtxR также была проанализирована путем введения мутаций в клонированный ген dtxR и анализа их влияния на экспрессию репортерных генов, регулируемых DtxR, в E.коли. Важная роль C102 была установлена ​​путем демонстрации того, что все возможные аминокислотные замены для C102, кроме аспартата, отменяли активность DtxR, в то время как вариант C102D был значительно менее активен, чем DtxR дикого типа [133]. Случайный бисульфитный мутагенез dtxR с последующим фенотипическим скринингом и секвенированием нуклеотидов идентифицировал 20 мутаций, затрагивающих одиночные кодоны, из которых 18 приводили к заменам одиночных аминокислот в DtxR, а 2 были терминирующими цепь [124].Два варианта DtxR с аминокислотными заменами в домене 1 имели фенотип дикого типа, а все остальные варианты DtxR проявляли пониженную репрессорную активность от незначительной до резкой.

Среди вариантов DtxR со сниженной активностью десять замен и одно усечение были расположены в домене 1, 5 замен и одно усечение произошло в домене 2, и только 1 замена была в домене 3. Большинство этих замен затрагивали остатки в или непосредственно прилегающие к ДНК-связывающему мотиву, интерфейсу димера или сайту связывания металла 2 [124, 126].Единичные замены аланина для каждой из аминокислот, которые служат лигандами для связывания металлов в сайте 1 (H79, E83 и H98) и сайте 2 (C102, E105 и h206), продемонстрировали, что замены в сайте 1 мало или совсем не влияют на репрессорной активности, но замены в сайте 2 отменяют репрессорную активность [128, 133]. Кроме того, одиночные замены аланином остатков E6, D9, M10, R13 и E17 в домене 1, которые прямо или косвенно взаимодействуют с аминокислотами в домене 2, участвующими в связывании металлов, приводили к снижению репрессорной активности.Исследователи пришли к выводу, что сайт 2 является основным сайтом связывания металлов, который непосредственно участвует в активации DtxR, а сайт 1 играет в лучшем случае незначительную роль в активации DtxR [128].

В недавнем исследовании были повторно исследованы одиночные аланиновые замены для связывающих металл остатков в сайтах 1 и 2 и расширен анализ, чтобы включить замены для анион-связывающих остатков R80, S126 и N130, а также остатка E20 в домене 1, который взаимодействует напрямую с R80 в домене 2 через две водородные связи [134]. Результаты подтвердили, что замены остатков, связывающих металл, в сайте 1 не снижали активность DtxR так сильно, как замены в сайте 2, но, напротив, замена R80, S126, N130 или E20 на аланин снижала активность DtxR почти так же, как замена в сайте 2. сайт 2 замены. Эти находки демонстрируют, что остатки, участвующие в связывании аниона в сайте 1 и взаимодействии R80-E20, необходимы для репрессорной активности, и подтверждают вывод, что и сайт связывания аниона с катионом 1, и сайт связывания катиона 2 важны для функции DtxR.

DtxR функционирует как железозависимый глобальный регулятор метаболизма у C. diphtheriae, , и в настоящее время проводится характеристика семейства генов в регулоне DtxR и их продуктов. Продукция ДТ и сидерофора координированно регулируется при переходе от железодефицитных к железодефицитным условиям роста [135]. Продукция как DT, так и сидерофора дерепрессируется в C. diphtheriae C7(β)hm723, который лишен функции DtxR, а комплементация аллелем dtxR + дикого типа восстанавливает репрессивность продукции как DT, так и сидерофора при высоких -условия роста железа [112]. Клонирование хромосомных локусов из C. diphtheriae C7(-) и скрининг промоторов, которые функциональны в E. coli и репрессируются DtxR в условиях роста с высоким содержанием железа, привели к идентификации пяти различных регулируемых железом промоторов/операторов. обозначены от IRP1 до IRP5 [120, 122, 136]. Липопротеин массой 38 кДа, который функционирует как предполагаемый рецептор сидерофора железа, кодируется ниже IRP1 [136], белок массой 15 кДа, гомологичный нескольким бактериальным регуляторным белкам семейства AraC, кодируется ниже IRP3 [122], и кадры, кодирующие белок массой 15 кДа и предполагаемый полипептид из 67 аминокислот с неизвестными функциями, кодируются ниже IRP4 и IRP5 соответственно [122].DtxR также регулирует ген hmuO C. diphtheriae , который кодирует гемоксигеназу [106, 108]. Кроме того, было идентифицировано по крайней мере 14 белков, которые предпочтительно экспрессируются C. diphtheriae в условиях низкого содержания железа, но не установлено, регулирует ли их DtxR [137].

DtxR в настоящее время признан прототипом семейства гомологичных железозависимых регуляторных белков (обычно называемых IdeR), обнаруженных у ряда бактерий вне рода Corynebacterium, , включая Brevibacterium lactofermentum [138], Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium Tuberculosis [136, 139, 140], Streptomyces Lividans и Streptomyces и , Staphylococcus Epidermidis и Staphylococcus Aureus [142] и Treponema Pallidum [143].Аминокислотные последовательности этих белков высококонсервативны (общая идентичность с DtxR составляет 50–60%), хотя домены 1 и 2 демонстрируют гораздо более высокую консервативность, а домен 3 демонстрирует гораздо большую изменчивость. Поразительно, аминокислоты, которые считаются важными для функционирования в сайте связывания аниона и катиона 1 и в сайте связывания металла 2, идентичны среди всех этих гомологов DtxR, за исключением предполагаемой замены H79D в белке IdeR, кодируемом . B. lactofermentum 138].

Молекулярная эпидемиология

tox и dtxR Гены в C. diphtheriae

Клонирование и секвенирование гена tox в начале 1980-х гг. и гена dtxR в начале 1990-х гг. позволило непосредственно изучить эволюцию этих генов среди штаммов C. diphtheriae , выделенных в разное время и в разные локации. В то же время эпидемия дифтерии, начавшаяся в 1990 г. в Российской Федерации и ставшая крупнейшей вспышкой дифтерии в развитых странах мира с 1960-х гг., предоставила уникальную возможность определить, могут ли специфические аллели tox или dtxR быть полезными в качестве молекулярные маркеры для конкретных клонов C.diphtheriae , которые циркулируют или развиваются в ходе крупной эпидемии. Родственные молекулярные методы использовались для определения того, почему некоторые нетоксигенные изоляты C. diphtheriae несут последовательностей генов tox , но не продуцируют DT, как обсуждалось в предыдущем разделе этого обзора.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием специфических прямых и обратных праймеров в пределах гена tox , соответствующего сегменту домена А DT, была исследована как быстрый метод для определения того, являются ли клинические изоляты C.diphtheriae были токсиногенными [144–146]. Точность теста выгодно отличается от теста Элека для обнаружения производства DT и является полезным дополнением к диагностическому арсеналу. Недавно были разработаны оптимизированные стандартные условия для выявления токсикогенных C. diphtheriae непосредственно из клинических образцов с помощью ПЦР с двумя наборами праймеров, специфичных для доменов А и В DT [147]. Расчетные уровни чувствительности для использования этих двух наборов праймеров составляли 50 и 500 КОЕ на смесь для ПЦР.Хотя тесты на основе ПЦР могут давать вводящие в заблуждение результаты относительно токсигенности штаммов, которые имеют последовательности генов tox , но не продуцируют биологически активный DT, такие штаммы редко встречаются среди клинических изолятов C. diphtheriae.

Традиционные методы дифференциации бактериальных штаммов, такие как биотипирование, антибиограммы, фаговое типирование и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, получили лишь ограниченное признание в качестве инструментов для молекулярно-эпидемиологических исследований C.diphtheriae , потому что им не хватало мощности для различения штаммов или они были слишком громоздкими, чтобы их можно было широко использовать (или и то, и другое). В последнее время для молекулярно-эпидемиологического сравнения изолятов C. diphtheriae из эпидемии в России и из коллекций эталонных культур с большим успехом применялись риботипирование, мультилокусный электрофорез ферментов и гель-электрофорез в пульсирующем поле [148, 149]. Эти исследования показали, что в 1990 г. в России появилась отдельная клональная группа изолятов (названная комплексом ET 8), которая по мере развития эпидемии становилась все более распространенной.

Эти исследования были расширены за счет использования ПЦР для анализа гетерогенности генов tox и dtxR среди 72 изолятов C. diphtheriae из России и Украины, которые были собраны до и в течение ранней стадии настоящей эпидемии. [150]. Праймеры были сконструированы таким образом, чтобы ампликоны из четырех наборов охватывали dtxR, ампликонов из восьми наборов охватывали tox, , и ампликоны имели подходящий размер для анализа по паттернам одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP).Все четыре области в dtxR и три области в tox показали значительные различия в размерах или количестве (или обоих) ампликонов, а dtxR и tox можно было разделить на 12 и 6 различных типов соответственно. Большинство эпидемических изолятов из России были dtxR типов 2 и 8 (все биотипы gravis), большинство эпидемических изолятов из Украины были dtxR типа 5 (все биотипы gravis), а изоляты обоих типов были tox типов 3 и 4.Изоляты биотипа mitis относились к типу dtxR 1. Таким образом, анализ ПЦР-SSCP позволил выявить четкую связь изолятов различного географического и временного происхождения с конкретными типами dtxR и tox .

Прямое секвенирование аллелей dtxR и tox проведено на 72 изолятах из России и Украины, ранее подвергнутых SSCP-анализу [151]. Одна молчащая точечная мутация была обнаружена в области tox , кодирующей домен А DT, и три молчащие мутации были обнаружены в области tox , кодирующей домен B DT, но аминокислотные последовательности всех белков DT кодируемые этими аллелями tox были идентичными.Большая изменчивость была обнаружена в dtxR. Всего было обнаружено 35 точечных мутаций, 9 из которых привели к заменам аминокислот в карбоксиконцевой половине DtxR, а 26 из них были молчащими. 9 мутаций, которые привели к аминокислотным заменам, были распределены среди 7 типов SSCP и привели к 5 различным аминокислотным последовательностям. Эти результаты показали, что вариации типов SSCP хорошо коррелируют с различиями в нуклеотидных последовательностях аллелей dtxR и tox .

В заключение, анализ SSCP является полезным методом скрининга для молекулярно-эпидемиологических исследований генов dtxR и tox , а также функциональных последствий различий в выведенных последовательностях аминокислот в DtxR среди клинических изолятов C. diphtheriae остается установить.

Благодарности

Я благодарю нынешних и бывших докторантов, студентов и техников моей лаборатории, которые внесли большой вклад в наше исследование C.diphtheriae, коринефагов, дифтерийный токсин и репрессор дифтерийного токсина. Я также благодарю своих сотрудников, Вима Дж. Дж. Хола (Вашингтонский университет, Сиэтл) и Иссара Смита (Исследовательский институт общественного здравоохранения, Нью-Йорк), а также ученых в их лабораториях, которые участвовали в наших совместных исследованиях, за их выдающийся вклад в изучение репрессор дифтерийного токсина и его микобактериальные гомологи. Наконец, я с благодарностью отмечаю наставничество и многолетнюю дружбу Лейна Барксдейла (умершего), который познакомил меня с C.diphtheriae во время учебы в аспирантуре Медицинского центра Нью-Йоркского университета (Нью-Йорк).

Каталожные номера

1.

Дифтерия: исследования по биологии инфекционного заболевания

,

Harvey Lect

,

1980

, vol.

76

 (стр. 

45

73

)2.

Corynebacterium diphtheriae и родственные ей

,

Bacteriol Rev

,

1970

, vol.

4

 (стр. 

378

422

)3., .

Патогенез дифтерии

,

Механизмы микробной патогенности. Пятый симпозиум Общества общей микробиологии

,

1955

Cambridge

Cambridge University Press

(стр.

40

56

)4.

История токсичного белка, 1888–1992

,

Protein Sci

,

1993

, vol.

2

 (стр. 

292

8

)5. , 

От миазмов к молекулам

1961

Нью-Йорк

Columbia University Press

6.

Исследования вирулентности инфицированных бактериофагами штаммов Corynebacterium diphtheriae

,

J Bacteriol

,

1951

, vol.

61

 (стр. 

675

88

)7.

Связь бактериофага с изменением Corynebacterium diphtheriae с авирулентности на вирулентность

,

Science

,

1953

, vol.

117

 (стр. 

297

9

)8.

Доказательства индуцированного характера перехода от нетоксигенности к токсигенности у Corynebacterium diphtheriae в результате воздействия специфического бактериофага

,

J Bacteriol

,

1953

, vol.

66

 (стр. 

184

91

)9,  .

Отношения фаг-хозяин в нетоксигенных и токсигенных дифтерийных бациллах

,

J Bacteriol

,

1954

, vol.

56

 (стр. 

220

32

)10,  .

Персистирующие бактериофаговые инфекции, лизогения и фаговая конверсия

28

 (стр. 

265

99

)11.

Конверсия коринефагами и ее роль в естественном развитии дифтерии

93

 (стр. 

405

17

)12,  .

Генетический анализ tox + и tox бактериофагов Corynebacterium diphtheriae

,

J Virol

9 vol

7, 1

,

3

 (стр. 

586

98

)13,  ,  .

Мутация в структурном гене дифтерийного токсина, переносимом умеренным фагом

,

Nat New Biol

,

1971

, vol.

233

 (стр.

8

11

)14,  .

Фагонаправленный синтез дифтерийного токсина в нетоксикогенных Corynebacterium diphtheriae

,

Nature

,

1966

, vol.

210

 (стр. 

911

3

)15,  .

Система для исследования бактериофаг-направленного синтеза дифтерийного токсина

,

J Bacteriol

,

1967

, том.

93

 (стр. 

722

30

)16,  ,  .

Экспрессия генов дифтерийного токсина, переносимого интегрированными и неинтегрированными фагами бета

,

Вирусология

,

1972

, vol.

50

 (стр. 

664

8

)17.

Характеристика и генетическое картирование нетоксигенных (tox) мутантов коринебактериофага бета

,

J Virol

,

1976

, vol.

19

 (стр. 

195

207

)18,  .

Ориентация гена tox в профаге коринебактериофага бета

,

J Virol

,

1976

, vol.

19

 (стр. 

228

31

)19,  .

Карта профагов конвертирующего коринебактериофага бета

,

J Virol

,

1976

, vol.

19

 (стр. 

208

19

)20,  .

Физическая карта хромосомной области Corynebacterium diphtheriae , содержащей места прикрепления коринефагов

158

 (стр. 

325

30

)21,  ,  .

Ген тРНК (2Arg) Corynebacterium diphtheriae является сайтом хромосомной интеграции для токсиногенных бактериофагов [letter]

,

Mol Microbiol

,

1997

, vol.

25

 (стр. 

1179

81

)22,  .

Физическое картирование геномов бета-конвертирующих и гамма-неконвертирующих коринебактериофагов

,

J Bacteriol

,

1981

, том.

148

 (стр. 

131

42

)23,  ,  ,  .

Рестрикционная карта коринебактериофагов бета с и бета vir и физическая локализация дифтерийного tox оперона

,

J Bacteriol

,

1981

, vol.

148

 (стр. 

124

30

)24,  ,  ,  .

Карта эндонуклеаз рестрикции нетоксигенного коринефага гамма c и ее связь с токсигенным коринефагом бета c.

,

J Virol

,

1982

, том.

42

 (стр. 

510

8

)25,  ,  , и др.

Нуклеотидная последовательность структурного гена дифтерийного токсина, переносимого коринебактериофагом бета

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1983

, vol.

80

 (стр. 

6853

7

)26,  ,  , и др.

Нуклеотидная последовательность и экспрессия гена дифтерии tox 228 в Escherichia coli

,

Science

,

1983

, vol.

221

 (стр. 

855

8

)27,  ,  .

Полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего дифтерийный токсин, в геноме коринефага омега ( tox + )

,

Nucleic Acids Res

,

1983

, vol.

11

 (стр. 

6589

95

)28,  ,  .

Аминокислотная последовательность двух нетоксичных мутантов дифтерийного токсина: CRM45 и CRM197

,

Nucleic Acids Res

,

1984

, vol.

12

 (стр. 

4063

9

)29,  ,  ,  .

Обнаружение и экспрессия ДНК, гомологичной гену tox , в нетоксикогенных изолятах Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun

,

1983

, vol.

42

 (стр. 

48

56

)30,  ,  ,  .

Обнаружение и физическая карта OMEGA TOX + -RELATED дефектный пропага в Corynebacterium Diptheriae Belfanti 1030 (-) TOX

,

J ViRol

,

1985

, Vol.

54

 (стр. 

194

8

)31,  .

Сравнительные исследования с коринебактериофагами tox plus и tox minus

,

J Virol

,

1970

, vol.

5

 (стр. 

783

94

)32,  ,  ,  ,  .

Отношения ДНК между некоторыми коринебактериофагами, содержащими tox

,

Infect Immun

,

1985

, vol.

49

 (стр. 

679

84

)33,  .

Характеристика транскрипта дифтерии tox в Corynebacterium diphtheriae и Escherichia coli

,

J Bacteriol

,

1985

, vol.

163

 (стр.

1114

9

)34,  .

Характеристика бактериофагов из tox -содержащих нетоксигенных изолятов Corynebacterium diphtheriae

,

Microb Pathog

,

1997

, vol.

22

 (стр. 

343

51

)35,  ,  .

Элемент ДНК Corynebacterium diphtheriae со свойствами вставочной последовательности и пригодностью для эпидемиологических исследований

,

J Bacteriol

,

1987

, vol.

169

 (стр. 

308

12

)36.

Дифтерийный токсин

,

Annu Rev Biochem

,

1977

, vol.

46

 (стр. 

69

94

)37.

Дифтерийный токсин: механизм действия и структура

,

Bacteriol Rev

,

1975

, vol.

39

 (стр.  

54

85

)38,  .

Влияние дифтерийного токсина на метаболизм клеток HeLa

,

J Exp Med

,

1959

, vol.

109

 (стр. 

144

63

)39,  .

Изучение механизма действия дифтерийного токсина. II. Влияние токсина на включение аминокислот в бесклеточные системы

,

J Exp Med

,

1964

, vol.

120

 (стр. 

1019

39

)40.

Влияние дифтерийного токсина на синтез белка: инактивация одного из факторов переноса

,

J Mol Biol

,

1967

, vol.

25

 (стр. 

83

98

)41,  .

Изучение механизма действия дифтерийного токсина. III. Место действия токсина в бесклеточных экстрактах

,

J Exp Med

,

1967

, vol.

126

 (стр. 

899

912

)42,  ,  .

Аденозиндифосфорибозилирование аминоацилтрансферазы II дифтерийным токсином

,

Cold Spring Harb Symp Quant Biol

,

1969

, vol.

34

 (стр. 

603

68

)43,  ,  .

Структура и активность дифтерийного токсина.II. Атака трипсином в определенном месте интактной молекулы токсина

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр. 

1504

10

)44,  .

Взаимосвязь структура-активность дифтерийного токсина

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр. 

1492

5

)45,  .

Структура и активность дифтерийного токсина. I. Тиолзависимая диссоциация фракции токсина на ферментативно активные и неактивные фрагменты

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр. 

1496

503

)46,  .

Наблюдения за структурой дифтерийного токсина

,

J Biol Chem

,

1971

, vol.

246

 (стр. 

1485

91

)47,  ,  ,  .

Одна молекула фрагмента А дифтерийного токсина, введенная в клетку, может убить клетку

15

 (стр. 

245

50

)48,  .

Дифтерийный токсин. Сайт и конфигурация АДФ-рибозилирования дифтамида в факторе элонгации 2

,

J Biol Chem

,

1981

, vol.

256

 (стр. 

8579

81

)49,  ,  .

АДФ-рибозилирование фактора элонгации 2 дифтерийным токсином. Спектры ЯМР и предполагаемые структуры рибозилдифтамида и продуктов его гидролиза

,

J Biol Chem

,

1980

, vol.

255

 (стр. 

10710

6

)50,  ,  .

Дифтамид в факторе элонгации 2: АДФ-рибозилирование, очистка и свойства

106

 (стр. 

378

87

)51,  .

Механизм АДФ-рибозилирования фактора элонгации 2, катализируемого фрагментом А дифтерийного токсина

,

Biochim Biophys Acta

,

1977

, vol.

483

 (стр. 

248

57

)52,  .

Характеристика системы устойчивости к дифтерийному токсину в клетках яичников китайского хомячка

,

Соматические клетки Genet

,

1979

, том

5

 (стр. 

453

68

)53,  ,  .

Посттрансляционная модификация фактора элонгации 2 у устойчивых к дифтерийному токсину мутантов клеток CHO-K1

77

 (стр.  

1010

4

)54,  ,  .

Устойчивые к дифтерийному токсину мутанты Saccharomyces cerevisiae

,

Mol Cell Biol

,

1985

, vol.

5

 (стр. 

3357

60

)55,  ,  .

Мутации в гене фактора элонгации 2, которые придают устойчивость к токсину дифтерии и экзотоксину Pseudomonas A.Генетические и биохимические анализы

,

J Biol Chem

,

1995

, vol.

270

 (стр. 

23218

25

)56,  ,  .

Рецептор-опосредованная интернализация и деградация дифтерийного токсина клетками почек обезьян

,

J Biol Chem

,

1979

, vol.

254

 (стр. 

11337

42

)57,  ,  .

Ассоциация дифтерийного токсина с клетками Vero. Демонстрация рецептора

,

J Biol Chem

,

1978

, vol.

253

 (стр. 

7325

30

)58,  .

Реакция культивируемых клеток млекопитающих на экзотоксины Pseudomonas aeruginosa и Corynebacterium diphtheriae: дифференциальная цитотоксичность

,

Can J Microbiol

,

1977

, vol.

23

 (стр. 

183

9

)59,  ,  .

Экспрессия функциональных рецепторов дифтерийного токсина на высокочувствительных к токсину клетках мыши, которые специфически связывают радиоактивный йодтоксин

89

 (стр. 

2170

4

)60,  ,  ,  .

Клонирование экспрессии рецептора дифтерийного токсина: идентичность с гепарин-связывающим предшественником EGF-подобного фактора роста

,

Cell

,

1992

, vol.

69

 (стр. 

1051

61

)61,  ,  ,  ,  .

Очистка рецептора дифтерийного токсина из клеток Vero

,

J Biol Chem

,

1991

, vol.

266

 (стр. 

20457

62

)62,  .

Локализация критического домена, связывающего дифтерийный токсин, на С-конце области зрелого гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста рецептора дифтерийного токсина.

206

 (стр. 

710

7

)63,  ,  ,  ,  .

Дифтерийный токсин связывается с эпидермальным фактором роста (EGF)-подобным доменом человеческого гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста/рецептора дифтерийного токсина и специфически ингибирует его митогенную активность

270

 (стр.  

1015

9

)64,  ,  ,  ,  ,  .

Гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, который действует как рецептор дифтерийного токсина, образует комплекс с мембранным белком DRAP27/CD9, который активирует функциональные рецепторы и чувствительность к дифтерийному токсину .

13

 (стр. 

2322

30

)65,  ,  , и др.

Белок с молекулярной массой 27 кДа, ассоциированный с рецептором дифтерийного токсина (DRAP27) из клеток Vero, является обезьяньим гомологом человеческого антигена CD9: экспрессия DRAP27 повышает количество рецепторов дифтерийного токсина на чувствительных к токсину клетках

J Cell Biol

1992

, том.

118

 (стр. 

1389

99

)66,  .

Глутаминовая кислота 141 рецептора дифтерийного токсина (предшественник HB-EGF) имеет решающее значение для связывания токсина и чувствительности к токсину.

220

 (стр. 

675

80

)67,  ,  , и др.

Структурно-функциональный анализ сайта связывания токсина рецептора дифтерийного токсина с помощью сайт-направленного мутагенеза

272

 (стр.  

27084

90

)68,  ,  ,  .

Рецептор-опосредованное проникновение дифтерийного токсина в клетки почек обезьян (Vero): электронная микроскопия

,

Infect Immun

,

1985

, vol.

50

 (стр. 

721

7

)69,  ,  , и др.

Мембранная транслокация фрагмента А дифтерийного токсина использует механизм перемещения эндосом от раннего к позднему

,

Mol Microbiol

,

1997

, vol.

23

 (стр.

445

57

)70,  .

Попадание дифтерийного токсина в цитоплазму клеток млекопитающих: свидетельство вовлечения лизосом

87

 (стр. 

849

54

)71,  .

Поступлению дифтерийного токсина в клетки способствует низкий рН

87

 (стр. 

828

32

)72,  .

Доказательства прямого введения фрагментов А и В дифтерийного токсина в модельные мембраны

,

J Biol Chem

,

1984

, том.

259

 (стр. 

12226

33

)73,  ,  ,  .

Гидрофобное фотомаркирование субъединиц коклюшного токсина, взаимодействующих с липидами

,

FEBS Lett

,

1986

, vol.

194

 (стр. 

301

4

)74,  ,  .

Высвобождение А-фрагмента дифтерийного токсина в клетках Vero, вызванное низким pH. Биохимические доказательства переноса в цитозоль

,

J Biol Chem

,

1988

, vol.

263

 (стр. 

2518

25

)75,  ,  .

Фрагмент дифтерийного токсина образует большие поры в фосфолипидных бислойных мембранах

78

 (стр. 

4950

4

)76,  ,  ,  .

Проникновение дифтерийного токсина в клетки. Восстановление межцепочечного дисульфидного мостика является лимитирующей стадией транслокации в цитозоле

,

J Biol Chem

,

1993

, vol.

268

 (стр. 

1567

74

)77,  ,  ,  .

Структурно-функциональная взаимосвязь ионного канала, образованного дифтерийным токсином в клеточных мембранах Vero

156

 (стр. 

141

8

)78,  ,  .

Белковые токсины, действующие на внутриклеточные мишени: клеточное поглощение и транслокация в цитозоль

182

 (стр.  

51

61

)79,  .

Поступление токсина: ретроградный транспорт по секреторному пути

,

J Cell Biol

,

1998

, vol.

140

 (стр. 

733

6

)80,  ,  ,  ,  ,  .

Дефектное закисление эндосом у мутантов клеток яичника китайского хомячка, перекрестно устойчивых к токсинам и вирусам

80

 (стр. 

5315

9

)81,  ,  , и др.

Кристаллическая структура дифтерийного токсина

,

Nature

,

1992

, vol.

357

 (стр. 

216

22

)82,  ,  .

Уточненная структура димерного дифтерийного токсина с разрешением 2,0 Å

,

Protein Sci

,

1994

, vol.

3

 (стр. 

1444

63

)83,  .

Уточненная структура мономерного дифтерийного токсина с разрешением 2,3 Å

,

Protein Sci

,

1994

, vol.

3

 (стр. 

1464

75

)84,  ,  ,  .

Структура выделенного каталитического домена дифтерийного токсина

,

Биохимия

,

1995

, том.

34

 (стр. 

773

81

)85,  .

Кристаллическая структура дифтерийного токсина, связанного с никотинамидадениндинуклеотидом

,

Биохимия

,

1996

, том.

35

 (стр. 

1137

49

)86,  .

Кристаллическая структура безнуклеотидного дифтерийного токсина

,

Биохимия

,

1997

, том.

36

 (стр. 

481

8

)87,  ,  ,  .

Общие черты NAD-связывающего и каталитического сайта АДФ-рибозилирующих токсинов

14

 (стр. 

41

50

)88,  .

Три консервативные консенсусные последовательности идентифицируют NAD-связывающий сайт АДФ-рибозилирующих ферментов, экспрессируемых эукариотами, бактериями и Т-четными бактериофагами

21

 (стр. 

667

74

)89,  .

Производство дифтерийного токсина высокой активности (100 Lf) на воспроизводимой среде

40

 (стр.

21

32

)90.

Питание дифтерийной палочки

,

Bacteriol Rev

,

1940

, vol.

4

 (стр. 

97

134

)91.

Влияние железа на выработку дифтерийного токсина

,

J Immunol

,

1941

, vol.

42

 (стр. 

343

51

)92,  .

Исследования продукции дифтерийного токсина. I. Влияние железа и меди

,

Br J Exp Pathol

,

1936

, том.

17

 (стр. 

335

41

)93,  ,  .

Синтез продуктов гена дифтерии tox в экстрактах Escherichia coli

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1974

, vol.

71

 (стр. 

11

5

)94,  ,  .

Выделение из Corynebacterium diphtheriae С7(бета) бактериальных мутантов, продуцирующих токсин в среде с избытком железа

,

Infect Immun

,

1977

, vol.

18

 (стр. 

203

9

)95,  .

Регуляция токсиногенеза у Corynebacterium diphtheriae . II. Генетическое картирование регуляторной мутации tox в бактериофаге бета

,

J Virol

,

1981

, vol.

37

 (стр. 

946

54

)96,  .

Регуляция токсиногенеза у Corynebacterium diphtheriae . I. Мутации бета-бактериофага, изменяющие действие железа на продукцию токсина

,

J Virol

,

1981

, vol.

37

 (стр. 

936

45

)97,  ,  .

Выделение и частичная характеристика коринебактериофага бета, tox оператор, конститутивно-подобный мутантный лизоген Corynebacterium diphtheriae

,

J Virol

,

1976

, vol.

18

 (стр. 

235

44

)98,  ,  .

Доказательства того, что регуляция продукции дифтерийного токсина осуществляется на уровне транскрипции

135

 (стр. 

511

6

)99. .

Генетические аспекты токсиногенеза у бактерий. .

Регулирование производства дифтерийного токсина

,

Микробиология — 1979

,

1979

Вашингтон, округ Колумбия

Американское общество микробиологии

(стр.

181

)

Первоначальная характеристика транспортной системы трехвалентного железа Corynebacterium diphtheriae

,

J Bacteriol

,

1983

, vol.

155

 (стр. 

1439

42

)102,  ,  .

Регуляция токсиногенеза у Corynebacterium diphtheriae: мутации в бактериальном геноме, которые изменяют действие железа на выработку токсина

154

 (стр. 

245

52

)103,  ,  .

Генетические и биохимические доказательства зависимой от сидерофоров системы транспорта железа у Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun

,

1984

, vol.

45

 (стр. 

143

9

)104,  ,  ,  ,  .

Коринебактин, циклический катехолат-сидерофор из Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 ( Brevibacterium sp. DSM 20411)

,

Z Naturforsch [C]

,

1997, 900vol.

52

 (стр.

551

4

)105,  .

Высокотоксигенный, но авирулентный штамм Park-Williams 8 Corynebacterium diphtheriae не продуцирует сидерофор

,

Infect Immun

,

1985

, vol.

47

 (стр. 

575

8

)106.

Использование источников железа хозяина Corynebacterium diphtheriae: идентификация гена, продукт которого гомологичен эукариотическим гемоксигеназам и необходим для получения железа из гема и гемоглобина

179

 (стр. 

838

45

)107,  .

Экспрессия и характеристика гемоксигеназы (Hmu O) из Corynebacterium diphtheriae . Для получения железа требуется окислительное расщепление макроцикла гема

,

J Biol Chem

,

1998

, vol.

273

 (стр. 

837

41

)108.

Транскрипция гена Corynebacterium diphtheriae hmuO регулируется железом и гем

,

Infect Immun

,

1997

, vol.

65

 (стр. 

4634

41

)109,  .

Анализ промотора дифтерии tox методом сайт-направленного мутагенеза

,

J Bacteriol

,

1988

, vol.

170

 (стр. 

5949

52

)110,  ,  .

Доказательства прямой регуляции транскрипции гена дифтерийного токсина Fe 2+ -зависимым ДНК-связывающим репрессором, DtoxR, в Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun

,

1989

57

 (стр.  

3221

5

)111,  ,  .

Молекулярное клонирование и анализ последовательности ДНК дифтерийного tox железозависимого регуляторного элемента (dtxR) из Corynebacterium diphtheriae

,

Proc Natl Acad Sci USA

, vol

0,099

87

 (стр. 

5968

72

)112,  .

Железозависимая регуляция экспрессии дифтерийного токсина и сидерофоров с помощью клонированного Corynebacterium diphtheriae репрессорного гена dtxR в C.diphtheriae C7 штаммы

,

Infect Immun

,

1991

, vol.

59

 (стр. 

1899

904

)113.

Регуляция транспорта трехвалентного железа в Escherichia coli K12: выделение конститутивного мутанта

,

Mol Gen Genet

,

1981

, vol.

182

 (стр. 

288

92

)114,  .

Характеристика дефектного аллеля репрессора дифтерийного токсина (dtxR) и анализ транскрипции dtxR в штаммах дикого типа и мутантных штаммах Corynebacterium diphtheriae

,

Infect Immun 0, 1 9007

59

 (стр.  

3903

8

)115,  ,  .

последовательности ДНК и характеристика аллелей dtxR из Corynebacterium diphtheriae PW8(-), 1030(-) и C7hm723(-)

,

J Bacteriol

,

1992 ,

174

 (стр. 

1268

72

)116,  ,  .

Очистка и характеристика репрессора дифтерийного токсина

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1992

, vol.

89

 (стр.

7576

80

)117,  ,  .

Специфическое связывание регуляторного элемента дифтерии tox DtxR с оператором tox требует двухвалентных ионов тяжелых металлов и прерываемой палиндромной последовательности из 9 пар оснований

89

 (стр. 

5897

901

)118,  .

Связывание металлорегуляторного белка DtxR с оператором дифтерии tox требует двухвалентного иона тяжелого металла и защищает палиндромную последовательность от расщепления ДНКазой I

267

 (стр. 

21761

4

)119,  .

Анализ взаимодействий репрессор-оператор дифтерийного токсина и характеристика мутантного репрессора со сниженной активностью связывания двухвалентных металлов

9

 (стр.  

173

81

)120,  .

Клонирование, последовательность и анализ следов двух промоторов/операторов из Corynebacterium diphtheriae , которые регулируются репрессором дифтерийного токсина (DtxR) и железом

,

J Bacteriol

,

1994

, vol.

176

 (стр. 

1141

9

)121,  .

Определение минимальной последовательности основных нуклеотидов для связывания репрессора дифтерии tox с помощью аффинной селекции in vitro

91

 (стр. 

9646

50

)122,  ,  ,  ,  ,  .

Идентификация и характеристика трех новых промоторов/операторов из Corynebacterium diphtheriae , которые регулируются репрессором дифтерийного токсина (DtxR) и железом

,

Infect Immun

,

1997

, vol.

65

 (стр. 

4273

80

)123,  ,  ,  .

Анализ транскрипции и нуклеотидная последовательность промотора/оператора tox мутантов коринебактериофага бета

,

Microb Pathog

,

1992

, vol.

13

 (стр. 

85

92

)124,  ,  .

Характеристика мутаций, инактивирующих ген-репрессор дифтерийного токсина (dtxR)

,

Infect Immun

,

1994

, vol.

62

 (стр. 

1600

8

)125,  ,  .

Активация связывания ДНК ионами переходных металлов репрессором дифтерии tox требует образования стабильных гомодимеров

92

 (стр. 

6803

7

)126,  ,  ,  ,  ,  .

Трехмерная структура репрессора дифтерийного токсина в комплексе с корепрессорами двухвалентных катионов

3

 (стр. 

87

100

)127,  ,  ,  ,  ,  .

Структуры апо- и активируемых ионами металлов форм дифтерии tox репрессор из Corynebacterium diphtheriae

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1995

, vol.

92

 (стр. 

9843

50

)128,  ,  ,  ,  .

Идентификация основных сайтов активации ионов металлов репрессора дифтерии tox с помощью рентгеновской кристаллографии и сайт-направленного мутационного анализа

3

 (стр.  

382

7

)129,  ,  ,  .

Структура репрессора дифтерийного токсина в комплексе с кобальтом и марганцем с высоким разрешением выявляет Sh4-подобный третий домен и предполагает возможную роль фосфата в качестве ко-корепрессора

35

 (стр. 

12292

302

)130,  ,  ,  ,  .

Сравнение структур высокого разрешения репрессора дифтерийного токсина в комплексе с кобальтом и цинком в месте связывания катиона и аниона

6

 (стр. 

1114

8

)131,  ,  .

Движение ДНК-связывающего домена относительно ядра репрессора дифтерийного токсина (DtxR), обнаруженное в кристаллических структурах апо- и голо-DtxR

,

J Biol Chem

,

1998

, vol.

273

 (стр. 

22420

7

)132,  ,  ,  ,  .

Структура активируемого ионами металла репрессора дифтерийного токсина/комплекс оператора tox

,

Nature

,

1998

, vol.

394

 (стр. 

502

6

)133,  .

Цистеин-102 расположен в месте активации связывания металлов регуляторного элемента DtxR Corynebacterium diphtheriae

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

1993

, vol.

90

 (стр. 

8524

8

)134,  ,  ,  .

Анион-координирующие остатки в сайте связывания 1 необходимы для биологической активности репрессора дифтерийного токсина

,

Infect Immun

,

1999

, vol.

67

 (стр. 

1806

11

)135,  ,  ,  .

Координированная регуляция продукции сидерофоров и дифтерийных токсинов железом в

9

 (стр. 

267

73

)136,  ,  ,  ,  .

Характеристика железозависимого регуляторного белка (IdeR) Mycobacterium tuberculosis как функционального гомолога репрессора дифтерийного токсина (DtxR) из Corynebacterium diphtheriae [опубликованные опечатки появляются в Infect Immun 1996; 64:681]

,

Infect Immun

,

1995

, vol.

63

 (стр. 

4284

9

)137,  .

Клонирование репрессируемого железом гена Corynebacterium diphtheriae , который имеет гомологию последовательности с субъединицей AhpC алкилгидропероксидредуктазы Salmonella typhimurium

,

J Bacteriol

,

1995,

, vol.

177

 (стр. 

3512

7

)138,  ,  ,  ,  .

Молекулярное клонирование, анализ последовательности ДНК и характеристика гомолога Corynebacterium diphtheriae dtxR из Brevibacterium lactofermentum

,

J Bacteriol

,

1995

, vol.

177

 (стр. 

465

7

)139,  ,  .

Мутант ideR Mycobacterium smegmatis имеет дерепрессию продукции сидерофоров и измененную реакцию на окислительный стресс

22

 (стр. 

535

44

)140,  ,  , и др.

Геномная организация сигма-генного кластера микобактерий

,

Ген

,

1995

, vol.

165

 (стр. 

67

70

)141,  .

Клонирование и анализ последовательности гомолога Corynebacterium diphtheriae dtxR из Streptomyces lividans и S. pilosus , кодирующего предполагаемый белок-репрессор железа

,

Gene

, vol 0.0.

166

 (стр. 

117

9

)142,  ,  ,  ,  ,  .

SirR, новый железозависимый репрессор в Staphylococcus epidermidis

,

Infect Immun

,

1998

, vol.

66

 (стр.

4123

9

)143,  ,  , и др.

Идентификация и анализ транскрипции оперона Treponema pallidum , кодирующего предполагаемую транспортную систему ABC, гомолог активируемого железом белка-репрессора и гомолог фермента гликолитического пути

197

 (стр. 

47

64

)144.

Экспресс-скрининг токсигенных Corynebacterium diphtheriae методом полимеразной цепной реакции

,

J Clin Pathol

,

1991

, vol.

44

 (стр. 

1025

6

)145,  ,  ,  .

Полимеразная цепная реакция для скрининга клинических изолятов коринебактерий на продукцию дифтерийного токсина

47

 (стр. 

353

6

)146,  ,  , и др.

Применение ПЦР для выявления токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae , выделенных во время эпидемии дифтерии в России с 1990 по 1994 гг.

33

 (стр. 

3061

3

)147,  .

Разработка прямого ПЦР-анализа для обнаружения гена дифтерийного токсина

35

 (стр. 

1651

5

)148,  ,  , и др.

Молекулярная эпидемиология Corynebacterium diphtheriae из северо-западной России и соседних стран, изученная с помощью риботипирования и гель-электрофореза в пульсирующем поле

33

 (стр. 

1080

3

)149,  ,  , и др.

Молекулярная эпидемиология дифтерии в России, 1985–1994 гг.

,

J Infect Dis

,

1996

, том.

174

 (стр. 

1064

72

)150,  ,  , и др.

Гетерогенность гена дифтерийного токсина, tox, и его регуляторного элемента, dtxR, в штаммах Corynebacterium diphtheriae , вызывающих эпидемию дифтерии в России и Украине

,

J Clin Microbiol

, 9006

34

 (стр. 

1711

6

)151,  ,  ,  .

Анализ гетерогенности гена токсина Corynebacterium diphtheriae , tox, и его регуляторного элемента, dtxR, методом прямого секвенирования

,

Res Microbiol

,

1007 90vol.

148

 (стр. 

45

54

)

Примечания автора

© 2000 Американского общества инфекционистов

Дифтерия

Дифтерия Дифтерия
  • Является острой инфекционной болезнью
  • Дифтерия – результат местного и системного действия дифтерии токсин.
  • Характеризуется образованием мембран в горле.
  • Инфекция может вызвать заболевание или носительство
  • Дифтерия раньше была болезнью детей

Corynebacterium diphtheriae

  • Человек – единственный резервуар инфекции
  • Аэробные, булавовидные, грамположительные, неподвижные, неинкапсулированные, плеоморфные бациллы с терминальными вздутиями
  • При окрашивании часто обнаруживается группами, образующими острые углы друг с другом. другие и напоминают китайские буквы.
Восприимчивые хозяева
  • Дети, не вакцинированные против C. diphtheria.
  • Иммунодефицит  
  • Плохо иммунизированные взрослые
Доступ к людям
  • Респираторные капли
  • Носоглоточный секрет
  • Прямой контакт с кожной инфекцией
  • Фомиты
. Организмы могут выживать в пыли и одежде до 6 месяцев.

Патогенные механизмы

Заболевание вызывается экзотоксином, ингибирующим синтез белка эукариотические клетки

  • Токсин содержит токсическую субъединицу А (активный токсин) и рецептор связывание субъединицы В.

  • Субъединица B (фрагмент) облегчает транслокацию Субъединица из фагосомы в цитозоль с последующим разделением, обеспечение полной активности субъединицы А в отношении удлинения белка-мишени фактор-2.EF-2 переносит полипептидил-транспортную РНК от акцептора к донору. сайты на рибосоме клетки-хозяина.

  • Субъединица А катализирует перенос аденин-рибозы фосфат из НАД в EF-2 (рибозилирование АДФ), инактивируя EF-2 и выключая синтез белка, токсин C. diphtheria способен ингибировать белковый синтез всех эукариотических клеток.

  • Фрагмент А обладает ферментативной активностью

  • Фрагмент B прикрепляется к клеточным рецепторам и обеспечивает фрагмент Вход в клетку, где он ингибирует синтез белка.

  • Экзотоксин i всасывается в кровоток и распространяется, что приводит к системным осложнениям, включая демиелинизирующие невриты и миокардиты.

  • Дифтерийный токсин также вызывает локальную деструкцию в место образования мембраны .

Ген токсина

  • Ген дифтерийного токсина содержится в геноме бактериофаг.

  • Штаммы C. diphtheria должны содержать бактериофаг (бета-фаг), полученный путем трансдукции от других штаммов C. diphtheria, в для того, чтобы выразить токсин.

  • Фаг должен быть лизогенизирован после трансдукции.

  • Экспрессия токсина (ген fox) регулируется белок-репрессор, кодируемый хромосомой (DtxR), когда железо ограничено.

H ПВО
  • Кажется, у нас нет никакой защиты от токсина.Защита есть обеспечивается только вакцинацией.
  • Организмы берутся?
Клинические проявления

Инкубационный период 2-5 дней

Дифтерия – результат местного и системного действия дифтерии токсин.

Летальность при отсутствии лечения составляет 10-50%.

Диагностика
  • Первоначальный клинический диагноз

  • Без экспресс-теста

  • Окрашивание горла по Граму бесполезно

  • Организм можно культивировать для подтверждения диагноза.Пропущенный на рутинных культурах. Сообщить в лабораторию о возможном диагнозе.

  • Производство токсинов культивируемыми штаммами может осуществляться иммунодиффузия.

  • Сыворотка на антитела к дифтерийному токсину

Другие полезные оценки

  • ЭКГ и сердечные ферменты для выявления миокардита

  • CXR: Гиперинфляция, сужение подсвязочного пространства

Терапевтическая стратегия
  • Строгая изоляция

  • С.diphtheriae антитоксин вводится немедленно для нейтрализации свободных токсин.

    • Обратитесь в CDC за антитоксином и инструкциями по применению.

    • Не ждать для подтверждения культуры.

    • Антитела, вырабатываемые против токсина в природных инфекционное заболевание.

    • Обработка токсином для нейтрализации свободного токсина перед связывается с клетками.

  • Сам организм можно лечить пенициллином , цефалоспорины и эритромицин.

  • Сообщите в отдел здравоохранения

  • Клиническая дифтерия не дает иммунитета, поэтому активная иммунизация дифтерийным анатоксином должна быть обеспечена во время выздоровление.

  • Бронходилататоры при необходимости.

  • Следите за обструкцией дыхательных путей и принимайте необходимые шаги.

  • Следите за миокардитом и чесоткой надлежащим образом

Профилактика
  • Своевременная вакцинация
    • Дифтерия: иммунизация анатоксином вызывает гуморальный ответ, предотвращающий заражение дифтерией.
    • Вакцинация анатоксином = обработанным формалином токсином
  • Бустерная доза от столбняка-дифтерии каждые 10 лет до совершеннолетия
  • Эпиднадзор в сообществах, эндемичных по дифтерии
  • Закрыть контакты
    • Должны быть идентифицированы и пролечены пероральным эритромицином для 7-10 дней
    • Обеспечить активную иммунизацию

Другие виды

Коринебактерии язвенные:

  • Кожная дифтерия
    • Обычно вызывается токсическими штаммами.
    • Вырабатывает естественный иммунитет
    • Может вызывать эпидемии среди плохо иммунизированных групп населения.

Человеческие антитела, нейтрализующие дифтерийный токсин in vitro и in vivo

  • Berkowitz, A.L. Столбняк, ботулизм и дифтерия. Контин. (Миннеап, Миннесота) 24 , 1459–1488 (2018).

    Google ученый

  • Мур, Л.S. P. и др. . Коринебактерии язвенной болезни кожи дифтерии. Ланцет Заражение. Дис. 15 , 11:00–11:07 (2015).

    Артикул Google ученый

  • Хэдфилд Т.Л., Макэвой П., Полоцкий Ю., Цинсерлинг В.А., Яковлев А.А. Патология дифтерии. Дж. Заражение. Дис. 181 (Приложение 1), S116–120 (2000).

    Артикул Google ученый

  • Книн, Р. и др. . Пенициллин против эритромицина в лечении дифтерии. клин. Заразить. Дис. 27 , 845–850 (1998).

    Артикул КАС Google ученый

  • Вагнер, К. С. и др. . Обзор международных проблем, связанных с наличием и спросом на дифтерийный антитоксин для терапевтического использования. Вакцина 28 , 14–20 (2009).

    Артикул КАС Google ученый

  • Хамборски Дж., Kroger, A. & Wolfe, S. Эпидемиология и профилактика вакциноуправляемых заболеваний . (Общественное Он, 2015).

  • Мерфи, Дж. Р. Corynebacterium Diphtheriae. В Medical Microbiology (изд. Baron, S.) (Медицинское отделение Техасского университета в Галвестоне, 1996).

  • Учида Т., Гилл Д. М. и Паппенгеймер А. М. Мутация в структурном гене дифтерийного токсина, переносимого умеренным фагом. Нац. Н. биол. 233 , 8–11 (1971).

    Артикул КАС Google ученый

  • Гринфилд, Л. и др. . Нуклеотидная последовательность структурного гена дифтерийного токсина коринебактериофага бета. Проц. Натл. акад. науч. США 80 , 6853–6857 (1983).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Google ученый

  • Смит В.П., Тай П.С., Мерфи Дж.Р. и Дэвис Б.D. Предшественник котрансляционной секреции дифтерийного токсина. J. Бактериол. 141 , 184–189 (1980).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Качорек М. и др. . Нуклеотидная последовательность и экспрессия гена дифтерии tox228 в Escherichia coli. Наука 221 , 855–858 (1983).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гилл, Д.М. и Паппенгеймер, А.М. Взаимосвязь структура-активность дифтерийного токсина. J. Biol. хим. 246 , 1492–1495 (1971).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Collier, R.J. & Kandel, J. Структура и активность дифтерийного токсина. I. Тиолзависимая диссоциация фракции токсина на ферментативно активный и неактивный фрагменты. J. Biol. хим. 246 , 1496–1503 (1971).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Дразин Р., Кандел Дж. и Кольер Р. Дж. Структура и активность дифтерийного токсина. II. Атака трипсином в определенном месте интактной молекулы токсина. J. Biol. хим. 246 , 1504–1510 (1971).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чоу, С. и др. . Кристаллическая структура дифтерийного токсина. Природа 357 , 216–222 (1992).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Дорланд, Р. Б., Миддлбрук, Дж. Л. и Леппла, С. Х. Опосредованная рецепторами интернализация и деградация дифтерийного токсина клетками почек обезьян. J. Biol. хим. 254 , 11337–11342 (1979).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Моррис Р.Э., Герштейн, А.С., Бонвентре, П.Ф. и Селингер, С.Б. Опосредованное рецептором проникновение дифтерийного токсина в клетки почки обезьяны (Веро): электронно-микроскопическая оценка. Заразить. Иммун. 50 , 721–727 (1985).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Moskaug, J. O., Sandvig, K. & Olsnes, S. Высвобождение А-фрагмента дифтерийного токсина в клетках Vero, индуцированное низким pH. Биохимические доказательства перехода в цитозоль. J. Biol. хим. 263 , 2518–2525 (1988).

    КАС Google ученый

  • Паппенгеймер, А. М. Дифтерийный токсин. Анну. Преподобный Биохим. 46 , 69–94 (1977).

    Артикул КАС Google ученый

  • Komatsu, N., Oda, T. & Muramatsu, T. Участие как каспазоподобных протеаз, так и сериновых протеаз в апоптотической гибели клеток, вызванной рицином, модекцином, токсином дифтерии и токсином псевдомонады. J. Biochem. 124 , 1038–1044 (1998).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • фон Беринг, Э. и Китасато, С. Über das Zustandekommen der Diphtherie-Immunität und der столбняк-Immunität bei Thieren. Дтч. Medizinische Wochenzeitschrift 16 , 1113–1114 (1890 г.).

    Артикул Google ученый

  • Гранди, Дж.и Биггс, Б.-А. Влияние конфликта на охват иммунизацией в 16 странах. Междунар. J. Управление политикой здравоохранения. 8 , 211–221 (2018).

    Артикул Google ученый

  • Дуреаб, Ф. и др. . Вспышка дифтерии в Йемене: влияние конфликта на хрупкую систему здравоохранения. Конф. Здоровье 13 , 19 (2019).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Паниз-Мондольфи, А.Е. и др. . Возрождение вакциноуправляемых заболеваний в Венесуэле как региональная угроза общественному здравоохранению в Северной и Южной Америке. Экстренный. Заразить. Дис. 25 , 625–632 (2019).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Палец, Ф. и др. . Анализ в режиме реального времени вспышки дифтерии среди вынужденно перемещенных граждан Мьянмы в Бангладеш. БМС Мед. 17 , 58 (2019).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кейт, Дж. Р. Лечение сывороточной болезни, возникающей при дифтерии. Бр. Мед. J. 2 , 105 (1911).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Tuft, L. & Ramsdell, S.G. Реакция антител у человека после инъекции нормальной лошадиной сыворотки. Дж. Экспл. Мед. 50 , 431–437 (1929).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кникер В.Т. и Кокрейн К.Г. Локализация циркулирующих иммунных комплексов при экспериментальной сывороточной болезни. Роль вазоактивных аминов и гидродинамических сил. Дж. Экспл. Мед. 127 , 119–136 (1968).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Оба, Л., Уайт Дж., Мандал С. и Эфстратиу А. Доступ к дифтерийному антитоксину для терапии и диагностики. евро. Наблюдение . 19 (2014).

  • Laustsen, A. H. Как можно использовать моноклональные антитела против забытых тропических болезней и других инфекционных болезней? Эксперт. мнение Препарат, средство, медикамент. Дисков . 1–10, https://doi.org/10.1080/17460441.2019.1646723 (2019).

  • Кун, П. и др. . Рекомбинантные антитела для диагностики и терапии патогенов и токсинов, генерируемых фаговым дисплеем. Протеом. клин. заявл. 10 , 922–948 (2016).

    Артикул КАС Google ученый

  • Frenzel, A., Schirrmann, T. & Hust, M. Человеческие антитела, полученные из фагового дисплея, в клинической разработке и терапии. MAbs 8 , 1177–1194 (2016).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Руссо, Г. и др. . Параллельный отбор антител в титрационных микропланшетах. Методы Мол. биол. 1701 , 273–284 (2018).

    Артикул КАС Google ученый

  • Ch’ng, A.C.W., Hamidon, N.H.B., Konthur, Z. & Lim, TS. Полуавтоматическое панорамирование на основе магнитных наночастиц для высокопроизводительного отбора антител. Методы Мол. биол. 1701 , 301–319 (2018).

    Артикул КАС Google ученый

  • Ледсгаард, Л., Килструп, М., Каратт-Веллатт, А., Маккафферти, Дж. и Лауссен, А. Х. Основы технологии фагового дисплея антител. Токсины. (Базель) 10 (2018).

  • Ширрманн Т., Мейер Т., Шютте М., Френцель А. и Хуст М. Фаговый дисплей для выработки антител для исследования протеома, диагностики и терапии. Молекулы 16 , 412–426 (2011).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Стейнванд, М. и др. . Влияние формата фрагмента антитела на созревание аффинности IgG на основе фагового дисплея. MAbs 6 , 204–218 (2014).

    Артикул Google ученый

  • Bujak, E., Matasci, M., Neri, D. & Wulhfard, S. Переформатирование антител scFv в формат scFv-Fc и их последующая очистка. Методы Мол. биол. 1131 , 315–334 (2014).

    Артикул КАС Google ученый

  • Мите, С. и др. . Разработка гуманизированных зародышевых антител, нейтрализующих ботулинический нейротоксин A и B. PLoS One 11 , e0161446 (2016).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Мите, С. и др. . Разработка похожего на человека scFv-Fc, нейтрализующего ботулинический нейротоксин E. PLoS One 10 , e0139905 (2015).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Разетти-Эскаргейл, К. и др. . Европейская рамочная программа AntibotABE и ее обновление: разработка инновационных ботулинических антител. Токсины. (Базель) 9 (2017).

  • Пелат, Т. и др. . Выделение фрагмента человеческого антитела (scFv), который нейтрализует биологическую активность рицина. БМС Биотехнолог. 9 , 60 (2009).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Пелат Т. и др. . Высокоаффинный фрагмент антитела, подобный человеческому антителу (одноцепочечный вариабельный фрагмент), нейтрализующий летальный фактор (LF) Bacillus anthracis путем ингибирования образования защитного комплекса антиген-LF. Антимикроб. Агенты Чемотер. 51 , 2758–64 (2007).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лаустен, А. Х. и др. . In vivo Нейтрализация опосредованной дендротоксином нейротоксичности яда черной мамбы с помощью олигоклональных антител IgG человека. Нац. коммун. 9 , 3928 (2018).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Солтес, Г. и др. . О влиянии дизайна вектора на фаговый дисплей антител. Дж. Биотехнолог. 127 , 626–37 (2007).

    Артикул КАС Google ученый

  • Рондо С., Кох Дж., Breitling, F. & Dübel, S. Вспомогательный фаг для улучшения представления одноцепочечных антител в фаговом дисплее. Нац. Биотехнолог. 19 , 75–8 (2001).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Hoy, C.S. & Sesardic, D. Анализы in vitro для обнаружения дифтерийного токсина. Токсикол. Vitro 8 , 693–695 (1994).

    Артикул КАС Google ученый

  • Мец, Б., Jiskoot, W., Hennink, WE, Crommelin, DJA и Kersten, GFA. Физико-химические и иммунохимические методы позволяют прогнозировать качество вакцин против дифтерийного анатоксина. Вакцина 22 , 156–167 (2003).

    Артикул КАС Google ученый

  • Proia, R.L., Hart, D.A., Holmes, R.K., Holmes, K.V. & Eidels, L. Иммунопреципитация и частичная характеристика гликопротеинов, связывающих дифтерийный токсин, с поверхности клеток морской свинки. Проц. Натл. акад. науч. США 76 , 685–689 (1979).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Google ученый

  • Кюглер, Дж. и др. . Идентификация иммуногенных полипептидов из геномной библиотеки Mycoplasma hyopneumoniae с помощью фагового дисплея. Заяв. микробиол. Биотехнолог. 80 , 447–58 (2008).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Сесардич, Д., Prior, C., Daas, A. & Buchheit, K.H., Национальный институт биологических стандартов и контроля, Хартфордшир, Великобритания, Европейское управление по качеству лекарственных средств, Совет Европы, Strasbourg Cedex 1, Франция. Совместное исследование для создания партии 1 Европейской фармакопеи BRP для дифтерийного токсина. Pharmeuropa Bio 2003, (5–21 (2003).

    Google ученый

  • Уинснес Р., Сесардик Д., Даас А. и Бер-Гросс М.-Э. Совместное исследование по валидации серологических методов проверки эффективности вакцин против дифтерийного анатоксина — часть 1. Pharmeuropa Bio 2003 , 35–68 (2004).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Френзель, А. и др. . Конструирование человеческих антител с помощью фагового дисплея. Трансфус. Мед. Hemother 44 , 312–318 (2017).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Строл, В.R. Текущий прогресс в разработке инновационных антител. Protein Cell 9 , 86–120 (2018).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Haurum, J. S. Рекомбинантные поликлональные антитела: новое поколение терапевтических средств на основе антител? Препарат. Дисков. Сегодня 11 , 655–660 (2006 г.).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Шютте, М. и др. . Идентификация предполагаемого варианта сплайсинга Crf и создание рекомбинантных антител для специфического обнаружения Aspergillus fumigatus. PLoS One 4 , e6625 (2009 г.).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кюглер, Дж. и др. . Создание и анализ улучшенных библиотек фагового дисплея человеческих антител HAL9/10. БМС Биотехнолог. 15 , 10 (2015).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Тиллер, Т. и др. . Полностью синтетическая библиотека Fab-антител человека на основе фиксированных пар VH/VL-каркасов с благоприятными биофизическими свойствами. MAbs 5 , 445–470 (2013).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Шикель, Дж.-Н. и др. . Самореактивные В-клетки IgG, экспрессирующие Vh5-34, распознают комменсальные бактерии. Дж. Экспл. Мед. 214 , 1991–2003 (2017).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Бигио, М. и др. . Конформационные изменения дифтерийных анатоксинов. Анализ с моноклональными антителами. ФЭБС Письмо. 218 , 271–276 (1987).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ягер, В. и др. . Временная продукция высокого уровня рекомбинантных антител и слитых белков антител в клетках HEK293. БМС Биотехнолог. 13 , 52 (2013).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Тье, Х. и др. . Рост и падение специфического антитела против MUC1. PLoS One 6 , e15921 (2011 г.).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лорд Д.М. и др. . Основанная на структуре инженерия для восстановления высокоаффинного связывания селективного по изоформе антитела против TGFβ1. MAbs 10 , 444–452 (2018).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Фюнер, В. и др. . Картирование эпитопов с помощью фагового дисплея из библиотек отдельных генов. Методы Мол. биол. 1904 , 353–375 (2019).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Морейра, Г.MSG, Fühner, V. & Hust, M. Картирование эпитопов с помощью фагового дисплея. Методы Мол. биол. 1701 , 497–518 (2018).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Rojas, G., Tundidor, Y. & Infante, Y.C. Высокопроизводительное функциональное картирование эпитопов: пересмотр платформы фагового дисплея для сканирования поверхности антигена-мишени. MAbs 6 , 1368–1376 (2014).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ли Р. и др. . Идентификация эпитопа на С-конце нормального прионного белка, экспрессия которого модулируется событиями связывания на N-конце. Дж. Мол. биол. 301 , 567–573 (2000).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Руссо, Г. и др. . Антитела с определенной последовательностью улучшают обнаружение кадгерина 2 (N-кадгерина) во время развития рыбок данио. Н. Биотехнолог. 45 , 98–112 (2018).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Фюнер, В. и др. . Разработка нейтрализующих и ненейтрализующих антител, нацеленных на известные и новые эпитопы TcdB Clostridioides difficile. Перед. микробиол. 9 , 2908 (2018).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Севиньи, Л.М. и др. . Идентификация человеческого моноклонального антитела для замены антитоксина дифтерии лошадей для лечения интоксикации дифтерией. Заразить. Иммун. 81 , 3992–4000 (2013).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Какита М. и др. . Выделение человеческого моноклонального антитела с сильной нейтрализующей активностью в отношении токсина дифтерии. Заразить.Иммун. 74 , 3682–3683 (2006).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Danelli M das, G., Teixeira, L.M., Formiga, L.C. & Peralta, J.M. Защитные моноклональные антитела к дифтерийному токсину. Мем. Инст. Освальдо Круз 86 , 265–267 (1991).

    Артикул Google ученый

  • Каусмалли Л. и др. . Нейтрализующие антитела человека к вирусу ветряной оспы (VZV), полученные из библиотеки рекомбинантных антител пациента с VZV. Дж. Генерал Вирол. 85 , 3493–3500 (2004).

    Артикул КАС Google ученый

  • Heidelberger, M. & Kendall, F. E. Количественные исследования реакции преципитации. Дж. Экспл. Мед . 555–561 (1932).

  • Эрнандес, Л. Д. и др. .Эпитопы и механизм действия токсина Clostridium difficile А-нейтрализующего антитела актоксумаб. Дж. Мол. биол. 429 , 1030–1044 (2017).

    Артикул КАС Google ученый

  • Herrera, C., Klokk, T.I., Cole, R., Sandvig, K. & Mantis, N.J. Биспецифическое антитело способствует агрегации рицинового токсина на клеточных поверхностях и изменяет динамику интернализации и транспортировки токсина. PLoS One 11 , e0156893 (2016 г.).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Herrera, C., Tremblay, J.M., Shoemaker, C.B. & Mantis, N.J. Механизмы нейтрализации рицинового токсина, обнаруженные с помощью сконструированных гомодимерных и гетеродимерных антител верблюдовых. J. Biol. хим. 290 , 27880–27889 (2015).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Смит, Х.L., Cheslock, P., Leney, M., Barton, B. & Molrine, D.C. Эффективность человеческого моноклонального антитела к дифтерийному токсину по сравнению с конским дифтерийным антитоксином в модели интоксикации морской свинки. Вирулентность 1–9, https://doi.org/10.1080/21505594.2016.1171436 (2016).

  • Кюглер, Дж., Томшак, Ф., Френцель, А. и Хуст, М. Создание библиотек человеческих иммунных и наивных scFv. Методы Мол. биол. 1701 , 3–24 (2018).

    Артикул КАС Google ученый

  • Моллова С., Реттер И., Хуст М., Дюбель С. и Мюллер В. Анализ последовательностей одноцепочечных антител с использованием инструмента анализа VBASE2 Fab. В Antibody Engineering 3–10 (Springer Verlag, 2010).

  • Гупта, Р. К., Хайэм, С., Гупта, С. К., Рост, Б. и Сибер, Г. Р. Пригодность метода клеток Vero для титрования дифтерийного антитоксина в тесте на эффективность дифтерийного анатоксина в США. Biologicals 22 , 65–72 (1994).

    Артикул КАС Google ученый

  • Кюглер, Й., Zantow, J., Meyer, T. & Hust, M. Фаговый дисплей олигопептида m13 в исследовании патогенов. Вирусы 5 , 2531–2545 (2013).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Совет Европы. Европейская фармакопея (Ph. Eur.) (2019).

  • Wenzel, EV. Разработка рекомбинантных человеческих антител, нейтрализующих дифтерийный токсин, для терапии дифтерии (2019).Кандидатская диссертация в Техническом университете Брауншвейга.

  • Bennett, M.J., Choe, S. & Eisenberg, D. Уточненная структура димерного дифтерийного токсина с разрешением 2,0 A. Науки о белках. 3 , 1444–1463 (1994).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Антитела к дифтерийному токсину А (8A4) (NB110-2565): Novus Biologicals

    Антитело к дифтерийному токсину А (8A4) Сводка

    Иммуноген

    Гибридомный клон был получен путем гибридизации клеток миеломы Sp2/0 с клетками селезенки мышей Balb/c, иммунизированных дифтерийным анатоксином.

    Специфичность

    Реагирует со свободными субъединицами А дифтерийного токсина. Он не реагирует ни со всем токсином дифтерии, ни со свободной субъединицей В токсина дифтерии.

    Изотип

    IgG2a

    Клональность

    Моноклональный

    Хост

    Мышь

    Чистота

    Белок А очищенный

    Награда новатору

    Приложения/разбавления

    Разведения
    • Сэндвич-ИФА 1:100-1:2000
    Указания по применению Выявление А-субъединицы дифтерийного токсина различными иммунохимическими методами.Рекомендуемая пара для сэндвич-иммуноанализа (захват-обнаружение): NB110-2565 — NB110-2567.

    Упаковка, хранение и составы

    Хранение

    Хранить при 4C на короткий срок. Аликвотировать и хранить при температуре -20°С в течение длительного времени. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.

    Буфер

    PBS (pH 7,4)

    Консервант

    0.09% азид натрия

    Чистота

    Белок А очищенный

    Альтернативные названия антител к дифтерийному токсину А (8A4)

    Фон

    Дифтерийный токсин представляет собой белок с молекулярной массой 58 кДа, секретируемый лизогенными штаммами Corynebacterium diphtheriae. Токсин вызывает заболевание дифтерией у людей, проникая в цитоплазму клетки и ингибируя синтез белка.Механизм ингибирования включает перенос АДФ-рибозной группы НАД на фактор элонгации-2 (EF-2), что делает EF-2 неактивным. Катализируемая реакция выглядит следующим образом: НАД + + пептид дифтамид = никотинамид + пептид N-(АДФ-D-рибозил)дифтамид Кристаллическая структура гомодимера дифтерийного токсина определена с разрешением 2,5А. В структуре обнаруживается Y-образная молекула из 3-х доменов, каталитический домен (фрагмент А), укладка которого относится к типу альфа+бета; трансмембранный (ТМ) домен, состоящий из 9 альфа-спиралей, 2 пары из которых могут участвовать в инсерции и транслокации мембраны, запускаемой рН; и рецептор-связывающий домен, который образует уплощенный бета-бочонок с топологией, напоминающей желеобразный рулет.Домены связывания TM и рецептора вместе составляют фрагмент B.

    Ограничения

    Этот продукт предназначен только для исследовательских целей и не одобрен для использования на людях или в клинической диагностике. Гарантия на первичные антитела составляет 1 год с даты получения.

    Публикации по антителу к дифтерийному токсину А (NB110-2565) (0)

    Нет публикаций по антителу к дифтерийному токсину А (NB110-2565).

    Отправляя информацию о публикации, вы получаете подарочные карты и скидки на будущие покупки.

    Отзывы о антителе к дифтерийному токсину А (NB110-2565) (0)

    Нет отзывов о антителе к дифтерийному токсину А (NB110-2565). Отправив отзыв, вы получите электронную подарочную карту Amazon или скидку на продукт Novus.
    • Обзор без изображения — 10 долл. США/7 евро/6 фунтов стерлингов/10 канадских долларов/70 юаней/1110 иен
    • Обзор с изображением — 25 долларов США/18 евро/15 фунтов стерлингов/25 канадских долларов/150 юаней/2500 иен

    Другие доступные форматы

    Дополнительные продукты с дифтерийным токсином А

    Блоги о дифтерийном токсине А

    Рекомбинантное антитело к дифтерийному токсину [IGX3492] (ab209329)

    Обзор

    • Название продукта

    • Описание

      Человеческий моноклональный [IGX3492] к дифтерийному токсину

    • Виды-хозяева

      Человек

    • Протестированные приложения

    • Реактивность видов

      Реагирует с: Другие виды

    • Иммуноген

      Рекомбинантный полноразмерный белок.Эта информация считается коммерческой тайной.

    • Положительный контроль

      • WB: дифтерийный токсин (мутированный G52 E), полноразмерный белок
    • Общие примечания

      Этот продукт был изготовлен с использованием синтетических библиотек и технологии фагового дисплея.

      Это антитело является рекомбинантным антителом.
      Человеческое моноклональное антитело.

      Для рекомендуемых вторичных антител —

      Кроличьи моноклональные антитела к человеческому IgG1 H&L (Alexa Fluor® 488) — ab200622
      Кроличьи моноклональные антитела к человеческому IgG1 H&L (Alexa Fluor® 647) — ab200623
      Кроличьи моноклональные антитела к человеческому IgG1 H&L — ab201485
      Кроличьи античеловеческие IgG H&L (HRP) — ab6759

    Свойства

    • Форма

      Жидкость

    • Инструкции по хранению

      Поставляется при 4°C.Хранить при +4°C кратковременно (1-2 недели). При доставке аликвоты. Хранить при температуре -20°C длительное время. Избегайте циклов замораживания/оттаивания.

    • Буфер хранения

      Консервант: 0,01% азид натрия
      Составляющие: 40% глицерин, PBS

    • Загрузка информации о концентрации…
    • Чистота

      Белок А очищенный

    • Клональность

      Моноклональный

    • Номер клона

      IGX3492

    • Изотип

      IgG1

    • Области исследований

    Сопутствующие товары

    • Совместимые вторичные модули

    • Контроль изотипа

    • Сопутствующие товары

    Приложения

    Гарантия Abpromise

    Наша гарантия Abpromise распространяется на использование ab209329 в следующих протестированных приложениях.

    В примечаниях по применению указаны рекомендуемые начальные разведения; оптимальные разведения/концентрации должны определяться конечным пользователем.

    Приложение Сокращения Примечания
    ВБ

    Используйте концентрацию 1 мкг/мл. Обнаруживает полосу приблизительно 60 кДа (прогнозируемая молекулярная масса: 58 кДа).

    Примечания

    WB
    Используйте концентрацию 1 мкг/мл. Обнаруживает полосу приблизительно 60 кДа (прогнозируемая молекулярная масса: 58 кДа).

    Цель

    • Актуальность

      Corynebacterium diphtheriae — грамположительные неподвижные бактерии, обнаруженные в почве и фекалиях животных.C. diphteriae заражает эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, где они продуцируют и выделяют сильнодействующий токсин. Этот токсин всасывается и распространяется через лимфатические каналы и кровь в восприимчивые ткани организма.

    • Сотовая локализация

      Секретно

    • Альтернативные названия

      • Антитела к токсоиду Corynebacterium diphtheriae
      • Антитело к дифтерийному токсину
      • токсическое антитело

    Изображения

    • Вестерн-блоттинг — антитело к токсину дифтерии [IGX3492] (ab209329)

      Антитело к дифтерийному токсину [IGX3492] (ab209329) при 1 мкг/мл + белок нативного дифтерийного токсина (мутированный G52E) (ab188505) при 0.1 мкг

      Вторичный
      HRP-конъюгированный козий античеловеческий IgG (H+L) в разведении 1/10000

      Разработан с использованием методики ECL.

      Выполняется в восстановительных условиях.

      Прогнозируемый размер полосы: 58 кДа

      Время экспозиции: 5 секунд

      Этот блот был получен с использованием геля Bistris 4-12% в буферной системе MES. Гель работал при 200 В в течение 35 минут, а затем переносился на нитроцеллюлозную мембрану при 30 В в течение 70 минут.Затем мембрану блокировали в течение часа с использованием 3% молока, а затем инкубировали с ab209329 в течение ночи при 4°C. Связывание антител визуализировали с использованием проявочного раствора ECL ab133406.

    • Антитело к дифтерийному токсину [IGX3492] (ab209329)

    Спецификации и документы

    • скачать паспорт безопасности

      Страна/регионВыберите страну/регион

      ЯзыкВыберите язык

    • Скачать спецификацию

    Ссылки (0)

    ab209329 еще не упоминался конкретно ни в каких публикациях.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.