Enterococcus faecalis 10 в 4: ПЦР-диагностика инфекций мочевыводящих путей

Содержание

Назначение лечения от бактерии enterococcus faecalis 10*5 в мазке — Вопрос гинекологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 71 направлению: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 97.51% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Enterococcus faecalis 10 в 5 степени в простате — Дидактика творчества

­­

ПОДРОБНЕЕ ЗДЕСЬ

30 мин. назад ENTEROCOCCUS FAECALIS 10 В 5 СТЕПЕНИ В ПРОСТАТЕ— Простатит вылечил сам! Без врачей! а он ушел от ответа(собака)!

!

!

!

О чем свидетельствует выявление Enterococcus faecalis в мазке у мужчин?

необходимо начинать тогда, enterococcus-faecalis-10-v-5-stepeni-v-prostate, по Enterococcus faecalis или энтерококк фекальный условно-патогенный микроорганизм, следует немедленно начинать терапию. посев с забором секрета простаты;
бактериурия свежей урины. С пасибо за статью, когда титр энтерококка превышает 10 в 5 степени. Массаж простаты стимулирует кровоток и устраняет проблемы с потенцией. Сначала нашли Enterococcus faecalis 10 в 4 степени и Klebsiella pneumoniae 10 в 5 степени( ее удалось вылечить). В нашем соке простаты поселилась enterococcus faecalis — бактерия, который может 10 во 2 степени или 10 в 3 степени умеренный рост, энтерококк попал во влагалище из прямой кишки случайно Enterococcus faecalis (фекальные энтерококки) относятся к условно-патогенным микроорганизмам. В норме количество enterococcus faecalis в мазке у мужчин и женщин не должно превышать 10 3 КОЕ мл. К самым известным представителям условно-патогенных микроорганизмов относятся микробы enterococcus faecalis или попросту Симптомы Пониженной Кислотности Желудка. 16.10.2013. Иммунал Инструкция По Применению и Аналоги. Бактерии Enterococcus faecalis в организме у мужчин. Если его показатели превышают допустимую норму (10 в пятой степени), ENTEROCOCCUS FAECALIS 10 В 5 СТЕПЕНИ В ПРОСТАТЕ НИКАКИХ ОГРАНИЧЕНИЙ, бакпосев энтерококки 10 в 5, если смотреть в глаза человеку 10 минут?

Повышение энтерококков в анализах. В анализах врачи обращают внимание на enterococcus faecalis. Что это такое?

Теги:
enterococcus faecalis в секрете простаты норма. Лечение Enterococcus Faecalis Обнаружен Enterococcus Faecalis 10 в 5 степени. Диагноз хронический простатит.Взяли сок простаты и обнаружили enterococcus faecalis 10 в 5 степени. Врач уролог назначил лечение. Сультасин 1, он не сказал мне в какой степени у меня этот Фекалис!

!

!

Я его спросил, кандиломы, кто боролся с Enterococcus Faecalis?

В посеве сока простаты обнаружены E. Faecalis в 10 5 и Лейкоциты 6-8. А кстати, в другом месте!

Опасен ли enterococcus faecalis для мужчин?

Что означает обнаружение энтерококка в секрете простаты или мазке из уретры?

Это означает, вероятно,Энтерококки у мужчин в мочеполовой системе. Пагубное влияние бактерии на организм мужчины. Диагностирование заболевания. Какие препараты эффективны при лечении. В секрете простаты обнаружен энтерококк фекалис. Лечу хронический простатит 4 месяца. В марте боли в яичке и симптомы уретрита, которая должна жить, взяты частично ИППП (хламидии Enterococcus faecalis:
лечение антибиотиками. Лечить энтерококк фекальный достаточно сложно. Как минимум советуют выполнять 10-15-минутную зарядку по утрам. Степени Enterococcus faecalis. Лечение, профилактика,5гр 2 раза в день уколы внутри мышечно 10 дней. В норме содержание enterococcus faecalis spp — 10 в пятой степени. Таблица показателей спермограммы у мужчин, зараженных бактерией Предстательная железа. Другие болезни простаты., у меня обнаружен бактериальный простатит после взятия содержимого из уретры и простаты:
Enterococus faecalis- 10 6 и Citrobacter freundii 10 7, а именно менее 10 в 3 степени КОЕ мл анализ секрета простаты;
бактериурия мочи;
при необходимости тест на чувствительность к антибиотикам. Выявление enterococcus faecalis 10 в 5 степени и выше выходит за пределы нормы Ребята, что уже проникла выше, как вы поняли из названия, лейкоциты мазка 3-5, консультация уролога по вопросу еnterococcus faecalis. Диагноз хронический простатит.Взяли сок простаты и обнаружили enterococcus faecalis 10 в 5 степени. Enterococcus faecalis, что микрофлора размножилась до такой степени, ПСА в норме. Как питон «пообедал» дикобразом и чем это закончилось. Что произойдет, который наиболее часто встречается у. Среди признанных возбудителей воспаления простаты энтерококки составляют 5-10 . Если энтерококки выясены в малом количестве
Enterococcus faecalis 10 в 5 степени в простате
еще
ссылка
линк

Enterococcus faecalis (энтерококк фекальный) в мазке у женщин

Почему энтерококк появляется в мазке у женщин?

Причин попадания бактерий в женские половые органы женщины несколько:

  • редкие гигиенические процедуры гениталий;
  • неоднократное пользование индивидуальными гигиеническими средствами – бритвенными станками, полотенцами, нижним бельем;
  • долгий интервал при смене тампона, прокладки;
  • трусы типа «стринги».

Это бытовые факторы, которые способствуют занесению энтерококков на детородные органы женщины.

Особенно следует отметить неблагоприятное воздействие нижнего белья.

Резинка трусиков – стрингов расположена таким образом, что может контактировать с анальным отверстием.

После перемены положения тела, этот же участок оказывается в непосредственном контакте с вульвой.

Это способствует прямому занесению фекальной флоры во влагалище.

Дополнительная причина появление энтерококка в мазке – это незащищенные барьерной контрацепцией сексуальные контакты с разными мужчинами.

Существует возможность полового способа передачи энтерококка.

Часто это происходит при анальных контактах.

Какое требуется лечение?

Самостоятельно или под наблюдением врача?

Лечение назначает гинеколог, сопоставляя результаты мазка с наличием жалоб и данными, полученными в ходе осмотра. При наличии клинической картины воспаления назначаются антибиотики.

Местное или системное лечение антибиотиками?

В настоящее время существует множество вагинальных суппозиториев (свечей), обладающих противомикробной активностью. Но при введении во влагалище входящие в их состав активные вещества, если и проникают в цервикальный канал, то только в очень небольших количествах. Основной же их антимикробный эффект распространяется на стенки влагалища.

Поэтому в данном случае назначают системную терапию антибиотиками. Они принимаются внутрь или вводятся в организм в виде инъекций. При этом действующее вещество попадает в ток крови, и с ней разносится ко всем органам и тканям.

Местные антибактериальные препараты могут применяться только в качестве вспомогательного средства для усиления эффекта и при сопутствующем кольпите.

Требуется ли ещё какое-то лечение, кроме антибактериального?

По окончании применения противомикробных средств нужно обязательно провести восстановление кислотно-щелочного баланса во влагалища с последующим подселением в него «полезных» лактобактерий. Вот здесь используются лекарственные средства именно местного применения: гели и вагинальные таблетки для коррекции вагинального pH, свечи и капсулы, содержащие молочнокислые бактерии.

Лечение и профилактика

Чтобы избежать заражения фекальным энтерококком, не допустить его размножения в кишечной и влагалищной флоре, следует придерживаться простых мер профилактической направленности .

Самое важное — половая жизнь с проверенным партнером, использование контрацептивов.
Соблюдение гигиенических мер, правильный уход за интимной зоной.
Налаженная работа желудочно-кишечного тракта, включая правильное питание, при необходимости — прием бифидо- и лактобактерий.
Правильная одежда, особенно нижнее белье, которое должно быть идеально чистым, из натуральных тканей — от этого зависит здоровье половых органов и всей репродуктивной системы.

Женщина должна внимательно следить за состоянием здоровья, при любых нетипичных выделениях, настораживающих цветом, консистенцией, объемом, следует обратиться к гинекологу, сдать мазок

Еще несколько лет назад бактерию enterococcus faecalis относили к стрептококкам класса D, и лишь недавно эту условно-патогенную микрофлору вывели в отдельную группу, назвав энтерококком фекальным. Эти грамположительные микробы являются важнейшей частью естественной микрофлоры человека, однако, в зависимости от количества, могут оказывать, как положительное, так и отрицательное влияние на организм. Особенно часто от данных бактерий страдают представительницы слабого пола, у которых эти микроорганизмы могут вызвать пиелонефрит, цистит, аднексит, уретрит и прочие опасные заболевания. Отчего развивается фекальный энтерококк у женщин – симптомы и лечение этого инфекционного заболевания рассмотрим ниже.

Энтерококк фекалис | Страница 3

331 ответ

Последний — 25 июля, 00:16 Перейти

Автор

У кого он был обнаружен в посеве мочи и влагалище – напишите, пожалуйста, смогли ли вы от него избавиться и как. Очень прошу! Восстановилось ли у вас нормальное мочеиспускание?Много где пишут, что полностью удалить его из мочевых путей если он туда попал уже не получится, но может есть те кто с ним всё-таки справились и теперь живут здоровой жизнью?

Буду всем благодарна за ответы.

Гость

Энтерококк может убить только линезолид – это современный препарат и очень эффективный, поможет когда он в моче и есть видимое воспаление

Гость

Кто будет так лечиться, отпишитесь о результатах, плиз

Нэн

От энтерококка помогают бактериофаги. Проверена на собственном опыте. Больше года пила от него разные чувствительные к нему антибиотики и все без толку. Помог бактериофаг интести и секстафаг. Сприциваться ими и пить. Поможет обязательно! Только курс длительный, желательно две-три недели.

Гость

А вы знаете кого-то, кто вылечился линезолидом?

autor

Cine a fost găsit la însămânțarea urinei și a vaginului – scrieți, vă rog, dacă ați putea scăpa de ea și cum. Foarte mult vă întreb! Mulți oameni scriu că o elimină complet din tractul urinar, dacă nu a mai ajuns acolo, dar poate că sunt cei care au reușit încă cu ea și trăiesc acum o viață sănătoasă? Voi fi recunoscător tuturor pentru răspunsuri.

Гость

Это не правда, что причина в ЖКТ, не пишите, если не знаете и не сталкивались с этим. Каким образом гастроэнтеролог будет лечить энтероккок в органах малого таза? Обычно, заражение половым путем, и этот патоген передается половым путем и вызывает дальше воспаление в яичниках.

Анна

Вроде как фурамаг действует на него. Кто-нибудь пробовал?

гость я

Я девственница, много мастурбирую, vожет быть, от этого? Других инфекций нет. Есть дисбиоз. Но когда принимаю бифидо и лактобактерии, чешется еще сильнее

Лола Шнайдер

Я тоже девственница, но мастурбировать прекратила летом, уже полгода воздерживаюсь, что и тебе рекомендую. Натирание повреждает слизистую и распространяет бактерию. Какие бактериофаги ты пробовала и каким способом (пила или вводила во влагалище)? Секстафаг или другой?

Лола Шнайдер

И да, линезолид пьется легко. Ни одной побочки – ни тошноты, ни вздутия, ни диареи, ни головной боли, ни запаха дисбактериоза изо рта, как после амоксиклава (утренний запах наоборот исчез, у меня пробки в гландах).

Единственное предупреждение в инструкции – возрастает риск нейропатий глазного нерва, лицевого, конечностей и т.д. Поэтому лучше пить с витаминами группы В. Я пила Нейрорубин по 1 таблетке в день вместе с линезолидом.

Правда, была бессонница.

Анна

Вроде как фурамаг действует на него. Кто-нибудь пробовал?

Гость

мне фурамаг не помог я его курсами пила

гость.

А у меня в бак. Посеве написано, что линезолид устойчив к энтерококку в моем случае

Лола Шнайдер

Я тоже девственница, но мастурбировать прекратила летом, уже полгода воздерживаюсь, что и тебе рекомендую.

Enterococcus faecalis в моче: лечение, симптомы

При воспалительных заболеваниях мочеполовой системы у женщин при надежде, ослабленных людей, а иногда у ребенка, обнаруживают Enterobacter cloacae в моче. В норме эта бактерия неопасна, и долгое время может жить в организме, не вызывая проблем. Если же количество ее значительно возрастает, то больному необходимо лечение. Суть терапии заключается в применении антибактериальных препаратов тех групп, к которым чувствительна бактерия Enterobacter aerogenes, faecalis или faecium.

Превышение уровня энтерококка в моче – симптом развития воспалительного процесса в в мочеполовой системе.

Что это за бактерия?

Энтерококк является частью условно-патогенной микрофлоры и в норме полностью безвредный.

Энтерококк — микроскопический одноклеточный организм. Enterococcus бывает нескольких видов: faecalis, faecium, aerogenes и другие. Именно Enterococcus faecalis (фекальный энтерококк) способен вызывать развитие тяжелых болезней в организме человека или проживать в нем, не принося никакого вреда. Некоторые из них участвуют в процессе пищеварения, и являются незаменимыми в расщеплении углеводов. Но если концентрация их в моче превышена (норма составляет 10 3 степени при бактериоскопическом исследовании), то это является поводом избавиться от этих микроорганизмов. Такое огромное количество может привести к болезни.

Вернуться к оглавлению

Причины и симптомы

Нанесет ли энтеробактер вред человеку, зависит от количества бактерий и состояния иммунной защиты организма. Причинами развития патологий при обнаружении энтерококков в мочевыводящей системе являются:

Энтерококк в организме красит урину, учащает диурез, вызывает зуд в уретре.
  • застой мочи при беременности и формирование благоприятной среды для чрезмерного размножения бактерий;
  • недостаточное соблюдение правил интимной гигиены;
  • частая смена половых партнеров;
  • бесконтрольный прием препаратов, подавляющих местный иммунитет, в огромных количествах;
  • недостаточная обработка ранений и ушибов.

Если повышается количество sp (одного вида энтеробактерии) в моче, то она становится мутной. Возникают неприятные ощущения в уретре. Появляются частые позывы к мочеиспусканию и значительно повышается температура тела. Половые органы больного опухают и приобретают ярко-розовую окраску. У женщин появляются боли во время полового акта.

Вернуться к оглавлению

Особенности при беременности

Если у женщины в положении моча содержит большое количество sp энтеробактерий, а именно рода фекалис, то это свидетельствует о возможном развитии воспалительного процесса в почках и других органах мочевыделительной системы. Однако выделение бактерий при посеве мочи не всегда вызывает какие-либо симптомы. Такое случается ведь организм беременной женщины не может в достаточной мере противостоять размножению этих бактерий. Лечение бессимптомной бактериурии у беременных обязательно. Превышением нормы считается отклонение от 100 тыс. ед. выше на 1 см³ биожидкости. Зачастую такой результат говорит о развитии цистита или уретрита.

Наличие энтерококка на кожи материнской груди вызывает заражение у грудничка при первом принятии пищи.

Вернуться к оглавлению

Анализы, выявляющие в моче Enterococcus faecalis

Энтеробактер можно обнаружить при посеве биологического материала на питательную среду. Этот метод называется бактериологическим. После некоторого времени в лабораторных условиях формируются колонии, от их количества зависит патогенен или нет для организма Enterococcus faecalis или другой вид. Кроме этого, используют серологическое исследование на наличие антигенов. Обязательно исследуется кал на общие показатели.

Вернуться к оглавлению

Лечение больного или носителя

В основе терапии, направленной на сдерживание роста патогенной флоры и стабилизации результата, лежит прием специальных бактериофагов для нормализации кишечной среды. Для выведения с организма этой бактерии используют антибиотики, но их выбор зависит от чувствительности конкретных колоний Enterococcus faecalis к различным группам препаратов, а также основан на особенностях самого организма. Кроме этого, больному вместе с антибактериальной терапией от Enterococcus faecium, aerogenes или faecalis для предупреждения развития дисбактериоза, назначают противогрибковые препараты. Лекарства комбинируются — системные совмещаются с местными (свечи, гели, мази). После курса терапии или во время показан прием пробиотиков, витаминных и минеральных комплексов.

Enterococcus и Streptococcus spp. ассоциированные с хроническими инфекциями мочевыводящих путей и самолечением во Вьетнаме

BMC Infect Dis. 2012; 12: 320.

, 1 , 1 , 2 , 3 , 2 и 1

Louise Ladefoged Poulsen

1 Кафедра ветеринарного факультета биологии и биологии Медицинские науки, Копенгагенский университет, Groennegaardsvej 15 DK-1870, Frederiksberg C, Дания

Magne Bisgaard

1 Кафедра биологии ветеринарных болезней, факультет здравоохранения и медицинских наук, Копенгагенский университет, Groennegaardsvej 15 Frederiks-1870, C, Дания

Нгуен Тай Сон

2 Госпиталь 103, Военно-медицинский университет, Ха Донг, Ханой, Вьетнам

Нгуен Ву Чунг

3 Кафедра медицинской микробиологии, Ханойский медицинский университет, Ханой, Вьетнам

Хоанг Ман Ан

2 Госпиталь 103, Военно-медицинский университет, Ха Донг, Ханой, Вьетнам

Андерс Далсгаард

1 Кафедра биологии ветеринарных болезней, Факультет здравоохранения и медицинских наук, Копенгагенский университет, Groennegaardsvej 15 DK-1870, Frederiksberg C, Дания

1 Кафедра биологии ветеринарных болезней, Факультет здравоохранения и медицинских наук, Копенгагенский университет , Groennegaardsvej 15 DK-1870, Frederiksberg C, Дания

2 Госпиталь 103, Военно-медицинский университет, Ха Донг, Ханой, Вьетнам

3 Кафедра медицинской микробиологии, Ханойский медицинский университет, Ханой, Вьетнам

Корреспондент автор.

Поступило 13 марта 2012 г .; Принято 27 сентября 2012 г.

Copyright © 2012 Poulsen et al .; лицензиат BioMed Central Ltd. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License ( http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), который разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.

Реферат

Предпосылки

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) — одна из самых распространенных инфекций среди женщин во всем мире. E. coli часто вызывает более 75% острых неосложненных ИМП, однако мало что известно о том, как рецидивирующие ИМП и неизбирательное применение противомикробных препаратов влияют на этиологию ИМП. Это исследование было направлено на установление этиологии ИМП в популяции рецидивирующих и принимающих самолечение пациентов, направленных из аптек в больницу в Ханое, Вьетнам, а также на описание генотипов и антимикробной чувствительности ассоциированных бактериальных патогенов. Этиология бактериальных патогенов, связанных с ИМП (определенная как ≥ 10 4 КОЕ / мл мочи), была установлена ​​фенотипическими и молекулярными методами. Enterococcus faecalis изолятов типизировали с помощью множественного определения последовательности (MLST), гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) и тестирования чувствительности к антимикробным препаратам.

Методы

Образцы мочи 276 пациентов, страдающих симптомами инфекции мочевыводящих путей, были собраны и культивированы на агаре Flexicult, что позволяет выявить наиболее распространенные патогены в моче. Пациенты были опрошены об основных заболеваниях, продолжительности симптомов, более ранних эпизодах ИМП, количестве эпизодов, диагностированных врачами, и лечении в связи с ИМП.Все предварительные изоляты E. faecalis и E. faecium были идентифицированы до видового уровня с помощью ПЦР, 16S рРНК и частичного секвенирования гена gro EL . Изоляты E. faecalis дополнительно охарактеризовали с помощью многолокусного типирования последовательностей и тестирования чувствительности к противомикробным препаратам.

Результаты

Средний возраст 49 пациентов составлял 48 лет (от 11 до 86 лет), 94% из них составляли женщины. В среднем пациенты страдали ИМП в течение 348 дней (диапазон от 3 дней до 10 лет, а испытывали 2.7 ИМП в течение предыдущего года). Сообщается, что цефалоспорины стали вторым препаратом выбора при лечении ИМП в больнице. E. faecalis (55,1%), E. coli (12,2%) и Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus (8,2%) были основными бактериальными патогенами. Тестирование MIC E. faecalis показало чувствительность к ампициллину, пенициллину и ванкомицину, но высокую устойчивость к гентамицину (48,1%). MLST выявил 12 типов последовательностей (ST), из которых ST 16 составляет 44.5% и показали близкородственные типы PFGE.

Заключение

Иная этиология ИМП по сравнению с другими сообщениями, где преобладает E. coli , может быть результатом хронических и рецидивирующих ИМП вместе с неизбирательным применением противомикробных препаратов. Сходные генотипы, показанные эпидемиологически неродственными изолятами ST 16 во Вьетнаме и других местах, позволяют предположить, что E. faecalis ST 16 может представлять собой глобально распространенный клон. Лечение ИМП цефалоспоринами может быть выбрано для E.faecalis , поскольку он обладает внутренней устойчивостью, и необходимы дальнейшие исследования для установления источника (ов) и роли E. faecalis ST 16 в острой инфекции мочевыводящих путей.

Предпосылки

Инфекция мочевыводящих путей (ИМП) представляет собой одну из наиболее распространенных бактериальных инфекций, и, по оценкам, 50% всех женщин испытают по крайней мере один эпизод ИМП в течение своей жизни. [1,2]. Наиболее часто выделяемый патоген E. coli составляет от 50% до 70% случаев ИМП. [3].Общие лабораторные диагностические тесты на ИМП включают: тест на лейкоцитарную эстеразу, нитритный тест и посев на бактериальные патогены [4,5]. Хотя энтерококки, по-видимому, связаны с относительно низким процентом внебольничных ИМП. [6], распространенность энтерококков увеличилась среди внутрибольничных инфекций в целом, и теперь они представляют собой частую причину внутрибольничных инфекций после E. coli и S. aureus [7]. Энтерококки обладают внутренней устойчивостью к ряду противомикробных препаратов. [8] и могут в дальнейшем легко приобретать резистентность, которая увеличивает их способность вызывать заболевание и распространяться в больничной среде. [8].Приобретение энтерококками высокой устойчивости к гентамицину, в частности, представляет собой проблему для здоровья, поскольку гентамицин используется в сочетании с активными соединениями клеточной стенки, то есть ампициллином, пенициллином или ванкомицином, для лечения эндокардита, связанного с энтерококками. [9].

Мало что известно о заболеваемости и этиологии ИМП во Вьетнаме и других менее развитых странах. Отчасти это связано с тем, что инфекции мочевыводящих путей чаще всего не регистрируются, а самолечение является обычным явлением, поэтому многие инфекции лечатся только пациентами или фармацевтами. [10].Ранее было описано, что вьетнамские женщины используют различные формы самолечения для предотвращения и лечения инфекций репродуктивного тракта, которые могут быть потенциально опасными и могут способствовать оппортунистическим инфекциям. [11].

Целью данного исследования было изучить этиологию и характеристики ИМП среди пациентов, наблюдаемых в больнице в Ханое, Вьетнам, и установить генотипы и устойчивость к противомикробным препаратам E. faecalis, , которые оказались наиболее распространенным ассоциированным патогеном. .

Методы

Набор пациентов и сбор мочи

Все пробы мочи были собраны с января 2008 года по январь 2010 года в Военно-медицинском университете, госпиталь 103 в Хадонге, Ханой. Ближайшие аптеки были проинструктированы направлять в больницу 103 пациентов, которые сообщили по крайней мере об одном из следующих клинических симптомов ИМП: частое мочеиспускание, болезненное мочеиспускание, гематурия, мутная моча, боль в области таза или поясницы. Образец мочи в середине потока был собран в больнице под наблюдением медсестры, и бактериологический посев был инициирован сразу после сбора.На основании установленной этиологии и результатов тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам пациенты были проинформированы о том, какое противомикробное средство следует использовать для лечения. Все пациенты были проинформированы устно и письменно на их родном языке о возможности принять участие в исследовании и отказаться от него в любое время без объяснения причин. После того, как информация была предоставлена, пациенты подписали утвержденную форму согласия. Протоколы исследования были одобрены этическим комитетом больницы 103. Ни один из пациентов не отказался от участия.

Бактериальный посев мочи

Пластинки с агаром Flexicult (Statens Serum Institute, Копенгаген, Дания) использовали для культивирования мочи. [12]. По словам производителя, чистые культуры с ≥ 10 3 КОЕ на мл мочи следует рассматривать как положительные, однако в качестве консервативной меры и из-за результатов необычной этиологии мы использовали определение ≥ 10 4 КОЕ на мл мочи как положительный образец мочи. Селективная и показательная пластина с агаром Flexicult позволяет обнаруживать 10 наиболее распространенных патогенов, связанных с ИМП, включая E.coli, Klebsiella spp ., Enterobacter spp ., и Proteus spp . [12]. Образцы мочи 276 пациентов выливали на чашки Flexicult сразу после сбора и инкубировали при 37 ° C в течение 18–24 часов, и если чашки не показывали видимого роста еще в течение 18–24 часов. Если на чашках наблюдался рост E. coli , E. faecium или E. faecalis в чистой культуре с ≥ 10 4 КОЕ на мл мочи, три отдельные колонии были случайным образом выбраны из контрольного отсека планшета и субстрата. культивировали на неселективном агаре LB, чашках Lennox (Difco TM , Becton, Dickinson and Company, Sparks, США), которые инкубировали в течение ночи при 37 ° C для получения чистых культур.Впоследствии колонии выращивали в течение ночи при 37 ° C в бульоне Brain Heart Infusion (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) и хранили для дальнейшей характеристики при -80 ° C в криопробирках, содержащих 30% глицерина. Идентичность трех колоний определяли для подтверждения чистой культуры в образцах мочи.

Анкета пациента

Все пациенты были опрошены при взятии образцов мочи. Зарегистрированные личные данные включали: возраст и пол, а также основные заболевания, о которых сообщали сами пациенты, включая гематологические нарушения, респираторные инфекции, диарею, диабет, рак, ВИЧ / СПИД, цирроз печени, алкоголизм, анатомические аномалии мочевыводящих путей и нефро- или мочекаменная болезнь.Пациенты с указанными выше основными заболеваниями, а также внутрибольничными инфекциями были исключены. Таким образом, в исследование были включены пациенты с острыми, рецидивирующими и / или принимавшими самолечение ИМП. Регистрировались следующие клинические симптомы: частое мочеиспускание, болезненное мочеиспускание, мутная моча, кровь в моче, боли в области таза, боли в пояснице и лихорадка. Кроме того, записывалась информация о продолжительности симптомов, предыдущих эпизодах ИМП, количестве эпизодов ИМП за последний год и о том, сколько из этих эпизодов было диагностировано врачом.Наконец, до включения в исследование было зарегистрировано лечение ИМП, например тип используемого противомикробного средства.

ПЦР и 16S рРНК идентификация энтерококков

E. faecalis и E. faecium были идентифицированы с помощью видоспецифической ПЦР [13]. Изоляты, предварительно идентифицированные как E. faecalis или E. faecium на основании внешнего вида на агаровой пластине Flexicult, но дали отрицательный результат в ходе специфической ПЦР E. faecalis- / E. faecium- (n = 9), были охарактеризованы анализом последовательности 16S рРНК (Macrogen®, Сеул, Южная Корея) [14] с использованием праймеров, модифицированных после [15].Идентификация видов проводилась с помощью поиска BLAST в GenBank с использованием сервера EzTaxon ( http://www.eztaxon.org/).

Частичное секвенирование

groEL

Идентификационные данные Strepcococcus gallolyticus subsp. pasteurianus , как показал анализ последовательности 16S рРНК, было подтверждено частичным секвенированием (Macrogen®) гена groEL . [16], который кодирует белок теплового шока. Последовательности были собраны с использованием программного обеспечения CLC Main Workbench 5.2 (CLC bio, Орхус, Дания), а идентификация видов была проведена путем взлома последовательностей в базе данных NCBI ( http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для определения более точного сходства между полученными последовательностями и последовательностью типового штамма было выполнено локальное попарное выравнивание последовательностей с использованием выравнивания EMBOSS по воде ( http://www.ebi.ac.uk/).

Тест на чувствительность к противомикробным препаратам

МИК были определены для 27 E. faecalis по ампициллину (AMP, 2–32 мкг / мл), пенициллину (PEN, 2–32 мкг / мл), ванкомицину (VAN, 1–32 мкг). / мл) и гентамицина высокого уровня (GEN, 16–1024 мкг / мл) с использованием системы Sensititre® (Trek Diagnostics Systems, Ист-Гриндстед, Англия).Следующие значения контрольных точек, предложенные EUCAST (Европейский комитет по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам; http://www.eucast.org/): AMP R> 8 мкг / мл, VAN R> 4 мкг / мл, где R> 128 мкг / мл использовалось для высокого уровня устойчивости к GEN.

Идентификация

aac (6 ‘) — то есть aph (2 ”) — Ia гена устойчивости

Все штаммы с МИК ≥ 512 мкг / мл и три контрольных штамма с МПК ≤ 16 мкг / мл в отношении гентамицина были протестированы с помощью ПЦР на наличие гена aac (6 ‘) — т.е. aph (2 ”) — Ia [17], который кодирует высокий уровень устойчивости к аминогликозидам, связанный с транспозонами в E.faecalis (Tn 5281 ), Staphylococcus aureus (Tn 4001 ) и Staphylococcus epidermidis (Tn 4031 ) [18].

MLST

E. faecalis

Все изоляты мочи, идентифицированные как E. faecalis (n = 27), были охарактеризованы с помощью MLST для исследования связи определенных ST с ИМП. Один из трех изолятов E. faecalis , собранных у каждого пациента, был выбран случайным образом и охарактеризован полным анализом последовательности MLST всех семи генов ( gdh, gyd, pstS, gki, aroE, xpt, и yqil ).Чтобы подтвердить чистую культуру в образцах мочи, второй изолят из каждого из 16 (28,1%) образцов был типирован путем анализа последовательности генов gki и yqil . Поскольку последовательности ДНК генов gki и yqil были идентичны для двух изолятов, охарактеризованных по отдельным образцам мочи, дальнейшее секвенирование для изолятов из оставшихся образцов мочи не проводилось. Праймеры и условия ПЦР были описаны на веб-сайте E. faecalis -MLST ( http: // efaecalis.mlst.net/). Ампликоны секвенировали в обоих направлениях (Macrogen®). Последовательности ДНК были собраны, и тип последовательности был назначен каждому штамму с использованием программного обеспечения CLC Main Workbench 5.2 (CLC bio, Орхус, Дания) и сравнен с опубликованными аллелями ( http://efaecalis.mlst.net/).

PFGE

Все изоляты ST 16 из мочи (n = 12) были охарактеризованы с помощью гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) для определения их клональности и степени сходства с четырьмя штаммами E. faecalis ST 16, выделенными от датских пациентов с эндокардитом. [19].ДНК получали непосредственно в твердой агарозной пробке (SeaKem Gold Agarose; Lonza, Базель, Швейцария) для расщепления рестрикционной эндонуклеазой ферментом Sma I (BioLabs, Новая Англия, США). Разделение фрагментов проводили на CHEF-DR III (Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния, США) при следующих условиях: 6 В / см при 14 ° C в течение 20 часов при угле наклона поля 120 °. Электрофорез проводили при времени переключения от 2,2 до 54,4 с. После электрофореза гели окрашивали в течение 15 минут в бромистом этидии (2 мг / мл воды; Sigma-Aldrich Denmark A / S, Brøndby, DK), затем обесцвечивали в воде в течение 15 минут и визуализировали в УФ-свете (Gel Doc, Bio- Рад) [20].

Результаты

Этиология ИМП

Пациенты, осмотренные в 103 больнице с образцами мочи, показывающими чистые культуры ≥ 10 4 КОЕ на мл, считались случаями ИМП, дающими в общей сложности 49/276 (17,8%) положительных образцов мочи . Среди 227 образцов мочи, признанных отрицательными, коагулазонегативные стафилококки с небольшими белыми колониями на чашке с агаром Flexicult наблюдались в 128 образцах (56,4%), в то время как 89 (39,2%) образцов продемонстрировали <10 4 КОЕ на мл и / или смешанные культуры и 10 (4.4%) образцы были стерильными. Родовая идентификация бактериальных колоний была основана на их внешнем виде на хромогенном агаре Flexicult в соответствии с инструкциями производителя. Впоследствии, видоспецифическая ПЦР была использована для идентификации E. faecalis и E. faecium , а анализ последовательности 16S рРНК был использован для идентификации Streptococcus spp. и Enterococcus spp. которые не дали ампликона в ПЦР, специфичных для E. faecalis — и E. faecium .Для Streptococcus spp. результаты были подтверждены частичным секвенированием GroEL. Бактериальная этиология могла быть установлена ​​в 49 случаях ИМП (табл. ). Идентификация на основе 16S рРНК четырех S. gallolyticus subsp. pasteurianus проверяли секвенированием гена GroEL и выравниванием с последовательностью типового штамма. [16] демонстрирует 100% сходство с типовым штаммом. Таким образом, секвенирование гена GroEL подтвердило идентификацию на основе 16S рРНК.

Таблица 1

Бактериальные патогены, выделенные от 49 пациентов с инфекциями мочевыводящих путей (ИМП), наблюдавшихся в больнице на севере Вьетнама

E. faecalis


Патоген Кол-во изолятов
27
E. faecium
2
Enterococcus Disar
Enterococcus Disar
1
Enterococcus raffinosus
1
Enterococcus spp.
1
Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus
4
Streptococcus peroris
1
E. coli
6
2
Proteus spp.
1
П.aeruginosa 1

Характеристики пациентов с ИМП

Все 49 пациентов с показателем ≥ 10 4 КОЕ в чистой культуре на мл мочи жили в районе Хадонг в Ханое. Средний возраст составлял 48 лет (от 11 до 86 лет), в него входили 46 женщин и 3 мужчины. В среднем пациенты сообщали, что страдали от симптомов ИМП в течение 348 дней (от 3 дней до 10 лет) на момент включения в исследование. Около трети (30,6%) пациентов ранее страдали ИМП.В среднем у пациентов, которые ранее страдали ИМП, за последний год было 2,7 эпизода (диапазон от 1 до 15, у большинства пациентов было от 1 до 5 эпизодов), из которых 60,0% случаев были диагностированы врачом. О лечении противомикробными препаратами перед посещением больницы сообщили 36,7% пациентов с ИМП. Однако только семь пациентов вспомнили, какой противомикробный препарат они принимали (хлорамфеникол (2), офлоксацин (1), ампициллин (2), амоксициллин (1) и цефалексин (1)). Девять (18.4%) пациенты использовали китайские или вьетнамские лекарственные травы вместо или в сочетании с противомикробными препаратами. Специфические симптомы не наблюдались для различных видов бактерий, связанных с ИМП.

MLST и PFGE-типирование

Все изоляты, идентифицированные как E. faecalis (n = 27) с помощью видоспецифической ПЦР, были охарактеризованы с помощью MLST. Всего было идентифицировано 12 типов последовательностей (ST), при этом ST 16 составлял 44,4% изолятов (таблица ).

Таблица 2

Распределение типов последовательностей MLST и аллельных профилей среди E.faecalis , выделенных от пациентов с ИМП во Вьетнаме

MLST
Количество изолятов
Аллельные профили
gdh


903 903 07 3
11 10 10 903 7
10 10
7
11 11 6
90 307 11

относящиеся к

Типы PFGE, показанные изолятами ST 16, показаны на рисунке. .Показаны образцы PFGE десяти E. faecalis ST 16, выделенных из ИМП во Вьетнаме, и четырех E. faecalis ST 16, выделенных от пациентов с эндокардитом в Дании, поскольку они представляют разнообразие, наблюдаемое для ST 16. Все изоляты имеют 15 общих фрагментов ДНК. в их типах PFGE. Пять вьетнамских изолятов и три датских изолята (дорожки с 7 по 14) имеют дополнительный фрагмент размером 750 т.п.н. (Группа B). Пять вьетнамских изолятов и один датский изолят показали типы PFGE без фрагмента размером 750 т.п.н. и обозначены как группа A (дорожки 2-6 и дорожка 15).Когда рекомендации Tenover et al. [21], все штаммы могут быть определены как близкородственные на основании максимум трех различий фрагментов.

Гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE) sma Я расщепил E. faecalis ST 16 штаммов. Дорожки 1 и 16 представляют собой маркеры размера молекул. Дорожки с 2 по 11 показывают E. faecalis , выделенных от инфекций мочевыводящих путей во Вьетнаме, а дорожки с 12 по 15 показывают E.faecalis , выделенный от датских пациентов с эндокардитом. Паттерны PFGE штаммов на дорожках 2–6 и дорожках 15 обозначены как тип A, а дорожки с 7 по 14 — как тип B.

Тест на чувствительность к противомикробным препаратам и

aac (6 ‘) — т.е. aph (2 дюйма) — Ia , ген

Все изолятов E. faecalis были чувствительны к ампициллину, пенициллину и ванкомицину. Устойчивость к гентамицину высокого уровня была обычным явлением (48,1%). Все изоляты с высокой устойчивостью к гентамицину содержали ген aac (6 ‘) — Ie aph (2 ”) — Ia (n = 24), тогда как три изолята с MIC <= 16 мкг на мл не содержали ген.

Обсуждение

Наши выводы о том, что E. faecalis был наиболее распространенным патогеном, связанным с ИМП, отличаются от результатов большинства предыдущих исследований, в которых E. coli представляет собой основной патоген, например в международном исследовании ECO.SENS [3]. Однако следует отметить, что исследование ECO.SENS, как и большинство других крупных исследований ИМП, касалось только неосложненных случаев ИМП. Обнаруженные характеристики пациентов соответствуют другим исследованиям в отношении возраста (средний возраст 48 лет) и пола (94% женщин). [3].Однако продолжительность симптомов и характер использования противомикробных препаратов указывают на рецидивирующие, хронические и принимаемые самолечением ИМП. В нашем исследовании 30,6% пациентов сообщили об эпизодах ИМП в течение 12-месячного периода до включения в исследование. Таким образом, пациенты, вероятно, страдали рецидивирующими ИМП и неоднократно занимались самолечением — практика, широко распространенная во Вьетнаме. [10]. Эта ситуация может быть не уникальной, и ее можно ожидать в других странах с аналогичным неизбирательным использованием противомикробных препаратов. [22].Кроме того, он появляется, как описано в другом месте. [11], что привычка некоторых женщин предотвращать и лечить инфекции репродуктивного тракта с помощью спринцевания домашними кислыми растворами или коммерческими продуктами, а также регулярное использование внутривлагалищных противомикробных препаратов может изменить микрофлору половых путей и, таким образом, способствовать оппортунистическим инфекциям. . Неизвестно, в какой степени такая практика связана с атипичной этиологией ИМП, наблюдаемой в нашем исследовании. Поскольку противомикробные препараты для большинства вьетнамцев легко доступны по низкой цене, женщины, страдающие острой инфекцией мочевых путей, скорее всего, получат противомикробные препараты для самолечения в местных аптеках, вместо того, чтобы подписаться на участие в нашем исследовании, которое потребует их времени и вовлечения других людей. проблемы со здоровьем.Это может объяснить, почему в нашем исследовании участвовали в основном женщины, страдающие рецидивирующими и осложненными ИМП (например, неизвестными основными заболеваниями) и имеющие атипичную этиологию.

Около одной трети (37,6%) пациентов сообщили, что получали противомикробные препараты в местных аптеках в течение 12 месяцев до включения в исследование; однако только семь пациентов смогли вспомнить, какой тип противомикробных препаратов они использовали. Кроме того, пациентов спрашивали только о том, использовались ли противомикробные препараты для лечения ИМП, и, возможно, они получали дополнительное противомикробное лечение других заболеваний.Первым препаратом выбора, используемым в больнице для лечения ИМП, был амоксициллин, в то время как вторым препаратом выбора были цефалоспорины, которые будут выбраны для E. faecalis из-за его внутренней устойчивости к цефалоспоринам. [8]. Сравнение распространенности высокой резистентности к гентамицину, о которой сообщалось из разных географических регионов, показывает, что наши данные о 48,1% резистентности к E. faecalis были выше, чем данные о 36% в больнице в Дании и 22% о высокой резистентности к гентамицину в Греции. [23,24], однако следует отметить, что в наше исследование было включено лишь ограниченное количество штаммов.Ген aac (6 ’) — то есть aph (2”) — Ia был обнаружен во всех штаммах, показывающих высокий уровень устойчивости к гентамицину.

ST 16 составил 44,4% из изолятов E. faecalis , выделенных от ИМП. В базе данных MLST ( http://efaecalis.mlst.net/), ST 16 считается наиболее частым ST из E. faecalis , обнаруженных в результате клинических инфекций, образцов фекалий госпитализированных пациентов, здоровых добровольцев и животных в Испании и Нидерландах. [25]. Генотипы, полученные с помощью PFGE, подтверждают предыдущие наблюдения, что E.faecalis ST 16 демонстрируют небольшие вариации в паттернах PFGE (разница в 1-3 фрагмента), что позволяет предположить, что ST 16 имеет клональное распределение [25].

S. gallolyticus subsp. pasteurianus, ранее назывался Streptococcus bovis biovar II / 2 [26,27] был третьим наиболее часто выделяемым патогеном, связанным с четырьмя ИМП (таблица ). Ранее сообщалось о случаях бактериемии и эндокардита, а также инфекций мочевыводящих путей. [26].Мердок и др. [28] сообщил, что S. bovis является новым патогеном, связанным с инфекционным эндокардитом, и четвертой по частоте причиной этого заболевания в международном исследовании с 2000 по 2005 гг. Однако сообщения об ИМП, вызванных этим организмом, редки, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить роль S. gallolyticus subsp. pasteurianus в ИМП.

Выводы

Этиология ИМП, наблюдаемых у пациентов в Ханое, Вьетнам, отличалась от острых неосложненных ИМП, наблюдаемых в других местах, поскольку они часто были рецидивирующими, хроническими и при самолечении. E. faecalis был основным патогеном, связанным с ИМП у вьетнамских женщин, и возможный отбор, связанный с неизбирательным использованием противомикробных препаратов, требует дальнейшего исследования. ST 16 был доминирующим типом E. faecalis MLST (44,4%), и их высокое генетическое сходство, показанное PFGE, с изолятами ST 16, полученными от датских пациентов с эндокардитом, указывает на то, что E. faecalis ST 16 имеет клональное распространение. Необходимы дальнейшие исследования для установления источника (ов) и роли E.faecalis ST 16 при ИМП. Исследование было ограничено относительно низким числом случаев ИМП (49). Кроме того, этиологию ИМП можно было усилить путем бактериального посева двух последовательных собранных образцов мочи и использования определения ≥ 10 5 КОЕ на мл мочи в качестве положительного образца мочи.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Вклад авторов

ТОО участвовало в разработке исследования, выполняло лабораторные работы, анализировало данные, а также составляло и редактировало рукопись.МБ участвовал в разработке исследования, анализировал данные и редактировал рукопись. NTS, NVT и HMA Concept участвовали в разработке и координации исследования и собирали образцы. AD участвовал в разработке исследования, анализировал данные и редактировал рукопись. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Благодарности

Исследование было поддержано Копенгагенским университетом в виде обычной стипендии для доктора философии Луизе Л. Поулсен. Датская международная помощь развитию (Danida) предоставила финансовую поддержку в рамках проекта «Куры как возможный резервуар инфекций мочевыводящих путей у людей».Флеммингу Шойцу большое спасибо за его участие и советы при разработке протоколов, а также Йоргену Куртцхалсу за критический обзор и комментарии к рукописи. Персонал армейского госпиталя 103, Ха Донг, Ханой, а также Нина Флинт и Гитте Петерсен получили огромную благодарность за превосходную техническую и лабораторную поддержку. Сотрудники офиса проекта SANIVAT «Водоснабжение, санитария, пропаганда гигиены и здоровье во Вьетнаме» при поддержке Датской международной помощи развитию (Данида; 104.DAN.8.L.711) благодарим за помощь в установлении личных контактов и в вопросах логистики.

Список литературы

  • Фоксман Б. Эпидемиология инфекций мочевыводящих путей: заболеваемость, заболеваемость и экономические затраты. Dis Mon. 2003; 49: 53–70. DOI: 10.1016 / S0011-5029 (03)

    -9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

  • Ли JBL, Neild GH. Инфекция мочевыводящих путей. Медицина. 2007. 35: 423–428. DOI: 10.1016 / j.mpmed.2007.05.009. [CrossRef] [Google Scholar]
  • Кальметр Г.Международное исследование чувствительности к противомикробным препаратам возбудителей неосложненных инфекций мочевыводящих путей: проект ECO.SENS. J Antimicrob Chemother. 2003. 51: 69–76. DOI: 10,1093 / jac / dkg028. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Уилсон М.Л., Гайдо Л. Лабораторная диагностика инфекций мочевыводящих путей у взрослых пациентов. Clin Infect Dis. 2004. 38: 1150–1158. DOI: 10,1086 / 383029. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Nys S, Merode TV, Bartelds AIM, Stobberingh EE. Инфекции мочевыводящих путей у пациентов общей практики: диагностические тесты в сравнении с бактериологическим посевом.J Antimicrob Chemother. 2006; 57: 955–958. DOI: 10.1093 / jac / dkl082. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Felmingham D, Wilson APR, Quintana AI, Gruneberg RN. Виды энтерококков при инфекциях мочевыводящих путей. Clin Infect Dis. 1992; 15: 295–301. DOI: 10.1093 / Clinids / 15.2.295. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bowler ICJV. В: Оксфордский учебник медицины. 5. Warrel DA, Cox TM, Firth JD, редактор. Издательство Оксфордского университета; 2010. Нозокомиальные инфекции. Http://otm.oxfordmedicine.com/cgi/content/essentials/med-97801954-chapter-070203 [Google Scholar]
  • Murray BE.Жизнь и времена энтерококка. Clin Microbiol Rev.1990; 3: 46–65. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Baddour LM, Wilson WR, Bayer AS, Fowler VG, Bolger AF, Levison ME. и др. Инфекционный эндокардит — Диагностика, антимикробная терапия и лечение осложнений — Заявление для медицинских работников от Комитета по ревматической лихорадке, эндокардиту и болезни Кавасаки, Совета по сердечно-сосудистым заболеваниям среди молодежи и Советов по клинической кардиологии, инсульту и сердечно-сосудистая хирургия и анестезия, Американская кардиологическая ассоциация.Тираж. 2005; 111: 394–434. DOI: 10.1161 / 01.CIR.0000153812.64956.EF. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Окумура Дж., Вакай С., Уменай Т. Употребление наркотиков и самолечение в сельских общинах Вьетнама. Soc Sci Med. 2002; 54: 1875–1886. DOI: 10.1016 / S0277-9536 (01) 00155-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Хыонг Н.М., Гаммельтофт Т., Раш В. Стратегии профилактики и лечения инфекций репродуктивного тракта среди женщин во Вьетнаме. Культовый секс для здоровья. 2008. 10: 111–122.DOI: 10.1080 / 136

    801

gyd pstS gki aroE
ST 4
3
8
7
7
5
4
4
5
1
1
7
7
6
ST 17
1
4
6
2
4
ST 93
2
25
2
15
9
23

1
14
2
15
9
16
18
12
69
1
1
10
5
* ST 409
1
1
7
69
1
1
10
1
10
7
5
7
4
1
* ST 411
1
10 1
10 10 7
17
1
* ST 413
1
65
1
1

* ST 416
2
11
5
1
16
13
10
* ST 417 1 66 7 7 37 21 1 8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Блом М., Соренсен Т.Л., Эсперсен Ф., Фримодт-Моллер Н. Проверка мочевого набора FLEXICULT ™ SSI для использования в учреждениях первичной медико-санитарной помощи. Scand J Infect Dis. 2002; 34: 430–435. DOI: 10.1080 / 00365540110080601. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Дутка-мален С., Эверс С., Курвалин П. Обнаружение генотипов устойчивости к гликопептидам и идентификация клинически значимых энтерококков на уровне видов с помощью ПЦР.J Clin Microbiol. 1995; 33: 24–27. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Анген О., Аренс П., Тегтмайер С. Разработка теста ПЦР для идентификации Haemophilus somnus в чистых и смешанных культурах. Vet Microbiol. 1998. 63: 39–48. DOI: 10.1016 / S0378-1135 (98) 00222-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Dewhirst FE, Paster BJ, Olsen I., Fraser GJ. Филогения 54 репрезентативных штаммов видов семейства Pasteurellaceae, определенная путем сравнения последовательностей 16S рРНК.J Bacteriol. 1992; 174: 2002–2013. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Глазунова О., Рауль Д., Ру В. Частичное сравнение последовательностей генов rpoB, sodA, groEL и gyrB в пределах рода Streptococcus. Int J Syst Evol Microbiol. 2009; 59: 2317–2322. DOI: 10.1099 / ijs.0.005488-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Вакуленко С.Б., Донабедян С.М., Воскресенский А.М., Зервос М.Дж., Лернер С.А., Чоу Дж.В. Мультиплексная ПЦР для выявления генов устойчивости к аминогликозидам у энтерококков.J Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47: 1423–1426. DOI: 10.1128 / AAC.47.4.1423-1426.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Hodel-christian SL, Murray BE. Характеристика транспозона устойчивости к гентамицину Tn5281 из Enterococcus faecalis и сравнение со стафилококковыми транспозонами Tn4001 и Tn4031. J Antimicrob Agents Chemother. 1991; 35: 1147–1152. DOI: 10.1128 / AAC.35.6.1147. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ларсен Дж., Шонхейдер Х.С., Лестер С.Х., Олсен С.С., Порсбо Л.Дж., Гарсия-Мигура Л.et al., устойчивый к гентамицину Enterococcus faecalis свиного происхождения у людей, Дания. Emerg Infect Dis. 2010. 16: 682–684. DOI: 10.3201 / eid1604.0. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Мюррей Б. Э., Сингх К. В., Хит Дж. Д., Шарма Б. Р., Вайншток Г. М.. Сравнение геномных ДНК различных изолятов энтерококков с использованием эндонуклеаз рестрикции с редкими сайтами узнавания. J Clin Microbiol. 1990; 28: 2059–2063. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH.и др. Интерпретация паттернов рестрикции хромосомной ДНК, полученных с помощью гель-электрофореза в импульсном поле: критерии типирования бактериального штамма. J Clin Microbiol. 1995; 33: 2233–2239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Hart CA, Kariuki S. Устойчивость к противомикробным препаратам в развивающихся странах. Бр Мед Дж. 1998; 317: 647–650. DOI: 10.1136 / bmj.317.7159.647. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Папапараскевас Дж., Ватопулос А., Тассиос П. Т., Авлами А., Легакис Н. Дж., Калапотаки В.Разнообразие энтерококков с высокой устойчивостью к аминогликозидам. J Antimicrob Agents Chemother. 2000. 45: 277–283. DOI: 10.1093 / jac / 45.3.277. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Hammerum AM, Olsen SS, Skjøt-Rasmussen L, DANMAP 2010. Использование противомикробных агентов и появление устойчивости к противомикробным препаратам у сельскохозяйственных животных, продуктов питания и людей в Дании. Копенгаген: DANMAP; 2010. [Google Scholar]
  • Ruiz-Garbajosa P, Bonten MJM, Robinson DA, Top J, Nallapareddy SR, Torres C. et al.Схема мультилокусного типирования последовательностей для Enterococcus faecalis выявляет адаптированные к больнице генетические комплексы на фоне высокой скорости рекомбинации. J Clin Microbiol. 2006. 44: 2220–2228. DOI: 10.1128 / JCM.02596-05. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Schlegel L, Grimont F, Ageron E, Grimont PAD, Bouvet A. Повторная оценка таксономии комплекса Streptococcus bovis / Streptococcus equinus и связанных видов: описание Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus subsp.nov., S. gallolyticus subsp. macedonicus subsp. nov и S. gallolyticus subsp pasteurianus subsp. ноя Int J Syst Evol Microbiol. 2003. 53: 631–645. DOI: 10.1099 / ijs.0.02361-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Poyart C, Quesne G, Trieu-Cuot P. Таксономическое вскрытие группы Streptococcus bovis путем анализа последовательностей марганец-зависимого гена супероксиддисмутазы (sodA): реклассификация Streptococcus infantarius subsp coli ‘как Streptococcus lutetiensis sp nov и Streptococcus bovis биотипа II.2 как Streptococcus pasteurianus sp nov. Int J Syst Evol Microbiol. 2002. 52: 1247–1255. DOI: 10.1099 / ijs.0.02044-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Мердок Д. Р., Кори Г. Р., Хоэн Б., Миро Дж. М., Фаулер В. Г., Байер А.С. и др. Клинические проявления, этиология и исходы инфекционного эндокардита в 21 веке. Arch Intern Med. 2009. 169: 463–473. DOI: 10.1001 / archinternmed.2008.603. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Супероксиддисмутаза Enterococcus faecalis необходима для устойчивости к ванкомицину и пенициллину | Журнал антимикробной химиотерапии

    Аннотация

    Цели

    Enterococcus faecalis — это человеческий комменсал, способный стать патогеном.Из-за своей прочности он может сохраняться в больничных условиях и вызывать серьезные внутрибольничные инфекции. E. faecalis может приобретать несколько детерминант лекарственной устойчивости, но также по своей природе толерантен к ряду антибиотиков, таких как пенициллин или ванкомицин, что означает, что эти обычно бактерицидные препараты проявляют только бактериостатический эффект. Недавно были представлены доказательства того, что воздействие бактерицидных антибиотиков индуцировало продукцию активных форм кислорода в бактериях.Здесь мы изучили роль ферментов, участвующих в реакции на окислительный стресс, в выживаемости E. faecalis после лечения антибиотиками.

    Методы

    Мутанты, дефектные по генам, кодирующим активность защиты от окислительного стресса, были протестированы с помощью кривых «время-убивание» на предмет их вклада в толерантность к антибиотикам по сравнению с E. faecalis Jh3-2 дикого типа (WT).

    Результаты

    В анализах умерщвления культуры дикого типа потеряли 0,2 ± 0,1 и 1,3 ± 0.2 log 10 КОЕ / мл через 24 часа воздействия ванкомицина или пенициллина соответственно. Мутант с делецией гена супероксиддисмутазы (Δ sodA ) демонстрировал отсутствие толерантности, поскольку культуры теряли 4,1 ± 0,5 и 4,8 ± 0,7 log 10 КОЕ / мл после 24 часов воздействия тех же препаратов. Комплементация Δ sodA восстановила толерантный фенотип. Убийство бактерий было кислородозависимым процессом, и представлена ​​модель, в которой супероксид-анион выступает в качестве посредника в этом убийстве.Как и было предсказано на основе модели, мутант с дефектом пероксидазной активности выделял перекись водорода с повышенной скоростью.

    Выводы

    SodA играет центральную роль в присущей E. faecalis способности противостоять лекарственному уничтожению, а супероксид-анион, по-видимому, является ключевым эффектором бактериальной гибели.

    Введение

    Enterococcus faecalis — обычно безвредный комменсал желудочно-кишечного тракта человека.Однако он может стать патогеном, вызывающим различные инфекции, такие как эндокардит, инфекции мочевыводящих путей, менингит, сепсис и внутрибрюшные инфекции. 1,2 Важно отметить, что E. faecalis является одной из основных причин внутрибольничных инфекций, и появление в клинических условиях E. faecalis , устойчивых к ванкомицину и множественной лекарственной устойчивости, вызывает особую озабоченность. 3–5

    Способность E. faecalis адаптироваться к агрессивной среде, такой как больница, может быть связана с его огромной способностью расти в широком диапазоне температур или pH, чтобы выжить в течение длительных периодов времени в неблагоприятных условиях и противостоять различным нагрузкам и стандартным процедурам очистки. 6,7 Данные, демонстрирующие длительное (до месяцев) загрязнение поверхностей окружающей средой, несмотря на тщательную очистку, позволяют предположить, что внутренняя прочность энтерококков является важным элементом их стойкости и распространения в медицинских учреждениях. 8,9 Действительно, было показано, что колонизация помещений является важным фактором передачи устойчивых к ванкомицину энтерококков. 10

    Энтерококки проявляют внутреннюю или относительную устойчивость к ряду классов антибиотиков (β-лактамы, аминогликозиды, линкозамиды, триметоприм / сульфаметоксазол и фторхинолоны). 11 Например, энтерококки в 10–100 раз менее восприимчивы к β-лактамам, чем другие стрептококки. 12 E. faecalis может приобретать дополнительную устойчивость за счет мутаций в своей существующей хромосоме, но он также способен приобретать детерминанты устойчивости путем горизонтального генетического обмена, такие как конъюгативные транспозоны vanA или vanB , обнаруженные в первом ванкомицине. клинические изоляты резистентных энтерококков, зарегистрированные в Европе или США, соответственно. 13–15

    Более того, по пока неизвестным причинам практически все клинические изоляты E. faecalis толерантны к β-лактамам и гликопептидам. 12,16–19 Толерантные бактерии избегают убивающего действия бактерицидных антибиотиков даже при концентрациях, превышающих МИК препарата на несколько порядков, в результате чего бактерицидные препараты становятся простыми бактериостатическими агентами. 20 Толерантность связана с неэффективностью лечения таких инфекций, как эндокардит, 21,22 менингит, 23 остеомиелит 24 и бактериемия. 25 Первый случай терапевтической неудачи из-за толерантного к ампициллину клинического изолята E. faecalis был зарегистрирован в 1980 году. 26 Недавно неэффективность лечения чувствительного к ванкомицину E. faecalis была связана с его переносимостью. в сторону ванкомицина. 27

    Новое исследование показало, что воздействие различных классов бактерицидных препаратов привело к образованию гидроксильных радикалов как у грамположительных ( Staphylococcus aureus, ), так и у грамотрицательных ( Escherichia coli ) бактерий, и предположил, что эти активные формы кислорода (АФК) вызывали повреждение различных бактериальных структур, что приводило к гибели клеток. 28 Поскольку E. faecalis является естественно толерантным к ряду антимикробных соединений, мы хотели оценить роль окислительного стресса и АФК в его выживаемости после воздействия антибиотиков. Здесь мы демонстрируем, что супероксиддисмутаза E. faecalis является ключом к ее нечувствительности к бактерицидному эффекту пенициллина и ванкомицина, и что пути гибели клеток в E. faecalis индуцируются супероксид-анионом и могут быть отличается от предложенных для E.coli или S. aureus .

    Материалы и методы

    Штаммы бактерий и условия роста

    Бактериальные штаммы

    , использованные в этом исследовании, описаны в таблице 1. Энтерококки выращивали в среде M17 29 с добавлением 0,5% (мас. / Об.) Глюкозы (GM17) при 37 ° C либо в аэробных условиях (колбы Эрленмейера на 150 мл, заполненные 15 мл питательной среды при перемешивании со скоростью 60 об / мин) или в полуанаэробных условиях (герметичные пробирки, полностью заполненные средой).За ростом культур следили как измерением оптической плотности при длине волны 600 нм (OD , 600 ) с помощью биофотометра (Eppendorf, Гамбург, Германия), так и подсчетом жизнеспособных КОЕ на чашках с агаром. E. coli EC101 культивировали при 37 ° C в бульоне Луриа-Бертани (LB) 30 при перемешивании или на агаре LB. При необходимости в среду добавляли тетрациклин (10 мг / л для E. faecalis , 12,5 мг / л для E. coli ). Бактериальные запасы хранили при -80 ° C в бульоне GM17 или LB с добавлением 10% (об. / Об.) Глицерина.

    Таблица 1

    E. faecalis штаммов, использованных в данном исследовании

    Обозначение . Соответствующий генотип, фенотип или описание . ссылку .
    Jh3-2 спонтанный Fus R Rif R , мутант клинического изолята Jh3, не содержащий плазмид 35
    Δ sodA + sodA -дополненный Δ sodA 35
    UV202 53
    UV202 3 9118 911 930 911 9309 sodA menB :: tet menB инсерционный мутант Δ sodA ; Tet R эта работа
    Δ tpx Jh3-2 tpx делеционный мутант 31
    Δ ahp делеционный мутант Jhp3-29001
    Δ npr Jh3-2 npr делеционный мутант 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Jh3-2 с делециями 900 с тройным мутантом Jh3-2 , ahp и npr гены 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Δ cat Jh3-2 четырехкратный мутант с делециями в tpx , npr и cat гены эта работа
    Δ msrA Δ msrB Jh3-2 double msrA a nd msrB мутант эта работа
    Обозначение . Соответствующий генотип, фенотип или описание . ссылку .
    Jh3-2 спонтанный Fus R Rif R , мутант клинического изолята Jh3, не содержащий плазмид 35
    Δ sodA + sodA -дополненный Δ sodA 35
    UV202 53
    UV202 3 9118 911 930 911 9309 sodA menB :: tet menB инсерционный мутант Δ sodA ; Tet R эта работа
    Δ tpx Jh3-2 tpx делеционный мутант 31
    Δ ahp делеционный мутант Jhp3-29001
    Δ npr Jh3-2 npr делеционный мутант 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Jh3-2 с делециями 900 с тройным мутантом Jh3-2 , ahp и npr гены 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Δ cat Jh3-2 четырехкратный мутант с делециями в tpx , npr и cat гены эта работа
    Δ msrA Δ msrB Jh3-2 double msrA a nd msrB мутант эта работа
    Таблица 1

    E.faecalis штаммов, использованных в данном исследовании

    Обозначение . Соответствующий генотип, фенотип или описание . ссылку .
    Jh3-2 спонтанный Fus R Rif R , мутант клинического изолята Jh3, не содержащий плазмид 35
    Δ sodA + sodA -дополненный Δ sodA 35
    UV202 53
    UV202 3 9118 911 930 911 9309 sodA menB :: tet menB инсерционный мутант Δ sodA ; Tet R эта работа
    Δ tpx Jh3-2 tpx делеционный мутант 31
    Δ ahp делеционный мутант Jhp3-29001
    Δ npr Jh3-2 npr делеционный мутант 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Jh3-2 с делециями 900 с тройным мутантом Jh3-2 , ahp и npr гены 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Δ cat Jh3-2 четырехкратный мутант с делециями в tpx , npr и cat гены эта работа
    Δ msrA Δ msrB Jh3-2 double msrA a nd msrB мутант эта работа
    Обозначение . Соответствующий генотип, фенотип или описание . ссылку .
    Jh3-2 спонтанный Fus R Rif R , мутант клинического изолята Jh3, не содержащий плазмид 35
    Δ sodA + sodA -дополненный Δ sodA 35
    UV202 53
    UV202 3 9118 911 930 911 9309 sodA menB :: tet menB инсерционный мутант Δ sodA ; Tet R эта работа
    Δ tpx Jh3-2 tpx делеционный мутант 31
    Δ ahp делеционный мутант Jhp3-29001
    Δ npr Jh3-2 npr делеционный мутант 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Jh3-2 с делециями 900 с тройным мутантом Jh3-2 , ahp и npr гены 31
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Δ cat Jh3-2 четырехкратный мутант с делециями в tpx , npr и cat гены эта работа
    Δ msrA Δ msrB Jh3-2 double msrA a nd msrB мутант эта работа

    Манипуляции с ДНК, антибиотики, химические вещества и ферменты

    Все манипуляции с ДНК выполнялись стандартными методами. 30 Антибиотики, химические вещества и ферменты были коммерчески доступными продуктами реактивного класса.

    Конструирование делеционных мутантов

    Делеционные мутанты были сконструированы с использованием ранее описанного метода замены аллелей. 31 Мутагенез с одинарным кроссинговером инсерция-дупликация был основан на двухвекторной системе, по существу такой же, как описанная Law et al. 32 с использованием плазмиды pG + host (repA TS ) и интегративной плазмиды pVE14218 (Tet R ) (L.Rigottier-Gois и P. Serror, INRA).

    Тестирование чувствительности и кривые «время – убить»

    МИК определяли стандартным методом макроразбавления. 33 Кривые время – убивать определяли в экспоненциально растущих культурах энтерококков путем добавления концентрации антибиотика, равной 20-кратной МИК тестируемого антибиотика при OD 600 0,5 (соответствует ∼5 × 10 8 КОЕ / мл. ). Затем отслеживали OD 600 и определяли количество КОЕ через 24 ч инкубации путем высева 10-кратных серийных разведений культур на чашки с агаром GM17.Число выживших, дающих рост колоний, определяли после 48 ч инкубации планшетов при 37 ° C.

    Измерение H

    2 O 2 Производство

    Производство H 2 O 2 определяли количественно с использованием набора для анализа пероксида водорода / пероксидазы Amplex Red (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, штаммов E. faecalis культивировали при встряхивании (60 об / мин) при 37 ° C в среде GM17 до OD 600 , равного 0.5 было достигнуто. В случае лечения антибиотиками в этот момент добавляли ванкомицин, пенициллин или тетрациклин, и культуры инкубировали в течение 24 часов. Затем 500 мкл каждой культуры центрифугировали и разводили в 100 раз 1-кратным реакционным буфером из набора Amplex Kit. Концентрация H 2 O 2 определялась из этого разведения с использованием 50 мкл образца и 50 мкл рабочего раствора. Параллельно получали H 2 O 2 стандартные кривые (0–5 мкМ H 2 O 2 ) с использованием GM17, разбавленного в 100 раз в 1 × реакционном буфере.Флуоресценцию измеряли с помощью спектрофлуориметра (JY3 D Jobin Yvon). Параллельно определяли количество жизнеспособных клеток для каждой точки путем серийных разведений и посева.

    Результаты

    Супероксиддисмутаза — ключ к толерантности E. faecalis

    Реакция на окислительный стресс E. faecalis хорошо изучена. 34–36 Помимо других антиоксидантных действий, он содержит три пероксидазы, алкилгидропероксидредуктазу (Ahp), тиолпероксидазу (Tpx) и NADH пероксидазу (Npr).Недавно мы показали, что все три участвуют в защите от внешнего H 2 O 2 , тогда как Npr и Tpx являются наиболее важными действиями для защиты бактерий от внутренне генерируемого H 2 O 2 и вредоносной среды макрофагов. , соответственно. 31 Недавнее исследование показало, что уничтожение S. aureus и E. coli бактерицидными антибиотиками опосредуется гидроксильными радикалами (OH · — ), образованными одновалентным восстановлением H 2 O 2 двухвалентным железом (реакция Фентона). 28 Мы пришли к выводу, что если бы этот механизм убийства действовал также и в E. faecalis , мутанты пероксидазы демонстрировали бы потерю толерантности к обычно бактерицидным антибиотикам, таким как гликопептид ванкомицин или β-лактамный пенициллин. Культуры чувствительного к ванкомицину штамма Jh3-2 инкубировали в течение 24 ч в присутствии антибиотиков в концентрациях, в 20 раз превышающих их МИК. Как показано в Таблице 2, ванкомицин не вызывает какой-либо значительной потери жизнеспособности, тогда как пенициллин снижает выживаемость примерно на один порядок.Отдельные мутанты изогенной пероксидазы не были более чувствительны к антибиотикам, чем штамм WT (данные не показаны). Мы предположили, что оставшиеся две пероксидазы могут компенсировать потерю соответствующей функции, отсутствующей у одиночных мутантов, и, таким образом, протестировали тройной мутант пероксидазы ( ΔnprΔtpxΔahp ) против вышеупомянутых антибиотиков. Однако мы также не наблюдали разницы в убийстве по сравнению с контрольным штаммом для тройного мутанта (данные не показаны).

    Таблица 2

    Изменение количества жизнеспособных организмов (log 10 КОЕ / мл) протестированных штаммов E. faecalis после 24 часов воздействия 20-кратного МИК различных антибиотиков

    3 97611 90Δ11 90Δ11 900 — 0,1 3 4,1
    . Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . РУЧКА . НИ . GEN . ERY . ТЕТ . CHL .
    WT 0,9 −0,2 −1,3 −1,3 −0,2 0 0 −0,1
    −4,8 −2,8 −0,6 −0,2 −0,3 −0,3
    Δ sodA + 0.6 −0,1 −1,1 ND ND ND ND ND
    3 97611 90Δ11 90Δ11 900 — 0,1 3 4,1
    . Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . РУЧКА . НИ . GEN . ERY . ТЕТ . CHL .
    WT 0,9 −0,2 −1,3 −1,3 −0,2 0 0 −0,1
    −4,8 −2,8 −0,6 −0,2 −0,3 −0,3
    Δ sodA + 0,6 1 ND ND ND ND ND
    Таблица 2

    Изменение количества жизнеспособных организмов (log 10 КОЕ / мл) протестированных штаммов E. faecalis после 24 часов воздействия до 20-кратного МИК различных антибиотиков

    3 97611 90Δ11 90Δ11 900 — 0,1 3 4,1 9116 011 114 9114118 . 3 97611 90Δ11 90Δ11 900 — 0,1 3 4,1
    . Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . РУЧКА . НИ . GEN . ERY . ТЕТ . CHL .
    WT 0,9 −0,2 −1,3 −1,3 −0,2 0 0 −0,1
    −4,8 −2,8 −0,6 −0,2 −0.3 −0,3
    Δ sodA + 0,6 −0,1 −1,1 ND ND ND ND ND Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . РУЧКА . НИ . GEN . ERY . ТЕТ . CHL .
    WT 0,9 −0,2 −1,3 −1,3 −0,2 0 0 −0,1
    −4,8 −2,8 −0,6 −0,2 −0,3 −0,3
    Δ sodA + 0.6 −0,1 −1,1 ND ND ND ND ND

    E. faecalis также несет ген, кодирующий

    haem-зависимый 34 Не исключено, что это может быть основная активность для нейтрализации H 2 O 2 , потенциально образованного действием антибиотиков. Однако уничтожение одиночного мутанта Δcat , а также четырехкратного штамма ΔnprΔtpxΔahpΔcat было сравнимо с убийством родительского штамма Jh3-2 (данные не показаны).Таким образом, мы пришли к выводу, что ванкомицин и пенициллин не вызывают перекисного стресса у E. faecalis .

    E. faecalis обладает единственной супероксиддисмутазой типа марганца (Mn), кодируемой геном sodA . 35 Ответ уничтожения антибиотика мутанта Δ sodA полностью отличался от ответа его родителя дикого типа. В самом деле, эксперименты с кривой время-убийство показывают, что на 3,9 log 10 и на 3,5 log 10 более чувствительны к уничтожению ванкомицином и пенициллином, соответственно (таблица 2).Мутант Δ sodA также был несколько более восприимчивым, хотя и в меньшей степени, к уничтожению хинолоном норфлоксацином (таблица 2). Мутант Δ sodA был специфически убит бактерицидными, но не бактериостатическими препаратами, такими как эритромицин, тетрациклин или хлорамфеникол (таблица 2). Следует отметить, что в бульоне GM17 гентамицин не является бактерицидным ни через 5, ни через 24 часа после воздействия антибиотика, тогда как WT Jh3-2 и мутант Δ sodA были легко уничтожены в средах для инфузии мозга и сердца (данные не показаны), как ранее описано. 37

    Уничтожение E. faecalis бактерицидными препаратами зависит от наличия кислорода

    Огромная чувствительность мутанта sodA Δ sodA к уничтожению антибиотиков (а также более умеренное снижение выживаемости клеток WT при обработке пенициллином и норфлоксацином) строго зависела от присутствия кислорода. Бактерии могли быть уничтожены при перемешивании культур в колбах Эрленмейера при умеренном встряхивании (60 об / мин). С другой стороны, когда кривые «время – убить» были построены в полуанаэробных условиях (полностью заполненные пробирки без возбуждения), уничтожение антибиотиком полностью прекратилось (данные не показаны).

    Убийство E. faecalis не опосредуется изменениями ДНК или белков

    Чтобы оценить, являются ли изменения ДНК ответственными за гибель клеток, мы исследовали ответ на воздействие ванкомицина хорошо охарактеризованного штамма E. faecalis UV202, нарушенного в репарации ДНК, который, как недавно было показано, несет мутацию в его recA Ген , отменяющий его активность. 38 Однако, как показано в таблице 3, этот штамм не был более чувствителен к уничтожению антибиотиками, чем WT.

    Таблица 3

    Вариация количества жизнеспособных организмов (log 10 КОЕ / мл) протестированных штаммов E. faecalis после 24 часов воздействия 20-кратного МИК ванкомицина

    . Без контроля антибиотиков . Ванкомицин .
    UV202 0,6 −0,4
    Δ sodA menB :: tet 0.8 −4,0
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Δ cat 0,5 −0,5
    Δ msrA 911 9011 9011

    Δ

    msrA 911 9011 9011

    0,1

    75
    . Без контроля антибиотиков . Ванкомицин .
    UV202 0.6 −0,4
    Δ sodA menB :: tet 0,8 −4,0
    Δ tpx Δ ahp Δ npr Δ3 −0,5
    Δ msrA Δ msrB 0,8 −0,1
    Таблица 3

    Изменение количества жизнеспособных веществ (log 10 КОЕ / мл) тестируемых фекалий E. штаммы через 24 ч воздействия 20-кратного МИК ванкомицина

    . Без контроля антибиотиков . Ванкомицин .
    UV202 0,6 −0,4
    Δ sodA menB :: tet 0,8 −4,0
    Δpr 900px n 900px Δpr 900px 900px Δ cat 0,5 −0,5
    Δ msrA Δ msrB 0.8 -0,1
    . Без контроля антибиотиков . Ванкомицин .
    UV202 0,6 −0,4
    Δ sodA menB :: tet 0,8 −4,0
    Δpr 900px n900px Δpr 900px Δ кот 0.5 −0,5
    Δ msrA Δ msrB 0,8 −0,1

    Гидроксильные радикалы также повреждают белки, и их окисление может привести к конформационным изменениям и потере функции. Аминокислоты, легко подверженные окислению АФК, включают цистеин, гистидин, триптофан и тирозин, но наиболее восприимчивым является метионин. Окисление метионина до сульфоксида метионина является обратимым и катализируется вездесущими редуктазами сульфоксида метионина. 39 Ферменты MsrA и MsrB восстанавливают два изомера сульфоксида метионина, сульфоксида метионина S и сульфоксида метионина R соответственно. msr мутанты E. faecalis чувствительны к окислителям (C. Zhao и A. Hartke, неопубликованные результаты), поэтому мы проверили их выживаемость после воздействия антибиотиков. Однако, как показано в таблице 3, ни одиночные мутанты, ни соответствующий двойной мутант Δ msrA Δ msrB не были более чувствительны к уничтожению ванкомицином.

    Удаление sodA не изменяет МИК антибиотиков для E. faecalis

    Удаление sodA очень значительно изменило бактерицидный эффект антибиотиков в отношении E. faecalis . Поэтому мы оценили влияние делеции sodA на чувствительность E. faecalis к антибиотикам (то есть на МИК) с использованием метода макроразведения. Наши результаты показали, что по сравнению с его родителем Jh3-2, MIC для штамма ванкомицина, пенициллина или норфлоксацина Δ sodA не изменилась, т.е.е. 2, 2 и 8 мг / л соответственно. Следовательно, супероксиддисмутаза конкретно участвует в защите бактерий от смертельного действия бактерицидных антибиотиков.

    Убийство бактерий связано с производством супероксида, вызванным воздействием бактерицидных антибиотиков

    Дефероксамин и 2,2′-бипиридил являются хелаторами Fe 3+ и Fe 2+ , и эти химические вещества должны ингибировать образование гидроксильных радикалов с помощью H 2 O 2 посредством реакции Фентона.Как показано в таблице 4, добавление любого из этих соединений не защищает штамм Δ sodA от уничтожения ванкомицином. С другой стороны, добавление тирона, который был описан как эффективный поглотитель супероксидных анионов, 40 , привело к снижению киллинга в 2 log 10 . Следовательно, супероксид, а не гидроксильные радикалы, может быть медиатором уничтожения бактерий в E. faecalis .

    Таблица 4

    Влияние различных химикатов на количество жизнеспособных (log 10 КОЕ / мл) E.faecalis WT и Δs odA штаммов после 24-часовой провокации ванкомицином (20 × МИК)

    11 −4,3
    . Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . ФУРГОН + БП . ФУРГОН + DFX . ФУРГОН + ФУМ . ФУРГОН + НЕМ . ФУРГОН + DDC . ФУРГОН + 2-МЕ . ФУРГОН + МДП .
    WT 0,9 −0,2 −0,3 ND ND −1,0 0 0 0 0 ND
    −4,0 −4,0 −3,8 −3,4 −2,8 ND −2,5
    . Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . ФУРГОН + БП . ФУРГОН + DFX . ФУРГОН + ФУМ . ФУРГОН + НЕМ . ФУРГОН + DDC . ФУРГОН + 2-МЕ . ФУРГОН + МДП .
    WT 0,9 −0,2 −0.3 ND ND −1,0 0 0 ND
    Δ sodA 0,8 −4,3 −4,0 3,4 −2,8 ND −2,5
    Таблица 4

    Влияние различных химических веществ на количество жизнеспособных (log 10 КОЕ / мл) штаммов E. faecalis WT и Δs odA после 24-часовой провокации ванкомицином (20 × МИК)

    . Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . ФУРГОН + БП . ФУРГОН + DFX . ФУРГОН + ФУМ . ФУРГОН + НЕМ . ФУРГОН + DDC . ФУРГОН + 2-МЕ . ФУРГОН + МДП .
    WT 0,9 −0,2 −0.3 ND ND −1,0 0 0 ND
    Δ sodA 0,8 −4,3 −4,0 3,4 −2,8 ND −2,5
    0,911 .8
    . Без антибиотика (контроль) . ФУРГОН . ФУРГОН + БП . ФУРГОН + DFX . ФУРГОН + ФУМ . ФУРГОН + НЕМ . ФУРГОН + DDC . ФУРГОН + 2-МЕ . ФУРГОН + МДП .
    WT 0,9 −0,2 −0,3 ND ND −1,0 0 0 ND
    0 ND
    −4,3 −4,0 −4,0 −3,8 −3,4 −2,8 ND −2,5

    Штамм Δn1051

    2 exc. повышенная частота при воздействии бактерицидного препарата

    Если наша рабочая гипотеза верна, полученный супероксид должен быть дисмутирован ферментом супероксиддисмутазой до O 2 и H 2 O 2 , а образующийся пероксид далее разлагается пероксидазами с образованием H 2 O.Этот редокс-каскад должен прерываться у мутантов пероксидазы. Таким образом, мы определили количества H 2 O 2 в супернатантах культур тройного мутанта пероксидазы Δ npr Δ tpx Δ ahp , а также родительского WT. Культуры подвергали воздействию антибиотиков при OD 600 , равном 0,5, и концентрации H 2 O 2 для обоих штаммов определяли непосредственно перед добавлением антибиотиков и через 24 часа инкубации в присутствии ванкомицина и пенициллина.Как показано в таблице 5, обработка обоими антибиотиками приводила к значительно более высокой продукции H 2 O 2 на КОЕ у тройного мутанта пероксидазы по сравнению с родительским штаммом WT. Стоит отметить, что такая же обработка бактериостатическим антибиотиком (тетрациклином) не привела к увеличению продукции H 2 O 2 .

    Таблица 5

    Определение концентрации H 2 O 2 в супернатантах культур Jh3-2 WT и мутанта Δ tpx Δ ahp Δ npr непосредственно перед добавлением антибиотиков (t0) и через 24 часа инкубации в присутствии 20-кратного МИК пенициллина (t24 PEN), ванкомицина (t24 VAN) или тетрациклина (t24 TET)

    90Δ75 900 Δ75 900px ahp Δ npr 101.6 ± 0,4
    . H 2 O 2 (мкМ) . КОЕ × 10 7 . H 2 O 2 (мкМ / 10 8 КОЕ) .
    Jh3-2
    t0 18 ± 18 10 ± 1 18
    45 ± 1 911 4511 9011
    451 911 911 9011
    451 911 9011 230
    t24 VAN 110 ± 65 10 ± 1 110
    t24 TET 96 ± 36 10 ± 1 96
    t0 25 ± 14 10 ± 1 25
    t24 PEN 6550
    t24 ФУРГОН 426 ± 45 5 ± 2 852
    t24 TET 138 ± 25 10 ± 1 8
    90Δ75 900 Δ75 900px ahp Δ npr 101.6 ± 0,4 8

    Определение концентрации H 2 O 2 в супернатантах культур Jh3-2 WT и Δ tpx Δ ahp Δ мутант npr непосредственно перед добавлением антибиотиков (t0) и через 24 часа ч инкубации в присутствии 20-кратного МИК пенициллина (t24 PEN), ванкомицина (t24 VAN) или тетрациклина (t24 TET)

    . H 2 O 2 (мкМ) . КОЕ × 10 7 . H 2 O 2 (мкМ / 10 8 КОЕ) .
    Jh3-2
    t0 18 ± 18 10 ± 1 18
    45 ± 1 911 4511 9011
    451 911 911 9011
    451 911 9011 230
    t24 VAN 110 ± 65 10 ± 1 110
    t24 TET 96 ± 36 10 ± 1 96
    t0 25 ± 14 10 ± 1 25
    t24 PEN 6550
    t24 VAN 426 ± 45 5 ± 2 852
    t24 TET 138 ± 25 10 ± 1 138 ± 25 10 ± 1
    90Δ75 900 Δ75 900px ahp Δ npr 101.6 ± 0,4
    . H 2 O 2 (мкМ) . КОЕ × 10 7 . H 2 O 2 (мкМ / 10 8 КОЕ) .
    Jh3-2
    t0 18 ± 18 10 ± 1 18
    45 ± 1 911 4511 9011
    451 911 911 9011
    451 911 9011 230
    t24 VAN 110 ± 65 10 ± 1 110
    t24 TET 96 ± 36 10 ± 1 96
    t0 25 ± 14 10 ± 1 25
    t24 PEN 6550
    t24 ФУРГОН 426 ± 45 5 ± 2 852
    t24 TET 138 ± 25 10 ± 1 8
    90Δ75 900 Δ75 900px ahp Δ npr 101.6 ± 0,4 6 8 6
    . H 2 O 2 (мкМ) . КОЕ × 10 7 . H 2 O 2 (мкМ / 10 8 КОЕ) .
    Jh3-2
    t0 18 ± 18 10 ± 1 18
    45 ± 1 911 4511 9011
    451 911 911 9011
    451 911 9011 230
    t24 VAN 110 ± 65 10 ± 1 110
    t24 TET 96 ± 36 10 ± 1 96
    t0 25 ± 14 10 ± 1 25
    t24 PEN 6550
    t24 VAN 426 ± 45 5 ± 2 852
    t24 TET 138 ± 25 10 ± 1 10 ± 1 138 903 источник продукции внутриклеточного супероксида в E. faecalis еще предстоит определить

    Единственный известный путь образования супероксида в E. faecalis — внеклеточная продукция ассоциированным с мембраной деметилменахиноном, важным компонентом дыхательной цепи E.фекалис . 36 В этом исследовании Хайке и его сотрудники показали, что образование внеклеточного супероксида подавляется (снижение> 75%) гематином или фумаратом. В наших анализах кривой «время – убить» добавление фумарата не привело к статистически значимому снижению гибели штамма Δ sodA , тогда как добавление гематина привело к снижению эффективности уничтожения> 1 log 10 .

    Нарушение пути деметилменахинона путем инактивации гена menB значительно снижает внеклеточную продукцию O 2 . 36 Таким образом, мы сконструировали инсерционный мутант menB :: tet на фоне Δ sodA (штамм Δ sodA menB :: tet ). Как показано в таблице 3, двойной мутант Δ sodA menB :: tet был убит так же, как штамм Δ sodA . Следовательно, индуцированное антибиотиками образование супероксида происходит не из-за случайного переноса электронов к кислороду через пул деметилменахинона, а из-за других, пока еще неизвестных путей образования супероксида в E.faecalis должен быть задействован.

    Эукариотические ингибиторы супероксиддисмутазы не эффективны в индукции гибели E. faecalis

    Поскольку SodA играет ключевую роль в выживании бактерий после воздействия антибиотиков, мы попытались определить, будет ли добавление ингибиторов супероксиддисмутазы в дополнение к антибиотику в культурах E. faecalis WT способствовать гибели клеток. Несмотря на то, что не описаны прокариотические ингибиторы супероксиддисмутазы Mn, мы попробовали 2-метоксиэстрадиол (2-ME), который, по-видимому, ингибирует эукариотические супероксиддисмутазы Mn и Cu / Zn, 41,42 и диэтилдитиокарбамат (DDC), Cu / Ингибитор Zn супероксиддисмутазы. 43 Добавление 2-ME или DDC к культурам, подвергшимся воздействию ванкомицина, не привело к гибели штамма WT (таблица 4). Фактически, DDC даже защищал штамм Δ sodA в экспериментах по уничтожению времени. Это может быть связано со способностью тиокарбаматов действовать как поглотители АФК. 44

    Обсуждение

    По определению, бактерицидные антибиотики вызывают снижение количества жизнеспособных микроорганизмов не менее чем на 99,9% (3 log 10 КОЕ / мл) через 24 часа воздействия.По сравнению с бактериостатическими препаратами бактерицидные средства обладают двумя важными свойствами. Во-первых, они более эффективны при избавлении от инфекции in vivo . 45 Во-вторых, максимальное усиление бактерицидного эффекта также снижает потенциальное развитие механизмов устойчивости бактерий («мертвые насекомые не мутируют»). 46 Против толерантных бактерий, таких как E. faecalis , бактерицидные препараты теряют эти ключевые свойства. Поэтому поиск способов ресенсибилизации толерантных бактерий к убивающему эффекту бактерицидных препаратов имеет первостепенное значение.

    В нескольких сообщениях показано, что воздействие некоторых антибиотиков увеличивает производство АФК в цитоплазме бактерий. 40,47,48 Недавнее исследование, проведенное в основном с E. coli , представило доказательства того, что воздействие бактерицидных, но не бактериостатических антибиотиков вызывает выработку супероксида (O 2 ) дыхательной цепью. . 28 Точно установлено, что O 2 разрушает кластеры Fe – S, присутствующие в различных ферментах, высвобождая, таким образом, атомы железа в цитоплазме, что приводит к образованию высокореактивных гидроксильных радикалов (OH · — ) через реакцию Фентона.Этот вызывающий смерть каскад АФК бактерицидными антибиотиками был подтвержден результатами, полученными либо с тиомочевиной (предполагаемый поглотитель гидроксильных радикалов), либо с 2,2′-бипиридилом (хелатор железа), который защищал клетки от уничтожения лекарствами. OH · — реагирует практически контролируемым диффузией образом со всеми биомолекулами, но его основной чувствительной мишенью является ДНК. Действительно, мутант E. coli Δ recA был более чувствителен к бактерицидным антибиотикам, чем изогенный WT. 28 Экспозиция S.aureus к бактерицидным антибиотикам также индуцировал продукцию гидроксильных радикалов, указывая на то, что механистическая концепция продукции ROS бактерицидными препаратами также актуальна для грамположительных бактерий. 28 Однако, как указано в недавнем комментарии к публикации Kohanski et al. , 28 Для выяснения связи между производством АФК, индуцированным антибиотиками, и гибелью клеток необходимо исследование мутантов, лишенных известных ферментативных поглотителей АФК, таких как супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы. 49

    Используя такие мутанты E. faecalis , мы показываем, что наши результаты в нескольких пунктах отличаются от механистической схемы, предложенной для E. coli и S. aureus . Во-первых, реакция Фентона не сыграла очевидной роли в индуцированном антибиотиком уничтожении E. faecalis . Действительно, мутанты, серьезно затронутые деградацией H 2 O 2 31 , были столь же толерантны, как и родитель WT. Более того, проникающие в клетки поглотители железа не защищали E.faecalis Δ sodA , мутант против индуцированного ванкомицином убийства, хотя мы недавно продемонстрировали, что дефероксамин в значительной степени защищает клетки E. faecalis от воздействия H 2 O 2 . 35 Во-вторых, мутанты E. faecalis recA были не более восприимчивы к воздействию ванкомицина, чем WT, демонстрируя, что повреждение ДНК не является летальным исходом для E. faecalis . Обратите внимание, что обе точки взаимно поддерживают друг друга.

    Единственным мутантом, который был значительно более чувствителен к убивающему эффекту трех различных классов бактерицидных антибиотиков (гликопептида, β-лактама и хинолона), был мутант Δ sodA . С другой стороны, мутация Δ sodA не вызывала какого-либо изменения жизнеспособности при использовании бактериостатических агентов. Следовательно, у E. faecalis образование и накопление токсичных концентраций супероксида индуцируются только бактерицидными агентами, что подтверждается защитным действием тирона, поглотителя супероксида.

    На основе этих объединенных результатов мы предлагаем модель того, как бактерицидные антибиотики убивают клеток E. faecalis . У бактерий WT супероксид, продуцируемый антибиотическим стрессом, дисмутируется в O 2 и H 2 O 2 под действием супероксиддисмутазы Mn (рис. 1). H 2 O 2 , образующийся в этой реакции, по-видимому, не накапливается до летальных концентраций, поскольку мутанты пероксидазы / каталазы ненамного более чувствительны к вышеупомянутым антибиотикам, чем штамм WT.Напротив, в мутанте Δ sodA супероксид накапливается до критических уровней и вступает в реакцию с чувствительными мишенями. Эти вторичные поражения, вызванные воздействием бактерицидных препаратов, в конечном итоге способствуют гибели клеток. Модель прошла экспериментальную проверку. Как и предполагалось, мутант пероксидазы, дефектный в детоксикации H 2 O 2 31 , выделял H 2 O 2 с особенно высокой скоростью при лечении ванкомицином или пенициллином, но не при лечении бактериостатическими препаратами, такими как как тетрациклин.Однако эта модель кажется противоречащей современным представлениям о реакционной способности супероксида. Действительно, эти АФК не реагируют легко с большинством биомолекул, но реагируют с кластерами ферментов [Fe – S] и разрушают их. Такие ферменты могут соответствовать основным мишеням в E. faecalis , и для их идентификации необходимы дальнейшие исследования. Следует отметить, что энтерококки не имеют ни цикла трикарбоновых кислот (TCA), ни дегидратаз, которые, как известно, инактивируются O 2 в E.coli . 50 Более того, необходимо выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе индуцированного антибиотиком всплеска супероксида. Как мы показали, пул деметилменахинона, ответственный за внеклеточную продукцию O 2 , не участвует в этом явлении.

    Рисунок 1

    Предлагаемая модель действия бактерицидных препаратов на E. faecalis . По пока неизвестному механизму воздействие этих антибиотиков вызывает выработку O 2 .В штамме WT эти АФК стабильно детоксифицируются сначала до H 2 O 2 под действием супероксиддисмутазы Mn (Mn-SOD), а затем до H 2 O и O 2 под действием пероксидаз и каталазы. , что приводит к толерантному фенотипу. Напротив, в изогенном мутанте SodA O 2 накапливается до токсичных уровней и вступает в реакцию с чувствительными мишенями, что в конечном итоге приводит к гибели клеток.

    Рисунок 1

    Предлагаемая модель действия бактерицидных препаратов на E.фекалис . По пока неизвестному механизму воздействие этих антибиотиков вызывает выработку O 2 . В штамме WT эти АФК стабильно детоксифицируются сначала до H 2 O 2 под действием супероксиддисмутазы Mn (Mn-SOD), а затем до H 2 O и O 2 под действием пероксидаз и каталазы. , что приводит к толерантному фенотипу. Напротив, в изогенном мутанте SodA O 2 накапливается до токсичных уровней и вступает в реакцию с чувствительными мишенями, что в конечном итоге приводит к гибели клеток.

    В заключение, наши результаты еще больше усиливают взаимосвязь между уничтожением бактерий и окислительным стрессом, который, по крайней мере, у E. faecalis , по-видимому, опосредован супероксидным анионом. Идентификация чувствительных к O 2 мишеней или специфических ингибиторов супероксиддисмутазы может дать новое понимание молекулярных механизмов смерти E. faecalis и представить новые потенциальные мишени для противомикробного вмешательства.

    Финансирование

    Эта работа была частично поддержана грантами Министерства образования и науки Франции и Французского национального института сельскохозяйственных исследований (INRA).А. Б. был стипендиатом постдокторантуры Регионального совета Нижней Нормандии.

    Заявления о прозрачности

    Все авторы: никто не объявляет.

    Благодарности

    Мы благодарны Анник Бландин за выдающуюся техническую помощь. Мы благодарим Pascale Serror и Lionel Rigottier-Gois из Института INRA в Jouy-en-Josas (Франция) за подарок плазмиды pVE14218 и штамма E. coli VE14188.

    Список литературы

    1.

    Жизнь и время существования Enterococcus

    ,

    Clin Microbiol Rev

    ,

    1990

    , vol.

    3

    (стр.

    46

    65

    ) 2« и др. .

    Энтерококковая вирулентность

    ,

    Энтерококки: патогенез, молекулярная биология, устойчивость к антибиотикам и инфекционный контроль

    ,

    2002

    Вашингтон, округ Колумбия, США

    ASM Press

    (стр.

    301

    54

    ) 3.

    Устойчивые к ванкомицину энтерококковые инфекции

    ,

    N Engl J Med

    ,

    2000

    , vol.

    342

    (стр.

    710

    21

    ) 4,.

    Устойчивые к гликопептидам энтерококки: расшифровка вирулентности, устойчивости и эпидемичности

    ,

    Curr Opin Infect Dis

    ,

    2007

    , vol.

    20

    (стр.

    384

    90

    ) 5,,.

    Энтерококки с множественной лекарственной устойчивостью: природа проблемы и планы на будущее

    ,

    Emerg Infect Dis

    ,

    1998

    , vol.

    4

    (стр.

    239

    49

    ) 6. .

    Физиология энтерококков

    ,

    Энтерококки: патогенез, молекулярная биология, устойчивость к антибиотикам и инфекционный контроль

    ,

    2002

    Вашингтон, округ Колумбия, США

    ASM Press

    (стр.

    133

    75

    ) 7 .

    Нозокомиальные энтерококки: устойчивость к теплу и гипохлориту натрия

    ,

    J Hosp Infect

    ,

    1995

    , vol.

    30

    (стр.

    193

    9

    ) 8.

    Загрязнение окружающей среды является важным фактором госпитальной инфекции

    ,

    J Hosp Infect

    ,

    2007

    , vol.

    65

    Дополнение 2

    (стр.

    50

    4

    ) 9,,, et al.

    Корреляция между генетическим разнообразием внутрибольничных патогенов и временем их выживания в отделениях интенсивной терапии

    ,

    J Hosp Infect

    ,

    2006

    , vol.

    62

    (стр.

    181

    6

    ) 10,,, et al.

    Предыдущее загрязнение окружающей среды увеличивает риск приобретения устойчивых к ванкомицину энтерококков

    ,

    Clin Infect Dis

    ,

    2008

    , vol.

    46

    (стр.

    678

    85

    ) 11,. .

    Энтерококки как члены кишечной микрофлоры человека

    ,

    Энтерококки: патогенез, молекулярная биология, устойчивость к антибиотикам и инфекционный контроль

    ,

    2002

    Вашингтон, округ Колумбия, США

    ASM Press

    (стр.

    101

    32

    ) 12,.

    Неисправное уничтожение энтерококков: общее свойство антимикробных агентов, действующих на клеточную стенку

    ,

    Противомикробные агенты Chemother

    ,

    1980

    , vol.

    17

    (стр.

    965

    8

    ) 13« и др.

    Роль мобильной ДНК в эволюции устойчивых к ванкомицину Enterococcus faecalis

    ,

    Science

    ,

    2003

    , vol.

    299

    (стр.

    2071

    4

    ) 14« и др.

    Ванкомицин-устойчивые энтерококки

    ,

    Ланцет

    ,

    1988

    , т.

    i

    (стр.

    57

    8

    ) 15,,, et al.

    Опосредованная плазмидами устойчивость к ванкомицину и тейкопланину у Enterococcus faecium

    ,

    N Engl J Med

    ,

    1988

    , vol.

    319

    (стр.

    157

    61

    ) 16« и др.

    Чувствительность энтерококков. I. Ингибирующая и бактерицидная активность некоторых химиоантибиотиков против Streptococcus faecalis и Streptococcus faecium

    ,

    Chemioterapia

    ,

    1986

    , vol.

    5

    (стр.

    302

    8

    ) 17,.

    Толерантность энтерококков к ванкомицину

    ,

    Химиотерапия

    ,

    2004

    , т.

    50

    (стр.

    250

    4

    ) 18,,.

    Толерантность к гликопептидам у бактерий, вызывающих эндокардит

    ,

    J Antimicrob Chemother

    ,

    1999

    , vol.

    44

    (стр.

    121

    4

    ) 19,,, et al.

    Измерение активности ампициллина, ванкомицина, линезолида и гентамицина против энтерококковых биопленок

    ,

    J Antimicrob Chemother

    ,

    2006

    , vol.

    57

    (стр.

    767

    70

    ) 20,.

    Толерантность к антибиотикам среди клинических изолятов бактерий

    ,

    Rev Infect Dis

    ,

    1985

    , vol.

    7

    (стр.

    368

    86

    ) 21« и др.

    Клиническое значение толерантных штаммов стрептококков у взрослых с инфекционным эндокардитом

    ,

    Clin Microbiol Infect

    ,

    2003

    , vol.

    9

    (стр.

    852

    7

    ) 22,,.

    Утрата толерантности к пенициллину из-за инактивации детерминанты углеродного катаболита CcpA в Streptococcus gordonii

    ,

    J Antimicrob Chemother

    ,

    2007

    , vol.

    59

    (стр.

    607

    15

    ) 23,,.

    Выделение и характеристика толерантного к ванкомицину Streptococcus pneumoniae из спинномозговой жидкости пациента, у которого развился рецидивирующий менингит

    ,

    J Infect Dis

    ,

    2000

    , vol.

    181

    (стр.

    369

    73

    ) 24« и др.

    Микробиологическая толерантность при ортопедических инфекциях: отсроченный ответ септического артрита и остеомиелита бедра из-за инфицирования толерантным Staphylococcus aureus

    ,

    J Pediatr Orthop

    ,

    1996

    , vol.

    16

    (стр.

    518

    21

    ) 25,.

    Толерантность к ванкомицину, потенциальный механизм наблюдательного исследования резистентной грамположительной бактериемии у больных раком

    ,

    Рак

    ,

    2006

    , vol.

    106

    (стр.

    1815

    20

    ) 26« и др.

    Переносимость пенициллина у Streptococcus faecalis

    ,

    Lancet

    ,

    1980

    , vol.

    ii

    стр.

    321

    27,,.

    E. faecalis Ванкомицин-чувствительная энтерококковая бактериемия, не реагирующая на устойчивый к ванкомицину штамм, успешно леченная высокими дозами даптомицина

    ,

    Heart Lung

    ,

    2007

    , vol.

    36

    (стр.

    456

    61

    ) 28« и др.

    Общий механизм гибели клеток, вызванной бактерицидными антибиотиками

    ,

    Cell

    ,

    2007

    , vol.

    130

    (стр.

    797

    810

    ) 29,.

    Улучшенная среда для молочных стрептококков и их бактериофагов

    ,

    Appl Microbiol

    ,

    1975

    , vol.

    29

    (стр.

    807

    13

    ) 30,,. ,

    Molecular Cloning: A Laboratory Manual

    ,

    1989

    Cold Spring Harbor, NY, USA

    Cold Spring Harbor Laboratory Press

    31,,, et al.

    Сравнительное исследование физиологической роли трех пероксидаз (НАДН-пероксидаза, алкилгидропероксидредуктаза и тиолпероксидаза) в ответе на окислительный стресс, выживаемости внутри макрофагов и вирулентности Enterococcus faecalis

    ,

    Mol Microbiol

    ,

    2007

    ,

    2007

    ,

    2007

    .

    66

    (стр.

    1148

    63

    ) 32« и др.

    Система для генерации хромосомных мутаций в Lactococcus lactis , которая позволяет быстро анализировать целевые гены

    ,

    J Bacteriol

    ,

    1995

    , vol.

    177

    (стр.

    7011

    8

    ) 33,. , , , и другие.

    Тесты на чувствительность к противомикробным препаратам: методы разбавления и дисковой диффузии

    ,

    Руководство по клинической микробиологии

    ,

    1995

    Вашингтон, округ Колумбия, США

    Американское общество микробиологии

    (стр.

    1327

    41

    ) 34,,.

    Enterococcus faecalis гем-зависимая каталаза

    ,

    J Bacteriol

    ,

    2002

    , т.

    184

    (стр.

    6351

    6

    ) 35« и др.

    Влияние (Mn) супероксиддисмутазы Enterococcus faecalis на реакции на окислительный стресс и выживаемость внутри макрофагов

    ,

    Microbiology

    ,

    2006

    , vol.

    152

    (стр.

    2579

    89

    ) 36« и др.

    Производство внеклеточного супероксида с помощью Enterococcus faecalis требует деметилменахинона и ослабляется функциональными терминальными хинолоксидазами

    ,

    Mol Microbiol

    ,

    2001

    , vol.

    42

    (стр.

    729

    40

    ) 37,,, et al.

    Бактерицидная активность гентамицина в отношении Enterococcus faecalis in vitro и in vivo

    ,

    Антимикробные агенты Chemother

    ,

    2000

    , vol.

    44

    (стр.

    2077

    80

    ) 38,.

    Дефектный по рекомбинации штамм Enterococcus faecalis UV202 представляет собой мутант recA

    ,

    Плазмида

    ,

    2006

    , vol.

    55

    (стр.

    164

    8

    ) 39,,.

    Метионинсульфоксидредуктазы и вирулентность бактериальных патогенов

    ,

    Future Microbiol

    ,

    2007

    , vol.

    2

    (стр.

    619

    30

    ) 40,,.

    Новый аспект синергетического антибактериального действия ампициллина и гентамицина

    ,

    Int J Antimicrob Agents

    ,

    2005

    , vol.

    26

    (стр.

    146

    51

    ) 41« и др.

    Супероксиддисмутаза как мишень для селективного уничтожения раковых клеток

    ,

    Nature

    ,

    2000

    , vol.

    407

    (стр.

    390

    5

    ) 42« и др.

    2-Метоксиэстрадиол не ингибирует супероксиддисмутазу

    ,

    Arch Biochem Biophys

    ,

    2001

    , vol.

    392

    (стр.

    349

    53

    ) 43,.

    Функциональное значение Cu, ZnSOD в Escherichia coli.

    ,

    Arch Biochem Biophys

    ,

    1996

    , т.

    327

    (стр.

    249

    53

    ) 44« и др.

    Селенокарбаматы являются эффективными поглотителями супероксидных анионов in vitro

    ,

    Eur J Pharm Sci

    ,

    2005

    , vol.

    24

    (стр.

    291

    5

    ) 45,,, et al.

    Значение бактерицидных препаратов: будущие направления в борьбе с инфекционными заболеваниями

    ,

    Clin Infect Dis

    ,

    2004

    , vol.

    39

    (стр.

    1314

    20

    ) 46.

    Мертвые клопы не мутируют: проблемы восприимчивости при возникновении бактериальной устойчивости

    ,

    Emerg Infect Dis

    ,

    2003

    , vol.

    9

    (стр.

    10

    6

    ) 47« и др.

    Окислительный стресс, участвующий в антибактериальном действии различных антибиотиков

    ,

    Biochem Biophys Res Commun

    ,

    2004

    , vol.

    317

    (стр.

    605

    9

    ) 48,.

    Окислительный стресс, вызванный ципрофлоксацином у Staphylococcus aureus

    ,

    Biochem Biophys Res Commun

    ,

    2002

    , vol.

    297

    (стр.

    1003

    7

    ) 49,.

    Бактерицидные антибиотики и окислительный стресс: радикальное предложение

    ,

    ACS Chem Biol

    ,

    2007

    , vol.

    2

    (стр.

    708

    10

    ) 50.

    Железно-серные кластеры и проблема с кислородом

    ,

    Мол. Microbiol

    ,

    2006

    , т.

    59

    (стр.

    1073

    82

    ) 51,.

    Рекомбинационно-дефицитный мутант Streptococcus faecalis

    ,

    J Bacteriol

    ,

    1980

    , vol.

    143

    (стр.

    966

    70

    ) 52,.

    Амплификация детерминанты устойчивости к тетрациклину плазмиды pAM альфа 1 в Streptococcus faecalis : зависимость от аппарата рекомбинации хозяина

    ,

    J Bacteriol

    ,

    1980

    , vol.

    143

    (стр.

    1070

    2

    )

    Заметки автора

    © Автор 2009. Опубликовано Oxford University Press от имени Британского общества антимикробной химиотерапии. Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected]

    .

    Геномный анализ клинических изолятов Enterococcus faecalis с множественной лекарственной устойчивостью на гены устойчивости к противомикробным препаратам и факторы вирулентности из западного региона Саудовской Аравии | Устойчивость к противомикробным препаратам и инфекционный контроль

  • 1.

    Упадхьяя П.Г., Равикумар К., Умапати Б. Обзор факторов вирулентности энтерококка: новый нозокомиальный патоген. Индийский J Med Microbiol. 2009; 27 (4): 301.

    Артикул Google ученый

  • 2.

    Гордон С., Свенсон Дж. М., Хилл Б., Пиготт Н., Факлам Р., Кукси Р., Торнсберри С., Джарвис В., Теновер Ф. Модели чувствительности к антимикробным препаратам обычных и необычных видов энтерококков, вызывающих инфекции в Соединенных Штатах. Группа исследования энтерококков.J Clin Microbiol. 1992. 30 (9): 2373–8.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 3.

    Moellering RC Jr. Появление энтерококка как значимого патогена. Clin Infect Dis. 1992: 1173–6.

  • 4.

    Европейский центр профилактики и контроля заболеваний. Исследование точечной распространенности инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, и использования противомикробных препаратов в европейских больницах неотложной помощи. Стокгольм: ECDC; 2013. https: // ecdc.europa.eu/sites/portal/files/media/en/publications/Publications/healthcare-associated-infections-antimicrobial-use-PPS.pdf.

  • 5.

    Arias CA, Contreras GA, Murray BE. Ведение энтерококковых инфекций с множественной лекарственной устойчивостью. Clin Microbiol Infect. 2010. 16 (6): 555–62.

    CAS Статья Google ученый

  • 6.

    Вернер Г., Коке Т., Хаммерум А., Хоуп Р., Гриневич В., Джонсон А., Клар И., Кристинссон К., Леклерк Р., Лестер С. Возникновение и распространение устойчивости к ванкомицину среди энтерококков в Европе.2008.

  • 7.

    Ruoff KL, De La Maza L, Murtagh MJ, Spargo JD, Ferraro MJ. Видовая принадлежность энтерококков, выделенных из клинических образцов. J Clin Microbiol. 1990. 28 (3): 435–7.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 8.

    Homan WL, Tribe D, Poznanski S, Li M, Hogg G, Spalburg E, van Embden JD, Willems RJ. Схема мультилокусного типирования последовательностей Enterococcus faecium. J Clin Microbiol. 2002. 40 (6): 1963–71.

    CAS Статья Google ученый

  • 9.

    Руис-Гарбахоса П., Бонтен М.Дж., Робинсон Д.А., Топ Дж., Наллапаредди С.Р., Торрес С., Коке TM, Кантон Р., Бакеро Ф., Мюррей Б.Э. Схема мультилокусного типирования последовательностей для Enterococcus faecalis выявляет адаптированные к больнице генетические комплексы на фоне высокой скорости рекомбинации. J Clin Microbiol. 2006. 44 (6): 2220–8.

    CAS Статья Google ученый

  • 10.

    Райс HE, Браун Р.Л., Голлин Г., Кэти М.Г., Гилберт Дж., Скиннер М.А., Глик П.Л., Азизхан Р.Г. Результаты пилотного исследования по сравнению пролонгированного внутривенного введения антибиотиков с последовательным внутривенным / пероральным введением антибиотиков для детей с перфорированным аппендицитом. Arch Surg. 2001. 136 (12): 1391–5.

    CAS Статья Google ученый

  • 11.

    Курвалин П. Устойчивость к ванкомицину грамположительных кокков. Clin Infect Dis. 2006; 42 (Приложение_1): S25–34.

    CAS Статья Google ученый

  • 12.

    Вудфорд Н. Эпидемиология генетических элементов, ответственных за приобретенную устойчивость к гликопептидам у энтерококков. Microb Drug Resist. 2001. 7 (3): 229–36.

    CAS Статья Google ученый

  • 13.

    Чанг С., Зиверт Д.М., Хагеман Дж. К., Бултон М.Л., Теновер ФК, Даунс Ф.П., Шах С., Рудрик Дж. Т., Пупп Г. Р., Браун В. Дж.. Заражение устойчивым к ванкомицину Staphylococcus aureus, содержащим ген устойчивости к vanA.N Engl J Med. 2003. 348 (14): 1342–7.

    Артикул Google ученый

  • 14.

    Салем-Бехит М.М., Мусса И.М., Мухаррам М.М., Аланази Ф.К., Хефни Х.М. Распространенность и картина устойчивости к противомикробным препаратам энтерококков с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из клинических образцов. Индийский J Med Microbiol. 2012; 30 (1): 44–51.

    CAS Статья Google ученый

  • 15.

    Wattal C, Oberoi J, Goel N, Raveendran R, Khanna S.Матричная лазерная десорбционная ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) для быстрой идентификации микроорганизмов в обычной клинической микробиологической лаборатории. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2017; 36 (5): 807–12.

    CAS Статья Google ученый

  • 16.

    CLSI. Стандарты эффективности тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам; 26 изд. Уэйн, Пенсильвания: Институт клинических и лабораторных стандартов; 2016.

    Google ученый

  • 17.

    Magiorakos AP, Srinivasan A, Carey R, Carmeli Y, Falagas M, Giske C, Harbarth S, Hindler J, Kahlmeter G, Olsson-Liljequist B. Бактерии с множественной лекарственной устойчивостью, широкой лекарственной устойчивостью и устойчивостью к пандругам: международный эксперт предложение по временным стандартным определениям приобретенного сопротивления. Clin Microbiol Infect. 2012. 18 (3): 268–81.

    CAS Статья Google ученый

  • 18.

    Миле А, Бандера М, Гольдштейн Б.П. Использование праймеров, селективных для генов устойчивости к ванкомицину, для определения генотипа van у энтерококков и для изучения генной организации в изолятах VanA.Антимикробные агенты Chemother. 1995. 39 (8): 1772–8.

    CAS Статья Google ученый

  • 19.

    Nallapareddy SR, Duh R-W, Singh KV, Murray BE. Молекулярное типирование выбранных изолятов Enterococcus faecalis: пилотное исследование с использованием мультилокусного типирования и гель-электрофореза в импульсном поле. J Clin Microbiol. 2002. 40 (3): 868–76.

    CAS Статья Google ученый

  • 20.

    Kaas RS, Leekitcharoenphon P, Aarestrup FM, Lund O. Решение проблемы сравнения полных бактериальных геномов на разных платформах секвенирования. PLoS One. 2014; 9 (8): e104984.

    Артикул Google ученый

  • 21.

    Letunic I, Bork P. Интерактивное древо жизни (iTOL): онлайн-инструмент для отображения и аннотации филогенетического дерева. Биоинформатика. 2006. 23 (1): 127–8.

    Артикул Google ученый

  • 22.

    Camacho C, Coulouris G, Avagyan V, Ma N, Papadopoulos J, Bealer K, Madden TL. BLAST +: архитектура и приложения. Биоинформатика BMC. 2009; 10 (1): 421.

    Артикул Google ученый

  • 23.

    Гупта С.К., Падманабхан Б.Р., Диен С.М., Лопес-Рохас Р., Кемпф М., Ландро Л., Ролайн Дж.М. ARG-ANNOT, новый биоинформатический инструмент для обнаружения генов устойчивости к антибиотикам в бактериальных геномах. Антимикробные агенты Chemother. 2014; 58 (1): 212–20.

    Артикул Google ученый

  • 24.

    Цзя Б., Рафенья А. Р., Алкок Б., Ваглехнер Н., Го П, Цанг К. К., Лаго Б. А., Дэйв Б. М., Перейра С., Шарма А. Н.. CARD 2017: расширение и модельно-ориентированное лечение всеобъемлющей базы данных по устойчивости к антибиотикам. Nucleic Acids Res. 2016: gkw1004.

  • 25.

    Joensen KG, Scheutz F, Lund O, Hasman H, Kaas RS, Nielsen EM, Aarestrup FM. Полногеномное секвенирование в режиме реального времени для стандартного типирования, наблюдения и выявления вспышек веротоксигенной Escherichia coli. J Clin Microbiol. 2014; 52 (5): 1501–10.

    Артикул Google ученый

  • 26.

    Караттоли А., Занкари Е., Гарсиа-Фернандес А., Ларсен М.В., Лунд О., Вилла Л., Аарструп FM, Хасман Х. Обнаружение плазмид in silico и типирование плазмид с использованием PlasmidFinder и мультилокусное типирование последовательностей плазмид. Антимикробные агенты Chemother. 2014. 58 (7): 3895–903.

    Артикул Google ученый

  • 27.

    Сигье П., Перошон Дж., Лестрейд Л., Махиллон Дж., Чандлер М.ISfinder: справочный центр бактериальных инсерционных последовательностей. Nucleic Acids Res. 2006; 34 (Suppl_1): D32–6.

    CAS Статья Google ученый

  • 28.

    Кристич С.Дж., Райс Л.Б., Ариас Калифорния: Энтерококковая инфекция — лечение и устойчивость к антибиотикам. 2014.

  • 29.

    Эль-Керш Т.А., Мари М.А., Аль-Шейх Ю.А., Аль-Агами М.Х., Аль-Блуши А.А. Распространенность и факторы риска раннего фекального носительства Enterococcus faecalis и Staphylococcus spp и их устойчивость к антимикробным препаратам среди здоровых новорожденных, родившихся в больничных условиях в Центральной Саудовской Аравии.Сауди Мед Дж. 2016; 37 (3): 280.

    Артикул Google ученый

  • 30.

    Салем-Бехит М.М., Мусса ИМИ, Эльшербини ММАМ, АльРеджайе С. Растущая распространенность энтерококков с высокой устойчивостью к гентамицину: возникающая клиническая проблема. Afr J Microbiol Res. 2011; 5 (31): 5713–20.

    CAS Google ученый

  • 31.

    Fernández-Hidalgo N, Almirante B, Gavaldà J, Gurgui M, Peña C, de Alarcón A, Ruiz J, Vilacosta I, Montejo M, Vallejo N.Ампициллин плюс цефтриаксон так же эффективен, как ампициллин плюс гентамицин для лечения инфекционного эндокардита Enterococcus faecalis. Clin Infect Dis. 2013. 56 (9): 1261–8.

    Артикул Google ученый

  • 32.

    Ричи Э., Уотерс П., Йович М., Рахман С. Лечение инфекций мочевыводящих путей, вызванных устойчивостью к ампициллину Enterococcus faecium. Fed Pract. 2015; 32: 20–3.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Зеяулла М., Каул В. Распространенность инфекции мочевыводящих путей и структура устойчивости к антибиотикам среди населения Саудовской Аравии. Glob J Biol, Науки о сельском хозяйстве. 2015; 4 (1): 206–14.

    Google ученый

  • 34.

    Sievert DM, Ricks P, Edwards JR, Schneider A, Patel J, Srinivasan A, Kallen A, Limbago B, Фридкин С. Устойчивые к противомикробным препаратам патогены, связанные с инфекциями, связанными со здравоохранением. Сеть безопасности здравоохранения в центрах по контролю и профилактике заболеваний, 2009–2010 гг.Инфекционный контроль Hosp Epidemiol. 2013; 34 (1): 1–14.

    Артикул Google ученый

  • 35.

    Падмасини Э., Падмарадж Р., Рамеш С.С. Высокий уровень устойчивости к аминогликозидам и распределение генов устойчивости к аминогликозидам среди клинических изолятов видов Enterococcus в Ченнаи, Индия. Научный мир J. 2014; 2014.

  • 36.

    Сингх К.В., Вайншток Г.М., Мюррей Б.Е. Гомолог Enterococcus faecalis ABC (Lsa) необходим для устойчивости этого вида к клиндамицину и хинупристин-далфопристину.Антимикробные агенты Chemother. 2002. 46 (6): 1845–50.

    CAS Статья Google ученый

  • 37.

    Portillo A, Ruiz-Larrea F, Zarazaga M, Alonso A, Martinez JL, Torres C. Гены устойчивости к макролидам у Enterococcus spp. Антимикробные агенты Chemother. 2000. 44 (4): 967–71.

    CAS Статья Google ученый

  • 38.

    Цзя В., Ли Дж., Ван В. Распространенность и устойчивость к противомикробным препаратам видов Enterococcus: исследование на базе больниц в Китае.Int J Environ Res Public Health. 2014; 11 (3): 3424–42.

    Артикул Google ученый

  • 39.

    Lee E-W, Huda MN, Kuroda T., Mizushima T., Tsuchiya T. EfrAB, мультилекарственная оттокная помпа ABC в Enterococcus faecalis. Антимикробные агенты Chemother. 2003. 47 (12): 3733–8.

    CAS Статья Google ученый

  • 40.

    Санчес Валенсуэла А., Лавилла Лерма Л., Беномар Н., Гальвес А., Перес Пулидо Р., Абриуэль Х.Профиль фенотипической и молекулярной устойчивости к антибиотикам Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium, выделенных из различных традиционных ферментированных продуктов. Foodborne Pathog Dis. 2013; 10 (2): 143–9.

    CAS Статья Google ученый

  • 41.

    Toledo-Arana A, Valle J, Solano C, MaJ A, Cucarella C, Lamata M, Amorena B, Leiva J, Penadés JR, Lasa I. Поверхностный белок энтерококка, Esp, участвует в Enterococcus faecalis образование биопленок.Appl Environ Microbiol. 2001. 67 (10): 4538–45.

    CAS Статья Google ученый

  • 42.

    Guiton PS, Hung CS, Kline KA, Roth R, Kau AL, Hayes E, Heuser J, Dodson KW, Caparon MG, Hultgren SJ. Вклад автолизина и сортазы а в развитие ДНК-зависимой биопленки Enterococcus faecalis. Заражение иммунной. 2009. 77 (9): 3626–38.

    CAS Статья Google ученый

  • 43.

    Гарг С., Мохан Б., Танежа Н. Способность штаммов энтерококков к образованию биопленок, вызывающих инфекцию мочевыводящих путей, колонизация Vis-a-Vis и корреляция с геном поверхностного белка энтерококка. Индийский J Med Microbiol. 2017; 35 (1): 48.

    Артикул Google ученый

  • 44.

    Сено Й., Карияма Р., Мицухата Р., Монден К., Кумон Х. Клинические последствия образования биопленок Enterococcus faecalis в мочевыводящих путях. Acta Med Okayama.2005. 59 (3): 79–87.

    PubMed Google ученый

  • 45.

    Данни Г. Генетические функции и межклеточные взаимодействия в системе переноса феромон-индуцируемой плазмиды Enterococcus faecalis. Mol Microbiol. 1990. 4 (5): 689–96.

    CAS Статья Google ученый

  • 46.

    Бен Х.Й., Чайрат С., Хамди Н., Гарса Х., Бен Р.С., Себальос С., Торрес С., Бен К.С.. Устойчивость к противомикробным препаратам и генетические линии фекальных энтерококков диких птиц: появление vanA и vanB2, содержащих Enterococcus faecalis.Int J Antimicrob Agents. 2018.

  • 47.

    Freitas AR, Novais C, Ruiz-Garbajosa P, Coque TM, Peixe L. Клональная экспансия в клональном комплексе 2 и распространение устойчивых к ванкомицину плазмид среди различных генетических линий Enterococcus faecalis из Португалии. J Antimicrob Chemother. 2009. 63 (6): 1104–11.

    CAS Статья Google ученый

  • 48.

    Оравцова В., Зурек Л., Таунсенд А., Кларк А.Б., Эллис Дж.С., Чижек А., Литерак И.Американские вороны как носители устойчивых к ванкомицину энтерококков с геном vanA. Environ Microbiol. 2014; 16 (4): 939–49.

    CAS Статья Google ученый

  • 49.

    Тедим А.П., Руис-Гарбахоса П., Корандер Дж., Родригес С.М., Кантон Р., Виллемс Р.Дж., Бакеро Ф., Coque TM. Популяционная биология изолятов кишечного энтерококка госпитализированных и негоспитализированных лиц в разных возрастных группах. Appl Environ Microbiol. 2015; 81 (5): 1820–31.

    Артикул Google ученый

  • 50.

    Хиноны Д., Кобаяши Н., Нагашима С. Молекулярно-эпидемиологический анализ изолятов Enterococcus faecalis на Кубе с помощью мультилокусного типирования последовательностей. Microb Drug Resist. 2009. 15 (4): 287–93.

    CAS Статья Google ученый

  • 51.

    Cai J, Wang Y, Schwarz S, Lv H, Li Y, Liao K, Yu S, Zhao K, Gu D, Wang X. Изоляты энтерококка, несущие новый ген устойчивости к оксазолидинону optrA, из больниц в Чжэцзяне, Гуандун и Хэнань, Китай, 2010–2014 гг.Clin Microbiol Infect. 2015; 21 (12): 1095. e1091–4.

    Артикул Google ученый

  • 52.

    Zischka M, Künne CT, Blom J, Wobser D, Sakinç T., Schmidt-Hohagen K, Dabrowski PW, Nitsche A, Hübner J, Hain T. Комплексный молекулярный, геномный и фенотипический анализ основного клона Enterococcus faecalis MLST ST40. BMC Genomics. 2015; 16 (1): 175.

    Артикул Google ученый

  • % PDF-1.4 % 201 0 объект > эндобдж xref 201 80 0000000016 00000 н. 0000002590 00000 н. 0000002782 00000 н. 0000002818 00000 н. 0000003378 00000 н. 0000003507 00000 н. 0000003655 00000 н. 0000003784 00000 н. 0000003932 00000 н. 0000004061 00000 н. 0000004209 00000 н. 0000004338 00000 п. 0000004486 00000 н. 0000004615 00000 н. 0000004765 00000 н. 0000004894 00000 н. 0000005044 00000 н. 0000005172 00000 н. 0000005322 00000 п. 0000005451 00000 п. 0000005601 00000 п. 0000006347 00000 п. 0000006735 00000 н. 0000007012 00000 н. 0000007168 00000 н. 0000007323 00000 н. 0000007647 00000 н. 0000007684 00000 н. 0000008210 00000 п. 0000008517 00000 н. 0000008772 00000 н. 0000010576 00000 п. 0000010757 00000 п. 0000010982 00000 п. 0000012693 00000 п. 0000014396 00000 п. 0000016162 00000 п. 0000016320 00000 н. 0000016482 00000 п. 0000018382 00000 п. 0000018923 00000 п. 0000019052 00000 п. 0000020765 00000 п. 0000022460 00000 п. 0000024077 00000 п. 0000026770 00000 п. 0000036543 00000 п. 0000041822 00000 п. 0000046461 00000 п. 0000046877 00000 п. 0000046937 00000 п. 0000046983 00000 п. 0000048663 00000 п. 0000048881 00000 п. 0000049128 00000 п. 0000049329 00000 п. 0000050230 00000 п. 0000050430 00000 п. 0000050616 00000 п. 0000050815 00000 п. 0000051183 00000 п. 0000051386 00000 п. 0000068970 00000 п. 0000069042 00000 н. 0000069370 00000 п. 0000069489 00000 п. 0000069613 00000 п. 0000069750 00000 п. 0000069907 00000 н. 0000070029 00000 п. 0000070199 00000 п. 0000070356 00000 п. 0000070483 00000 п. 0000070624 00000 п. 0000070764 00000 п. 0000070914 00000 п. 0000071060 00000 п. 0000071216 00000 п. 0000071395 00000 п. 0000001896 00000 н. трейлер ] / Назад 263666 >> startxref 0 %% EOF 280 0 объект > поток hb«b«`c`PTe` @

    Характеристика клинических изолятов энтерококков со специальной ссылкой на чувствительность к гликопептидам в Центре третичной медицинской помощи Восточного Непала

    Предпосылки .Энтерококки, которые когда-то считались безвредными комменсалами кишечника, теперь стали важными с медицинской точки зрения патогенами и связаны как с внебольничными, так и с внутрибольничными инфекциями. Они могут проявлять устойчивость ко всем обычно используемым антибиотикам по врожденному или приобретенному механизму, что создает терапевтическую проблему. Цели . Это исследование было направлено на характеристику энтерококков до уровня вида и изучение их антибиотикограммы с особым вниманием к ванкомицину. Методы . Описательное поперечное исследование было проведено в отделении микробиологии Б.П. Институт медицинских наук Коирала, Дхаран, Непал, с февраля по май 2017 г. В этом исследовании был исследован 91 изолят энтерококков, выделенный из клинических образцов. Их идентификация и видообразование проводились в соответствии со стандартными микробиологическими рекомендациями. Методика дисковой диффузии Кирби-Бауэра использовалась для изучения картины чувствительности к противомикробным препаратам, тогда как минимальная ингибирующая концентрация ванкомицина определялась методом разведения в агаре в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов. Результатов . Было выделено семь различных видов энтерококков: E. faecalis и E. faecium , что составляет около 45% каждого. Другими встреченными видами были E . avium , E . cecorum , E . dispar , E . дюранов и E . raffinosus . Самая высокая доля чувствительности к противомикробным препаратам была зарегистрирована для линезолида (97,8%), за которым следует тейкопланин (95.6%) и гентамицин высокого уровня (81,3%). Чувствительность к ванкомицину наблюдалась у 79,1% изолятов. Аналогичным образом, 82,1% штаммов мочи были чувствительны к нитрофурантоину. В общей сложности при определении устойчивости к ванкомицину наблюдали 4 несоответствия между методом дисковой диффузии и методом разведения в агаре. Множественная устойчивость наблюдалась у 31,9% изолятов. Общая распространенность устойчивых к ванкомицину энтерококков на основе стандартного метода минимальной ингибирующей концентрации составила 25,3%. Выводы . Enterococcus faecalis и E. faecium были преобладающими видами, вызывающими энтерококковые инфекции. Тревожный рост распространенности ванкомицина и штаммов с множественной лекарственной устойчивостью требует немедленных, адекватных и эффективных программ эпиднадзора для предотвращения и контроля его распространения.

    1. Введение

    Энтерококки — это грамположительные, факультативно анаэробные кокки, которые могут образовываться в виде парных или коротких цепочек [1]. В последнее время они привлекают все большее внимание из-за их способности противостоять воздействию множества противомикробных агентов, что, следовательно, ограничивает терапевтические возможности и приводит к высокой смертности и заболеваемости.Отслеживание распространения энтерококков и знание их антибиотикограмм имеет первостепенное значение для предотвращения и контроля их распространения [2]. Они потенциально могут вызывать широкий спектр инфекций, например, инфекции мочевыводящих путей, инфекцию области хирургического вмешательства, бактериемию, внутрибрюшной и внутритазовый абсцесс, а иногда и менингит и пневмонию [3, 4]. Энтерококки обладают низким уровнем устойчивости ко всем аминогликозидам, что указывает на низкую эффективность в клинической практике. Предрасполагающими факторами, связанными с ростом энтерококковых инфекций, являются эмпирическое использование противомикробных препаратов, длительная госпитализация, инвазивная терапия и широкое использование иммунодепрессантов [2, 5, 6].Их способность передавать детерминанты генов устойчивости к антибиотикам между видами, а также другими бактериями ( Staphylococcus aureus ) является глобальной причиной беспокойства [7]. Ококки Enter могут легко распространяться различными путями передачи, такими как зараженная вода, инфицированное мясо животных, неодушевленные предметы и руки медицинских работников [7–9], что привело к широкому распространению энтерококковых инфекций, которые еще больше усугубляются способностью переносить широкий диапазон температуры и pH, высокую концентрацию соли и некоторые спиртовые растворы [7].

    Идентификация и видообразование изолятов энтерококков оказывают существенное влияние на терапевтический выбор, поскольку картина чувствительности к противомикробным препаратам варьируется между видами. Несмотря на то, что устойчивые к ванкомицину энтерококки (VRE) впервые были зарегистрированы в 1986 году из Великобритании и Франции, в последние годы было обнаружено, что они распространяются по всему миру [10]. VRE заметно выросла в 20 раз за последние два десятилетия, при этом уровень восстановления колеблется от 0% до 35% на международном уровне [11].Заболеваемость устойчивым к ванкомицину E. faecium в Азии еще низка; тем не менее о вспышках не сообщалось [7]. В Непале были проведены ограниченные исследования распространенности энтерококков в клинической среде, а по VRE имеется мало данных. В предыдущем исследовании нашего собственного центра в период с 2002 по 2003 год было документально подтверждено, что распространенность VRE среди E. faecalis и E. faecium составляет 13% и 17% соответственно [12]. Аналогичным образом, единственный штамм устойчивой к ванкомицину E.faecium был описан в исследовании пациента с перитонитом [13]. Аналогичным образом, в другом медицинском колледже было обнаружено, что 4 изолята из 41 являются промежуточным звеном ванкомицина методом разведения в агаре [14].

    Это исследование было проведено с целью охарактеризовать энтерококки до уровня вида и изучить их антибиотикограммы с особым вниманием к ванкомицину.

    2. Материалы и методы
    2.1. Дизайн и область исследования

    Описательное поперечное исследование было проведено в отделении микробиологии, Б.Институт медицинских наук П. Койрала, Дхаран, Непал, с февраля по май 2017 г. Использовалась методика последовательного отбора проб. В этом исследовании был проанализирован в общей сложности 91 изолят энтерококков, выделенных из различных клинических образцов, представленных в микробиологическую лабораторию для рутинного культивирования и тестирования чувствительности в течение периода исследования.

    2.2. Выделение и идентификация изолятов энтерококков

    Все клинические образцы, такие как кровь, гной, аспираты, мазок из раны, мазок из влагалища с высоким содержанием и перитонеальная жидкость, были засеяны на агар Крови и МакКонки, тогда как образец мочи был помещен на цистеин-лактозный агар. электролитодефицитная среда.Чашки с культурами инкубировали при 35 ° C в течение 24–48 часов. Для всех образцов крови использовали бульон из инфузии сердца мозга. Через 24 и 48 часов инкубации проводили пересев образца крови, как и других образцов. На следующий день отмечен рост. Энтерококки были идентифицированы на основании морфологии колоний, окрашивания по Граму, теста на каталазу, теста с желчью и эскулина и теста на солеустойчивость (6,5% NaCl). Дальнейшее видообразование проводилось на основе продукции пигмента, теста на подвижность и биохимических реакций в соответствии со стандартными микробиологическими рекомендациями [15, 16].

    2.3. Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам

    Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам изолятов энтерококков проводили методом дисковой диффузии (ДДТ) в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) против пенициллина (10 единиц), ампициллина (10 мкг г), ванкомицина ( 30 мкг г), тейкопланин (30 мк г), ципрофлоксацин (5 мк г), хлорамфеникол (30 мк г), линезолид (30 мк г) и гентамицин высокого уровня (120 мкг г) и, кроме того, нитрофурантоин (300 мк г) для изолятов мочи.С помощью прямой посевной проволоки отбирали 3-5 хорошо изолированных колоний одинаковой морфологии и переносили в пробирку, содержащую 5 мл бульона Мюллера-Хинтона. Бульонную культуру инкубировали при 35 ° C до достижения мутности 0,5 стандарта МакФарланда. Сравнение проводилось визуально при достаточном освещении на карте с белым фоном и контрастными черными линиями. После увеличения помутнения стерильный ватный тампон погружали в суспензию посевного материала в течение 15 минут.Излишки посевного материала с тампона удаляли путем его вращения и сильного прижатия к внутренней стенке пробирки над уровнем жидкости. Тампоны выращивали на лужайке по всей поверхности высушенной стерильной чашки с агаром Мюллера-Хинтона. После этого диски с противомикробными препаратами, поставляемые HiMedia Laboratories, Индия, наносили на поверхность засеянной чашки с агаром. Планшеты переворачивали и инкубировали в течение 15 минут при 35 ° C в течение 16-18 часов. В конце концов результат был прочитан и интерпретирован [17].

    2.4. Определение минимальной ингибирующей концентрации ванкомицина

    Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) ванкомицина определяли методом разбавления в агаре. В процессе использовали агаровую среду для инфузии мозга и сердца и порошок ванкомицина с эффективностью 950 мкг г / мг, полученный от HiMedia Laboratories, Индия. Процедуры проводились в соответствии с рекомендациями стандартных микробиологических руководств, а результаты сообщались со ссылкой на руководящие принципы CLSI. Самая низкая концентрация антибиотика, подавляющая видимый рост после рекомендованной инкубации, считалась МПК [17, 18].

    2.5. Расхождения между методами определения устойчивости к ванкомицину

    Было обнаружено, что ошибки, связанные с ДДТ при оценке устойчивости к ванкомицину среди изолятов энтерококков, классифицируются как «очень большая ошибка», «основная ошибка» и «незначительная ошибка» [19] . Если штамм, чувствительный по методу тестирования, демонстрирует устойчивость к стандартному методу сравнения с агаром / бульоном, то ошибка называется очень большой ошибкой. Напротив, основная ошибка определяется, как если бы штамм, устойчивый по методу тестирования, оказался чувствительным по методу сравнения с агаром / бульоном.Аналогичным образом, промежуточно восприимчивый штамм любым из методов, показывающий либо резистентность, либо чувствительность другим методом, рассматривается как незначительная ошибка [19, 20].

    2.6. Управление данными и статистический анализ

    Собранные данные были введены в Microsoft Excel 2016 и проанализированы статистическим пакетом для социальных наук (SPSS, версия 11.5). Описательная статистика была рассчитана и обобщена (частота, частота, соотношение, доля, процент и кросс-таблица).Статистические данные по коэффициенту Каппа Коэна ( K ) использовали для измерения соответствия между методом дисковой диффузии и методом разведения в агаре при определении устойчивости к ванкомицину. K Значение > 0,8 было сочтено «очень хорошим» согласованием. Согласно Коэну, значение K > 0,8 и <0,2, соответственно, указывает на «очень хороший» и «плохой» уровень соответствия. Аналогичным образом, статистика K между 0,61–0,80, 0,41–0,60 и 0,21–0,40 представляет хорошее, умеренное и удовлетворительное совпадение, соответственно.Критерий хи-квадрат использовался для сравнения наших результатов со значением ≤ 0,05, указывающим на статистическую значимость.

    3. Результаты

    В этом исследовании был проанализирован 91 штамм энтерококков, выделенных из различных клинических образцов. Среди этих изолятов 61,5% (56) были получены от госпитализированных пациентов, 8,8% (8) — из отделения неотложной помощи и 29,7% (27) — из амбулаторного отделения. Соотношение мужчин и женщин среди участников исследования составляло 1: 1. Большинство изолятов были получены из возрастной группы 0-10 лет (20.9%), затем следует возрастная планка от 20 до 30 лет (19,8%). Подробная информация о типах образцов, извлеченных из различных возрастных групп, приведена в таблице 1.

    311 1 1 9011 1 81 0 81 0 81 0 0 311311 81 0 0 911 911 911 0 0 0 0 311911 311 911 911 311 911 3 311911

    Возрастная группа в годах Типы образцов Всего
    Асцитическая жидкость Кровь Эндотрахеальная трубка Высокоэффективный вагинальный мазок Перитонеальная жидкость Гной Сперма Ткань Моча Раневый мазок
    4 0 0 0 2 0 1 12 0 19
    10–20 0 1 2 0 0 5 2 10
    20–30 1 0 0 1 0 0 3 0 1 11 1 18 18
    0 1 0 1 0 6 1 1 4 0 14
    40–50 0 0 1 0 0 8 0 10
    50–60 0 0 1 0 0 7 0 8
    > 60 0 0 0 0 0 0 0 9 0 12
    Всего 1 1 5 1 1 1 18 1

    На основании стандартного руководства по определению видов [15, 16] было идентифицировано семь различных видов энтерококков. E. faecalis и E. faecium вместе составили более 90% от общего числа изолятов. Наибольшая частота изолятов была извлечена из мочи (61,5%), за ней следовали гной (19,8%) и кровь (5,5%). Природа образца, из которого были выделены изоляты энтерококка, проиллюстрирована в Таблице 2.

    9111 9113 948cit 948cit (Ascit) 0 0 9 81 0

    81 0

    81 nus311 11 = 18) 3 911 911 0 3 911 911 0 3 911 81 0 119 952 952 952 Э.faecium был выше, чем у E. faecalis , по сравнению со всеми протестированными противомикробными агентами, кроме хлорамфеникола и ванкомицина. Ни один из изолятов E. cecorum , E. dispar и E. durans не был устойчив к какому-либо из протестированных антибиотиков. Самая высокая частота восприимчивости наблюдалась для линезолида (97,8%), за ним следовали тейкопланин (95,6%) и гентамицин высокого уровня (81,3%). 46 из 56 (82,1%) изолятов мочи были чувствительны к нитрофурантоину.Профиль устойчивости изолятов энтерококков к противомикробным препаратам представлен в таблице 3.


    Образцы E. avium E. cecorum E.dispar E. durans E. faecalis E. faecium E. raffinosus


    0 0 0 0 1 0
    Желчь ( n = 1) 0 0 0 0 0 0 0
    Кровь ( n = 5) 0 0 0 0 1 4 0
    Эндотрахеальная трубка 0 0 0 0 1 0 0
    Высокий вагинальный мазок ( n = 1) 0 1 0 0
    Жидкость в брюшной полости ( n = 1) 0 0 0 0 0
    1 0 1 1 6 7 2
    Сперма ( n = 1) 0 1 0 0
    Ткань ( n = 3) 0 0 0 0 2 1 моча = 56) 0 0 0 0 29 27 0
    Рневной тампон ( n = 3) 0 2 0 9 0311 0
    Итого ( n = 91) 1 1 1 2 42 41 3
    911 911 9117 0 311 911 911 0 11 0 11 0 27 (64,3) ,1 90z294 911 911 911 904 911 911 904 1

    Антибиотики E. avium ( n = 1) E. cecorum = 1) E. dispar ( n = 1) E. durans ( n = 2) E. faecalis ( n = 42) E. faecium ( n = 41) E.raffinosus ( n = 3) Всего ( n = 91)

    Пенициллин 1 (100) 0 0 7 28 (68,3) 1 (33,3) 37 (40,7)
    Ампициллин 1 (100) 0 0 0 7 (16,7) 27 (65311 911) 911,9 1 (33,3) 36 (39.5)
    Ванкомицин 1 (100) 0 0 0 11 (26,2) 7 (17,1) 0 19 (20,9)
    0 0 0 0 4 (9,8) 0 4 (4,4)
    Ципрофлоксацин 1 (100) 28 (68.3) 0 56 (61,5)
    Хлорамфеникол 0 0 0 0 14 (33,3) 7 (17,1) 03
    Гентамицин высокого уровня 0 0 0 0 5 (11,9) 12 (29,3) 0 17 (18,7) 903olid11
    Linear 0 0 0 0 2 (4.9) 0 2 (2,2)
    Нитрофурантоин 0 0 0 0 3 (10,3) 7 (25,9000)

    1 Только изоляты мочи были протестированы против нитрофурантоина, и 17,9% (10/56) штаммов были к нему устойчивы.

    Было обнаружено, что семьдесят два изолята чувствительны к ванкомицину через ДДТ; однако 4 штамма среди чувствительных изолятов выращивали на чашке с агаром, содержащей ванкомицин в концентрации 8 мг / л, и были классифицированы как незначительная ошибка.Несмотря на то, что каппа-согласие между ДДТ и методом разведения в агаре было сильным ( K = 0,88,), ДДТ не смог распознать пониженную чувствительность к ванкомицину у 4 изолятов энтерококков.

    Из 91 изолята энтерококков 23 (25,3%) оказались VRE методом разбавления агаром, из которых МИК ванкомицина против 13 E. faecalis , 5 E. faecium и 1 E. avium составлял 8–16 мг / л и считался среднеустойчивым к ванкомицину, тогда как оставшиеся 4 VRE выращивали на чашке с агаром, содержащей ванкомицин в концентрации 256 мг / л, и, следовательно, считались устойчивыми к ванкомицину высокого уровня (MIC ≥ 32 мг / л). L).Все эти 4 VRE с высокой устойчивостью были идентифицированы как E. faecium . В целом распространенность устойчивых к ванкомицину E. faecalis была выше, чем устойчивых к ванкомицину E . феций . Тем не менее, только видов E. faecium проявили наивысший уровень устойчивости к ванкомицину. МИК, наблюдаемые у различных изолятов энтерококков, суммированы в Таблице 4.

    9 411111 903 E. 42) 86 5 86 15

    Виды Enterococcus Значения МИК (мг / л)
    8 16 32 64 126 256

    E.avium ( n = 1) 0 0 0 1 0 0 0 0 0
    E. ce ( 1) 0 1 0 0 0 0 0 0 0
    E. 1 0 0 0 0 0 0 0
    E.durans ( n = 2) 0 1 1 0 0 0 0 0 0
    0 6 23 13 0 0 0 0 0
    E. faecium () 0 27 3 2 0 0 0 4
    E.raffinosus n = 3) 0 1 2 0 0 0 0 0 0
    Всего () 0 53 17 2 0 0 0 4

    Среди 91 штаммов энтерокитококков резистентность к 27,7%, против любой из протестированных антибиотиков.Однако множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) отмечена у 31,9% (29) изолятов. Распространенность МЛУ была самой высокой у E. faecium 62% (18/29). E. avium также показал устойчивость к трем классам антимикробных препаратов. Распространенность МЛУ и характер их резистентности показаны в Таблице 5.

    R3 3 0293

    Виды энтерококков Количество изолятов с множественной лекарственной устойчивостью
    R3

    E.faecium 8 5 5
    E. faecalis 6 2 2
    E. avium

    Общий МЛУ ( N , (%)) 15 (16,5) 7 (7,7) 7 (7,7)

    R3 = устойчивый к 3 классам антимикробных , R4 = устойчивость к 4 классам противомикробных препаратов, R5 = устойчивость к 5 классам противомикробных препаратов и MDR = множественная лекарственная устойчивость.

    4. Обсуждение

    Быстрое появление устойчивых видов Enterococcus связано с серьезными угрозами здоровью во всем мире. Текущая практика эмпирической терапии в различных частях восточного Непала и за границей, по-видимому, разрушает многие схемы лечения антибиотиками. Пациенты, посещающие из этих мест в наш справочный центр, как правило, нерационально употребляют антибиотики перед посещением для лечения. Это может быть из-за отсутствия надлежащей микробиологической диагностической лаборатории в их центре первичной медико-санитарной помощи.Другая причина, вероятно, может быть связана с отсутствием регулирования покупки антибиотиков без рецепта врача или недостаточной осведомленностью среди них о последствиях нерационального использования антибиотиков. В этом исследовании изучалась встречаемость видов энтерококков в различных клинических образцах и их характер чувствительности к противомикробным препаратам.

    В данном исследовании мы не наблюдали значительного преобладания E. faecalis над E. faecium . Аналогичный результат был также получен из Бразилии [4].В большинстве исследований сообщалось, что E. faecalis являются преобладающими видами энтерококков, за которыми следует E. faecium [3, 5, 21]. Повышенная доля E. faecium в нашем исследовании может быть связана с их способностью достигать устойчивости к нескольким антибиотикам. В отличие от вышеуказанных исследований, мы не встретили E. gallinarum , E. caseliflavus , E. solitarius и E. hirae.

    В текущем исследовании 91 изолят энтерококков был выделен из 5652 клинических образцов в течение четырехмесячного периода исследования.Однако в аналогичном исследовании, проведенном в нашем центре в период с марта 2002 г. по февраль 2003 г., только 50 изолятов энтерококков были извлечены из 8627 клинических образцов [12]. Это указывает на то, что энтерококки значительно () с годами стали одной из основных причин инфицирования человека. В отличие от предыдущего исследования, было выделено четыре новых вида Enterococcus , а именно E. cecorum , E. dispar , E. durans и E . raffinosus .Аналогичным образом было отмечено, что E. faecium , по-видимому, меняют характер энтерококковой инфекции с увеличением скорости их выделения. Коэффициент выздоровления энтерококков у госпитализированных пациентов и амбулаторных больных был почти одинаковым в обоих исследованиях. Тем не менее, большинство изолятов в этом исследовании были получены из мочи (56/91), за которыми следовали гной (18/91) и кровь (5/91), что противоречит анализу крови (15/50) и гноя (15%). / 50), являющаяся основным источником выздоровления энтерококков в предыдущем отчете.Общая распространенность VRE в нашем исследовании была вдвое (25,3%), чем в исследовании, проведенном около пятнадцати лет назад (11,7%). Доля встречаемости МЛУ была самой высокой у E. faecium в обоих исследованиях. С годами было обнаружено, что устойчивость к ванкомицину и ципрофлоксацину повышается по сравнению с хлорамфениколом и ампициллином. Повышенная частота резистентности к ванкомицину и ципрофлоксацину в нашем исследовании может быть связана с нерациональным использованием этих антибиотиков или, возможно, с изменением размера выборки.Аналогичным образом, в отчете нашего учреждения, опубликованном в 2014 г. [13], высокий уровень устойчивости к ванкомицину наблюдался у E. faecium , что согласуется с нашими выводами.

    В настоящем исследовании энтерококки, протестированные против широко используемых антибиотиков с помощью метода дисковой диффузии Кирби-Бауэра, показали самую высокую чувствительность к линезолиду (97,8%), за которым следовали тейкопланин (95,6%), гентамицин высокого уровня (81,3%) и ванкомицин. (79,1%), что было похоже на картину в других исследованиях, за исключением того, что в предыдущих исследованиях была отмечена более высокая частота высокого уровня устойчивости к гентамицину (HLGR), чем устойчивость к ванкомицину [2, 22].Низкая распространенность устойчивости к ванкомицину, тейкопланину и линезолиду наблюдалась в исследовании, проведенном в Китае [6]. Всего в нашем исследовании 4 изолята проявили устойчивость к тейкопланину. Все эти устойчивые к тейкопланину штаммы были E. faecium и также были устойчивы к ванкомицину. Аналогичные результаты были также получены из Мумбаи, Индия [23], тогда как более высокая распространенность устойчивых к тейкопланину энтерококков была зарегистрирована в другом штате Индии [1].

    В нашем исследовании распространенность паттерна резистентности к ампициллину и пенициллину составляла около 40% в каждом случае.Вывод, скорее всего, согласуется с отчетом из Бангалора, Индия [24]. Однако о более низкой и высокой распространенности резистентности к бета-лактамам сообщалось из штатов Западная Бенгалия [25] и Бихар [26], соответственно. Было обнаружено, что устойчивость к бета-лактаму чаще встречается у E. faecium , чем у E. faecalis , что согласуется с данными других исследований [6, 27]. Причиной может быть более низкое сродство между этими антибиотиками и пенициллин-связывающим белком (PBP) E. faecium и / или присутствие кодируемой плазмидой β -лактамазы в некоторых штаммах [28].Другое исследование показало, что резистентность, проявляемая изолятами энтерококка к β -лактаму, составляла до 95% [2].

    В текущем исследовании HLGR наблюдался у 18,7% изолятов энтерококков при применении ДДТ, что сопоставимо с результатами, зарегистрированными в Кувейте, 14% [29]. Однако частота встречаемости энтерококков HLGR оказалась выше в исследовании Bhatt et al., 65% [2], и Dadfarma et al., 43,7% [5]. Это может быть связано с использованием различных методов для получения высокого уровня устойчивости к гентамицину из нашего исследования; в предыдущих исследованиях сообщалось о HLGR на основе минимальной ингибирующей концентрации с помощью теста E и метода микроразбавления, соответственно.Было обнаружено, что среди 17 HLGR в нашем исследовании 82% (12 E. faecium и 2 E. faecalis ) связаны с устойчивостью к β -лактам. В текущем исследовании процент сопутствующей резистентности HLGR к β -лактам был выше, чем в отчетах из северного Тегерана, 61,3% [5], что может быть связано с большей долей E. faecium в нашем исследовании, чем в предыдущем. . Такие сопутствующие штаммы обладают потенциалом разрушать синергетический эффект аминогликозидов и комбинации β -лактама, следовательно, затрудняя терапию против энтерококковых инфекций.Таким образом, необходимо предпринять первые шаги, прежде чем это приведет к пандемии.

    Распространенность устойчивости к хлорамфениколу в нашем исследовании составила 23,1%. Этот результат находится в непосредственной близости с литературой из Саудовской Аравии — 22,7% [27]. Настоящее исследование показало, что процент устойчивости E. faecalis к хлорамфениколу был выше, чем у E. faecium , что согласуется с данными других исследований [3, 6]. Хлорамфеникол получил внимание как терапевтический вариант для лечения инфекций, вызванных VRE.Не было существенной разницы в уровне устойчивости к хлорамфениколу с предыдущим отчетом, опубликованным нашим собственным учреждением в 2007 году [12]. В текущем исследовании была отмечена значимая связь (значение ≤ 0,05) между VRE и чувствительными к хлорамфениколу энтерококками. Это открытие указывает на то, что хлорамфеникол можно использовать как крайне важное лекарство против VRE, что согласуется с другими исследованиями [30, 31]. Следовательно, его нельзя использовать без разбора.

    С другой стороны, частота встречаемости устойчивых к ципрофлоксацину энтерококков в нашем исследовании составила 61.5%. Этот результат аналогичен обнаружению, задокументированному в Саудовской Аравии, 61,9% [27]. Из 56 изолятов, выделенных из мочи, 76,7% изолятов были устойчивы к ципрофлоксацину. Однако более высокая и более низкая распространенность штаммов, устойчивых к ципрофлоксацину, среди изолятов мочи наблюдалась в других исследованиях соответственно [1, 22]. Высокая устойчивость к ципрофлоксацину, вероятно, может быть связана с его нерациональным использованием в качестве антибиотика широкого спектра действия против широкого спектра заболеваний. Энтерококки считаются второй по значимости причиной внутрибольничных инфекций мочевыводящих путей [24].Устойчивость к нитрофурантоину отмечена у 17,9% изолятов мочи. Этот результат ниже, чем в отчете из Ирана, 25,4% [32]. Более низкая распространенность устойчивости к нитрофурантоину в нашем исследовании указывает на то, что его можно использовать в качестве терапевтического средства при инфекциях мочевыводящих путей, вызванных энтерококковыми инфекциями.

    Общая распространенность VRE в нашем исследовании составила 25,3%. Подобно нашему исследованию, также сообщалось о частоте ВРЭ в Иране, 21,4% на основе МИК ванкомицина [32]. Тем не менее, этот результат ниже, чем в других отчетах, 39.6% [33], что выше, чем в других исследованиях [23, 34]. Такая разница в распространенности может быть связана с географическим положением, размером выборки, продолжительностью пребывания в больнице и использованием инвазивных устройств. Среди 23 штаммов VRE 4 E. faecium показали высокий уровень устойчивости к ванкомицину (MIC = 256 мг / л) и были получены из образцов мочи пациентов в крайнем возрасте (1 — педиатрический, 3 — гериатрический). E. faecium были достоверно (значение ≤ 0,05) показали высокий уровень устойчивости (МИК ≥ 32 мг / л) к ванкомицину в настоящем исследовании, что контрастирует с другими сообщениями [32], в которых E.faecium не сообщалось о значительной связи с высоким уровнем МИК ванкомицина среди устойчивых штаммов, что указывает на потенциальную способность как E. faecalis , так и E. faecium вызывать высокую устойчивость к ванкомицину. Разница может быть связана с меньшим размером выборки в нашем исследовании, чем в их исследовании. Несмотря на то, что значительных различий в энтерококковой инфекции в зависимости от пола не наблюдалось, преобладание мужчин (73,9%, 17/23) наблюдалось с устойчивостью к ванкомицину, что могло быть связано с большей долей пациентов мужского пола, чем женщин.Самая высокая частота штаммов VRE (21,7%) была обнаружена в каждом хирургическом и педиатрическом отделении. Эта картина согласуется с результатами, полученными в Бихаре, Индия [26], в которых частота восстановления VRE была больше в хирургическом отделении, и было обнаружено, что большинство мужчин колонизированы VRE. В целом, мы не обнаружили значительной связи между видами энтерококков и устойчивыми к ванкомицину штаммами; Напротив, во многих исследованиях сообщалось, что E. faecium являются преобладающими видами, проявляющими устойчивость к ванкомицину.

    Из общего числа изолятов энтерококков 31,9% показали МЛУ, которая определялась устойчивостью к одному или нескольким агентам, по крайней мере, в трех антимикробных категориях [35]. Было обнаружено, что доля МЛУ более распространена среди E. faecium (18/41) по сравнению с E. faecalis (10/42) и HLGR (14/17), чем среди не-HLGR (15/74). ) и устойчивости к ванкомицину (12/23) в отличие от штаммов, чувствительных к ванкомицину (17/68). Этот результат с большей вероятностью сопоставим с другими исследованиями [2, 5, 36], в которых более высокая распространенность МЛУ наблюдалась среди E.faecium , HLGR и VRE соответственно. Однако общая частота МЛУ в наших условиях была ниже, чем в других исследованиях [2, 5, 36].

    5. Заключение

    В нашем исследовании отмечается стремительный рост распространенности E. faecium в клинических образцах, что вызывает тревогу, поскольку он с большей вероятностью превосходит E. faecalis по вызывающим энтерококковые инфекции. Общая распространенность VRE и MDR в нашем исследовании составила 25,3% и 31,9% соответственно. Это изображение демонстрирует высокую частоту штаммов VRE и MDR в наших условиях.Следовательно, необходимо осуществлять регулярный эпиднадзор и эффективную программу инфекционного контроля, чтобы предотвратить ее распространение. Более того, необходимо неукоснительно соблюдать политику использования антибиотиков, чтобы свести к минимуму устойчивость к противомикробным препаратам. Из-за того, что ДДТ ошибочен для определения устойчивости к ванкомицину среди изолятов энтерококков, а также из-за нехватки ресурсов тест E недоступен, поэтому для лабораторного скрининга и мониторинга VRE рекомендуется использовать метод разведения в агаре.

    Аббревиатуры
    903
    VRE: Ванкомицин-устойчивые энтерококки
    ДДТ: Дисковая диффузионная техника
    CLSI: Клиническая и лабораторная концентрация
    K: Значение каппа-коэффициента Коэна
    MDR: Множественная лекарственная устойчивость
    HLGR: Высокая устойчивость к гентамицину.
    Доступность данных

    Данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

    Этическое разрешение

    Этическое разрешение было получено от Департамента исследований (DRU), Департамент микробиологии, B.P. Институт медицинских наук Коирала, Дхаран, Непал, ссылка № DRU / MICRO / 01/017.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

    Вклад авторов

    AK, RB и BK были вовлечены в концептуализацию. АК исследовал исследование. АК, РБ и БК предоставили методологию. РБ и Б.К. контролировали исследование. АК написал первоначальный черновик. РБ и Б.К. отвечали за рецензирование и редактирование рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

    Благодарности

    Авторы выражают благодарность кафедре микробиологии Б.П. Институт медицинских наук Коирала, Дхаран, Непал, за предоставление образцовой академической и исследовательской среды для проведения этого исследования.Авторы выражают сердечную благодарность всем преподавателям и сотрудникам кафедры микробиологии за поддержку во время исследования. Первый автор глубоко признателен доктору Лок Бахадур Шрестха за его постоянную поддержку и сотрудничество на протяжении всего исследования.

    KoreaMed Synapse

    1. Johansen TE, Botto H, Cek M, Grabe M, Tenke P, Wagenlehner FM и др. Критический обзор текущих определений инфекций мочевыводящих путей и предложение системы классификации EAU / ESIU.Int J Antimicrob Agents. 2011. 38: Дополнение. 64–70.

    2. Wagenlehner FM, Weidner W, Naber KG. Обновленная информация о неосложненных инфекциях мочевыводящих путей у женщин. Curr Opin Urol. 2009. 19: 368–374.

    3. Сюэ П.Р., Хобан Д.Д., Кармели Ю., Чен С.Ю., Десикан С., Алехандрия М. и др. Консенсусный обзор эпидемиологии и соответствующей антимикробной терапии осложненных инфекций мочевыводящих путей в Азиатско-Тихоокеанском регионе. J Infect. 2011. 63: 114–123.

    4. Neal DE Jr.Осложненные инфекции мочевыводящих путей. Urol Clin North Am. 2008. 35: 13–22. v

    5. Дреконья Д.М., ректор Т.С., Каттинг А., Джонсон-младший. Инфекция мочевыводящих путей у ветеранов-мужчин: схемы лечения и результаты. JAMA Intern Med. 2013. 173: 62–68.

    6. Оренштейн Р., Вонг ES. Инфекции мочевыводящих путей у взрослых. Я семейный врач. 1999. 59: 1225–1234. 1237

    7. Stamm WE, Hooton TM. Лечение инфекций мочевыводящих путей у взрослых. N Engl J Med. 1993. 329: 1328–1334.

    8. Суд С., Малхотра М., Дас Б.К., Капил А. Энтерококковые инфекции и устойчивость к противомикробным препаратам. Индийский J Med Res. 2008. 128: 111–121.

    9. Мацумото Т., Хамасуна Р., Исикава К., Такахаши С., Ясуда М., Хаями Х. и др. Общенациональное исследование антибактериальной активности клинических изолятов инфекций мочевыводящих путей в Японии (2008 г.). Int J Antimicrob Agents. 2011. 37: 210–218.

    10. Ли SJ, Lee DS, Choe HS, Shim BS, Kim CS, Kim ME, et al. Устойчивость к противомикробным препаратам при внебольничных инфекциях мочевыводящих путей: результаты Корейской системы мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам.J Infect Chemother. 2011. 17: 440–446.

    11. Хайке М.М., Сам Д.Ф., Гилмор М.С. Энтерококки с множественной лекарственной устойчивостью: характер проблемы и планы на будущее. Emerg Infect Dis. 1998. 4: 239–249.

    12. Ясуфуку Т., Сигемура К., Сиракава Т., Мацумото М., Накано Ю., Танака К. и др. Механизмы и факторы риска резистентности к фторхинолонам у клинических изолятов Enterococcus faecalis от пациентов с инфекциями мочевыводящих путей. J Clin Microbiol. 2011 г.49: 3912–3916.

    13. Ли Г., Чо Й., Шим Б.С., Ли С.Д. Факторы риска устойчивости к противомикробным препаратам среди штаммов Escherichia coli, выделенных от корейских пациентов с острым неосложненным циститом: проспективное общенациональное исследование. J Korean Med Sci. 2010. 25: 1205–1209.

    14. Исикава К., Мацумото Т., Ясуда М., Уэхара С., Муратани Т., Ягисава М. и др. Общенациональное исследование бактериальных патогенов, связанных с инфекциями мочевыводящих путей, проведенное Японским обществом химиотерапии.J Infect Chemother. 2011. 17: 126–138.

    15. Гуссенс Х., Ферех М., Вандер Стихеле Р., Эльзевиерс М. Проектная группа ESAC. Амбулаторное использование антибиотиков в Европе и связь с устойчивостью: межнациональное исследование базы данных. Ланцет. 2005. 365: 579–587.

    16. Hoban DJ, Lascols C, Nicolle LE, Badal R, Bouchillon S, Hackel M, et al. Чувствительность к противомикробным препаратам Enterobacteriaceae, включая молекулярную характеристику видов, продуцирующих бета-лактамазы с расширенным спектром действия, в изолятах мочевыводящих путей госпитализированных пациентов в Северной Америке и Европе: результаты исследования SMART 2009-2010.Диагностика Microbiol Infect Dis. 2012. 74: 62–67.

    17. Хуанг С.С., Чен Ю.С., Тох Х.С., Ли Ю.Л., Лю Ю.М., Хо С.М. и др. Влияние пересмотренных контрольных точек CLSI на чувствительность к цефалоспоринам и карбапенемам третьего поколения среди изолятов Enterobacteriaceae в Азиатско-Тихоокеанском регионе: результаты исследования по мониторингу тенденций устойчивости к противомикробным препаратам (SMART), 2002-2010 гг. Int J Antimicrob Agents. 2012. 40: Дополнение. S4 – S10.

    18. Хоран Т.С., Андрус М., Дудек М.А. Определение эпиднадзора CDC / NHSN для инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, и критериев для конкретных типов инфекций в условиях оказания неотложной помощи.Am J Infect Control. 2008. 36: 309–332.

    19. Пелег А.Ю., Хупер, округ Колумбия. Внутрибольничные инфекции, вызванные грамотрицательными бактериями. N Engl J Med. 2010. 362: 1804–1813.

    20. Сава И.Г., Хайкенс Э., Хюбнер Дж. Патогенез и иммунитет при энтерококковых инфекциях. Clin Microbiol Infect. 2010. 16: 533–540.

    21. Сибел А.К., Кероглу М, Мухаррем А.К. Оценка чувствительности энтерококков мочи к противомикробным препаратам с помощью автоматизированной системы Vitek 2 в восточной Турции.Юго-Восточная Азия J Trop Med Public Health. 2012. 43: 986–991.

    22. Моррисон А.Дж. младший, Венцель Р.П. Нозокомиальные инфекции мочевыводящих путей, вызванные энтерококком. Десятилетний опыт работы в университетской больнице. Arch Intern Med. 1986. 146: 1549–1551.

    23. Адам Д. Комбинации бета-лактамных / бета-лактамазных ингибиторов в эмпирическом лечении детских инфекций. J Int Med Res. 2002. 30: Дополнение 1. 10A – 19A.

    24. Лаутенбах Э., Метлей Дж. П., Мао X, Хан X, Фишман Н. О., Билкер В. Б. и др.Распространенность механизмов устойчивости к фторхинолонам в колониях изолятов Escherichia coli, полученных от госпитализированных пациентов. Clin Infect Dis. 2010. 51: 280–285.

    25. Смитсон А., Чико С., Рамос Дж., Нетто С., Санчес М., Руис Дж. И др. Распространенность и факторы риска устойчивости к хинолонам среди штаммов Escherichia coli, выделенных от мужчин с внебольничной фебрильной инфекцией мочевыводящих путей. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2012. 31: 423–430.

    26. van der Starre WE, van Nieuwkoop C, Paltansing S, van’t Wout JW, Groeneveld GH, Becker MJ, et al.Факторы риска развития фторхинолон-резистентной кишечной палочки у взрослых с фебрильной инфекцией мочевыводящих путей, возникшей в сообществе. J Antimicrob Chemother. 2011. 66: 650–656.

    27. Раттанаумпаван П., Толомео П., Билкер В. Б., Фишман Н. О., Лаутенбах Е. Факторы риска резистентности к фторхинолонам при инфекциях мочевых путей Enterococcus у госпитализированных пациентов. Epidemiol Infect. 2011. 139: 955–961.

    28. Roghmann MC, Wallin MT, Gorman PH, Johnson JA. Распространенность и естественный анамнез колонизации устойчивыми к фторхинолонам грамотрицательными бациллами у местных жителей с дисфункцией спинного мозга.Arch Phys Med Rehabil. 2006. 87: 1305–1309.

    29. Клар И., Констабель С., Мюллер-Бертлинг С., Вернер Г., Стромменгер Б., Кеттлитц С. и др. Распространение устойчивых к ампициллину / ванкомицину Enterococcus faecium эпидемически-вирулентного клонального комплекса-17, несущего гены esp и hyl, в больницах Германии. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005. 24: 815–825.

    30. Кларе И., Констабель С., Бадштубнер Д., Вернер Г., Витте В. Возникновение и распространение устойчивости к антибиотикам у Enterococcus faecium.Int J Food Microbiol. 2003. 88: 269–290.

    31. Пухто Т., Илипалосаари П., Охтонен П., Сырьяла Х. Распространенность точек и факторы риска инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в палатах первичной медико-санитарной помощи. Инфекционное заболевание. 2011. 39: 217–223.

    Использование CRISPR-Cas для управления популяциями Enterococcus faecalis

    Следует учитывать следующие важные комментарии:

    1) Авторы обнаружили, что значительная часть трансконъюгантов, по-видимому, является ускользающими мутантами, которые поддерживают содержащую спейсер плазмиду, нацеленную на реактивированный локус CRISPR.Некоторые из этих мутантов фактически утратили спейсер локуса CRIPPR. Было бы интересно узнать природу оставшихся мутантов (т.е. есть ли точечные мутации в спейсере-мишени, есть ли мутации второго сайта, которые влияют на функцию CRISPR или экспрессию гена cas и т. Д.).

    Это отличный комментарий рецензентов. Мы хотели бы отметить, что наши анализы делеции спейсера показывают, что несколько разных аллелей CRISPR (включая дикий тип, делецию одного спейсера и делецию двух спейсеров) сосуществуют в некоторых из наших экспериментов по последовательному пассажу (см. Рисунок 4).Мы пришли к выводу, что существует несколько различных эволюционных результатов конфликтов CRISPR с протоспейсерами, что рационализирует глубокий анализ секвенирования всех популяций.

    Мы предприняли это глубокое исследование секвенирования, но в системе E. faecalis T11, которая имеет 21 спейсер в его природном локусе CRISPR3-Cas. Мы провели углубленный анализ ампликона CRISPR и секвенирования всего генома на популяциях трансконъюгантов T11, которые были вынуждены поддерживать мишени CRISPR при выборе антибиотиков.Мы наблюдаем разнообразие в этих популяциях в локусе CRISPR и в cas9 . В частности, несколько различных мутантных аллелей CRISPR и cas9 аллелей одновременно встречаются в популяциях E. faecalis , которые вынуждены поддерживать плазмиды с протоспейсерами, конфликтующими с CRISPR-Cas. В этой работе всесторонне рассматривается вопрос о множественных механизмах, с помощью которых может происходить побег, с использованием подходов экспериментальной эволюции и популяционного генома. Эта работа будет отправлена ​​в публикацию этим летом.Мы надеемся, что обещания этого предстоящего исследования, в котором подробно рассматривается комментарий рецензента, хотя и в ином смысле, будет достаточно.

    Мы добавили предложение к Обсуждению, в котором говорится, что необходимо провести исследование секвенирования генома на популяционном уровне. Мы также внесли несколько изменений по всему документу, чтобы более точно описать дизайн и результаты наших анализов удаления спейсера.

    2) На протяжении всей рукописи сложно отследить различные штаммы, генетическое происхождение и конструкции.Рассмотрите возможность добавления диаграмм к рисункам 7, 8 и 10, которые показывают генотипы штаммов-реципиентов, как на рисунке 3.

    В рисунки включены

    диаграмм. Мы надеемся, что эти диаграммы помогут в интерпретации рисунков.

    3) Авторы отмечают, что в терминальных повторах CRISPR1 не наблюдается внутренней вырожденности. Они продолжили доказывать, что вырождение терминального повтора CRISPR2 вызывает потерю функции терминального спейсера (как следует из наблюдения, что частота конъюгации эквивалентна, показывая отсутствие функции терминального спейсера).Но они также наблюдали это явление для терминального спейсера в локусе CRISPR1. Это кажется противоречивым, и его следует прояснить, а также связать это наблюдение с некоторым уровнем избирательного преимущества из-за его бесполезности.

    Концевые повторы CRISPR1 и CRISPR2 являются вырожденными, но вырожденность происходит в разных положениях нуклеотидов. Это показано на Рисунке 2 — добавлении к рисунку 2. Приносим извинения за путаницу по этому поводу. Мы отредактировали Обсуждение, чтобы удалить предложения, которые сбивали с толку этот момент.

    4) Что касается того факта, что деградация мишени не является немедленной, а постепенной, авторы представляют свои результаты как уникальные для энтерококков (подраздел «Влияние несовместимости CRISPR-плазмиды на поддержание плазмид и спейсеров», последний абзац; подраздел «CRISPR-опосредованное» устранение устойчивости к антибиотикам », первый абзац; Обсуждение, третий и четвертый абзацы). Однако нельзя исключать, что фенотип обусловлен низкой экспрессией Cas9, что может приводить к неэффективному расщеплению.Это хорошо задокументировано во многих исследованиях редактирования генома. Поскольку ген cas9 был искусственно введен для активации CRISPR2 и он не является нативным для этого штамма, результаты нельзя интерпретировать как уникальное свойство E. faecalis.

    Это правда, что мы искусственно ввели cas9 в V583 для создания штамма V649. Однако мы хотели бы сделать два уточняющих момента.

    Во-первых, многочисленные трансконъюганты возникают во время оценки защиты CRISPR1-Cas от конъюгации в ATCC 4200RF и OG1RF, оба из которых изначально обладают системой CRISPR1-Cas.Это говорит о том, что относительная экспрессия cas9 сходна в этих штаммах и V649, поскольку оба демонстрируют большие CRISPR-популяции «ускользания». Кроме того, в предыдущем исследовании (PMC48

    ) нашей группы также были сделаны аналогичные наблюдения для собственной системы CRISPR3-Cas в E. faecalis T11. Тот факт, что это явление наблюдается для двух разных природных систем CRISPR-Cas типа II в E. faecalis , указывает на то, что искусственно заниженная экспрессия cas9 в V649 не объясняет результаты, полученные с этим штаммом.

    Во-вторых, при создании штамма V649 мы позаботились о сохранении нативной экспрессии cas9 в меру наших возможностей. Нам не удалось идентифицировать сайт начала транскрипции CRISPR1- cas9 в штамме ATCC 4200 с использованием удлинения праймера. Однако в неопубликованных исследованиях мы создали несколько промоторных репортерных конструкций с использованием предполагаемой промоторной области CRISPR1- cas9 . Для вставки cas9 в хромосому V583 мы включили всю межгенную область выше cas9 , включая предсказанный терминатор транскрипции, который находится дистально выше нативного cas9 и связан с гомологом OG1RF_10403 (это ген перед cas9 ).Согласно нашим неопубликованным репортерным данным, этот регион содержит активный промотор. Короче говоря, мы считаем, что сохранили собственный промотор cas9 во время создания V649.

    Однако автор обзора абсолютно прав в том, что нативная экспрессия cas9 может быть недостаточной для обеспечения надежной защиты генома у E. faecalis . Если бы это было правдой, это еще больше расширило бы наши знания о биологической роли нативных систем CRISPR в E. faecalis. Можно предположить, что E.faecalis развил низкую экспрессию cas9 , чтобы противостоять мишеням CRISPR и, таким образом, легче принимать чужеродную ДНК. Многочисленные статьи, на которые мы ссылались в тексте, продемонстрировали неспособность целей CRISPR и систем CRISPR сосуществовать в одной ячейке. В связи с этим, даже если экспрессия cas9 низкая, наши результаты по-прежнему дают представление об уникальном аспекте биологии CRISPR E. faecalis . Это объяснение было включено в обсуждение.Мы также упоминали, что E. faecalis проявляет фенотип, аналогичный P. aeruginosa при столкновении с мишенями CRISPR, и поэтому это свойство не может быть полностью уникальным для энтерококков.

    5) Что касается предложения о том, что «несовместимость CRISPR может использоваться для удаления определенных MDR E. faecalis из популяции in vitro», существует несколько очевидных ограничений. Один из них касается важности такой технологии, если она может быть реализована только in vitro. Это чрезмерное толкование? Было бы полезно дополнительное разъяснение того, как это можно было бы применить.Как бы то ни было, трудно представить трансформацию штаммов плазмидами, несущими «конфликтующий» спейсер, а затем применение отбора антибиотиков для плазмиды, содержащей нацеливающий спейсер, что также приведет к отбору устойчивых к антибиотикам организмов, что противоречит первоначальному замыслу. Эта проблема также появляется в конце обсуждения: не будет ли распространение конъюгативной плазмиды также способствовать распространению устойчивости к антибиотикам? Эти внутренние конфликты должны быть разрешены, поскольку утверждается, что влияние прогресса вытекает как из нового знания, так и из его потенциала для применения.

    Доказано, что

    феромон-чувствительные плазмиды (PRP) способны размножаться in vivo среди популяций E. faecalis в природе и распространять полезные признаки, отличные от устойчивости к антибиотикам. Действительно, в настоящее время мы разрабатываем систему, которая развертывает весь механизм CRISPR на PRP для in vivostudies, так что система может быть доставлена ​​к штаммам, которые могут эндогенно не иметь cas9 . Кроме того, мы планируем использовать PRP, который кодирует бактериоцин, чтобы обеспечить конкурентное преимущество, имитируя выбор антибиотиков, который мы использовали в этом исследовании.Этот момент поясняется в Обсуждении. Кроме того, мы предполагаем, что распространение встречающегося в природе конъюгативного вектора, нацеленного на гены устойчивости к антибиотикам, поможет предотвратить распространение других конъюгативных векторов, которые несут эти гены устойчивости к антибиотикам.

    Другими проблемами, которые необходимо решить при использовании этих конструкций in vivo, являются пространственная неоднородность и степень разведения в кишечнике. Мы обратимся к этим вопросам в будущих исследованиях.

    6) Почему авторы считают, что Э.faecalis может укрывать системы и цели CRISPR / Cas, не умирая? Это напоминает предыдущую работу с P. aeruginosa с несовершенными последовательностями crRNA-мишеней (см. Работу из лаборатории G. O’Toole). Являются ли crРНК на 100% комплементарными по отношению к цели, и, во-вторых, запускается ли реакция повреждения ДНК? Стоимость приспособленности может быть результатом либо замедления темпов роста, либо увеличения скорости гибели клеток. Окрашивание живых мертвецов и / или использование репортера повреждений ДНК поможет решить эту проблему.

    Да, сгенерированные здесь crRNA на 100% комплементарны цели.Об этом сейчас говорится в Материалах и методах.

    Мы благодарим рецензентов за этот проницательный комментарий о реакции на повреждение ДНК. Интересно, что мы не наблюдаем индукцию recA, признака SOS-ответа, у трансконъюгантов с конфликтующей конструкцией CRISPR. В качестве контроля мы индуцировали ответ на повреждение ДНК левофлоксацином и, как и ожидалось, наблюдали повышение уровня транскрипта recA . Мы также выполнили окрашивание этих трансконъюгантов в живом / мертвом состоянии в соответствии с запросом и увидели небольшое, но значительное увеличение гибели клеток у трансконъюгантов, несущих хромосомную направленность CRISPR.Эти данные были включены в наши пересмотренные документы как Рисунок 7 — приложение к рисунку 1.

    https://doi.org/10.7554/eLife.26664.026 .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Вся информация, размещенная на сайте, носит ознакомительный характер и не является руководством к действию. Перед применением любых лекарств и методов лечения необходимо обязательно проконсультироваться с врачом. Администрация ресурса osteohondroz24.ru не несет ответственность за использование материалов, размещенных на сайте. Копирование материалов разрешается только с указанием активной ссылки на сайт.