Hiv перевод: CDO — Ошибка — 404

Содержание

Перевод песни Down Low H.I.V.

H.I.V.

He’s crawling thru your blood,
He’s coming thru your cells…
When you don´t protect yourself, he strikes you
Do you know who he is? It’s the H.I.V.

Here we go, check it out!
Running thru your blood,
Intervening thru your cells,
I’ll be your worst nightmare,
So you can go and tell.
My duty is to take you off this earth,
Since your birth,
Let me tell you
How I go to work and how it hurts.
In the 20th century they invented me,
Swallowed many medicine, tackled many vaccines
Still standing here on my own and I can’t wait to get up in your home.

I’ll destroy your life and even take your wife,
So you better think twice
Before you take that price…
I’m coming in a midnight creep,
Watch ya family weep,
Slowly putting that ass to sleep.


I’m much greater as the dominator,
You and me one and one
I know, I’m the remainder,
Hopefully I go down in history as a memory,
You know my name.
I’ll be the H.I.V. !

Somebody please help me, cause I am falling (come on)
I’m going down, can’t you hear me calling (huh)
Can’t you see, what’s going on with me
Oh! I need someone to help me!… (I’ll be the H.I.V.)
Somebody please help me, cause I am falling
I’m going down, can’t you hear me calling (huh)
Can´t you see, what’s going on with me
Oh! I need someone to help me!… (I’ll be the H.I.V.)

Life is born from unprotected sex,
Life is born,
Sharing needles with the next.
Catch the context as I start to move it on,
Listen-up out there to the facts of the song.

No feeling when I´m coming to your heart,
Destroy your whole family just to do my part.
Can you hear me? Yo!
You do, in twenty more seconds I´ll be inside of you,
Slowly see his or her health begins to fall,
And sooner ot later I hear the phone call,
Protect yourself or get you a partner that´s true.
Or I´ll be coming yo you, pump it thru!
Thanks for the media for giving me attention,
And while I´m in your mind,
I like to mention, diseases of this world are family to me
Cause I´ll be the one you hate, I´ll be the H.I.V. !!

Somebody please help me, cause I am falling (come on)
I’m going down, can’t you hear me calling (huh)
Can’t you see, what’s going on with me
Oh! I need someone to help me!… (I’ll be the H.I.V.)

Somebody please help me, cause I am falling
I’m going down, can’t you hear me calling (huh)
Can´t you see, what’s going on with me
Oh! I need someone to help me!… (I’ll be the H. I.V.)

ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)

Он расползается по твоей крови,
Он проникает в твои клетки…
Когда не защищён ты, тебе удар наносит.
Тебе известно кто же он? Это ВИЧ.

И ещё раз, взгляни!
Протекая по твоей крови,
Вторгаясь в твои клетки,
Я буду твоим худшим кошмаром,
Так что ты можешь идти и рассказать.
Мой долг стереть с лица земли тебя ,
С самого твоего рождения,
Позволь тебе рассказать,
Как я действую и боль какую причиняю.
В двадцатом веке меня они открыли,
Глотали лекарства и бились над вакцинами.

Я всё ещё здесь и не дождусь, чтобы пробудиться в твоем доме.

Я разрушу твою жизнь и даже заберу твою жену,
Так что тебе лучше дважды подумать,
Прежде чем заплатить такую цену…
Я прихожу ночью с мурашками по коже,
Смотрю, как твоя семья рыдает,
Медленно усыпляя этого придурка.
Я гораздо больше, и тебя я контролирую,
Ты и я, мы один на один.
Я знаю, что в остатке лишь только я останусь,
Надеюсь я войду в историю как воспоминание,
Тебе известно мое имя.
Я буду ВИЧ!

Кто нибудь, помогите мне, я падаю (ну же!).
Я иду ко дну, разве ты вы не слышите мой крик (ха).
Разве вы не видите, что со мной происходит.
О! Нужно чтобы мне кто-то помог!…(Я буду ВИЧ)
Кто-нибудь, пожалуйста, помогите мне, ведь я падаю.

Я иду ко дну, разве ты вы не слышите мой крик (ха).
Разве вы не видите, что со мной происходит.
О! Нужно чтобы мне кто-то помог!…(Я буду ВИЧ)

Незащищенный секс даёт начало жизни,
Жизнь рождается,
Когда пользуешьcя одной иглой с приятелем.
Улавливай контекст, пока я продолжаю дальше,
Прислушайся внимательно ты к фактам этой песни.
Ничего не ощутишь ты, когда вхожу в твоё я сердце,
И разрушая всю твою семью, своё лишь делаю я дело.
Ты слышишь меня? Эй!
Секунд за двадцать с лишним буду внутри тебя я,
Неспешно наблюдая, как здоровье он или она теряет,
И рано или поздно услышу звонок я телефонный,
Защити себя или стань участником, и в этом вся правда.
Или я приду, эй, за тобой, пойми это!

И вам пасибо СМИ, что уделили мне внимание,
И пока я в твоих мыслях,
Упомяну не без радости я,
Все болезни этого мира — моя это семья.

Кто нибудь, помогите мне, я падаю (ну же!).
Я иду ко дну, разве ты вы не слышите мой крик (ха).
Разве вы не видите, что со мной происходит.
О! Нужно чтобы мне кто-то помог!…(Я буду ВИЧ)
Кто-нибудь, пожалуйста, помогите мне, ведь я падаю.
Я иду ко дну, разве ты вы не слышите мой крик (ха).
Разве вы не видите, что со мной происходит.
О! Нужно чтобы мне кто-то помог!…(Я буду ВИЧ)

перевод, произношение, транскрипция, примеры использования

Её анализы дали положительный результат на СПИД.

Он преподаёт искусство с помощью наглядных пособий. 

Национальное управление по контролю за распространением СПИДа (США) 

От СПИДа по-прежнему нет лекарства. / СПИД всё ещё неизлечим. 

Пневмония является распространённым осложнением СПИДа. 

Самым серьёзным неконтролируемым заболеванием является СПИД. 

We saw a tragic play about a man with AIDS. 

Мы увидели трагическую пьесу о человеке, больном СПИДом. 

Please don’t advertise the fact that he has AIDS. 

Пожалуйста, не афишируйте, что у него СПИД. 

The drug has been approved as a treatment for AIDS. 

Данный препарат одобрен в качестве средства для лечения СПИДа. 

AIDS remains a big problem in many parts of the world. 

СПИД по-прежнему остаётся большой проблемой во многих частях мира. 

He received blood that was infected with the AIDS virus. 

Ему перелили кровь, которая была инфицирована вирусом СПИДа. 

An AIDS outreach program for prostitutes on the streets.

Программа профилактики СПИДа среди уличных проституток. 

Welfare spending aids economic development in three ways. 

Расходы на соцобеспечение способствуют экономическому развитию тремя способами. 

Freddie died in 1982 after losing his battle against AIDS. 

Фредди умер в 1982 году, проиграв свою борьбу против СПИДа. 

The official number of people carrying the AIDS virus is low. 

По официальным данным, число людей, являющихся носителями вируса СПИД, невелико. 

Two-thirds of the adult population there has contracted AIDS. 

Там две трети взрослого населения заражено СПИДом. 

It was important to dispel the myth that Aids was a gay disease. 

Важно было развеять миф о том, что СПИД является болезнью гомосексуалистов. 

AIDS victims often experience social ostracism and discrimination. 

Жертвы СПИДа нередко подвергаются общественному остракизму и дискриминации. 

Their purpose is to elevate AIDS to the top of government priorities.

Их цель заключается в том, чтобы поднять СПИД на вершину приоритетов правительства. 

They may have contracted HIV, which can later develop into full-blown AIDS. 

Возможно, они являются носителями ВИЧ, а потом заболеют СПИДом. 

Health officials have tried to raise awareness (=improve people’s knowledge) about AIDS. 

Руководители органов здравоохранения попытались повысить осведомлённость (улучшить знания) населения о СПИДе. 

Before AIDS, many health care experts believed that large-scale infectious diseases were a thing of the past. 

До появления СПИДа многие медицинские эксперты считали, что крупномасштабные инфекционные заболевания уже в прошлом. 

COVID-19 Vaccine Info and Other FAQs

This page has information and frequently asked questions about COVID-19, including vaccines, symptoms, testing guidance, and the investigation process.

  • Para traducir esta página a otro idioma, encuentre este botón en la parte inferior de la página.
  • Щоб перекласти цю сторінку на іншу мову, знайдіть цю кнопку внизу сторінки.
  • Чтобы перевести эту страницу на другой язык, найдите эту кнопку внизу страницы.
Frequently Asked Questions
COVID-19 Vaccine Information

The COVID-19 Vaccine is our best way back to normal. .

In the United States there are 3 vaccines approved for use: Pfizer-BioNTech Moderna, and Janssen (Johnson & Johnson). The Pfizer and Moderna vaccines use mRNA technology and require 2 doses to be fully effective. The Pfizer vaccine can be used in people 12 and older with vaccinations spaced at least 21 days apart. The Moderna vaccine can be used in people 18 years and older with the vaccinations spaced 28 days apart. The Janssen vacine is an adenovirus vaccine and only requires one dose. It’s available for those 18 and older.

On August 23, 2021, the Pfizer vaccine received full FDA approval for those 18 and older. The vaccine is called Comirnaty and is the same vaccine that has been available since December 2020.

The vaccines were made quickly, but are safe to get. All 3 vaccines were reviewed by the federal Advisory Committee on Immunization Practices and the western states Scientific Safety Review Workgroup. The groups reviewed information and data to ensure they could safely recommend the vaccines and for which populations.

For more information on COVID-19 vaccine please see the WA Dept of Health and CDC websites:

Where Can I Go, If I Am Eligible to Get the COVID-19 Vaccine?

Everyone 12 and older is eligible to get a COVID-19 vaccination. Please contact your healthcare provider or check out the DOH Vaccine Locator page.

What is COVID-19?

COVID-19 is an illness caused by SARS-CoV-2, a novel coronavirus. Coronaviruses are common throughout the world and generally cause mild to moderate illness, however COVID-19 is a newly known virus that people haven’t been sick with before. Coronaviruses are a cause of the common cold and COVID-19 is a coronavirus that can cause more serious respiratory illness in people.

The Centers for Disease Control and Prevention, Washington Department of Health, and the Grant County Health District are closely monitoring the COVID-19 pandemic. Everyone is still learning about this virus. The pandemic began in China, but cases have been confirmed in nearly every other country in the world.

What Are The Symptoms of COVID-19?

Symptoms of COVID-19 are similar to other respiratory illnesses and include:

  • Cough
  • Shortness of Breath (or other respiratory symptoms)
  • Fever (>100.4°F) or feeling feverish
  • Chills
  • Sore throat
  • Muscle Ache
  • Headache
  • Sinus congestion
  • Runny nose
  • New loss of smell or taste
  • Other less common symptoms include nausea, vomiting, or diarrhea

    If you have a cough or shortness of breath you should call your doctor to see if you can be tested for COVID-19. If you have any two of the other symptoms, you should also call your doctor to see if can be tested.

Should I Be Tested for COVID-19?

If you feel sick, you should call your doctor. If you have a cough or shortness of breath you may need to be tested for COVID-19. If you have any two of the following symptoms, you should also call your doctor to see if can be tested: fever or feeling feverish, chills, sore throat, muscle ache, headache, or a new loss of taste or smell.

If you are a close contact of someone diagnosed with COVID-19 you should also contact your doctor to be tested. The best time to be tested is 5-7 days after you were exposed.

Close contacts are defined as someone who was within 6 feet of an infected person for a cumulative total of 15 minutes or more over a 24-hour period. This could be 1 longer expose, like having lunch with someone where you were sitting closer than 6 feet, or several shorter exposures like 5, 3-minute exposures where you talked to someone closer than 6 feet during a day. People with COVID-19 can spread the virus starting 2 days before symptoms start.

How Does COVID-19 Spread?

Like the common cold or influenza viruses, COVID-19 spreads:

  • Most commonly via respiratory droplets produced when an infected person coughs, sneezes, sings, or talks.
  • It can also spread through airborne articles that are formed when a person who has COVID-19 coughs, sneezes, sings, talks, or breathes.
  • It spreads between people who are in close contact with one another (within about 6 feet for a total of 15 minute or more within 24 hours).
How Can I Protect Myself from COVID-19?

Steps you can take to prevent spread of flu and the common cold will also help prevent coronavirus:

  • Practice physical distancing by staying 6 feet away from those around you when you go in public including at the grocery store, at the park, and at the doctor’s office
  • Wash hands often with soap and water. If not available, use hand sanitizer with more than 60% alcohol
  • Avoid touching your eyes, nose, or mouth with unwashed hands.
  • Avoid contact with people who are sick.
  • Cover your mouth/nose with a tissue or sleeve when coughing or sneezing.

The best thing you can do to protect yourself and others is to get vaccinate!

How Can I Protect Those Around Me?
  • Always wear a face covering like a fabric mask or bandana when you go out in public such as to work or the grocery store. For more information on how to make your own mask, please see our Resources Page.
  • Wash your hands often with soap and water. If handwashing isn’t available, use hand sanitizer with more than 60% alcohol
  • Stay home while you are sick and avoid close contact with others.
Do I Have to Wear a Face Covering?

The short answer is yes, you need to wear a face covering (mask) anytime you are in public and cannot maintain 6 feet distancing between yourself and others.

Unless you have an exemption, per Order of the Washington State Secretary of Health you are required to wear a face covering (PDF):

  • In indoor public settings, including:
    • Inside any building, including any business open to the public;
    • In healthcare settings including, but not limited to, a hospital, pharmacy, medical clinic, laboratory, physician or dental office, veterinary clinic, or blood bank; and
    • While in line to enter one of the above, or while waiting for or riding on public transportation or paratransit or while in a taxi, private car service, or ride-sharing vehicle.
  • In outdoor public settings, including public parks, trails, streets, and recreation areas, when six feet of physical distancing cannot be maintained between individuals who do not share a household.

This is one easy effort to assist with reducing the spread of COVID-19 as the County opens up to more public interactions. There is rising evidence that face coverings reduces the spread of the virus in settings outside of the home, such as settings where it is not possible to maintain 6 feet distance between yourself and others. Wearing a mask is not about protecting yourself it is about protecting those around you. It truly is about everyone else and is selfless act of kindness.

What is GCHD Doing for COVID-19 Response?

Grant County Health District is very involved in COVID-19 response and recovery efforts. We communicate daily with local and state partners to ensure that effective prevention measures and response strategies are in place as the situation evolves. We partner with healthcare facilities, businesses, farms, other local health jurisdictions, community advocates, and local and state agencies to address COVID-19. We also talk to local and state elected officials, both to stay informed and to inform them of our local response efforts.

GCHD investigates and contacts all Grant County residents who are diagnosed with COVID-19 (test positive). Part of the investigation includes contacting close contacts of positive cases. Because of the high rate of COVID-19 cases in Grant County right now, GCHD is not able to do contact tracing. Each person diagnosed with COVID-19 is asked to tell their close contacts to quarantine 14 days. GCHD will provide letters to close contacts for employers when needed. Everyone we contact who has been tested or is symptomatic is asked to isolate. Close contacts who don’t have symptoms (asymptomatic) are asked to quarantine.

How Does GCHD Investigate Cases and What is Contact Tracing?

We get notified about positive test results from healthcare providers or the testing labs themselves. Once we are notified of a positive case, we contact the person and begin our investigation. We ask the person multiple questions including demographics (age, sex, race), what are their symptoms and where they have been to try to find out where they might have been exposed or where they might have spread the illness. We also ask if they’re been hospitalized, if they work outside the home, if they know where they might have gotten it. Part of the investigation is gathering a list of close contacts.

Contact tracing is the process to identify a positive case’s close contacts: people they have been within 6 feet of for a combined total of 15 minutes in 24 hours. This could be all at one time or through several, shorter duration exposures. Contact tracing is not new to GCHD! Even before COVID-19, we’ve used the same process for communicable disease investigations such as tuberculosis, measles, or mumps. For COVID-19, we’ve been tracing close contacts since the first Grant County case. Each positive case can have few or many close contacts and we call them all. When we call close contacts, we do not tell them who it was that tested positive for COVID-19 unless we have permission from the patient.

GCHD may also work with an employer to identify additional close contacts and set up an employee screening plan to prevent further illness within the business. More information on contact tracing can be found on these flyers: English / Spanish

Information collected during interviews is used only by public health agencies. The information is protected in secure systems and individual information is not shared with anyone else. Interviewers operate under strict confidentiality rules.

Once we have all the data, GCHD staff enter it into the Washington Disease Reporting System (WDRS). That is Washington’s database of all notifiable conditions. Notifiable conditions are illnesses that must get reported to public health. Some other notifiable conditions are E. coli, salmonella, chlamydia, hepatitis, and tuberculosis. Our data gets combined with other state data so everyone can see how our state is doing with their response effects and who is being affected.

What’s the Difference Between Quarantine and Isolation?

Quarantine and isolation are two words that are getting used a lot during the COVID-19 pandemic. Sometimes people may use them interchangeably, but they aren’t the same thing.

Quarantine is used for people who aren’t sick, but we worry may become sick. This would be used for asymptomatic close contacts of positive cases. Quarantined people need to stay at home until their quarantine period is done. Currently quarantine lasts 14 days.

Isolation is used for people who are sick. They are symptomatic or tested positive for COVID-19. Not everyone who tests positive for COVID-19 shows symptoms, but they can still spread the disease. Isolation means that people are supposed to stay away from everyone, even people in their own homes. This may mean you stay in a bedroom with it’s own bathroom or it may mean you stay in an isolation location that is away from your home. Isolation locations may be hotels, former long term care facilities, or other places that are set up specifically to house those who are sick.

GCHD will not forcibly removed people from their homes or separate children from their families. People who need to be isolated may be given the option to isolate outside their homes.

How long should I isolate or quarantine if I have COVID-19 or have been exposed to COVID-19? English / Spanish / Ukranian / Russian

Where Can I Get More Information on COVID-19?

No one knows everything about this virus, and information and recommendations change as we learn more. Get your information from trusted sources:

  • For information about the outbreak in Washington please see the Washington Department of Health COVID-19 website.
  • For information on the State of Washington’s response and recovery, please see the Washington State Coronavirus Response website. www.who.int
  • For detailed national information including a complete national situation summary, updated statistics, and CDC response and recommendations, visit the CDC 2019 Novel Coronavirus web page.
  • The Washington State Department of Health has established a call center to address questions from the public. If you have questions about what is happening in Washington, how the virus is spread, and what to do if you have symptoms, please call 1-800-525-0127 and press #. The call center cannot give you testing results.
  • For information on the global situation and response efforts, please see the World Health Organization website.

Часть пособий от соцзащиты пермякам будет выплачивать ПФР

К этим выплатам относится, например, единовременное пособие при рождении ребенка Фото: depositphotos.com

Пенсионный фонд России с 1 января 2022 года будет предоставлять жителям региона ряд выплат, компенсаций и пособий, которые прежде назначали и выплачивали органы социальной защиты и Роструд. Об этом сообщает сайт ПФР по Пермскому краю.

Речь идет о пособиях, выплатах, компенсациях для пяти категорий граждан: семьям с детьми, семьям военных, гражданам, подвергшимся воздействию радиации, реабилитированным жертвам политических репрессий и инвалидам, имеющим транспорт.

«Перевод услуг из соцзащиты в Пенсионный фонд происходит автоматически. Тем, кто уже получает меры поддержки, не нужно никуда обращаться. Если же гражданин имеет право на эти пособия, но еще не воспользовался им, то с 1 января ему необходимо обратиться в клиентскую службу ПФР или офис МФЦ по месту жительства», — уточнили в Пенсионном фонде.

К этим выплатам относятся, например, ежемесячное пособие по уходу за ребенком до 1,5 лет, пособие по беременности и родам женщинам, уволенным в связи с ликвидацией организации, единовременное пособие при рождении ребенка, при передаче ребенка на воспитание в семью и т. д. С полным перечнем можно ознакомиться в специальном разделе на официальном сайте ПФР.

Если вы хотите сообщить новость, напишите нам

Подписывайтесь на URA. RU в Google News, Яндекс.Новости и наш канал в Яндекс.Дзен. Оперативные новости вашего региона — в telegram-канале «Пермь» и в viber-канале «Пермь», подбор главных новостей дня — в нашей рассылке с доставкой в вашу почту.

Пенсионный фонд России с 1 января 2022 года будет предоставлять жителям региона ряд выплат, компенсаций и пособий, которые прежде назначали и выплачивали органы социальной защиты и Роструд. Об этом сообщает сайт ПФР по Пермскому краю. Речь идет о пособиях, выплатах, компенсациях для пяти категорий граждан: семьям с детьми, семьям военных, гражданам, подвергшимся воздействию радиации, реабилитированным жертвам политических репрессий и инвалидам, имеющим транспорт. «Перевод услуг из соцзащиты в Пенсионный фонд происходит автоматически. Тем, кто уже получает меры поддержки, не нужно никуда обращаться. Если же гражданин имеет право на эти пособия, но еще не воспользовался им, то с 1 января ему необходимо обратиться в клиентскую службу ПФР или офис МФЦ по месту жительства», — уточнили в Пенсионном фонде. К этим выплатам относятся, например, ежемесячное пособие по уходу за ребенком до 1,5 лет, пособие по беременности и родам женщинам, уволенным в связи с ликвидацией организации, единовременное пособие при рождении ребенка, при передаче ребенка на воспитание в семью и т. д. С полным перечнем можно ознакомиться в специальном разделе на официальном сайте ПФР.

Трансляция ВИЧ-1 и ее регуляция клеточными факторами PKR и PACT

https://doi.org/10.1016/j.virusres.2014.07.014 Получить права и контент

Основные моменты

При трансляции ВИЧ используется cap-зависимый , IRES, сдвиг кадров и другие механизмы.

Несколько генов, стимулированных интерфероном (ISG), регулируют трансляцию вируса.

РНК-активированная протеинкиназа (PKR) ингибирует трансляцию ВИЧ путем фосфорилирования eIF2α.

PKR дезактивируется клеточными белками во время репликации ВИЧ.

Активатор PKR (PACT) изменяет свою функцию во время репликации ВИЧ.

Реферат

Синтез белков из вирусной мРНК является первым шагом на пути к сборке вируса. Вирусы зависят от клеточного механизма трансляции, чтобы синтезировать свои собственные белки. Синтез белков из РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типа использует несколько альтернативных механизмов.Регулирование производства вирусного белка требует постоянного взаимодействия между вирусными потребностями и реакцией клетки на вирусную инфекцию. Среди противовирусных клеточных ответов интерферон-индуцированная РНК-активированная протеинкиназа PKR регулирует клеточную и вирусную трансляцию. Во время ВИЧ-1-инфекции активация PKR сильно регулируется вирусными и клеточными факторами. Клеточный белок связывания РНК TAR, TRBP, аденозиндезаминаза, действующая на РНК, ADAR1, и активатор PKR, PACT, играют важную роль.Последние данные показывают, что PACT изменяет свою функцию с активатора на ингибитор в инфицированных ВИЧ-1 клетках. Следовательно, ВИЧ-1 эволюционировал для репликации в клетках, в которых TRBP, ADAR1 и PACT предотвращают активацию PKR, чтобы обеспечить эффективный синтез вирусного белка. Этот правильный перевод инициирует сборку вирусных частиц.

Сокращения

ADAR

аденозиндезаминаза, действующая на РНК

dsRBD

dsRNA связывающий домен

dsRBP

dsRNA связывающий белок

eIF

фактор инициации эукариотической трансляции

HIV

T0008 вирус иммунодефицита человека

ES

вирус иммунодефицита человека

ES Вирус иммунодефицита человека

ES HTL

ES Вирус иммунодефицита человека

ES сайт входа

IKK

ингибитор ядерного фактора киназы каппа-B

ISRE

IFN-стимулированный элемент ответа

MAPK

митоген-активированная протеинкиназа

MDA-7

ген, связанный с меланомой 7

NF-κB

ядерный фактор каппа-легкая цепь -усилитель активированных В-клеток

OAS

2′-5′-олигоаденилатсинтетаза

PABP

PolyA-связывающий белок

PAMPs

патоген-ассоциированные молекулярные паттерны

PDC

плазмацитоидные дендритные клетки

PKR

протеин-киназа RNA-активированный 9 X

S-HDag

малый дельта-антиген

SIV

Вирус иммунодефицита обезьян

siRNA

малая интерферирующая РНК

STAT

сигнальные преобразователи и активаторы транскрипции

TAR

трансактивационный элемент, отвечающий за трансактивацию

TRAF

TNFR-ассоциированный фактор

TRBP

TAR РНК-связывающий белок

VSV

9000

ВИЧ 9000

Вирус везикулярного стоматита

Перевод

Протеинкиназа R

Активатор PKR

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Полный текст

Copyright © 2014 Elsevier B. V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Инициирование трансляции мРНК ВИЧ-1

Реферат

Инициирование трансляции полноразмерной мРНК вируса иммунодефицита человека может происходить с помощью нескольких различных механизмов для поддержания продукции структурных белков вируса на всем протяжении цикл репликации. Синтез вирусного белка ВИЧ-1 может происходить как за счет использования кэп-зависимого, так и управляемого IRES механизма в зависимости от физиологических условий клетки и статуса продолжающейся инфекции.Для обоих этих механизмов существует потребность в нескольких вирусных и клеточных кофакторах для оптимальной трансляции вирусной мРНК. В этом обзоре мы опишем механизм, используемый полноразмерной мРНК для инициации трансляции, подчеркнув роль кофакторов в этом процессе. Особое внимание будет уделено роли геликазы РНК DDX3 в инициации трансляции мРНК ВИЧ-1.

Введение

Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) является прототипом лентивируса рода Retroviridae и этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Ретровирусы представляют собой уникальное семейство РНК-вирусов, которые используют кодируемую вирусами обратную транскриптазу (ОТ) для репликации через промежуточное соединение провирусной ДНК. 1 Провирус постоянно интегрирован в хромосому клетки-хозяина и, подобно клеточному гену, экспрессируется с помощью транскрипции клетки-хозяина, процессинга РНК и трансляции. После транскрипции ретровирусная пре-мРНК сплайсируется в вирусные мРНК, которые проявляют все характеристики клеточных мРНК, поскольку они несут 5′-шапочную структуру и 3′-поли (A) хвост.В случае ВИЧ-1 альтернативный сплайсинг дает более 30 различных видов мРНК, которые затем разными путями экспортируются в цитоплазму. МРНК ВИЧ-1 были сгруппированы в 3 класса в зависимости от степени их сплайсинга: (i) полноразмерные транскрипты, которые соответствуют мРНК, которые не подвергаются процессу сплайсинга, кодируют полипротеины Gag и Gag-Pol; (ii) однократно сплайсированные транскрипты, которые генерируют вирусные белки Env, Vif и Vpu; (iii) полностью сплайсированные транскрипты, которые экспрессируют Rev, Tat, Vpr и Nef. Как и для всех известных на сегодняшний день вирусов, синтез белка ВИЧ-1 зависит исключительно от аппарата трансляции в клетке-хозяине рибосом, тРНК, аминокислот и всех необходимых факторов инициации, удлинения и терминации. В этом обзоре мы представляем обзор того, что было задокументировано в отношении механизма инициации трансляции полноразмерной мРНК ВИЧ-1.

Полноразмерная или геномная РНК ВИЧ-1 (гРНК)

При входе ВИЧ-1, обратной транскрипции гРНК и интеграции вирусной ДНК интегрированная провирусная геномная ДНК транскрибируется РНК-полимеразой II (Pol II) хозяина с образованием первичный продукт транскрипции, который взаимодействует с аппаратом процессинга клеточной РНК, который должен быть сплайсирован, экспортирован в цитоплазму и транслирован аппаратом синтеза белка хозяина. 2 Однако часть пре-мРНК нарушает типичный процессинг РНК, сохраняя их интроны. Чтобы экспортировать свои несплайсированные и частично сплайсированные мРНК, ВИЧ-1 использует специфический механизм, включающий клеточный путь экспорта CRM1 и вирусный белок Rev (регулятор экспрессии вириона). 3,4 Белок Rev ВИЧ-1, ядерно-цитоплазматический челночный белок, связывающий РНК, взаимодействует с высокоструктурированным элементом РНК, расположенным в гене env, известным как элемент ответа Rev (RRE).Затем комплекс Rev-RRE экспортируется в цитоплазму. 5-7

Несплицированная или полноразмерная РНК ВИЧ-1 выполняет двойную роль в качестве мРНК (мРНК ВИЧ-1), где она кодирует полипротеины Gag и Gag / Pol и как геномную РНК (гРНК) для быть инкапсулировано во вновь синтезированные частицы. 2 мРНК ВИЧ-1 содержит высокоструктурированную 5′-нетранслируемую область (5’UTR) или лидер 8 с отчетливыми и хорошо охарактеризованными мотивами РНК, которые участвуют во многих этапах цикла репликации вируса (см.). 8 Первым структурным элементом является петля длиной около 60 нуклеотидов, называемая элементом ответа трансактивации (TAR), которая распознается вирусным белком Tat и необходима для транскрипции вирусной РНК (вРНК). 9 TAR сопровождается петлей ствола полиаденилирования (поли (A)), которая содержит сигнал полиаденилирования, который игнорируется, когда находится внутри 5′-лидера, но используется для обработки 3′-конца, когда он читается в 3′-нетранслируемой области ( 3′UTR). 10 За петлей поли (A) ствола идет сайт связывания праймера (PBS), который важен для рекрутирования тРНК (Lys3), которая служит праймером для инициации процесса обратной транскрипции гРНК. 11 Ниже PBS находятся сайт инициации димеризации (DIS), донор сплайсинга (SD) и сигналы упаковки (). Все шпильки используются либо во время процессинга РНК (SD), либо во время димеризации и инкапсидации вирусной гРНК (DIS и). 12,13 Эти сигналы РНК различаются по структуре РНК у разных лентивирусов, но их присутствие и функция у них законсервированы. 8,14,15 Например, TAR ВИЧ-2 намного длиннее и свернут в мотив вилки, тогда как в ВИЧ-1 это петля ствола. 16-18

Схематическое изображение геномной РНК (гРНК) ВИЧ-1. Полноразмерная мРНК ВИЧ-1 кэпирована на 5′-конце остатком 7-метилгуаниловой кислоты (m 7 G) или триметилгуанозином (TMG) и структурирована в виде четко определенных мотивов РНК: шпилька TAR, поли ( A ) Сигнал, первичный сайт связывания (PBS), сайт инициации димеризации (DIS), главный сайт донора сплайсинга (SD) и сигнал упаковки РНК (ψ). МРНК кодирует 2 белка: p55 и p40, которые могут быть синтезированы либо входом рибосомы из 5’cap, либо из IRES, расположенных как в 5’UTR, так и в кодирующей области (как показано на рисунке).Вход в рибосомы на 5′-конце происходит путем рекрутирования тримерного комплекса, состоящего из DDX3, PABP и eIF4G, тогда как внутренний вход происходит путем прямого связывания преинициативного комплекса 43S с элементами IRES. Обратите внимание, что 5′-колпачок также может быть связан комплексом CBC.

Инициирование трансляции

Инициирование трансляции большинства мРНК эукариот происходит с помощью механизма сканирования, посредством которого 40S рибосомная субъединица рекрутируется вблизи кэп-структуры, остатка 7-метилгуаниловой кислоты, расположенного на 5′-конце всех мРНК эукариот. и сканирует в направлении от 5 ‘до 3’ до тех пор, пока не встретится инициирующий кодон. 19,20 Рибосомная субъединица 40S рекрутируется в мРНК как часть инициирующего комплекса 43S, состоящего из субъединицы, связанной с eIF2-GTP / Met-tRNAi (инициаторная тРНК), eIF1A, eIF1 и eIF3. eIF4F, многосубъединичный комплекс, состоящий из eIF4E, eIF4A и eIF4G, важен в этом процессе рекрутирования. 19,20 eIF4E напрямую связывается со структурой 5’cap, в то время как eIF4A, член семейства DEA (D / H) -box РНК-геликазы, участвует, раскручивая вторичную структуру в 5′-нетранслируемой области (5’UTR ) мРНК.Активность геликазы eIF4A стимулируется eIF4G и eIF4B. 21 В этом процессе eIF4G служит каркасом для скоординированной сборки комплекса инициации трансляции, поскольку он содержит сайты связывания для eIF4A, eIF4E и eIF3. Следовательно, eIF4G связывает кэп мРНК (через eIF4E) и рибосомную субъединицу 40S (через eIF3) для присоединения матричной мРНК к аппарату трансляции. eIF4G также связывает поли (A) -связывающий белок (PABP), и это способствует циркуляризации мРНК путем связывания 5’cap (через eIF4E-eIF4G) и 3’poly (A) хвоста (через PABP-eIF4G) мРНК, которая физическая форма, благоприятная для перевода. 19,20

Альтернативный кэп-независимый механизм инициации трансляции был подтвержден при изучении трансляции не кэпированных мРНК пикорнавирусов. 22 Пикорнавирусные мРНК содержат структурный элемент РНК, называемый внутренним сайтом входа в рибосому (IRES), чтобы способствовать рекрутированию инициирующего комплекса 43S кэп-независимым образом. 23,24 Кроме того, некоторые пикорнавирусы кодируют вирусные протеазы, которые непосредственно нацелены на eIF4G и PABP во время инфекции, в то время как другие изменяют доступность eIF4E. 25-28 Оба события приводят к нарушению инициации клеточной кэп-зависимой трансляции во время вирусной инфекции, чтобы перенаправить аппарат трансляции хозяина на вирусные мРНК. 29 Более поздние исследования показали, что этот альтернативный механизм инициации трансляции не ограничивается пикорнавирусами, поскольку мРНК из других вирусных семейств, включая некоторых представителей Retroviridae, также используют IRES-зависимую инициацию трансляции. 30,31 В отличие от мРНК пикорнавирусов, ретровирусные мРНК обладают 5′-кэп-структурой и могут инициировать трансляцию либо по каноническому кэп-зависимому механизму, либо через IRES. 32,33

РНК-структуры

модулируют белковый синтез полноразмерной мРНК ВИЧ-1

5’UTR ВИЧ-1 содержит несколько хорошо охарактеризованных структурных элементов РНК, критических для различных стадий цикла репликации ВИЧ-1, такие как TAR, петля Poly (A), домен PBS, SD, DIS и (см.). Благодаря своей стабильности эти структуры РНК также могут модулировать инициацию трансляции вирусной мРНК. Таким образом, домен TAR представляет собой высокостабильную структуру петля-стержень длиной 57 нуклеотидов (ΔG = -29.6 ккал / моль), расположенный на самом 5′-конце всех транскриптов ВИЧ-1. 30 Фактически, структура петли стебля TAR закрывает кэп-фрагмент, что ставит под вопрос ее доступность для eIF4E во время сборки комплекса инициации трансляции над вирусной мРНК. 34,35 Как было ранее продемонстрировано, наличия стебель-петли с более слабой стабильностью (ΔG = -13,6 ккал / моль) на 5′-конце синтетической мРНК достаточно для ингибирования рекрутирования рибосом на 5′-конце. , 36 не стало неожиданностью, что присутствие только TAR или в контексте 5′-UTR ВИЧ-1 ингибирует кэп-зависимую трансляцию в RRL и в ооцитах Xenopus. 34,35,37,38 Добавление транс-доминантно-отрицательного мутанта eIF4A R362Q 39 в RRL, сильно подавленную экспрессию 5′-UTR ВИЧ-1, что указывает на то, что для преодоления РНК необходимы как eIF4G, так и eIF4A структуры, присутствующие в 5′-UTR ВИЧ-1. 40 Однако подавление трансляции, вызванное TAR, было менее выражено в клетках, и это было подтверждено восстановлением подавления трансляции в RRL после добавления экстрактов цитоплазматических клеток HeLa. 34,41 Это наблюдение согласуется с тем фактом, что известно несколько клеточных белков, которые связывают структуру TAR ВИЧ-1, способствуя активации трансляции мРНК ВИЧ-1. 42

Исследования показали, что 5’UTR ВИЧ-1 может принимать 2 пространственные конформации, которые представляют собой разветвленные множественные шпильки (BMH) и структуры дальнего взаимодействия (LDI). 43 Было показано, что BMH экспонирует сигналы димеризации и упаковки, чтобы способствовать инкапсидации и вирусной репликации. 44-46 Рибопереключение между LDI и BMH зависит от вирусной инфекции, поскольку оно усиливается как концентрацией геномной РНК, так и присутствием вирусного белка NC. 43,47 Однако эксперименты показали, что, несмотря на тот факт, что структура BMH перекрывает кодон стартового сайта AUG, 48 структура сама по себе не изменяет скорость трансляции, управляемую 5’UTR ВИЧ-1. 41,44 Кроме того, введение мутаций, предназначенных для изменения равновесия LDI-BMH, не оказывает значительного влияния на способность 5’UTR ВИЧ-1 управлять инициацией трансляции как в контексте моно-, так и бицистронной мРНК. . 41,44

Интересно, что экспрессия вирусного белка Gag подавляет его собственный синтез, одновременно стабилизируя конформацию структуры BMH. 49 Поскольку структура BMH сама по себе не препятствует трансляции вирусной мРНК 41,44 , это может быть присутствие белка Gag на вирусной мРНК, которое влияет на прикрепление рибосом или сканирование вдоль 5’UTR. Белок Gag оказывает бимодальный эффект на собственное производство с усилением экспрессии при низкой концентрации и ингибированием при высокой концентрации. 49 Другая возможность состоит в том, что репрессия трансляции мРНК ВИЧ-1 индуцируется Gag-опосредованной димеризацией гРНК ВИЧ-1. Дуплекс, образованный геномной РНК и белком Gag через домен NC, вероятно, создает сильное препятствие для сканирования или рекрутирования комплекса инициации трансляции. Следовательно, при высокой концентрации белок Gag будет непосредственно отвечать за ингибирование трансляции вирусной мРНК, способствуя ее упаковке в синтезированные de novo вирусные частицы 49 Эта возможность согласуется с результатами, показывающими, что димеризация вирусной РНК ингибирует трансляцию вирусной мРНК, одновременно способствуя инкапсидация гРНК. 47,50 Интересно, что димеризации РНК может способствовать дальнодействие РНК-РНК, устанавливаемое между нуклеотидами, присутствующими в кодирующей области Gag, и последовательностью 5’UTR. 47

Кэп-зависимая инициация геномной РНК ВИЧ-1

Сканирование рибосом из 5’cap

Эксперименты по трансляции in vitro, проведенные на лизате ретикулоцитов кролика (RRL), показали, что добавление как кэп-аналога, так и расщепление eIF4G протеазой L ящура ингибирует трансляцию кэпированного моноцистронного репортерного гена ВИЧ-1, что свидетельствует о том, что 5′-рибосомное сканирование имеет место на 5’UTR ВИЧ-1. 33 За этим последовали данные лаборатории Berkhout, показывающие, что экспрессия протеазы 2A от полиовируса нарушает инициацию трансляции геномной РНК ВИЧ-1 ex vivo. Более того, вставка вышележащих кодонов AUG (uAUG) в разные места в 5’UTR ВИЧ-1 сильно ингибировала трансляцию, подтверждая использование 5′-зависимого механизма сканирования рибосом. 51 Инициирование с кэпированного конца также дало объяснение тому факту, что укладка и длина структуры TAR (которая различается для ВИЧ типа 1 и типа 2) имеют такое большое влияние на общую эффективность трансляции. 34 Эта гипотеза о сканировании рибосом также хорошо согласуется с тем фактом, что большинство природных изолятов ВИЧ-1 не переносят uAUG в пределах их 5’UTR, несмотря на его большую длину. 8 Однако механизм, с помощью которого преинициативный комплекс 43S может иметь дело с этими стабильными структурами РНК, которые, как известно, нарушают как начальное связывание рибосом, так и сканирование, остается неясным. 52,53 В большинстве случаев присутствие eIF4A и eIF4B / eIF4H в преинициационном комплексе 43S может разрешить эти структуры АТФ-зависимым образом. 54 Однако, как указано выше, структура TAR, расположенная непосредственно ниже кэп-структуры, и сложная структура всей 5′-UTR ВИЧ-1, по-видимому, слишком стабильны, чтобы просто разворачиваться комплексами eIF4A / eIF4B / eIF4H. Следовательно, остается вопрос, как преинициативный комплекс 43S может связываться и сканировать этот структурированный 5’UTR ВИЧ-1.

Необходимость дополнительных геликаз в трансляции ВИЧ-1

Намек на вышеупомянутый вопрос был получен в недавних исследованиях, показывающих, что сложные структуры РНК можно раскручивать путем рекрутирования клеточных РНК-геликаз в комплекс 43S, чтобы помочь сканированию рибосом. 55 Эти геликазы принадлежат к растущему семейству белков DExD / H-бокса (DEAD, DEAH, DexH и DExD), которые характеризуются присутствием высококонсервативного корового домена геликазы, участвующего в связывании АТФ, гидролизе АТФ и связывании нуклеиновых кислот. 56,57 Эти ферменты участвуют практически во всех аспектах метаболизма РНК путем ремоделирования рибонуклеопротеинов (РНП) или комплексов РНК-РНК. Таким образом, некоторые из них были специально вовлечены в процесс инициации трансляции.Так обстоит дело с Ded1, RHA (DHX9) и DEAH-бокс-белком DHX29 у млекопитающих, которые взаимодействуют с eIF4A / eIF4B / eIF4H для повышения процессивности рибосомного сканирования структурированных транскриптов. 55,58-60 В этом процессе эти ферменты доставляются к 5′-концу мРНК либо путем связывания со специфическим посттранскрипционным элементом (PCE) в случае RHA, как часть комплекса eIF4F для Ded1. или вместе с рибосомной субъединицей 40S для DHX29. 60-62 В случае ВИЧ-1 Борис-Лори и его коллеги рассмотрели роль DHX9 / RHA в вирусной трансляции, и они показали, что последний необходим для стимулирования ремоделирования РНП через 5’UTR для обеспечения прогрессирования рибосом. . 61 Это происходит за счет начального связывания RHA с элементом PCE, обнаруженным в 5’UTR ВИЧ-1, и, по-видимому, требует АТФ-зависимой активности. 61 Дрожжевой ортолог Ded1, который у млекопитающих называется DDX3, также участвует в трансляции ВИЧ-1. DDX3 является членом семейства РНК-геликаз DEAD-box и участвует во многих биологических процессах, таких как развитие клеточного цикла, апоптоз, рак, врожденный иммунный ответ и в репликации многих вирусов, которые инфицируют людей 31 , таких как основные возбудители вирусов гепатита С и В вместе с ВИЧ-1. 31,63

В геноме человека есть 2 родственных DDX3 гена DDX3X и DDX3Y. DDX3X или DBX (в дальнейшем называемые DDX3) изначально были картированы в сцепленных с X-хромосомами генах с функциональными гомологами в Y-хромосоме и были обнаружены в области Xp11.3-11.23. 64,65 DDX3Y или DBY специфически экспрессируются в семенниках, где они играют важную роль в сперматогенезе; 66 однако, из-за этой специализированной роли, он не будет более подробно обсуждаться в этом обзоре. Первоначально было показано, что DDX3 важен для репликации ВИЧ-1, действуя как кофактор Rev и CRM1 во время ядерного экспорта RRE-содержащих векторов. 67 DDX3 позже было обнаружено, что он ассоциирован с некоторыми ключевыми членами механизма инициации трансляции и участвует в трансляции подмножества клеточных и вирусных мРНК, несущих структурированные 5′-UTR. 59,68,69 Однако, в отличие от своего дрожжевого ортолога, DDX3 необязателен для общей трансляции и не может рассматриваться как функциональный фактор инициации трансляции. 59,70 В недавнем отчете Лю и его коллеги исследовали роль DDX3 в трансляции ВИЧ-1 в контексте полноразмерного провируса и репортерных генов, происходящих от ВИЧ-1. Они выполнили сверхэкспрессию и нокдаун эндогенного белка на основе siRNA, чтобы обнаружить, что ВИЧ-1 требуется присутствие геликазы для трансляции. 71 Кроме того, используя бицистронные конструкции, содержащие IRES ВИЧ-1 в межцистронном спейсере, они предположили, что DDX3 может действовать как ITAF, способствуя трансляции, управляемой IRES. Однако не было предоставлено никаких механистических представлений для объяснения потребности в ферменте, и они скорее предполагали роль в содействии сканированию рибосом на 5′-лидере вируса.

В другом исследовании Soto-Rifo et al. нокдаун DDX3 в клетках HeLa, экспрессирующих полноразмерный провирусный клон ВИЧ-1, кодирующий репортерный ген renilla, обнаружив, что, хотя на общую трансляцию не влияет истощение DDX3, синтез Gag ВИЧ-1 из вРНК резко нарушается. 72 В том же исследовании несколько мутантов DDX3 были использованы для документирования необходимости мотивов связывания АТФ и гидролиза для функции DDX3 в инициации трансляции.Путем вставки неструктурированных спейсеров РНК между кэпом и началом структуры TAR было показано, что смещение TAR всего на 15 нуклеотидов от m 7 GTP было достаточным для отмены потребности в DDX3 в синтезе белка. Вместе эти наблюдения показывают, что DDX3 необходим для начальной стадии связывания рибосом, а не для процесса сканирования. Это было дополнительно продемонстрировано с помощью биохимического анализа, в котором было показано, что DDX3 связывается как с дуплексом РНК TAR, так и с 2 дополнительными сайтами на 5’UTR ВИЧ-1, которые соответствуют участкам одноцепочечной РНК, что дает биологические доказательства предлагаемого механизма локального разделение прядей, предложенное Янковским и его коллегами. 73 DDX3, как было продемонстрировано, локально раскручивает основание мотива TAR, чтобы сделать m 7 GTP доступным для связывания с рибосомами. В этой модели DDX3 заменяет eIF4E, чтобы зародить вступление преинициативного комплекса 43S. Интересно, что недавняя работа лаборатории Boris-Lawrie показала, что трансляция геномной РНК ВИЧ-1 может происходить независимо от eIF4E путем рекрутирования CBP 80 на 5′-конце транскрипта. 74 Таким образом, остается вопрос, происходит ли образование комплекса 43S за одну стадию, т.е.g., DDX3 связывает и образует ядро ​​сборки полного комплекса, состоящего из eIF4F, eIF4B, eIF3, eIF1 / 1a, eIF2 и рибосомы 40S, или сборка такого комплекса происходит последовательно? Точно так же другим важным вопросом, на который необходимо ответить, будет определение состава преинициативного комплекса 43S, опосредованного DDX3: содержит ли он весь набор eIF или некоторые из них отсутствуют? Кроме того, следует учитывать, что TAR является предпочтительным сайтом связывания для Tat. 75 Таким образом, прямое взаимодействие между DDX3 и Tat недавно было показано как in vitro, так и in vivo. 76,77 Поразительно, но взаимодействие Tat / DDX3 приводит как к усилению вирусной транскрипции, так и к трансляции. 76,77 В последнем случае, который больше соответствует теме этого обзора, было обнаружено, что комплекс Tat / DDX3 ассоциирован как с комплексами инициации трансляции, так и с полисомами. Нокдаун DDX3 приводит к высвобождению Tat из полисомальной фракции, что подчеркивает его роль в этом взаимодействии. 76

Эти данные согласуются с данными, показывающими, что взаимодействие клеточных РНК-связывающих белков с вирусной РНК влияет на структуру-функцию РНК. 41 РНК-связывающий белок аутоантиген волчанки La 78 был первым идентифицированным клеточным белком, который, как было показано, связывается с 5′-лидером ВИЧ-1 и снимает индуцированную TAR репрессию трансляции в системе in vitro. 38 Для такого эффекта требовался домен димеризации La 79 , а позже Hühn et al. (1997) сообщили, что La проявляет активность фермента, раскручивающего дцРНК, которая потенциально может быть использована для дестабилизации структуры TAR; 80 , тем не менее, влияние La на экспрессию ВИЧ-1 в культуре клеток или его роль в репликации ВИЧ-1 в дальнейшем не исследовалось.Staufen 1 и TAR-РНК-связывающий белок (TRBP) являются другими примерами клеточных белков, которые способны ослаблять репрессию трансляции, индуцированную TAR, путем прямого взаимодействия со структурой TAR РНК. 37,81

eIF4E Независимая трансляция полноразмерной мРНК ВИЧ-1

Во время синтеза и обработки мРНК образуются несколько различных, но динамичных комплексов мРНК-рибонуклеопротеин (мРНП). Один из первых белковых комплексов, котирующийся при совместной транскрипции через структуру 5’cap, известен как ядерный кэп-связывающий комплекс (CBC). 82 CBC состоит из белка субъединицы связывания кэпа 20 (CBP 20), который связывает кэп, и связывающего кэп белка 80 (CBP 80), который стабилизирует это взаимодействие. CBC играет важную роль в различных аспектах метаболизма ядерной мРНК, таких как сплайсинг пре-мРНК и ядерный экспорт, и остается связанным с мРНК во время удаления интрона, отложения комплекса экзонных соединений (EJC) и ядерного экспорта. В цитоплазме CBC играет аналогичную роль eIF4E, поскольку оба могут напрямую взаимодействовать с eIF4G, чтобы служить платформой для загрузки преинициативного комплекса 43S на мРНК, 83,84 , чтобы пройти то, что называется пионерским раундом перевод. 84 Это индуцирует обширные перестройки мРНП, связанных с CBC, с удалением EJC и связанных с EJC факторов трансляционными рибосомами и обменом ядерного поли (A) -связывающего белка N1 (PABPN1) на цитоплазматический PABPC1 на поли (Хвост. 84 CBP80 также способствует замене CBC на eIF4E в мРНК, ассоциированной с полисомами, с помощью механизма, который включает диссоциацию CBC от мРНК, вызванную кариоферином импортином-β. 83,84 Диссоциация CBC делает возможным связывание eIF4E с 5’cap и начало синтеза белка. Один eIF4E имеет более низкое сродство к кэпу, чем CBC, но сборка eIF4F увеличивает сродство eIF4E к кэпу. 85 Недавний отчет предполагает, что в случае ВИЧ-1 сплайсированные вирусные мРНК подвергаются обмену CBC на eIF4E, в то время как несплайсированные мРНК ВИЧ-1 остаются связанными с CBC в цитоплазме 74 во время трансляции мРНК и инкапсидации вирусной гРНК. 74 Эти наблюдения побудили авторов предложить модель, с помощью которой инициация трансляции полноразмерной мРНК HIV-1 д. Происходить с помощью неканонического cap-зависимого механизма инициации трансляции, зависящего от CBC вместо elF4E. 74 Однако альтернативная интерпретация этих открытий состоит в том, что CBC остается ассоциированным с вирусной мРНК, но рекрутирование 40S рибосомной субъединицы происходит 5′-концевым независимым образом, как подчеркнуто ниже. Эта возможность, которая не была учтена авторами, также соответствует всем выводам, которые они описывают. 74

Кеп-независимая инициация трансляции с мРНК ВИЧ-1

Характеристика последовательностей IRES

На полноразмерной мРНК ВИЧ-1 были идентифицированы два IRES, один в пределах ее 5’UTR, а другой — в кодирующая область Gag. 86,87 IRES в 5’UTR был подтвержден в лабораторно адаптированном инфекционном рекомбинантном провирусном клоне ВИЧ-1 NL4.3, CXCR4 (X4) -тропном первичном изоляте HIV-LAI и в 5’UTR вирусного РНК выделена из клинических образцов.

86,88-90 Кроме того, было показано, что трансляция ВИЧ-1 в бицистронном контексте устойчива к пикорнавирусным протеазам, которые специфически ингибируют кэп-зависимую инициацию трансляции. 86,89,91 Совсем недавно Monette et al. использовали эксперименты по трансфекции-инфекции ДНК, кодирующей бицистронную РНК, содержащую 5’UTR ВИЧ-1, доказывая, что ее активность не нарушается инфекцией полиовируса в 293 Т-клетках.

Структурный анализ лидера ВИЧ-1 показал, что короткий дуплекс РНК с предсказанной свободной энергией (ΔG) -10,4 образуется в лидерной области дикого типа путем спаривания оснований последовательностей, фланкирующих сайт связывания праймера (PBS). В Brasey et al. (2003), этот дуплекс из 7 пар оснований был усилен в контексте pNL4. 3 инфекционный клон для создания плазмиды, кодирующей вирусную РНК с повышенной стабильностью в домене PBS. ΔG, предсказанный для этих новых структур РНК, находился в диапазоне от -23,5 ккал / моль (дикий тип) до -38,4 ккал / моль. Последнее значение значительно превышало стабильность 5’UTR ВИЧ-1 дикого типа, включая стабильность структуры шпильки расширенной трансактивационной (TAR) области (-29,6 ккал / моль), которая, как известно, сильно ингибирует инициацию трансляции. После трансфекции клеток C33A не наблюдалось никакого эффекта на экспрессию белков Pr55Gag и CA-p24, что свидетельствует о наличии IRES.Кроме того, трансляционная активность 5’UTR IRES ВИЧ-1 оказалась устойчивой к введению мутаций, предназначенных для изменения специфических структурных элементов РНК в функциональной области, 41,89,90 , предполагая, что взаимосвязь структура-функция для ВИЧ -1 IRES не такой жесткий, как описанный для других вирусных IRES. 92-98 Биологическое значение этих результатов еще предстоит выяснить. Более того, изучая IRES 5′UTR ВИЧ-1, Gendron et al. определили область выше PBS, которую они назвали IRENE, для отрицательного элемента IRES, который отрицательно влияет на активность лидера IRES ВИЧ-1. 88 Молекулярные механизмы, с помощью которых этот цис-действующий элемент РНК может ингибировать управляемую IRES трансляцию, неизвестны и не изучались в дальнейшем. Помимо IRENE, другие цис-действующие репрессивные последовательности или ингибирующие последовательности (CRS / INS) 99-104 , как сообщается, разбросаны по участкам Gag, Pol и Env мРНК ВИЧ-1 99-104 , также способны ограничивать экспрессия структурных белков ВИЧ-1 по еще не определенному механизму. Хотя для этих элементов CRS / INS не была определена консенсусная последовательность, было показано, что они содержат элементы, богатые AU (ARE). 101,102 Один такой ингибирующий элемент, известный как INS-1, обнаружен в кодирующей области Gag матрицы (p17) и, как сообщается, действует как ингибитор как cap-зависимой, так и опосредованной IRES инициации трансляции мРНК ВИЧ-1. 99,102 Ингибирование трансляции не ограничивалось контекстом мРНК ВИЧ-1, поскольку вставка INS-1 в гетерологичную невирусную мРНК также могла ингибировать ее экспрессию. 99,102,105 Хотя молекулярный механизм, с помощью которого INS-1 ограничивает инициацию трансляции мРНК ВИЧ-1, остается неопределенным, несколько сообщений предполагают участие белков хозяина. 106-109

В том же духе Brasey et al. показали, что ORF Gag ингибирует экспрессию белка, опосредованного 5’UTR ВИЧ-1, в контексте линии клеток HeLa. 86 Такие результаты были очень загадочными в то время, учитывая, что 5’UTR ВИЧ-1 управляет экспрессией белка Gag. Следовательно, как может 5’UTR IRES ВИЧ-1 управлять эффективной экспрессией Gag, в то время как ORF Gag ингибирует функцию IRES? Этот вопрос недавно был решен Plank et al. которые показали, что ингибирующий эффект Gag ORF не наблюдался в контексте лимфоцитарной клеточной линии. 90 Эти наблюдения предполагают, что репрессия трансляции ограничена определенными типами клеток, но не естественными хозяевами инфекции ВИЧ-1. Вместе эти наблюдения предполагают, что тропизм ВИЧ-1 частично регулируется еще плохо изученным молекулярным механизмом, включающим трансляционный контроль экспрессии вирусных генов. Аналогичный сценарий был установлен для других вирусов, несущих IRES. Трансляционный контроль вирусного тропизма был охарактеризован для ВГС, а также для некоторых членов семейства вирусов пикорнавиридов. 110-114

В дополнение к IRES, присутствующим в 5’UTR ВИЧ-1, Бак и его коллеги также идентифицировали IRES в ORF Gag. 87 Этот второй IRES управляет экспрессией как Gag-белка, так и его более короткой N-усеченной изоформы (p40), в которой отсутствует весь матричный домен (см.). Хотя функция Gag p40 неизвестна, он продуцируется во время инфекции, и его делеция нарушает кинетику роста ВИЧ-1 в культуре. 87 Присутствие более коротких N-усеченных изоформ, которые возникают в результате альтернативной инициации в кодонах, расположенных в кодирующей области Gag, консервативно в ВИЧ-2 и обезьяньем гомологе (SIV). 115,116 Исследование механизма трансляции, используемого для продукции p40, выявило исключительное использование IRES, локализованной в ORF Gag, чья активность полностью независима от кэп-структуры и eIF4E и устойчива к обработке протеазой L ящура. 33 Однако наиболее характерные характеристики этого IRES заключаются в его способности стимулировать экспрессию в вышестоящем AUG, расположенном на его 5′-границе. 87,117 Это обеспечивает эффективный синтез белка из синтетических безлидерных мРНК, в которых кодон AUG расположен непосредственно на 5′-конце РНК.Удивительно, но трансляция, опосредованная этой синтетической мРНК, является высокоэффективной 117 (de Breyne et al., Неопубликовано) и происходит в аутентичном кодоне AUG без связанного сканирования утечки, что указывает на то, что рекрутирование рибосом в кодирующую область Gag IRES опосредуется нетрадиционным механизм. Эта характеристика сохраняется в ВИЧ-2 и в SIV. 115,117

Все эти особенности контрастируют с другими IRES, описанными на сегодняшний день, и позволяют предположить, что кодирующая область Gag содержит 2 сайта связывания для прикрепления рибосом, которые предназначены для каждого сайта инициации.

Активность IRES 5′-лидера ВИЧ-1 регулируется транс-действующими факторами IRES (ITAF)

IRES 5’UTR ВИЧ-1 продемонстрировал активность в различных биологических системах, таких как экстракты трансляции на основе HeLa, 86 в такие клетки, как HeLa, U20S, HEK293-T, Jurkat T-клетки, 71,86,88,90,118,119 и в ооцитах Xenopus laevis (см.). 41,120 Тем не менее, IRES ВИЧ-1 весьма неэффективен в продвижении трансляции в RRL. 121 Однако эта низкая активность может быть устранена добавлением экстрактов клеток HeLa, полученных из G2 / M-арестованных клеток, к лизату 41 , что указывает на потребность в клеточных белках и / или транс-действующих факторах IRES (ITAF). 41 Хотя точный механизм, с помощью которого ITAFs облегчает рекрутирование рибосомных субъединиц, остается неизвестным, они, по-видимому, способствуют связыванию eIFs и рибосом, или могут действовать, помогая РНК создавать структуру, способную рекрутировать инициирующий комплекс. 94,122-125 Используя эксперименты с выпадающим списком Vallejos et al. 41 идентифицировал серию белков, обнаруженных в экстрактах G2 / M HeLa, которые взаимодействуют с вирусным 5’UTR. Однако эти результаты являются предварительными, поскольку их роль в инициации трансляции не оценивалась в функциональном анализе. 41 Воздействие некоторых хорошо известных ITAF было исследовано на инициацию трансляции 5’UTR IRES ВИЧ-1. 71,118,120 Таким образом, Liu et al. показали, что eIF5A, человеческий Rev-взаимодействующий белок (hRIP) и DDX3 все способны стимулировать трансляционную активность 5’UTR IRES ВИЧ-1, когда они находятся в бицистронном контексте в клетках HEK293T. Интересно, что в том же отчете был отвергнут Sam68, член семейства белков трансдукции сигнала и активации РНК (STAR), как возможный ITAF для 5’UTR IRES ВИЧ-1. 71 Используя аналогичную стратегию, Monette et al. идентифицировали hnRNP A1 как клеточный фактор, который усиливает функцию 5’UTR IRES ВИЧ-1. 118 Они также представили доказательства того, что мРНК ВИЧ-1 загружена hnRNP A1 в ядре клетки и что белок перемещается в цитоплазму, связанную с вирусной мРНК, где он может выполнять свою функцию на уровне IRES-опосредованной инициации трансляции. 118 Что касается возникающих клеточных мРНК, ожидается, что мРНК ВИЧ-1 сначала столкнется с РНК-связывающими белками в ядре. 82 Фактически, полноразмерная вирусная мРНК достигает цитоплазмы как часть особого комплекса рибонуклеопротеидов (РНП) с ядерными РНК-связывающими факторами. 10,126 Таким образом, вполне вероятно, что и вирусные, и клеточные белки, такие как Rev и hRNP A1, изначально загружаются на вирусную мРНК в ядре, прежде чем они будут использоваться для экспрессии цитоплазматической РНК. 118,127 В соответствии с этой возможностью, недавнее сообщение подтверждает котранскрипционное образование стабильного экспортного комплекса, который включает как Rev, так и CRM1. 128 Примечательно, что Rev и ассоциированные белки не только определяют экспорт полноразмерной мРНК, но также играют роль в ее трансляции. Фактически Rev способствует полисомной ассоциации полноразмерной мРНК и стимулирует ее трансляцию. 127,129 Кроме того, Rev также необходим для связывания PABP с Rev-зависимыми вирусными мРНК и снимает ингибирование трансляции, налагаемое Gag ORF. 100,101,130 IRES-опосредованная инициация трансляции ВИЧ-1 также может быть изменена цитоплазматическими модификациями конкретных ITAF.Например, киназы, взаимодействующие с митоген-активированным протеином (MAP) киназой (Mnks), запускают фосфорилирование hRNP A1, и это событие, по-видимому, необходимо для активности IRES ВИЧ-1, поскольку ингибирование фосфорилирования Mnk приводит к снижению ВИЧ-инфекции. 1 IRES-опосредованная экспрессия белка. 118 В соответствии с этим наблюдением, инфекция ВИЧ-1 вызывает умеренное повышение статуса фосфорилирования hnRNP A1, и это может способствовать его способности влиять на инициацию IRES-опосредованной трансляции ВИЧ-1.

Различные уровни требований к факторам инициации для 5’UTR ВИЧ-1. МРНК ВИЧ-1 может использовать как кэп-зависимый механизм в моноцистронном контексте ( A, ), так и механизм, управляемый IRES ( B ). Добавление кэп-зависимых ингибиторов (протеазы P2A и FMDV L, аналог кэп) приводит к частичному подавлению экспрессии генов в моноцитронном контексте, но не в бицистронном контексте. Было показано, что добавление экстракта клеток HeLa в значительной степени стимулирует инициацию IRES ВИЧ-1.

Напротив, активность 5’UTR IRES ВИЧ-1 может также подавляться клеточными белками. Например, HuR, белок перемещения ядра-цитоплазмы, который принадлежит к консервативному семейству РНК-связывающих факторов, которые первоначально были идентифицированы у Drosophila как белки эмбрионального летального аномального зрения (ELAV), был идентифицирован как негативный модулятор активности IRES ВИЧ-1. . 120 Трансляционное ингибирование активности IRES ВИЧ-1 с помощью HuR не связано с прямым взаимодействием белок-РНК, поскольку связывание HuR с 5’UTR ВИЧ-1 установить не удалось; 120 поэтому действующий молекулярный механизм еще предстоит определить.

Почему мРНК ВИЧ-1 требует IRES?

Поскольку мРНК ВИЧ-1 несут 5’cap, можно утверждать, что IRES-зависимая инициация, по-видимому, не нужна во время трансляции вирусной мРНК. Однако несколько линий доказательств предполагают, что кэп-зависимая инициация трансляции нарушается во время репликации ВИЧ-1.

Исследования клеточных мРНК, несущих двойной режим инициации, такой как демонстрируемый мРНК ВИЧ-1, показывают, что в нормальных физиологических условиях кэп-зависимая трансляция будет преобладающим механизмом, используемым для трансляции.Однако при различных клеточных стрессах и стрессах окружающей среды глобальный синтез белка снижается, а экспрессия различных стресс-зависимых факторов, управляемых IRES, предпочтительно регулируется. 122-124,131 Таким образом, клеточные мРНК могут переключаться с кэп-зависимой на кэп-независимую трансляцию в качестве адаптивного ответа стрессоустойчивости 122-124,131 ; это также может иметь место при инициации трансляции с мРНК ВИЧ-1.

Как и все вирусы, ВИЧ-1 является облигатным внутриклеточным паразитом и должен использовать клеточный аппарат для производства вирусного белка.Как следствие, на ранней стадии инфицирования вирусные мРНК должны конкурировать со всеми активно транслируемыми клеточными мРНК за использование рибосом и, прежде всего, за ограниченный пул факторов инициации трансляции эукариот (eIFs), необходимых для инициации трансляции. Успех в этой конкуренции обеспечит перепрограммирование механизма хозяина в сторону производства кодируемых вирусами белков и, в конечном итоге, высвобождение инфекционных вирионов. 132,133 В случае ВИЧ-1 было показано, что 5’UTR управляет кэп-зависимой инициацией трансляции в нормальных физиологических условиях 33,51 и опосредует IRES-зависимый синтез белка во время стрессовых условий, которые, как известно, препятствуют кэп-зависимой трансляции. -зависимое инициирование перевода. 32,86,88,91,118 Интересно, что в ходе репликации вируса было показано, что ВИЧ-1 изменяет клеточный гомеостаз, изменяя несколько компонентов аппарата трансляции хозяина, что приводит к ингибированию кэп-зависимой трансляции. Например, ВИЧ-1 индуцирует эндогенное увеличение количества реактивных кислородных промежуточных соединений в клетках, что приводит к окислительному стрессу, который, как было продемонстрировано, способствует NF-каппа B-зависимой активации транскрипции ВИЧ и стимулирует активность 5’UTR IRES ВИЧ-1. 88 Кроме того, экспрессия вирусного белка R (Vpr), который играет роль в регуляции обратной транскрипции, ядерного транспорта, транскрипции, клеточного цикла и апоптоза, также может способствовать остановке клеточного цикла в G2 / M фаза. 134 В общем, во время фазы G2 / M клеточного цикла как eIF4E, так и 4E-BP гипофосфорилируются, что приводит к разрушению комплекса eIF4F, секвестрации eIF4E 4E-BP и подавлению cap -зависимое инициирование перевода. 135 Соответственно, во время остановки клеточного цикла G2 / M, индуцированной Vpr, функциональный eIF4E снижается, поскольку взаимодействие eIF4E-4EBP благоприятствует. 74 Напротив, индуцированная вирусом остановка клеточного цикла G2 / M стимулирует как транскрипцию ВИЧ-1, так и трансляцию мРНК Gag, 136 , что приводит к общему увеличению продукции вируса. 137 Это открытие сильно коррелирует с наблюдением, что экспрессия, управляемая IRES ВИЧ-1, практически не зависит от остановки G2 / M. 86

Фактор инициации eIF4G также является субстратом для нескольких различных клеточных и вирусных протеаз на поздних стадиях инфицирования ВИЧ-1.Действительно, активация апоптоза с помощью Vpr индуцирует активацию каспазы 3, которая, в свою очередь, опосредует протеолиз eIF4G. 138,139 Кроме того, вирусная протеаза ВИЧ-1, которая необходима для процессинга вирусных белков и также имеет несколько клеточных мишеней, 140-148 , также может расщеплять факторы инициации eIF4G, PABP и eIF3d. 140-142,148 Хотя влияние расщепления eIF3d на трансляцию не было определено, 148 протеолиз eIF4G и PABP приводит к репрессии кэп-зависимой трансляции в RRL, в бесклеточных экстрактах и ​​в культивируемых клетках. 141, 142, 149, 150 Однако в этих условиях, которые препятствуют кэп-зависимой инициации трансляции, синтез белка, управляемый EMCV- и PV-IRES, и 5’UTR ВИЧ-1 практически не затрагивается как в бесклеточных экстрактах, так и в клетках (см. ). 149,150 Эти эксперименты предполагают, что на поздних стадиях цикла репликации ВИЧ-1 нацелена кэп-зависимая инициация трансляции. Следовательно, в условиях, которые препятствуют инициации кэп-зависимой трансляции, присутствие функционального IRES будет способствовать трансляции вирусной мРНК по сравнению с трансляцией клеточных мРНК.

Кроме того, наличие модифицированной 5’cap-структуры на конце полноразмерной РНК ВИЧ-1 может также оправдать потребность в IRES. Действительно, белок, взаимодействующий с рецептором, активируемым пролифератором пероксисом, с доменом метилтрансферазы (PIMT) является белком, который, как известно, взаимодействует с комплексом Rev / RRE. PIMT гиперметилирует m 7 G RNA-cap с образованием пула триметилгуанозинового (TMG; m 2, 2,7 guanosine) -cap, содержащего вирусные мРНК. 151-153 TMG-кэпированные РНК, как известно, плохо транслируются, 154 из-за неэффективного распознавания триметила кэп-связывающим белком eIF4E. 155-158 Как следствие, можно было бы предсказать, что РНК TMG-HIV-1 будут неэффективно транслироваться, что приведет к снижению вирусной экспрессии. Однако это не так, и TMG-кэпирование вирусных мРНК ассоциируется с повышенной экспрессией структурных белков ВИЧ-1. 151 Хотя механизм, с помощью которого эти TMG-кэпированные вирусные мРНК рекрутируют трансляционный аппарат, не был изучен, есть соблазн предположить, что инициация трансляции с TMG-HIV-1 РНК может происходить с помощью независимого от кэпа IRES-опосредованного механизма. .

Инициирование трансляции мРНК ВИЧ-1

Abstract

Инициирование трансляции полноразмерной мРНК вируса иммунодефицита человека может происходить с помощью нескольких различных механизмов для поддержания продукции структурных белков вируса на протяжении всего цикла репликации. Синтез вирусного белка ВИЧ-1 может происходить как за счет использования кэп-зависимого, так и управляемого IRES механизма в зависимости от физиологических условий клетки и статуса продолжающейся инфекции. Для обоих этих механизмов существует потребность в нескольких вирусных и клеточных кофакторах для оптимальной трансляции вирусной мРНК.В этом обзоре мы опишем механизм, используемый полноразмерной мРНК для инициации трансляции, подчеркнув роль кофакторов в этом процессе. Особое внимание будет уделено роли геликазы РНК DDX3 в инициации трансляции мРНК ВИЧ-1.

Введение

Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) является прототипом лентивируса рода Retroviridae и этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Ретровирусы представляют собой уникальное семейство РНК-вирусов, которые используют кодируемую вирусами обратную транскриптазу (ОТ) для репликации через промежуточное соединение провирусной ДНК. 1 Провирус постоянно интегрирован в хромосому клетки-хозяина и, подобно клеточному гену, экспрессируется с помощью транскрипции клетки-хозяина, процессинга РНК и трансляции. После транскрипции ретровирусная пре-мРНК сплайсируется в вирусные мРНК, которые проявляют все характеристики клеточных мРНК, поскольку они несут 5′-шапочную структуру и 3′-поли (A) хвост. В случае ВИЧ-1 альтернативный сплайсинг дает более 30 различных видов мРНК, которые затем разными путями экспортируются в цитоплазму.МРНК ВИЧ-1 были сгруппированы в 3 класса в зависимости от степени их сплайсинга: (i) полноразмерные транскрипты, которые соответствуют мРНК, которые не подвергаются процессу сплайсинга, кодируют полипротеины Gag и Gag-Pol; (ii) однократно сплайсированные транскрипты, которые генерируют вирусные белки Env, Vif и Vpu; (iii) полностью сплайсированные транскрипты, которые экспрессируют Rev, Tat, Vpr и Nef. Как и для всех известных на сегодняшний день вирусов, синтез белка ВИЧ-1 зависит исключительно от аппарата трансляции в клетке-хозяине рибосом, тРНК, аминокислот и всех необходимых факторов инициации, удлинения и терминации.В этом обзоре мы представляем обзор того, что было задокументировано в отношении механизма инициации трансляции полноразмерной мРНК ВИЧ-1.

Полноразмерная или геномная РНК ВИЧ-1 (гРНК)

При входе ВИЧ-1, обратной транскрипции гРНК и интеграции вирусной ДНК интегрированная провирусная геномная ДНК транскрибируется РНК-полимеразой II (Pol II) хозяина с образованием первичный продукт транскрипции, который взаимодействует с аппаратом процессинга клеточной РНК, который должен быть сплайсирован, экспортирован в цитоплазму и транслирован аппаратом синтеза белка хозяина. 2 Однако часть пре-мРНК нарушает типичный процессинг РНК, сохраняя их интроны. Чтобы экспортировать свои несплайсированные и частично сплайсированные мРНК, ВИЧ-1 использует специфический механизм, включающий клеточный путь экспорта CRM1 и вирусный белок Rev (регулятор экспрессии вириона). 3,4 Белок Rev ВИЧ-1, ядерно-цитоплазматический челночный белок, связывающий РНК, взаимодействует с высокоструктурированным элементом РНК, расположенным в гене env, известным как элемент ответа Rev (RRE).Затем комплекс Rev-RRE экспортируется в цитоплазму. 5-7

Несплицированная или полноразмерная РНК ВИЧ-1 выполняет двойную роль в качестве мРНК (мРНК ВИЧ-1), где она кодирует полипротеины Gag и Gag / Pol и как геномную РНК (гРНК) для быть инкапсулировано во вновь синтезированные частицы. 2 мРНК ВИЧ-1 содержит высокоструктурированную 5′-нетранслируемую область (5’UTR) или лидер 8 с отчетливыми и хорошо охарактеризованными мотивами РНК, которые участвуют во многих этапах цикла репликации вируса (см. ). 8 Первым структурным элементом является петля длиной около 60 нуклеотидов, называемая элементом ответа трансактивации (TAR), которая распознается вирусным белком Tat и необходима для транскрипции вирусной РНК (вРНК). 9 TAR сопровождается петлей ствола полиаденилирования (поли (A)), которая содержит сигнал полиаденилирования, который игнорируется, когда находится внутри 5′-лидера, но используется для обработки 3′-конца, когда он читается в 3′-нетранслируемой области ( 3′UTR). 10 За петлей поли (A) ствола идет сайт связывания праймера (PBS), который важен для рекрутирования тРНК (Lys3), которая служит праймером для инициации процесса обратной транскрипции гРНК. 11 Ниже PBS находятся сайт инициации димеризации (DIS), донор сплайсинга (SD) и сигналы упаковки (). Все шпильки используются либо во время процессинга РНК (SD), либо во время димеризации и инкапсидации вирусной гРНК (DIS и). 12,13 Эти сигналы РНК различаются по структуре РНК у разных лентивирусов, но их присутствие и функция у них законсервированы. 8,14,15 Например, TAR ВИЧ-2 намного длиннее и свернут в мотив вилки, тогда как в ВИЧ-1 это петля ствола. 16-18

Схематическое изображение геномной РНК (гРНК) ВИЧ-1. Полноразмерная мРНК ВИЧ-1 кэпирована на 5′-конце остатком 7-метилгуаниловой кислоты (m 7 G) или триметилгуанозином (TMG) и структурирована в виде четко определенных мотивов РНК: шпилька TAR, поли ( A ) Сигнал, первичный сайт связывания (PBS), сайт инициации димеризации (DIS), главный сайт донора сплайсинга (SD) и сигнал упаковки РНК (ψ). МРНК кодирует 2 белка: p55 и p40, которые могут быть синтезированы либо входом рибосомы из 5’cap, либо из IRES, расположенных как в 5’UTR, так и в кодирующей области (как показано на рисунке).Вход в рибосомы на 5′-конце происходит путем рекрутирования тримерного комплекса, состоящего из DDX3, PABP и eIF4G, тогда как внутренний вход происходит путем прямого связывания преинициативного комплекса 43S с элементами IRES. Обратите внимание, что 5′-колпачок также может быть связан комплексом CBC.

Инициирование трансляции

Инициирование трансляции большинства мРНК эукариот происходит с помощью механизма сканирования, посредством которого 40S рибосомная субъединица рекрутируется вблизи кэп-структуры, остатка 7-метилгуаниловой кислоты, расположенного на 5′-конце всех мРНК эукариот. и сканирует в направлении от 5 ‘до 3’ до тех пор, пока не встретится инициирующий кодон. 19,20 Рибосомная субъединица 40S рекрутируется в мРНК как часть инициирующего комплекса 43S, состоящего из субъединицы, связанной с eIF2-GTP / Met-tRNAi (инициаторная тРНК), eIF1A, eIF1 и eIF3. eIF4F, многосубъединичный комплекс, состоящий из eIF4E, eIF4A и eIF4G, важен в этом процессе рекрутирования. 19,20 eIF4E напрямую связывается со структурой 5’cap, в то время как eIF4A, член семейства DEA (D / H) -box РНК-геликазы, участвует, раскручивая вторичную структуру в 5′-нетранслируемой области (5’UTR ) мРНК.Активность геликазы eIF4A стимулируется eIF4G и eIF4B. 21 В этом процессе eIF4G служит каркасом для скоординированной сборки комплекса инициации трансляции, поскольку он содержит сайты связывания для eIF4A, eIF4E и eIF3. Следовательно, eIF4G связывает кэп мРНК (через eIF4E) и рибосомную субъединицу 40S (через eIF3) для присоединения матричной мРНК к аппарату трансляции. eIF4G также связывает поли (A) -связывающий белок (PABP), и это способствует циркуляризации мРНК путем связывания 5’cap (через eIF4E-eIF4G) и 3’poly (A) хвоста (через PABP-eIF4G) мРНК, которая физическая форма, благоприятная для перевода. 19,20

Альтернативный кэп-независимый механизм инициации трансляции был подтвержден при изучении трансляции не кэпированных мРНК пикорнавирусов. 22 Пикорнавирусные мРНК содержат структурный элемент РНК, называемый внутренним сайтом входа в рибосому (IRES), чтобы способствовать рекрутированию инициирующего комплекса 43S кэп-независимым образом. 23,24 Кроме того, некоторые пикорнавирусы кодируют вирусные протеазы, которые непосредственно нацелены на eIF4G и PABP во время инфекции, в то время как другие изменяют доступность eIF4E. 25-28 Оба события приводят к нарушению инициации клеточной кэп-зависимой трансляции во время вирусной инфекции, чтобы перенаправить аппарат трансляции хозяина на вирусные мРНК. 29 Более поздние исследования показали, что этот альтернативный механизм инициации трансляции не ограничивается пикорнавирусами, поскольку мРНК из других вирусных семейств, включая некоторых представителей Retroviridae, также используют IRES-зависимую инициацию трансляции. 30,31 В отличие от мРНК пикорнавирусов, ретровирусные мРНК обладают 5′-кэп-структурой и могут инициировать трансляцию либо по каноническому кэп-зависимому механизму, либо через IRES. 32,33

РНК-структуры

модулируют белковый синтез полноразмерной мРНК ВИЧ-1

5’UTR ВИЧ-1 содержит несколько хорошо охарактеризованных структурных элементов РНК, критических для различных стадий цикла репликации ВИЧ-1, такие как TAR, петля Poly (A), домен PBS, SD, DIS и (см.). Благодаря своей стабильности эти структуры РНК также могут модулировать инициацию трансляции вирусной мРНК. Таким образом, домен TAR представляет собой высокостабильную структуру петля-стержень длиной 57 нуклеотидов (ΔG = -29. 6 ккал / моль), расположенный на самом 5′-конце всех транскриптов ВИЧ-1. 30 Фактически, структура петли стебля TAR закрывает кэп-фрагмент, что ставит под вопрос ее доступность для eIF4E во время сборки комплекса инициации трансляции над вирусной мРНК. 34,35 Как было ранее продемонстрировано, наличия стебель-петли с более слабой стабильностью (ΔG = -13,6 ккал / моль) на 5′-конце синтетической мРНК достаточно для ингибирования рекрутирования рибосом на 5′-конце. , 36 не стало неожиданностью, что присутствие только TAR или в контексте 5′-UTR ВИЧ-1 ингибирует кэп-зависимую трансляцию в RRL и в ооцитах Xenopus. 34,35,37,38 Добавление транс-доминантно-отрицательного мутанта eIF4A R362Q 39 в RRL, сильно подавленную экспрессию 5′-UTR ВИЧ-1, что указывает на то, что для преодоления РНК необходимы как eIF4G, так и eIF4A структуры, присутствующие в 5′-UTR ВИЧ-1. 40 Однако подавление трансляции, вызванное TAR, было менее выражено в клетках, и это было подтверждено восстановлением подавления трансляции в RRL после добавления экстрактов цитоплазматических клеток HeLa. 34,41 Это наблюдение согласуется с тем фактом, что известно несколько клеточных белков, которые связывают структуру TAR ВИЧ-1, способствуя активации трансляции мРНК ВИЧ-1. 42

Исследования показали, что 5’UTR ВИЧ-1 может принимать 2 пространственные конформации, которые представляют собой разветвленные множественные шпильки (BMH) и структуры дальнего взаимодействия (LDI). 43 Было показано, что BMH экспонирует сигналы димеризации и упаковки, чтобы способствовать инкапсидации и вирусной репликации. 44-46 Рибопереключение между LDI и BMH зависит от вирусной инфекции, поскольку оно усиливается как концентрацией геномной РНК, так и присутствием вирусного белка NC. 43,47 Однако эксперименты показали, что, несмотря на тот факт, что структура BMH перекрывает кодон стартового сайта AUG, 48 структура сама по себе не изменяет скорость трансляции, управляемую 5’UTR ВИЧ-1. 41,44 Кроме того, введение мутаций, предназначенных для изменения равновесия LDI-BMH, не оказывает значительного влияния на способность 5’UTR ВИЧ-1 управлять инициацией трансляции как в контексте моно-, так и бицистронной мРНК. . 41,44

Интересно, что экспрессия вирусного белка Gag подавляет его собственный синтез, одновременно стабилизируя конформацию структуры BMH. 49 Поскольку структура BMH сама по себе не препятствует трансляции вирусной мРНК 41,44 , это может быть присутствие белка Gag на вирусной мРНК, которое влияет на прикрепление рибосом или сканирование вдоль 5’UTR. Белок Gag оказывает бимодальный эффект на собственное производство с усилением экспрессии при низкой концентрации и ингибированием при высокой концентрации. 49 Другая возможность состоит в том, что репрессия трансляции мРНК ВИЧ-1 индуцируется Gag-опосредованной димеризацией гРНК ВИЧ-1. Дуплекс, образованный геномной РНК и белком Gag через домен NC, вероятно, создает сильное препятствие для сканирования или рекрутирования комплекса инициации трансляции. Следовательно, при высокой концентрации белок Gag будет непосредственно отвечать за ингибирование трансляции вирусной мРНК, способствуя ее упаковке в синтезированные de novo вирусные частицы 49 Эта возможность согласуется с результатами, показывающими, что димеризация вирусной РНК ингибирует трансляцию вирусной мРНК, одновременно способствуя инкапсидация гРНК. 47,50 Интересно, что димеризации РНК может способствовать дальнодействие РНК-РНК, устанавливаемое между нуклеотидами, присутствующими в кодирующей области Gag, и последовательностью 5’UTR. 47

Кэп-зависимая инициация геномной РНК ВИЧ-1

Сканирование рибосом из 5’cap

Эксперименты по трансляции in vitro, проведенные на лизате ретикулоцитов кролика (RRL), показали, что добавление как кэп-аналога, так и расщепление eIF4G протеазой L ящура ингибирует трансляцию кэпированного моноцистронного репортерного гена ВИЧ-1, что свидетельствует о том, что 5′-рибосомное сканирование имеет место на 5’UTR ВИЧ-1. 33 За этим последовали данные лаборатории Berkhout, показывающие, что экспрессия протеазы 2A от полиовируса нарушает инициацию трансляции геномной РНК ВИЧ-1 ex vivo. Более того, вставка вышележащих кодонов AUG (uAUG) в разные места в 5’UTR ВИЧ-1 сильно ингибировала трансляцию, подтверждая использование 5′-зависимого механизма сканирования рибосом. 51 Инициирование с кэпированного конца также дало объяснение тому факту, что укладка и длина структуры TAR (которая различается для ВИЧ типа 1 и типа 2) имеют такое большое влияние на общую эффективность трансляции. 34 Эта гипотеза о сканировании рибосом также хорошо согласуется с тем фактом, что большинство природных изолятов ВИЧ-1 не переносят uAUG в пределах их 5’UTR, несмотря на его большую длину. 8 Однако механизм, с помощью которого преинициативный комплекс 43S может иметь дело с этими стабильными структурами РНК, которые, как известно, нарушают как начальное связывание рибосом, так и сканирование, остается неясным. 52,53 В большинстве случаев присутствие eIF4A и eIF4B / eIF4H в преинициационном комплексе 43S может разрешить эти структуры АТФ-зависимым образом. 54 Однако, как указано выше, структура TAR, расположенная непосредственно ниже кэп-структуры, и сложная структура всей 5′-UTR ВИЧ-1, по-видимому, слишком стабильны, чтобы просто разворачиваться комплексами eIF4A / eIF4B / eIF4H. Следовательно, остается вопрос, как преинициативный комплекс 43S может связываться и сканировать этот структурированный 5’UTR ВИЧ-1.

Необходимость дополнительных геликаз в трансляции ВИЧ-1

Намек на вышеупомянутый вопрос был получен в недавних исследованиях, показывающих, что сложные структуры РНК можно раскручивать путем рекрутирования клеточных РНК-геликаз в комплекс 43S, чтобы помочь сканированию рибосом. 55 Эти геликазы принадлежат к растущему семейству белков DExD / H-бокса (DEAD, DEAH, DexH и DExD), которые характеризуются присутствием высококонсервативного корового домена геликазы, участвующего в связывании АТФ, гидролизе АТФ и связывании нуклеиновых кислот. 56,57 Эти ферменты участвуют практически во всех аспектах метаболизма РНК путем ремоделирования рибонуклеопротеинов (РНП) или комплексов РНК-РНК. Таким образом, некоторые из них были специально вовлечены в процесс инициации трансляции.Так обстоит дело с Ded1, RHA (DHX9) и DEAH-бокс-белком DHX29 у млекопитающих, которые взаимодействуют с eIF4A / eIF4B / eIF4H для повышения процессивности рибосомного сканирования структурированных транскриптов. 55,58-60 В этом процессе эти ферменты доставляются к 5′-концу мРНК либо путем связывания со специфическим посттранскрипционным элементом (PCE) в случае RHA, как часть комплекса eIF4F для Ded1. или вместе с рибосомной субъединицей 40S для DHX29. 60-62 В случае ВИЧ-1 Борис-Лори и его коллеги рассмотрели роль DHX9 / RHA в вирусной трансляции, и они показали, что последний необходим для стимулирования ремоделирования РНП через 5’UTR для обеспечения прогрессирования рибосом. . 61 Это происходит за счет начального связывания RHA с элементом PCE, обнаруженным в 5’UTR ВИЧ-1, и, по-видимому, требует АТФ-зависимой активности. 61 Дрожжевой ортолог Ded1, который у млекопитающих называется DDX3, также участвует в трансляции ВИЧ-1. DDX3 является членом семейства РНК-геликаз DEAD-box и участвует во многих биологических процессах, таких как развитие клеточного цикла, апоптоз, рак, врожденный иммунный ответ и в репликации многих вирусов, которые инфицируют людей 31 , таких как основные возбудители вирусов гепатита С и В вместе с ВИЧ-1. 31,63

В геноме человека есть 2 родственных DDX3 гена DDX3X и DDX3Y. DDX3X или DBX (в дальнейшем называемые DDX3) изначально были картированы в сцепленных с X-хромосомами генах с функциональными гомологами в Y-хромосоме и были обнаружены в области Xp11.3-11.23. 64,65 DDX3Y или DBY специфически экспрессируются в семенниках, где они играют важную роль в сперматогенезе; 66 однако, из-за этой специализированной роли, он не будет более подробно обсуждаться в этом обзоре.Первоначально было показано, что DDX3 важен для репликации ВИЧ-1, действуя как кофактор Rev и CRM1 во время ядерного экспорта RRE-содержащих векторов. 67 DDX3 позже было обнаружено, что он ассоциирован с некоторыми ключевыми членами механизма инициации трансляции и участвует в трансляции подмножества клеточных и вирусных мРНК, несущих структурированные 5′-UTR. 59,68,69 Однако, в отличие от своего дрожжевого ортолога, DDX3 необязателен для общей трансляции и не может рассматриваться как функциональный фактор инициации трансляции. 59,70 В недавнем отчете Лю и его коллеги исследовали роль DDX3 в трансляции ВИЧ-1 в контексте полноразмерного провируса и репортерных генов, происходящих от ВИЧ-1. Они выполнили сверхэкспрессию и нокдаун эндогенного белка на основе siRNA, чтобы обнаружить, что ВИЧ-1 требуется присутствие геликазы для трансляции. 71 Кроме того, используя бицистронные конструкции, содержащие IRES ВИЧ-1 в межцистронном спейсере, они предположили, что DDX3 может действовать как ITAF, способствуя трансляции, управляемой IRES.Однако не было предоставлено никаких механистических представлений для объяснения потребности в ферменте, и они скорее предполагали роль в содействии сканированию рибосом на 5′-лидере вируса.

В другом исследовании Soto-Rifo et al. нокдаун DDX3 в клетках HeLa, экспрессирующих полноразмерный провирусный клон ВИЧ-1, кодирующий репортерный ген renilla, обнаружив, что, хотя на общую трансляцию не влияет истощение DDX3, синтез Gag ВИЧ-1 из вРНК резко нарушается. 72 В том же исследовании несколько мутантов DDX3 были использованы для документирования необходимости мотивов связывания АТФ и гидролиза для функции DDX3 в инициации трансляции.Путем вставки неструктурированных спейсеров РНК между кэпом и началом структуры TAR было показано, что смещение TAR всего на 15 нуклеотидов от m 7 GTP было достаточным для отмены потребности в DDX3 в синтезе белка. Вместе эти наблюдения показывают, что DDX3 необходим для начальной стадии связывания рибосом, а не для процесса сканирования. Это было дополнительно продемонстрировано с помощью биохимического анализа, в котором было показано, что DDX3 связывается как с дуплексом РНК TAR, так и с 2 дополнительными сайтами на 5’UTR ВИЧ-1, которые соответствуют участкам одноцепочечной РНК, что дает биологические доказательства предлагаемого механизма локального разделение прядей, предложенное Янковским и его коллегами. 73 DDX3, как было продемонстрировано, локально раскручивает основание мотива TAR, чтобы сделать m 7 GTP доступным для связывания с рибосомами. В этой модели DDX3 заменяет eIF4E, чтобы зародить вступление преинициативного комплекса 43S. Интересно, что недавняя работа лаборатории Boris-Lawrie показала, что трансляция геномной РНК ВИЧ-1 может происходить независимо от eIF4E путем рекрутирования CBP 80 на 5′-конце транскрипта. 74 Таким образом, остается вопрос, происходит ли образование комплекса 43S за одну стадию, т.е.g., DDX3 связывает и образует ядро ​​сборки полного комплекса, состоящего из eIF4F, eIF4B, eIF3, eIF1 / 1a, eIF2 и рибосомы 40S, или сборка такого комплекса происходит последовательно? Точно так же другим важным вопросом, на который необходимо ответить, будет определение состава преинициативного комплекса 43S, опосредованного DDX3: содержит ли он весь набор eIF или некоторые из них отсутствуют? Кроме того, следует учитывать, что TAR является предпочтительным сайтом связывания для Tat. 75 Таким образом, прямое взаимодействие между DDX3 и Tat недавно было показано как in vitro, так и in vivo. 76,77 Поразительно, но взаимодействие Tat / DDX3 приводит как к усилению вирусной транскрипции, так и к трансляции. 76,77 В последнем случае, который больше соответствует теме этого обзора, было обнаружено, что комплекс Tat / DDX3 ассоциирован как с комплексами инициации трансляции, так и с полисомами. Нокдаун DDX3 приводит к высвобождению Tat из полисомальной фракции, что подчеркивает его роль в этом взаимодействии. 76

Эти данные согласуются с данными, показывающими, что взаимодействие клеточных РНК-связывающих белков с вирусной РНК влияет на структуру-функцию РНК. 41 РНК-связывающий белок аутоантиген волчанки La 78 был первым идентифицированным клеточным белком, который, как было показано, связывается с 5′-лидером ВИЧ-1 и снимает индуцированную TAR репрессию трансляции в системе in vitro. 38 Для такого эффекта требовался домен димеризации La 79 , а позже Hühn et al. (1997) сообщили, что La проявляет активность фермента, раскручивающего дцРНК, которая потенциально может быть использована для дестабилизации структуры TAR; 80 , тем не менее, влияние La на экспрессию ВИЧ-1 в культуре клеток или его роль в репликации ВИЧ-1 в дальнейшем не исследовалось. Staufen 1 и TAR-РНК-связывающий белок (TRBP) являются другими примерами клеточных белков, которые способны ослаблять репрессию трансляции, индуцированную TAR, путем прямого взаимодействия со структурой TAR РНК. 37,81

eIF4E Независимая трансляция полноразмерной мРНК ВИЧ-1

Во время синтеза и обработки мРНК образуются несколько различных, но динамичных комплексов мРНК-рибонуклеопротеин (мРНП). Один из первых белковых комплексов, котирующийся при совместной транскрипции через структуру 5’cap, известен как ядерный кэп-связывающий комплекс (CBC). 82 CBC состоит из белка субъединицы связывания кэпа 20 (CBP 20), который связывает кэп, и связывающего кэп белка 80 (CBP 80), который стабилизирует это взаимодействие. CBC играет важную роль в различных аспектах метаболизма ядерной мРНК, таких как сплайсинг пре-мРНК и ядерный экспорт, и остается связанным с мРНК во время удаления интрона, отложения комплекса экзонных соединений (EJC) и ядерного экспорта. В цитоплазме CBC играет аналогичную роль eIF4E, поскольку оба могут напрямую взаимодействовать с eIF4G, чтобы служить платформой для загрузки преинициативного комплекса 43S на мРНК, 83,84 , чтобы пройти то, что называется пионерским раундом перевод. 84 Это индуцирует обширные перестройки мРНП, связанных с CBC, с удалением EJC и связанных с EJC факторов трансляционными рибосомами и обменом ядерного поли (A) -связывающего белка N1 (PABPN1) на цитоплазматический PABPC1 на поли (Хвост. 84 CBP80 также способствует замене CBC на eIF4E в мРНК, ассоциированной с полисомами, с помощью механизма, который включает диссоциацию CBC от мРНК, вызванную кариоферином импортином-β. 83,84 Диссоциация CBC делает возможным связывание eIF4E с 5’cap и начало синтеза белка.Один eIF4E имеет более низкое сродство к кэпу, чем CBC, но сборка eIF4F увеличивает сродство eIF4E к кэпу. 85 Недавний отчет предполагает, что в случае ВИЧ-1 сплайсированные вирусные мРНК подвергаются обмену CBC на eIF4E, в то время как несплайсированные мРНК ВИЧ-1 остаются связанными с CBC в цитоплазме 74 во время трансляции мРНК и инкапсидации вирусной гРНК. 74 Эти наблюдения побудили авторов предложить модель, с помощью которой инициация трансляции полноразмерной мРНК HIV-1 д. Происходить с помощью неканонического cap-зависимого механизма инициации трансляции, зависящего от CBC вместо elF4E. 74 Однако альтернативная интерпретация этих открытий состоит в том, что CBC остается ассоциированным с вирусной мРНК, но рекрутирование 40S рибосомной субъединицы происходит 5′-концевым независимым образом, как подчеркнуто ниже. Эта возможность, которая не была учтена авторами, также соответствует всем выводам, которые они описывают. 74

Кеп-независимая инициация трансляции с мРНК ВИЧ-1

Характеристика последовательностей IRES

На полноразмерной мРНК ВИЧ-1 были идентифицированы два IRES, один в пределах ее 5’UTR, а другой — в кодирующая область Gag. 86,87 IRES в 5’UTR был подтвержден в лабораторно адаптированном инфекционном рекомбинантном провирусном клоне ВИЧ-1 NL4.3, CXCR4 (X4) -тропном первичном изоляте HIV-LAI и в 5’UTR вирусного РНК выделена из клинических образцов.

86,88-90 Кроме того, было показано, что трансляция ВИЧ-1 в бицистронном контексте устойчива к пикорнавирусным протеазам, которые специфически ингибируют кэп-зависимую инициацию трансляции. 86,89,91 Совсем недавно Monette et al. использовали эксперименты по трансфекции-инфекции ДНК, кодирующей бицистронную РНК, содержащую 5’UTR ВИЧ-1, доказывая, что ее активность не нарушается инфекцией полиовируса в 293 Т-клетках.

Структурный анализ лидера ВИЧ-1 показал, что короткий дуплекс РНК с предсказанной свободной энергией (ΔG) -10,4 образуется в лидерной области дикого типа путем спаривания оснований последовательностей, фланкирующих сайт связывания праймера (PBS). В Brasey et al. (2003), этот дуплекс из 7 пар оснований был усилен в контексте pNL4.3 инфекционный клон для создания плазмиды, кодирующей вирусную РНК с повышенной стабильностью в домене PBS. ΔG, предсказанный для этих новых структур РНК, находился в диапазоне от -23,5 ккал / моль (дикий тип) до -38,4 ккал / моль. Последнее значение значительно превышало стабильность 5’UTR ВИЧ-1 дикого типа, включая стабильность структуры шпильки расширенной трансактивационной (TAR) области (-29,6 ккал / моль), которая, как известно, сильно ингибирует инициацию трансляции. После трансфекции клеток C33A не наблюдалось никакого эффекта на экспрессию белков Pr55Gag и CA-p24, что свидетельствует о наличии IRES.Кроме того, трансляционная активность 5’UTR IRES ВИЧ-1 оказалась устойчивой к введению мутаций, предназначенных для изменения специфических структурных элементов РНК в функциональной области, 41,89,90 , предполагая, что взаимосвязь структура-функция для ВИЧ -1 IRES не такой жесткий, как описанный для других вирусных IRES. 92-98 Биологическое значение этих результатов еще предстоит выяснить. Более того, изучая IRES 5′UTR ВИЧ-1, Gendron et al. определили область выше PBS, которую они назвали IRENE, для отрицательного элемента IRES, который отрицательно влияет на активность лидера IRES ВИЧ-1. 88 Молекулярные механизмы, с помощью которых этот цис-действующий элемент РНК может ингибировать управляемую IRES трансляцию, неизвестны и не изучались в дальнейшем. Помимо IRENE, другие цис-действующие репрессивные последовательности или ингибирующие последовательности (CRS / INS) 99-104 , как сообщается, разбросаны по участкам Gag, Pol и Env мРНК ВИЧ-1 99-104 , также способны ограничивать экспрессия структурных белков ВИЧ-1 по еще не определенному механизму. Хотя для этих элементов CRS / INS не была определена консенсусная последовательность, было показано, что они содержат элементы, богатые AU (ARE). 101,102 Один такой ингибирующий элемент, известный как INS-1, обнаружен в кодирующей области Gag матрицы (p17) и, как сообщается, действует как ингибитор как cap-зависимой, так и опосредованной IRES инициации трансляции мРНК ВИЧ-1. 99,102 Ингибирование трансляции не ограничивалось контекстом мРНК ВИЧ-1, поскольку вставка INS-1 в гетерологичную невирусную мРНК также могла ингибировать ее экспрессию. 99,102,105 Хотя молекулярный механизм, с помощью которого INS-1 ограничивает инициацию трансляции мРНК ВИЧ-1, остается неопределенным, несколько сообщений предполагают участие белков хозяина. 106-109

В том же духе Brasey et al. показали, что ORF Gag ингибирует экспрессию белка, опосредованного 5’UTR ВИЧ-1, в контексте линии клеток HeLa. 86 Такие результаты были очень загадочными в то время, учитывая, что 5’UTR ВИЧ-1 управляет экспрессией белка Gag. Следовательно, как может 5’UTR IRES ВИЧ-1 управлять эффективной экспрессией Gag, в то время как ORF Gag ингибирует функцию IRES? Этот вопрос недавно был решен Plank et al. которые показали, что ингибирующий эффект Gag ORF не наблюдался в контексте лимфоцитарной клеточной линии. 90 Эти наблюдения предполагают, что репрессия трансляции ограничена определенными типами клеток, но не естественными хозяевами инфекции ВИЧ-1. Вместе эти наблюдения предполагают, что тропизм ВИЧ-1 частично регулируется еще плохо изученным молекулярным механизмом, включающим трансляционный контроль экспрессии вирусных генов. Аналогичный сценарий был установлен для других вирусов, несущих IRES. Трансляционный контроль вирусного тропизма был охарактеризован для ВГС, а также для некоторых членов семейства вирусов пикорнавиридов. 110-114

В дополнение к IRES, присутствующим в 5’UTR ВИЧ-1, Бак и его коллеги также идентифицировали IRES в ORF Gag. 87 Этот второй IRES управляет экспрессией как Gag-белка, так и его более короткой N-усеченной изоформы (p40), в которой отсутствует весь матричный домен (см. ). Хотя функция Gag p40 неизвестна, он продуцируется во время инфекции, и его делеция нарушает кинетику роста ВИЧ-1 в культуре. 87 Присутствие более коротких N-усеченных изоформ, которые возникают в результате альтернативной инициации в кодонах, расположенных в кодирующей области Gag, консервативно в ВИЧ-2 и обезьяньем гомологе (SIV). 115,116 Исследование механизма трансляции, используемого для продукции p40, выявило исключительное использование IRES, локализованной в ORF Gag, чья активность полностью независима от кэп-структуры и eIF4E и устойчива к обработке протеазой L ящура. 33 Однако наиболее характерные характеристики этого IRES заключаются в его способности стимулировать экспрессию в вышестоящем AUG, расположенном на его 5′-границе. 87,117 Это обеспечивает эффективный синтез белка из синтетических безлидерных мРНК, в которых кодон AUG расположен непосредственно на 5′-конце РНК.Удивительно, но трансляция, опосредованная этой синтетической мРНК, является высокоэффективной 117 (de Breyne et al. , Неопубликовано) и происходит в аутентичном кодоне AUG без связанного сканирования утечки, что указывает на то, что рекрутирование рибосом в кодирующую область Gag IRES опосредуется нетрадиционным механизм. Эта характеристика сохраняется в ВИЧ-2 и в SIV. 115,117

Все эти особенности контрастируют с другими IRES, описанными на сегодняшний день, и позволяют предположить, что кодирующая область Gag содержит 2 сайта связывания для прикрепления рибосом, которые предназначены для каждого сайта инициации.

Активность IRES 5′-лидера ВИЧ-1 регулируется транс-действующими факторами IRES (ITAF)

IRES 5’UTR ВИЧ-1 продемонстрировал активность в различных биологических системах, таких как экстракты трансляции на основе HeLa, 86 в такие клетки, как HeLa, U20S, HEK293-T, Jurkat T-клетки, 71,86,88,90,118,119 и в ооцитах Xenopus laevis (см.). 41,120 Тем не менее, IRES ВИЧ-1 весьма неэффективен в продвижении трансляции в RRL. 121 Однако эта низкая активность может быть устранена добавлением экстрактов клеток HeLa, полученных из G2 / M-арестованных клеток, к лизату 41 , что указывает на потребность в клеточных белках и / или транс-действующих факторах IRES (ITAF). 41 Хотя точный механизм, с помощью которого ITAFs облегчает рекрутирование рибосомных субъединиц, остается неизвестным, они, по-видимому, способствуют связыванию eIFs и рибосом, или могут действовать, помогая РНК создавать структуру, способную рекрутировать инициирующий комплекс. 94,122-125 Используя эксперименты с выпадающим списком Vallejos et al. 41 идентифицировал серию белков, обнаруженных в экстрактах G2 / M HeLa, которые взаимодействуют с вирусным 5’UTR. Однако эти результаты являются предварительными, поскольку их роль в инициации трансляции не оценивалась в функциональном анализе. 41 Воздействие некоторых хорошо известных ITAF было исследовано на инициацию трансляции 5’UTR IRES ВИЧ-1. 71,118,120 Таким образом, Liu et al. показали, что eIF5A, человеческий Rev-взаимодействующий белок (hRIP) и DDX3 все способны стимулировать трансляционную активность 5’UTR IRES ВИЧ-1, когда они находятся в бицистронном контексте в клетках HEK293T. Интересно, что в том же отчете был отвергнут Sam68, член семейства белков трансдукции сигнала и активации РНК (STAR), как возможный ITAF для 5’UTR IRES ВИЧ-1. 71 Используя аналогичную стратегию, Monette et al. идентифицировали hnRNP A1 как клеточный фактор, который усиливает функцию 5’UTR IRES ВИЧ-1. 118 Они также представили доказательства того, что мРНК ВИЧ-1 загружена hnRNP A1 в ядре клетки и что белок перемещается в цитоплазму, связанную с вирусной мРНК, где он может выполнять свою функцию на уровне IRES-опосредованной инициации трансляции. 118 Что касается возникающих клеточных мРНК, ожидается, что мРНК ВИЧ-1 сначала столкнется с РНК-связывающими белками в ядре. 82 Фактически, полноразмерная вирусная мРНК достигает цитоплазмы как часть особого комплекса рибонуклеопротеидов (РНП) с ядерными РНК-связывающими факторами. 10,126 Таким образом, вполне вероятно, что и вирусные, и клеточные белки, такие как Rev и hRNP A1, изначально загружаются на вирусную мРНК в ядре, прежде чем они будут использоваться для экспрессии цитоплазматической РНК. 118,127 В соответствии с этой возможностью, недавнее сообщение подтверждает котранскрипционное образование стабильного экспортного комплекса, который включает как Rev, так и CRM1. 128 Примечательно, что Rev и ассоциированные белки не только определяют экспорт полноразмерной мРНК, но также играют роль в ее трансляции. Фактически Rev способствует полисомной ассоциации полноразмерной мРНК и стимулирует ее трансляцию. 127,129 Кроме того, Rev также необходим для связывания PABP с Rev-зависимыми вирусными мРНК и снимает ингибирование трансляции, налагаемое Gag ORF. 100,101,130 IRES-опосредованная инициация трансляции ВИЧ-1 также может быть изменена цитоплазматическими модификациями конкретных ITAF.Например, киназы, взаимодействующие с митоген-активированным протеином (MAP) киназой (Mnks), запускают фосфорилирование hRNP A1, и это событие, по-видимому, необходимо для активности IRES ВИЧ-1, поскольку ингибирование фосфорилирования Mnk приводит к снижению ВИЧ-инфекции. 1 IRES-опосредованная экспрессия белка. 118 В соответствии с этим наблюдением, инфекция ВИЧ-1 вызывает умеренное повышение статуса фосфорилирования hnRNP A1, и это может способствовать его способности влиять на инициацию IRES-опосредованной трансляции ВИЧ-1.

Различные уровни требований к факторам инициации для 5’UTR ВИЧ-1. МРНК ВИЧ-1 может использовать как кэп-зависимый механизм в моноцистронном контексте ( A, ), так и механизм, управляемый IRES ( B ). Добавление кэп-зависимых ингибиторов (протеазы P2A и FMDV L, аналог кэп) приводит к частичному подавлению экспрессии генов в моноцитронном контексте, но не в бицистронном контексте. Было показано, что добавление экстракта клеток HeLa в значительной степени стимулирует инициацию IRES ВИЧ-1.

Напротив, активность 5’UTR IRES ВИЧ-1 может также подавляться клеточными белками. Например, HuR, белок перемещения ядра-цитоплазмы, который принадлежит к консервативному семейству РНК-связывающих факторов, которые первоначально были идентифицированы у Drosophila как белки эмбрионального летального аномального зрения (ELAV), был идентифицирован как негативный модулятор активности IRES ВИЧ-1. . 120 Трансляционное ингибирование активности IRES ВИЧ-1 с помощью HuR не связано с прямым взаимодействием белок-РНК, поскольку связывание HuR с 5’UTR ВИЧ-1 установить не удалось; 120 поэтому действующий молекулярный механизм еще предстоит определить.

Почему мРНК ВИЧ-1 требует IRES?

Поскольку мРНК ВИЧ-1 несут 5’cap, можно утверждать, что IRES-зависимая инициация, по-видимому, не нужна во время трансляции вирусной мРНК. Однако несколько линий доказательств предполагают, что кэп-зависимая инициация трансляции нарушается во время репликации ВИЧ-1.

Исследования клеточных мРНК, несущих двойной режим инициации, такой как демонстрируемый мРНК ВИЧ-1, показывают, что в нормальных физиологических условиях кэп-зависимая трансляция будет преобладающим механизмом, используемым для трансляции.Однако при различных клеточных стрессах и стрессах окружающей среды глобальный синтез белка снижается, а экспрессия различных стресс-зависимых факторов, управляемых IRES, предпочтительно регулируется. 122-124,131 Таким образом, клеточные мРНК могут переключаться с кэп-зависимой на кэп-независимую трансляцию в качестве адаптивного ответа стрессоустойчивости 122-124,131 ; это также может иметь место при инициации трансляции с мРНК ВИЧ-1.

Как и все вирусы, ВИЧ-1 является облигатным внутриклеточным паразитом и должен использовать клеточный аппарат для производства вирусного белка.Как следствие, на ранней стадии инфицирования вирусные мРНК должны конкурировать со всеми активно транслируемыми клеточными мРНК за использование рибосом и, прежде всего, за ограниченный пул факторов инициации трансляции эукариот (eIFs), необходимых для инициации трансляции. Успех в этой конкуренции обеспечит перепрограммирование механизма хозяина в сторону производства кодируемых вирусами белков и, в конечном итоге, высвобождение инфекционных вирионов. 132,133 В случае ВИЧ-1 было показано, что 5’UTR управляет кэп-зависимой инициацией трансляции в нормальных физиологических условиях 33,51 и опосредует IRES-зависимый синтез белка во время стрессовых условий, которые, как известно, препятствуют кэп-зависимой трансляции. -зависимое инициирование перевода. 32,86,88,91,118 Интересно, что в ходе репликации вируса было показано, что ВИЧ-1 изменяет клеточный гомеостаз, изменяя несколько компонентов аппарата трансляции хозяина, что приводит к ингибированию кэп-зависимой трансляции. Например, ВИЧ-1 индуцирует эндогенное увеличение количества реактивных кислородных промежуточных соединений в клетках, что приводит к окислительному стрессу, который, как было продемонстрировано, способствует NF-каппа B-зависимой активации транскрипции ВИЧ и стимулирует активность 5’UTR IRES ВИЧ-1. 88 Кроме того, экспрессия вирусного белка R (Vpr), который играет роль в регуляции обратной транскрипции, ядерного транспорта, транскрипции, клеточного цикла и апоптоза, также может способствовать остановке клеточного цикла в G2 / M фаза. 134 В общем, во время фазы G2 / M клеточного цикла как eIF4E, так и 4E-BP гипофосфорилируются, что приводит к разрушению комплекса eIF4F, секвестрации eIF4E 4E-BP и подавлению cap -зависимое инициирование перевода. 135 Соответственно, во время остановки клеточного цикла G2 / M, индуцированной Vpr, функциональный eIF4E снижается, поскольку взаимодействие eIF4E-4EBP благоприятствует. 74 Напротив, индуцированная вирусом остановка клеточного цикла G2 / M стимулирует как транскрипцию ВИЧ-1, так и трансляцию мРНК Gag, 136 , что приводит к общему увеличению продукции вируса. 137 Это открытие сильно коррелирует с наблюдением, что экспрессия, управляемая IRES ВИЧ-1, практически не зависит от остановки G2 / M. 86

Фактор инициации eIF4G также является субстратом для нескольких различных клеточных и вирусных протеаз на поздних стадиях инфицирования ВИЧ-1.Действительно, активация апоптоза с помощью Vpr индуцирует активацию каспазы 3, которая, в свою очередь, опосредует протеолиз eIF4G. 138,139 Кроме того, вирусная протеаза ВИЧ-1, которая необходима для процессинга вирусных белков и также имеет несколько клеточных мишеней, 140-148 , также может расщеплять факторы инициации eIF4G, PABP и eIF3d. 140-142,148 Хотя влияние расщепления eIF3d на трансляцию не было определено, 148 протеолиз eIF4G и PABP приводит к репрессии кэп-зависимой трансляции в RRL, в бесклеточных экстрактах и ​​в культивируемых клетках. 141, 142, 149, 150 Однако в этих условиях, которые препятствуют кэп-зависимой инициации трансляции, синтез белка, управляемый EMCV- и PV-IRES, и 5’UTR ВИЧ-1 практически не затрагивается как в бесклеточных экстрактах, так и в клетках (см. ). 149,150 Эти эксперименты предполагают, что на поздних стадиях цикла репликации ВИЧ-1 нацелена кэп-зависимая инициация трансляции. Следовательно, в условиях, которые препятствуют инициации кэп-зависимой трансляции, присутствие функционального IRES будет способствовать трансляции вирусной мРНК по сравнению с трансляцией клеточных мРНК.

Кроме того, наличие модифицированной 5’cap-структуры на конце полноразмерной РНК ВИЧ-1 может также оправдать потребность в IRES. Действительно, белок, взаимодействующий с рецептором, активируемым пролифератором пероксисом, с доменом метилтрансферазы (PIMT) является белком, который, как известно, взаимодействует с комплексом Rev / RRE. PIMT гиперметилирует m 7 G RNA-cap с образованием пула триметилгуанозинового (TMG; m 2, 2,7 guanosine) -cap, содержащего вирусные мРНК. 151-153 TMG-кэпированные РНК, как известно, плохо транслируются, 154 из-за неэффективного распознавания триметила кэп-связывающим белком eIF4E. 155-158 Как следствие, можно было бы предсказать, что РНК TMG-HIV-1 будут неэффективно транслироваться, что приведет к снижению вирусной экспрессии. Однако это не так, и TMG-кэпирование вирусных мРНК ассоциируется с повышенной экспрессией структурных белков ВИЧ-1. 151 Хотя механизм, с помощью которого эти TMG-кэпированные вирусные мРНК рекрутируют трансляционный аппарат, не был изучен, есть соблазн предположить, что инициация трансляции с TMG-HIV-1 РНК может происходить с помощью независимого от кэпа IRES-опосредованного механизма. .

Инициирование трансляции мРНК ВИЧ-1

Abstract

Инициирование трансляции полноразмерной мРНК вируса иммунодефицита человека может происходить с помощью нескольких различных механизмов для поддержания продукции структурных белков вируса на протяжении всего цикла репликации. Синтез вирусного белка ВИЧ-1 может происходить как за счет использования кэп-зависимого, так и управляемого IRES механизма в зависимости от физиологических условий клетки и статуса продолжающейся инфекции. Для обоих этих механизмов существует потребность в нескольких вирусных и клеточных кофакторах для оптимальной трансляции вирусной мРНК.В этом обзоре мы опишем механизм, используемый полноразмерной мРНК для инициации трансляции, подчеркнув роль кофакторов в этом процессе. Особое внимание будет уделено роли геликазы РНК DDX3 в инициации трансляции мРНК ВИЧ-1.

Введение

Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) является прототипом лентивируса рода Retroviridae и этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Ретровирусы представляют собой уникальное семейство РНК-вирусов, которые используют кодируемую вирусами обратную транскриптазу (ОТ) для репликации через промежуточное соединение провирусной ДНК. 1 Провирус постоянно интегрирован в хромосому клетки-хозяина и, подобно клеточному гену, экспрессируется с помощью транскрипции клетки-хозяина, процессинга РНК и трансляции. После транскрипции ретровирусная пре-мРНК сплайсируется в вирусные мРНК, которые проявляют все характеристики клеточных мРНК, поскольку они несут 5′-шапочную структуру и 3′-поли (A) хвост. В случае ВИЧ-1 альтернативный сплайсинг дает более 30 различных видов мРНК, которые затем разными путями экспортируются в цитоплазму.МРНК ВИЧ-1 были сгруппированы в 3 класса в зависимости от степени их сплайсинга: (i) полноразмерные транскрипты, которые соответствуют мРНК, которые не подвергаются процессу сплайсинга, кодируют полипротеины Gag и Gag-Pol; (ii) однократно сплайсированные транскрипты, которые генерируют вирусные белки Env, Vif и Vpu; (iii) полностью сплайсированные транскрипты, которые экспрессируют Rev, Tat, Vpr и Nef. Как и для всех известных на сегодняшний день вирусов, синтез белка ВИЧ-1 зависит исключительно от аппарата трансляции в клетке-хозяине рибосом, тРНК, аминокислот и всех необходимых факторов инициации, удлинения и терминации.В этом обзоре мы представляем обзор того, что было задокументировано в отношении механизма инициации трансляции полноразмерной мРНК ВИЧ-1.

Полноразмерная или геномная РНК ВИЧ-1 (гРНК)

При входе ВИЧ-1, обратной транскрипции гРНК и интеграции вирусной ДНК интегрированная провирусная геномная ДНК транскрибируется РНК-полимеразой II (Pol II) хозяина с образованием первичный продукт транскрипции, который взаимодействует с аппаратом процессинга клеточной РНК, который должен быть сплайсирован, экспортирован в цитоплазму и транслирован аппаратом синтеза белка хозяина. 2 Однако часть пре-мРНК нарушает типичный процессинг РНК, сохраняя их интроны. Чтобы экспортировать свои несплайсированные и частично сплайсированные мРНК, ВИЧ-1 использует специфический механизм, включающий клеточный путь экспорта CRM1 и вирусный белок Rev (регулятор экспрессии вириона). 3,4 Белок Rev ВИЧ-1, ядерно-цитоплазматический челночный белок, связывающий РНК, взаимодействует с высокоструктурированным элементом РНК, расположенным в гене env, известным как элемент ответа Rev (RRE).Затем комплекс Rev-RRE экспортируется в цитоплазму. 5-7

Несплицированная или полноразмерная РНК ВИЧ-1 выполняет двойную роль в качестве мРНК (мРНК ВИЧ-1), где она кодирует полипротеины Gag и Gag / Pol и как геномную РНК (гРНК) для быть инкапсулировано во вновь синтезированные частицы. 2 мРНК ВИЧ-1 содержит высокоструктурированную 5′-нетранслируемую область (5’UTR) или лидер 8 с отчетливыми и хорошо охарактеризованными мотивами РНК, которые участвуют во многих этапах цикла репликации вируса (см.). 8 Первым структурным элементом является петля длиной около 60 нуклеотидов, называемая элементом ответа трансактивации (TAR), которая распознается вирусным белком Tat и необходима для транскрипции вирусной РНК (вРНК). 9 TAR сопровождается петлей ствола полиаденилирования (поли (A)), которая содержит сигнал полиаденилирования, который игнорируется, когда находится внутри 5′-лидера, но используется для обработки 3′-конца, когда он читается в 3′-нетранслируемой области ( 3′UTR). 10 За петлей поли (A) ствола идет сайт связывания праймера (PBS), который важен для рекрутирования тРНК (Lys3), которая служит праймером для инициации процесса обратной транскрипции гРНК. 11 Ниже PBS находятся сайт инициации димеризации (DIS), донор сплайсинга (SD) и сигналы упаковки (). Все шпильки используются либо во время процессинга РНК (SD), либо во время димеризации и инкапсидации вирусной гРНК (DIS и). 12,13 Эти сигналы РНК различаются по структуре РНК у разных лентивирусов, но их присутствие и функция у них законсервированы. 8,14,15 Например, TAR ВИЧ-2 намного длиннее и свернут в мотив вилки, тогда как в ВИЧ-1 это петля ствола. 16-18

Схематическое изображение геномной РНК (гРНК) ВИЧ-1. Полноразмерная мРНК ВИЧ-1 кэпирована на 5′-конце остатком 7-метилгуаниловой кислоты (m 7 G) или триметилгуанозином (TMG) и структурирована в виде четко определенных мотивов РНК: шпилька TAR, поли ( A ) Сигнал, первичный сайт связывания (PBS), сайт инициации димеризации (DIS), главный сайт донора сплайсинга (SD) и сигнал упаковки РНК (ψ). МРНК кодирует 2 белка: p55 и p40, которые могут быть синтезированы либо входом рибосомы из 5’cap, либо из IRES, расположенных как в 5’UTR, так и в кодирующей области (как показано на рисунке).Вход в рибосомы на 5′-конце происходит путем рекрутирования тримерного комплекса, состоящего из DDX3, PABP и eIF4G, тогда как внутренний вход происходит путем прямого связывания преинициативного комплекса 43S с элементами IRES. Обратите внимание, что 5′-колпачок также может быть связан комплексом CBC.

Инициирование трансляции

Инициирование трансляции большинства мРНК эукариот происходит с помощью механизма сканирования, посредством которого 40S рибосомная субъединица рекрутируется вблизи кэп-структуры, остатка 7-метилгуаниловой кислоты, расположенного на 5′-конце всех мРНК эукариот. и сканирует в направлении от 5 ‘до 3’ до тех пор, пока не встретится инициирующий кодон. 19,20 Рибосомная субъединица 40S рекрутируется в мРНК как часть инициирующего комплекса 43S, состоящего из субъединицы, связанной с eIF2-GTP / Met-tRNAi (инициаторная тРНК), eIF1A, eIF1 и eIF3. eIF4F, многосубъединичный комплекс, состоящий из eIF4E, eIF4A и eIF4G, важен в этом процессе рекрутирования. 19,20 eIF4E напрямую связывается со структурой 5’cap, в то время как eIF4A, член семейства DEA (D / H) -box РНК-геликазы, участвует, раскручивая вторичную структуру в 5′-нетранслируемой области (5’UTR ) мРНК.Активность геликазы eIF4A стимулируется eIF4G и eIF4B. 21 В этом процессе eIF4G служит каркасом для скоординированной сборки комплекса инициации трансляции, поскольку он содержит сайты связывания для eIF4A, eIF4E и eIF3. Следовательно, eIF4G связывает кэп мРНК (через eIF4E) и рибосомную субъединицу 40S (через eIF3) для присоединения матричной мРНК к аппарату трансляции. eIF4G также связывает поли (A) -связывающий белок (PABP), и это способствует циркуляризации мРНК путем связывания 5’cap (через eIF4E-eIF4G) и 3’poly (A) хвоста (через PABP-eIF4G) мРНК, которая физическая форма, благоприятная для перевода. 19,20

Альтернативный кэп-независимый механизм инициации трансляции был подтвержден при изучении трансляции не кэпированных мРНК пикорнавирусов. 22 Пикорнавирусные мРНК содержат структурный элемент РНК, называемый внутренним сайтом входа в рибосому (IRES), чтобы способствовать рекрутированию инициирующего комплекса 43S кэп-независимым образом. 23,24 Кроме того, некоторые пикорнавирусы кодируют вирусные протеазы, которые непосредственно нацелены на eIF4G и PABP во время инфекции, в то время как другие изменяют доступность eIF4E. 25-28 Оба события приводят к нарушению инициации клеточной кэп-зависимой трансляции во время вирусной инфекции, чтобы перенаправить аппарат трансляции хозяина на вирусные мРНК. 29 Более поздние исследования показали, что этот альтернативный механизм инициации трансляции не ограничивается пикорнавирусами, поскольку мРНК из других вирусных семейств, включая некоторых представителей Retroviridae, также используют IRES-зависимую инициацию трансляции. 30,31 В отличие от мРНК пикорнавирусов, ретровирусные мРНК обладают 5′-кэп-структурой и могут инициировать трансляцию либо по каноническому кэп-зависимому механизму, либо через IRES. 32,33

РНК-структуры

модулируют белковый синтез полноразмерной мРНК ВИЧ-1

5’UTR ВИЧ-1 содержит несколько хорошо охарактеризованных структурных элементов РНК, критических для различных стадий цикла репликации ВИЧ-1, такие как TAR, петля Poly (A), домен PBS, SD, DIS и (см.). Благодаря своей стабильности эти структуры РНК также могут модулировать инициацию трансляции вирусной мРНК. Таким образом, домен TAR представляет собой высокостабильную структуру петля-стержень длиной 57 нуклеотидов (ΔG = -29.6 ккал / моль), расположенный на самом 5′-конце всех транскриптов ВИЧ-1. 30 Фактически, структура петли стебля TAR закрывает кэп-фрагмент, что ставит под вопрос ее доступность для eIF4E во время сборки комплекса инициации трансляции над вирусной мРНК. 34,35 Как было ранее продемонстрировано, наличия стебель-петли с более слабой стабильностью (ΔG = -13,6 ккал / моль) на 5′-конце синтетической мРНК достаточно для ингибирования рекрутирования рибосом на 5′-конце. , 36 не стало неожиданностью, что присутствие только TAR или в контексте 5′-UTR ВИЧ-1 ингибирует кэп-зависимую трансляцию в RRL и в ооцитах Xenopus. 34,35,37,38 Добавление транс-доминантно-отрицательного мутанта eIF4A R362Q 39 в RRL, сильно подавленную экспрессию 5′-UTR ВИЧ-1, что указывает на то, что для преодоления РНК необходимы как eIF4G, так и eIF4A структуры, присутствующие в 5′-UTR ВИЧ-1. 40 Однако подавление трансляции, вызванное TAR, было менее выражено в клетках, и это было подтверждено восстановлением подавления трансляции в RRL после добавления экстрактов цитоплазматических клеток HeLa. 34,41 Это наблюдение согласуется с тем фактом, что известно несколько клеточных белков, которые связывают структуру TAR ВИЧ-1, способствуя активации трансляции мРНК ВИЧ-1. 42

Исследования показали, что 5’UTR ВИЧ-1 может принимать 2 пространственные конформации, которые представляют собой разветвленные множественные шпильки (BMH) и структуры дальнего взаимодействия (LDI). 43 Было показано, что BMH экспонирует сигналы димеризации и упаковки, чтобы способствовать инкапсидации и вирусной репликации. 44-46 Рибопереключение между LDI и BMH зависит от вирусной инфекции, поскольку оно усиливается как концентрацией геномной РНК, так и присутствием вирусного белка NC. 43,47 Однако эксперименты показали, что, несмотря на тот факт, что структура BMH перекрывает кодон стартового сайта AUG, 48 структура сама по себе не изменяет скорость трансляции, управляемую 5’UTR ВИЧ-1. 41,44 Кроме того, введение мутаций, предназначенных для изменения равновесия LDI-BMH, не оказывает значительного влияния на способность 5’UTR ВИЧ-1 управлять инициацией трансляции как в контексте моно-, так и бицистронной мРНК. . 41,44

Интересно, что экспрессия вирусного белка Gag подавляет его собственный синтез, одновременно стабилизируя конформацию структуры BMH. 49 Поскольку структура BMH сама по себе не препятствует трансляции вирусной мРНК 41,44 , это может быть присутствие белка Gag на вирусной мРНК, которое влияет на прикрепление рибосом или сканирование вдоль 5’UTR. Белок Gag оказывает бимодальный эффект на собственное производство с усилением экспрессии при низкой концентрации и ингибированием при высокой концентрации. 49 Другая возможность состоит в том, что репрессия трансляции мРНК ВИЧ-1 индуцируется Gag-опосредованной димеризацией гРНК ВИЧ-1. Дуплекс, образованный геномной РНК и белком Gag через домен NC, вероятно, создает сильное препятствие для сканирования или рекрутирования комплекса инициации трансляции. Следовательно, при высокой концентрации белок Gag будет непосредственно отвечать за ингибирование трансляции вирусной мРНК, способствуя ее упаковке в синтезированные de novo вирусные частицы 49 Эта возможность согласуется с результатами, показывающими, что димеризация вирусной РНК ингибирует трансляцию вирусной мРНК, одновременно способствуя инкапсидация гРНК. 47,50 Интересно, что димеризации РНК может способствовать дальнодействие РНК-РНК, устанавливаемое между нуклеотидами, присутствующими в кодирующей области Gag, и последовательностью 5’UTR. 47

Кэп-зависимая инициация геномной РНК ВИЧ-1

Сканирование рибосом из 5’cap

Эксперименты по трансляции in vitro, проведенные на лизате ретикулоцитов кролика (RRL), показали, что добавление как кэп-аналога, так и расщепление eIF4G протеазой L ящура ингибирует трансляцию кэпированного моноцистронного репортерного гена ВИЧ-1, что свидетельствует о том, что 5′-рибосомное сканирование имеет место на 5’UTR ВИЧ-1. 33 За этим последовали данные лаборатории Berkhout, показывающие, что экспрессия протеазы 2A от полиовируса нарушает инициацию трансляции геномной РНК ВИЧ-1 ex vivo. Более того, вставка вышележащих кодонов AUG (uAUG) в разные места в 5’UTR ВИЧ-1 сильно ингибировала трансляцию, подтверждая использование 5′-зависимого механизма сканирования рибосом. 51 Инициирование с кэпированного конца также дало объяснение тому факту, что укладка и длина структуры TAR (которая различается для ВИЧ типа 1 и типа 2) имеют такое большое влияние на общую эффективность трансляции. 34 Эта гипотеза о сканировании рибосом также хорошо согласуется с тем фактом, что большинство природных изолятов ВИЧ-1 не переносят uAUG в пределах их 5’UTR, несмотря на его большую длину. 8 Однако механизм, с помощью которого преинициативный комплекс 43S может иметь дело с этими стабильными структурами РНК, которые, как известно, нарушают как начальное связывание рибосом, так и сканирование, остается неясным. 52,53 В большинстве случаев присутствие eIF4A и eIF4B / eIF4H в преинициационном комплексе 43S может разрешить эти структуры АТФ-зависимым образом. 54 Однако, как указано выше, структура TAR, расположенная непосредственно ниже кэп-структуры, и сложная структура всей 5′-UTR ВИЧ-1, по-видимому, слишком стабильны, чтобы просто разворачиваться комплексами eIF4A / eIF4B / eIF4H. Следовательно, остается вопрос, как преинициативный комплекс 43S может связываться и сканировать этот структурированный 5’UTR ВИЧ-1.

Необходимость дополнительных геликаз в трансляции ВИЧ-1

Намек на вышеупомянутый вопрос был получен в недавних исследованиях, показывающих, что сложные структуры РНК можно раскручивать путем рекрутирования клеточных РНК-геликаз в комплекс 43S, чтобы помочь сканированию рибосом. 55 Эти геликазы принадлежат к растущему семейству белков DExD / H-бокса (DEAD, DEAH, DexH и DExD), которые характеризуются присутствием высококонсервативного корового домена геликазы, участвующего в связывании АТФ, гидролизе АТФ и связывании нуклеиновых кислот. 56,57 Эти ферменты участвуют практически во всех аспектах метаболизма РНК путем ремоделирования рибонуклеопротеинов (РНП) или комплексов РНК-РНК. Таким образом, некоторые из них были специально вовлечены в процесс инициации трансляции.Так обстоит дело с Ded1, RHA (DHX9) и DEAH-бокс-белком DHX29 у млекопитающих, которые взаимодействуют с eIF4A / eIF4B / eIF4H для повышения процессивности рибосомного сканирования структурированных транскриптов. 55,58-60 В этом процессе эти ферменты доставляются к 5′-концу мРНК либо путем связывания со специфическим посттранскрипционным элементом (PCE) в случае RHA, как часть комплекса eIF4F для Ded1. или вместе с рибосомной субъединицей 40S для DHX29. 60-62 В случае ВИЧ-1 Борис-Лори и его коллеги рассмотрели роль DHX9 / RHA в вирусной трансляции, и они показали, что последний необходим для стимулирования ремоделирования РНП через 5’UTR для обеспечения прогрессирования рибосом. . 61 Это происходит за счет начального связывания RHA с элементом PCE, обнаруженным в 5’UTR ВИЧ-1, и, по-видимому, требует АТФ-зависимой активности. 61 Дрожжевой ортолог Ded1, который у млекопитающих называется DDX3, также участвует в трансляции ВИЧ-1. DDX3 является членом семейства РНК-геликаз DEAD-box и участвует во многих биологических процессах, таких как развитие клеточного цикла, апоптоз, рак, врожденный иммунный ответ и в репликации многих вирусов, которые инфицируют людей 31 , таких как основные возбудители вирусов гепатита С и В вместе с ВИЧ-1. 31,63

В геноме человека есть 2 родственных DDX3 гена DDX3X и DDX3Y. DDX3X или DBX (в дальнейшем называемые DDX3) изначально были картированы в сцепленных с X-хромосомами генах с функциональными гомологами в Y-хромосоме и были обнаружены в области Xp11.3-11.23. 64,65 DDX3Y или DBY специфически экспрессируются в семенниках, где они играют важную роль в сперматогенезе; 66 однако, из-за этой специализированной роли, он не будет более подробно обсуждаться в этом обзоре. Первоначально было показано, что DDX3 важен для репликации ВИЧ-1, действуя как кофактор Rev и CRM1 во время ядерного экспорта RRE-содержащих векторов. 67 DDX3 позже было обнаружено, что он ассоциирован с некоторыми ключевыми членами механизма инициации трансляции и участвует в трансляции подмножества клеточных и вирусных мРНК, несущих структурированные 5′-UTR. 59,68,69 Однако, в отличие от своего дрожжевого ортолога, DDX3 необязателен для общей трансляции и не может рассматриваться как функциональный фактор инициации трансляции. 59,70 В недавнем отчете Лю и его коллеги исследовали роль DDX3 в трансляции ВИЧ-1 в контексте полноразмерного провируса и репортерных генов, происходящих от ВИЧ-1. Они выполнили сверхэкспрессию и нокдаун эндогенного белка на основе siRNA, чтобы обнаружить, что ВИЧ-1 требуется присутствие геликазы для трансляции. 71 Кроме того, используя бицистронные конструкции, содержащие IRES ВИЧ-1 в межцистронном спейсере, они предположили, что DDX3 может действовать как ITAF, способствуя трансляции, управляемой IRES. Однако не было предоставлено никаких механистических представлений для объяснения потребности в ферменте, и они скорее предполагали роль в содействии сканированию рибосом на 5′-лидере вируса.

В другом исследовании Soto-Rifo et al. нокдаун DDX3 в клетках HeLa, экспрессирующих полноразмерный провирусный клон ВИЧ-1, кодирующий репортерный ген renilla, обнаружив, что, хотя на общую трансляцию не влияет истощение DDX3, синтез Gag ВИЧ-1 из вРНК резко нарушается. 72 В том же исследовании несколько мутантов DDX3 были использованы для документирования необходимости мотивов связывания АТФ и гидролиза для функции DDX3 в инициации трансляции.Путем вставки неструктурированных спейсеров РНК между кэпом и началом структуры TAR было показано, что смещение TAR всего на 15 нуклеотидов от m 7 GTP было достаточным для отмены потребности в DDX3 в синтезе белка. Вместе эти наблюдения показывают, что DDX3 необходим для начальной стадии связывания рибосом, а не для процесса сканирования. Это было дополнительно продемонстрировано с помощью биохимического анализа, в котором было показано, что DDX3 связывается как с дуплексом РНК TAR, так и с 2 дополнительными сайтами на 5’UTR ВИЧ-1, которые соответствуют участкам одноцепочечной РНК, что дает биологические доказательства предлагаемого механизма локального разделение прядей, предложенное Янковским и его коллегами. 73 DDX3, как было продемонстрировано, локально раскручивает основание мотива TAR, чтобы сделать m 7 GTP доступным для связывания с рибосомами. В этой модели DDX3 заменяет eIF4E, чтобы зародить вступление преинициативного комплекса 43S. Интересно, что недавняя работа лаборатории Boris-Lawrie показала, что трансляция геномной РНК ВИЧ-1 может происходить независимо от eIF4E путем рекрутирования CBP 80 на 5′-конце транскрипта. 74 Таким образом, остается вопрос, происходит ли образование комплекса 43S за одну стадию, т.е.g., DDX3 связывает и образует ядро ​​сборки полного комплекса, состоящего из eIF4F, eIF4B, eIF3, eIF1 / 1a, eIF2 и рибосомы 40S, или сборка такого комплекса происходит последовательно? Точно так же другим важным вопросом, на который необходимо ответить, будет определение состава преинициативного комплекса 43S, опосредованного DDX3: содержит ли он весь набор eIF или некоторые из них отсутствуют? Кроме того, следует учитывать, что TAR является предпочтительным сайтом связывания для Tat. 75 Таким образом, прямое взаимодействие между DDX3 и Tat недавно было показано как in vitro, так и in vivo. 76,77 Поразительно, но взаимодействие Tat / DDX3 приводит как к усилению вирусной транскрипции, так и к трансляции. 76,77 В последнем случае, который больше соответствует теме этого обзора, было обнаружено, что комплекс Tat / DDX3 ассоциирован как с комплексами инициации трансляции, так и с полисомами. Нокдаун DDX3 приводит к высвобождению Tat из полисомальной фракции, что подчеркивает его роль в этом взаимодействии. 76

Эти данные согласуются с данными, показывающими, что взаимодействие клеточных РНК-связывающих белков с вирусной РНК влияет на структуру-функцию РНК. 41 РНК-связывающий белок аутоантиген волчанки La 78 был первым идентифицированным клеточным белком, который, как было показано, связывается с 5′-лидером ВИЧ-1 и снимает индуцированную TAR репрессию трансляции в системе in vitro. 38 Для такого эффекта требовался домен димеризации La 79 , а позже Hühn et al. (1997) сообщили, что La проявляет активность фермента, раскручивающего дцРНК, которая потенциально может быть использована для дестабилизации структуры TAR; 80 , тем не менее, влияние La на экспрессию ВИЧ-1 в культуре клеток или его роль в репликации ВИЧ-1 в дальнейшем не исследовалось.Staufen 1 и TAR-РНК-связывающий белок (TRBP) являются другими примерами клеточных белков, которые способны ослаблять репрессию трансляции, индуцированную TAR, путем прямого взаимодействия со структурой TAR РНК. 37,81

eIF4E Независимая трансляция полноразмерной мРНК ВИЧ-1

Во время синтеза и обработки мРНК образуются несколько различных, но динамичных комплексов мРНК-рибонуклеопротеин (мРНП). Один из первых белковых комплексов, котирующийся при совместной транскрипции через структуру 5’cap, известен как ядерный кэп-связывающий комплекс (CBC). 82 CBC состоит из белка субъединицы связывания кэпа 20 (CBP 20), который связывает кэп, и связывающего кэп белка 80 (CBP 80), который стабилизирует это взаимодействие. CBC играет важную роль в различных аспектах метаболизма ядерной мРНК, таких как сплайсинг пре-мРНК и ядерный экспорт, и остается связанным с мРНК во время удаления интрона, отложения комплекса экзонных соединений (EJC) и ядерного экспорта. В цитоплазме CBC играет аналогичную роль eIF4E, поскольку оба могут напрямую взаимодействовать с eIF4G, чтобы служить платформой для загрузки преинициативного комплекса 43S на мРНК, 83,84 , чтобы пройти то, что называется пионерским раундом перевод. 84 Это индуцирует обширные перестройки мРНП, связанных с CBC, с удалением EJC и связанных с EJC факторов трансляционными рибосомами и обменом ядерного поли (A) -связывающего белка N1 (PABPN1) на цитоплазматический PABPC1 на поли (Хвост. 84 CBP80 также способствует замене CBC на eIF4E в мРНК, ассоциированной с полисомами, с помощью механизма, который включает диссоциацию CBC от мРНК, вызванную кариоферином импортином-β. 83,84 Диссоциация CBC делает возможным связывание eIF4E с 5’cap и начало синтеза белка. Один eIF4E имеет более низкое сродство к кэпу, чем CBC, но сборка eIF4F увеличивает сродство eIF4E к кэпу. 85 Недавний отчет предполагает, что в случае ВИЧ-1 сплайсированные вирусные мРНК подвергаются обмену CBC на eIF4E, в то время как несплайсированные мРНК ВИЧ-1 остаются связанными с CBC в цитоплазме 74 во время трансляции мРНК и инкапсидации вирусной гРНК. 74 Эти наблюдения побудили авторов предложить модель, с помощью которой инициация трансляции полноразмерной мРНК HIV-1 д. Происходить с помощью неканонического cap-зависимого механизма инициации трансляции, зависящего от CBC вместо elF4E. 74 Однако альтернативная интерпретация этих открытий состоит в том, что CBC остается ассоциированным с вирусной мРНК, но рекрутирование 40S рибосомной субъединицы происходит 5′-концевым независимым образом, как подчеркнуто ниже. Эта возможность, которая не была учтена авторами, также соответствует всем выводам, которые они описывают. 74

Кеп-независимая инициация трансляции с мРНК ВИЧ-1

Характеристика последовательностей IRES

На полноразмерной мРНК ВИЧ-1 были идентифицированы два IRES, один в пределах ее 5’UTR, а другой — в кодирующая область Gag. 86,87 IRES в 5’UTR был подтвержден в лабораторно адаптированном инфекционном рекомбинантном провирусном клоне ВИЧ-1 NL4.3, CXCR4 (X4) -тропном первичном изоляте HIV-LAI и в 5’UTR вирусного РНК выделена из клинических образцов.

86,88-90 Кроме того, было показано, что трансляция ВИЧ-1 в бицистронном контексте устойчива к пикорнавирусным протеазам, которые специфически ингибируют кэп-зависимую инициацию трансляции. 86,89,91 Совсем недавно Monette et al. использовали эксперименты по трансфекции-инфекции ДНК, кодирующей бицистронную РНК, содержащую 5’UTR ВИЧ-1, доказывая, что ее активность не нарушается инфекцией полиовируса в 293 Т-клетках.

Структурный анализ лидера ВИЧ-1 показал, что короткий дуплекс РНК с предсказанной свободной энергией (ΔG) -10,4 образуется в лидерной области дикого типа путем спаривания оснований последовательностей, фланкирующих сайт связывания праймера (PBS). В Brasey et al. (2003), этот дуплекс из 7 пар оснований был усилен в контексте pNL4. 3 инфекционный клон для создания плазмиды, кодирующей вирусную РНК с повышенной стабильностью в домене PBS. ΔG, предсказанный для этих новых структур РНК, находился в диапазоне от -23,5 ккал / моль (дикий тип) до -38,4 ккал / моль. Последнее значение значительно превышало стабильность 5’UTR ВИЧ-1 дикого типа, включая стабильность структуры шпильки расширенной трансактивационной (TAR) области (-29,6 ккал / моль), которая, как известно, сильно ингибирует инициацию трансляции. После трансфекции клеток C33A не наблюдалось никакого эффекта на экспрессию белков Pr55Gag и CA-p24, что свидетельствует о наличии IRES.Кроме того, трансляционная активность 5’UTR IRES ВИЧ-1 оказалась устойчивой к введению мутаций, предназначенных для изменения специфических структурных элементов РНК в функциональной области, 41,89,90 , предполагая, что взаимосвязь структура-функция для ВИЧ -1 IRES не такой жесткий, как описанный для других вирусных IRES. 92-98 Биологическое значение этих результатов еще предстоит выяснить. Более того, изучая IRES 5′UTR ВИЧ-1, Gendron et al. определили область выше PBS, которую они назвали IRENE, для отрицательного элемента IRES, который отрицательно влияет на активность лидера IRES ВИЧ-1. 88 Молекулярные механизмы, с помощью которых этот цис-действующий элемент РНК может ингибировать управляемую IRES трансляцию, неизвестны и не изучались в дальнейшем. Помимо IRENE, другие цис-действующие репрессивные последовательности или ингибирующие последовательности (CRS / INS) 99-104 , как сообщается, разбросаны по участкам Gag, Pol и Env мРНК ВИЧ-1 99-104 , также способны ограничивать экспрессия структурных белков ВИЧ-1 по еще не определенному механизму. Хотя для этих элементов CRS / INS не была определена консенсусная последовательность, было показано, что они содержат элементы, богатые AU (ARE). 101,102 Один такой ингибирующий элемент, известный как INS-1, обнаружен в кодирующей области Gag матрицы (p17) и, как сообщается, действует как ингибитор как cap-зависимой, так и опосредованной IRES инициации трансляции мРНК ВИЧ-1. 99,102 Ингибирование трансляции не ограничивалось контекстом мРНК ВИЧ-1, поскольку вставка INS-1 в гетерологичную невирусную мРНК также могла ингибировать ее экспрессию. 99,102,105 Хотя молекулярный механизм, с помощью которого INS-1 ограничивает инициацию трансляции мРНК ВИЧ-1, остается неопределенным, несколько сообщений предполагают участие белков хозяина. 106-109

В том же духе Brasey et al. показали, что ORF Gag ингибирует экспрессию белка, опосредованного 5’UTR ВИЧ-1, в контексте линии клеток HeLa. 86 Такие результаты были очень загадочными в то время, учитывая, что 5’UTR ВИЧ-1 управляет экспрессией белка Gag. Следовательно, как может 5’UTR IRES ВИЧ-1 управлять эффективной экспрессией Gag, в то время как ORF Gag ингибирует функцию IRES? Этот вопрос недавно был решен Plank et al. которые показали, что ингибирующий эффект Gag ORF не наблюдался в контексте лимфоцитарной клеточной линии. 90 Эти наблюдения предполагают, что репрессия трансляции ограничена определенными типами клеток, но не естественными хозяевами инфекции ВИЧ-1. Вместе эти наблюдения предполагают, что тропизм ВИЧ-1 частично регулируется еще плохо изученным молекулярным механизмом, включающим трансляционный контроль экспрессии вирусных генов. Аналогичный сценарий был установлен для других вирусов, несущих IRES. Трансляционный контроль вирусного тропизма был охарактеризован для ВГС, а также для некоторых членов семейства вирусов пикорнавиридов. 110-114

В дополнение к IRES, присутствующим в 5’UTR ВИЧ-1, Бак и его коллеги также идентифицировали IRES в ORF Gag. 87 Этот второй IRES управляет экспрессией как Gag-белка, так и его более короткой N-усеченной изоформы (p40), в которой отсутствует весь матричный домен (см.). Хотя функция Gag p40 неизвестна, он продуцируется во время инфекции, и его делеция нарушает кинетику роста ВИЧ-1 в культуре. 87 Присутствие более коротких N-усеченных изоформ, которые возникают в результате альтернативной инициации в кодонах, расположенных в кодирующей области Gag, консервативно в ВИЧ-2 и обезьяньем гомологе (SIV). 115,116 Исследование механизма трансляции, используемого для продукции p40, выявило исключительное использование IRES, локализованной в ORF Gag, чья активность полностью независима от кэп-структуры и eIF4E и устойчива к обработке протеазой L ящура. 33 Однако наиболее характерные характеристики этого IRES заключаются в его способности стимулировать экспрессию в вышестоящем AUG, расположенном на его 5′-границе. 87,117 Это обеспечивает эффективный синтез белка из синтетических безлидерных мРНК, в которых кодон AUG расположен непосредственно на 5′-конце РНК.Удивительно, но трансляция, опосредованная этой синтетической мРНК, является высокоэффективной 117 (de Breyne et al., Неопубликовано) и происходит в аутентичном кодоне AUG без связанного сканирования утечки, что указывает на то, что рекрутирование рибосом в кодирующую область Gag IRES опосредуется нетрадиционным механизм. Эта характеристика сохраняется в ВИЧ-2 и в SIV. 115,117

Все эти особенности контрастируют с другими IRES, описанными на сегодняшний день, и позволяют предположить, что кодирующая область Gag содержит 2 сайта связывания для прикрепления рибосом, которые предназначены для каждого сайта инициации.

Активность IRES 5′-лидера ВИЧ-1 регулируется транс-действующими факторами IRES (ITAF)

IRES 5’UTR ВИЧ-1 продемонстрировал активность в различных биологических системах, таких как экстракты трансляции на основе HeLa, 86 в такие клетки, как HeLa, U20S, HEK293-T, Jurkat T-клетки, 71,86,88,90,118,119 и в ооцитах Xenopus laevis (см.). 41,120 Тем не менее, IRES ВИЧ-1 весьма неэффективен в продвижении трансляции в RRL. 121 Однако эта низкая активность может быть устранена добавлением экстрактов клеток HeLa, полученных из G2 / M-арестованных клеток, к лизату 41 , что указывает на потребность в клеточных белках и / или транс-действующих факторах IRES (ITAF). 41 Хотя точный механизм, с помощью которого ITAFs облегчает рекрутирование рибосомных субъединиц, остается неизвестным, они, по-видимому, способствуют связыванию eIFs и рибосом, или могут действовать, помогая РНК создавать структуру, способную рекрутировать инициирующий комплекс. 94,122-125 Используя эксперименты с выпадающим списком Vallejos et al. 41 идентифицировал серию белков, обнаруженных в экстрактах G2 / M HeLa, которые взаимодействуют с вирусным 5’UTR. Однако эти результаты являются предварительными, поскольку их роль в инициации трансляции не оценивалась в функциональном анализе. 41 Воздействие некоторых хорошо известных ITAF было исследовано на инициацию трансляции 5’UTR IRES ВИЧ-1. 71,118,120 Таким образом, Liu et al. показали, что eIF5A, человеческий Rev-взаимодействующий белок (hRIP) и DDX3 все способны стимулировать трансляционную активность 5’UTR IRES ВИЧ-1, когда они находятся в бицистронном контексте в клетках HEK293T. Интересно, что в том же отчете был отвергнут Sam68, член семейства белков трансдукции сигнала и активации РНК (STAR), как возможный ITAF для 5’UTR IRES ВИЧ-1. 71 Используя аналогичную стратегию, Monette et al. идентифицировали hnRNP A1 как клеточный фактор, который усиливает функцию 5’UTR IRES ВИЧ-1. 118 Они также представили доказательства того, что мРНК ВИЧ-1 загружена hnRNP A1 в ядре клетки и что белок перемещается в цитоплазму, связанную с вирусной мРНК, где он может выполнять свою функцию на уровне IRES-опосредованной инициации трансляции. 118 Что касается возникающих клеточных мРНК, ожидается, что мРНК ВИЧ-1 сначала столкнется с РНК-связывающими белками в ядре. 82 Фактически, полноразмерная вирусная мРНК достигает цитоплазмы как часть особого комплекса рибонуклеопротеидов (РНП) с ядерными РНК-связывающими факторами. 10,126 Таким образом, вполне вероятно, что и вирусные, и клеточные белки, такие как Rev и hRNP A1, изначально загружаются на вирусную мРНК в ядре, прежде чем они будут использоваться для экспрессии цитоплазматической РНК. 118,127 В соответствии с этой возможностью, недавнее сообщение подтверждает котранскрипционное образование стабильного экспортного комплекса, который включает как Rev, так и CRM1. 128 Примечательно, что Rev и ассоциированные белки не только определяют экспорт полноразмерной мРНК, но также играют роль в ее трансляции. Фактически Rev способствует полисомной ассоциации полноразмерной мРНК и стимулирует ее трансляцию. 127,129 Кроме того, Rev также необходим для связывания PABP с Rev-зависимыми вирусными мРНК и снимает ингибирование трансляции, налагаемое Gag ORF. 100,101,130 IRES-опосредованная инициация трансляции ВИЧ-1 также может быть изменена цитоплазматическими модификациями конкретных ITAF.Например, киназы, взаимодействующие с митоген-активированным протеином (MAP) киназой (Mnks), запускают фосфорилирование hRNP A1, и это событие, по-видимому, необходимо для активности IRES ВИЧ-1, поскольку ингибирование фосфорилирования Mnk приводит к снижению ВИЧ-инфекции. 1 IRES-опосредованная экспрессия белка. 118 В соответствии с этим наблюдением, инфекция ВИЧ-1 вызывает умеренное повышение статуса фосфорилирования hnRNP A1, и это может способствовать его способности влиять на инициацию IRES-опосредованной трансляции ВИЧ-1.

Различные уровни требований к факторам инициации для 5’UTR ВИЧ-1. МРНК ВИЧ-1 может использовать как кэп-зависимый механизм в моноцистронном контексте ( A, ), так и механизм, управляемый IRES ( B ). Добавление кэп-зависимых ингибиторов (протеазы P2A и FMDV L, аналог кэп) приводит к частичному подавлению экспрессии генов в моноцитронном контексте, но не в бицистронном контексте. Было показано, что добавление экстракта клеток HeLa в значительной степени стимулирует инициацию IRES ВИЧ-1.

Напротив, активность 5’UTR IRES ВИЧ-1 может также подавляться клеточными белками. Например, HuR, белок перемещения ядра-цитоплазмы, который принадлежит к консервативному семейству РНК-связывающих факторов, которые первоначально были идентифицированы у Drosophila как белки эмбрионального летального аномального зрения (ELAV), был идентифицирован как негативный модулятор активности IRES ВИЧ-1. . 120 Трансляционное ингибирование активности IRES ВИЧ-1 с помощью HuR не связано с прямым взаимодействием белок-РНК, поскольку связывание HuR с 5’UTR ВИЧ-1 установить не удалось; 120 поэтому действующий молекулярный механизм еще предстоит определить.

Почему мРНК ВИЧ-1 требует IRES?

Поскольку мРНК ВИЧ-1 несут 5’cap, можно утверждать, что IRES-зависимая инициация, по-видимому, не нужна во время трансляции вирусной мРНК. Однако несколько линий доказательств предполагают, что кэп-зависимая инициация трансляции нарушается во время репликации ВИЧ-1.

Исследования клеточных мРНК, несущих двойной режим инициации, такой как демонстрируемый мРНК ВИЧ-1, показывают, что в нормальных физиологических условиях кэп-зависимая трансляция будет преобладающим механизмом, используемым для трансляции.Однако при различных клеточных стрессах и стрессах окружающей среды глобальный синтез белка снижается, а экспрессия различных стресс-зависимых факторов, управляемых IRES, предпочтительно регулируется. 122-124,131 Таким образом, клеточные мРНК могут переключаться с кэп-зависимой на кэп-независимую трансляцию в качестве адаптивного ответа стрессоустойчивости 122-124,131 ; это также может иметь место при инициации трансляции с мРНК ВИЧ-1.

Как и все вирусы, ВИЧ-1 является облигатным внутриклеточным паразитом и должен использовать клеточный аппарат для производства вирусного белка.Как следствие, на ранней стадии инфицирования вирусные мРНК должны конкурировать со всеми активно транслируемыми клеточными мРНК за использование рибосом и, прежде всего, за ограниченный пул факторов инициации трансляции эукариот (eIFs), необходимых для инициации трансляции. Успех в этой конкуренции обеспечит перепрограммирование механизма хозяина в сторону производства кодируемых вирусами белков и, в конечном итоге, высвобождение инфекционных вирионов. 132,133 В случае ВИЧ-1 было показано, что 5’UTR управляет кэп-зависимой инициацией трансляции в нормальных физиологических условиях 33,51 и опосредует IRES-зависимый синтез белка во время стрессовых условий, которые, как известно, препятствуют кэп-зависимой трансляции. -зависимое инициирование перевода. 32,86,88,91,118 Интересно, что в ходе репликации вируса было показано, что ВИЧ-1 изменяет клеточный гомеостаз, изменяя несколько компонентов аппарата трансляции хозяина, что приводит к ингибированию кэп-зависимой трансляции. Например, ВИЧ-1 индуцирует эндогенное увеличение количества реактивных кислородных промежуточных соединений в клетках, что приводит к окислительному стрессу, который, как было продемонстрировано, способствует NF-каппа B-зависимой активации транскрипции ВИЧ и стимулирует активность 5’UTR IRES ВИЧ-1. 88 Кроме того, экспрессия вирусного белка R (Vpr), который играет роль в регуляции обратной транскрипции, ядерного транспорта, транскрипции, клеточного цикла и апоптоза, также может способствовать остановке клеточного цикла в G2 / M фаза. 134 В общем, во время фазы G2 / M клеточного цикла как eIF4E, так и 4E-BP гипофосфорилируются, что приводит к разрушению комплекса eIF4F, секвестрации eIF4E 4E-BP и подавлению cap -зависимое инициирование перевода. 135 Соответственно, во время остановки клеточного цикла G2 / M, индуцированной Vpr, функциональный eIF4E снижается, поскольку взаимодействие eIF4E-4EBP благоприятствует. 74 Напротив, индуцированная вирусом остановка клеточного цикла G2 / M стимулирует как транскрипцию ВИЧ-1, так и трансляцию мРНК Gag, 136 , что приводит к общему увеличению продукции вируса. 137 Это открытие сильно коррелирует с наблюдением, что экспрессия, управляемая IRES ВИЧ-1, практически не зависит от остановки G2 / M. 86

Фактор инициации eIF4G также является субстратом для нескольких различных клеточных и вирусных протеаз на поздних стадиях инфицирования ВИЧ-1.Действительно, активация апоптоза с помощью Vpr индуцирует активацию каспазы 3, которая, в свою очередь, опосредует протеолиз eIF4G. 138,139 Кроме того, вирусная протеаза ВИЧ-1, которая необходима для процессинга вирусных белков и также имеет несколько клеточных мишеней, 140-148 , также может расщеплять факторы инициации eIF4G, PABP и eIF3d. 140-142,148 Хотя влияние расщепления eIF3d на трансляцию не было определено, 148 протеолиз eIF4G и PABP приводит к репрессии кэп-зависимой трансляции в RRL, в бесклеточных экстрактах и ​​в культивируемых клетках. 141, 142, 149, 150 Однако в этих условиях, которые препятствуют кэп-зависимой инициации трансляции, синтез белка, управляемый EMCV- и PV-IRES, и 5’UTR ВИЧ-1 практически не затрагивается как в бесклеточных экстрактах, так и в клетках (см. ). 149,150 Эти эксперименты предполагают, что на поздних стадиях цикла репликации ВИЧ-1 нацелена кэп-зависимая инициация трансляции. Следовательно, в условиях, которые препятствуют инициации кэп-зависимой трансляции, присутствие функционального IRES будет способствовать трансляции вирусной мРНК по сравнению с трансляцией клеточных мРНК.

Кроме того, наличие модифицированной 5’cap-структуры на конце полноразмерной РНК ВИЧ-1 может также оправдать потребность в IRES. Действительно, белок, взаимодействующий с рецептором, активируемым пролифератором пероксисом, с доменом метилтрансферазы (PIMT) является белком, который, как известно, взаимодействует с комплексом Rev / RRE. PIMT гиперметилирует m 7 G RNA-cap с образованием пула триметилгуанозинового (TMG; m 2, 2,7 guanosine) -cap, содержащего вирусные мРНК. 151-153 TMG-кэпированные РНК, как известно, плохо транслируются, 154 из-за неэффективного распознавания триметила кэп-связывающим белком eIF4E. 155-158 Как следствие, можно было бы предсказать, что РНК TMG-HIV-1 будут неэффективно транслироваться, что приведет к снижению вирусной экспрессии. Однако это не так, и TMG-кэпирование вирусных мРНК ассоциируется с повышенной экспрессией структурных белков ВИЧ-1. 151 Хотя механизм, с помощью которого эти TMG-кэпированные вирусные мРНК рекрутируют трансляционный аппарат, не был изучен, есть соблазн предположить, что инициация трансляции с TMG-HIV-1 РНК может происходить с помощью независимого от кэпа IRES-опосредованного механизма. .

Базальная скорость трансляции аутентичной РНК ВИЧ-1 регулируется 5’UTR-парами нуклеотидов на стыке R и U5

  • 1.

    Berkhout, B. ВИЧ-1 как машина эволюции РНК. РНК. Биол. 8 , 225–229 (2011).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 2.

    Бутш М. и Борис-Лори К. Судьба неспецифицированной ретровирусной РНК: рибосома и / или вирион? Дж. Virol. 76 , 3089–3094 (2002).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 3.

    Abbink, T. E., Ooms, M., Haasnoot, P. C. & Berkhout, B. Конформационный переключатель лидерной РНК ВИЧ-1 регулирует димеризацию РНК, но не регулирует трансляцию мРНК. Биохимия 44 , 9058–9066 (2005).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 4.

    Боден, Ф. и др. . Функциональные сайты в 5′-области РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 образуют определенные структурные домены. J. Mol. Биол. 229 , 382–397 (1993).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 5.

    Berkhout, B. & van Wamel, J. L. Лидер генома РНК ВИЧ-1 образует компактно сложенную третичную структуру. РНК. 6 , 282–295 (2000).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 6.

    Huthoff, H. & Berkhout, B. Две чередующиеся структуры лидерной РНК ВИЧ-1. РНК. 7 , 143–157 (2001).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 7.

    Кин С.К. и др. . Структура РНК.Структура сигнала упаковки РНК ВИЧ-1. Наука 348 , 917–921 (2015).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 8.

    Kenyon, J.C., Prestwood, L.J., Le Grice, S.F. & Lever, A.M. Зондирование в геле индивидуальных конформеров РНК в смешанной популяции выявляет структурный переключатель димеризации в лидере ВИЧ-1. Nucleic Acids Res. 41 , e174 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 9.

    Кузембаева М., Дилли К., Сардо Л. и Ху, У. С. Жизнь пси: как полноразмерные РНК ВИЧ-1 становятся упакованными геномами в вирусных частицах. Вирусология 454–455 , 362–370 (2014).

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 10.

    Лу, К. и др. . ЯМР-определение структур в 5′-лидерной РНК ВИЧ-1, которые регулируют упаковку генома. Наука 334 , 242–245 (2011).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 11.

    Ooms, M., Huthoff, H., Russell, R., Liang, C. & Berkhout, B. Рибопереключатель регулирует димеризацию и упаковку РНК в вирионах вируса иммунодефицита человека 1 типа. J. Virol. 78 , 10814–10819 (2004).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 12.

    Пайярт, Дж. К. и др. . Первые снимки структуры РНК ВИЧ-1 в инфицированных клетках и вирионах. J. Biol. Chem. 279 , 48397–48403 (2004).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 13.

    Сакураги Дж., Оде Х., Сакураги С., Шиода Т. и Сато Х. Предложение по новой структурной модели DLS ВИЧ-1. Nucleic Acids Res. 40 , 5012–5022 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 14.

    Сакураги, С., Йокояма, М., Сиода, Т., Сато, Х. и Сакураги, Дж. И. Повторный визит к SL1: функциональный анализ структуры и конформации РНК генома ВИЧ-1. Ретровирология. 13 , 79 (2016).

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 15.

    Стивенсон, Дж. Д. и др. . Трехмерная структура РНК основной сигнальной области упаковки ВИЧ-1. Структура. 21 , 951–962 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 16.

    Ватт, Дж. М. и др. . Архитектура и вторичная структура всего генома РНК ВИЧ-1. Природа 460 , 711–716 (2009).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 17.

    Уилкинсон, К. А. и др. . Высокопроизводительный SHAPE-анализ показывает, что структуры геномной РНК ВИЧ-1 сильно консервативны в различных биологических состояниях. PLoS. Биол. 6 , e96 (2008).

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 18.

    Abbink, T. E. и Berkhout, B. Новое взаимодействие спаривания оснований на большом расстоянии в РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 перекрывает старт-кодон Gag. J. Biol. Chem. 278 , 11601–11611 (2003).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 19.

    Смит, А. М., Фукс, Р. Т., Гранди, Ф. Дж. И Хенкин, Т. М. РНК рибосвитча: регуляция экспрессии генов путем прямого мониторинга физиологического сигнала. РНК. Биол. 7 , 104–110 (2010).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 20.

    Уилсон Р. К. и др. . Настройка регуляции рибопереключателя посредством конформационного отбора. Дж.Мол. Биол. 405 , 926–938 (2011).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 21.

    Webb, JA, Jones, CP, Parent, LJ, Rouzina, I. & Musier-Forsyth, K. Отчетливые связывающие взаимодействия Gag ВИЧ-1 с Psi и не-Psi РНК: значение для вирусной геномной РНК упаковка. РНК. 19 , 1078–1088 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 22.

    Левин, Дж. Г. и Розенак, М. Дж. Синтез белков вируса лейкемии мышей, связанных с вирионами, собранными в обработанных актиномицином D клетках: доказательства персистенции вирусной матричной РНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США 73 , 1154–1158 (1976).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 23.

    Мессер, Л. И., Левин, Дж. Г., Чаттопадхай, С.К. Метаболизм вирусной РНК в клетках, инфицированных вирусом лейкемии мышей; доказательства дифференциальной стабильности вирусного сообщения и РНК-предшественника вириона. J. Virol. 40 , 683–690 (1981).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 24.

    Каддис Мальдонадо, Р. Дж. И Родитель, Л. Дж. Организация отбора и упаковки геномной РНК ретровирусами: ансамбль вирусных и хозяйских факторов. Вирусы . 8 (2016).

  • 25.

    Бутш М. и Борис-Лори К. Перевод не требуется для создания РНК-предшественника вириона в Т-клетках, инфицированных вирусом иммунодефицита человека 1 типа. J. Virol. 74 , 11531–11537 (2000).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 26.

    Кэй, Дж. Ф. и Левер, А. М.Вирусы иммунодефицита человека 1 и 2 типов различаются по преобладающему механизму отбора геномной РНК для инкапсидации. J. Virol. 73 , 3023–3031 (1999).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 27.

    Ni, N. и др. . Механизмы упаковки РНК вируса иммунодефицита человека 2-го типа: эффективная транс-упаковка и выбор партнеров для повторной упаковки РНК. J. Virol. 85 , 7603–7612 (2011).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 28.

    Дорман, Н. и Левер, А. Сравнение механизмов сортировки вирусной геномной РНК в вирусах иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), ВИЧ-2 и вирусе мышиного лейкоза Молони. J. Virol. 74 , 11413–11417 (2000).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 29.

    Griffin, S. D., Allen, J. F. & Lever, A. M. Сигнал упаковки основного вируса иммунодефицита человека типа 2 (ВИЧ-2) присутствует на всех видах РНК ВИЧ-2: котрансляционная инкапсидация РНК и ограничение Gag-белка придают специфичность. J. Virol. 75 , 12058–12069 (2001).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 30.

    Андерсон, Э. К.И Левер А.М. Полипротеин Gag вируса иммунодефицита человека 1 типа модулирует собственную трансляцию. J. Virol. 80 , 10478–10486 (2006).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 31.

    Liang, C., Hu, J., Russell, R. S. & Wainberg, M. A. Трансляция Pr55 (gag) увеличивает упаковку РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 цис-действующим образом. AIDS Res. Гм. Ретровирусы 18 , 1117–1126 (2002).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 32.

    Poon, D. T., Chertova, E. N. & Ott, D. E. Вирус иммунодефицита человека типа 1 предпочтительно инкапсидирует геномные РНК, которые кодируют Pr55 (Gag): функциональная связь между трансляцией и упаковкой РНК. Вирусология 293 , 368–378 (2002).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 33.

    Lever, A.M. Упаковка РНК ВИЧ-1. Adv. Pharmacol. 55 , 1–32 (2007).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 34.

    Bieth, E., Gabus, C. & Darlix, J. L. Исследование образования димера РНК вируса саркомы Рауса и его влияния на синтез вирусного белка in vitro . Nucleic Acids Res. 18 , 119–127 (1990).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 35.

    Darlix, J. L. Контроль трансляции и упаковки РНК вируса саркомы Рауса с помощью 5 ‘и 3’ нетранслируемых последовательностей. J. Mol. Биол. 189 , 421–434 (1986).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 36.

    Ka, W.H., Jeong, Y. Y. & You, J. C. Идентификация последовательности упаковывающей РНК ВИЧ-1 (Psi) в качестве основного детерминанта ингибирования трансляции, обеспечиваемого 5′-UTR ВИЧ-1. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 417 , 501–507 (2012).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 37.

    Miele, G., Mouland, A., Harrison, GP, Cohen, E. & Lever, AM. 5′-сигнальная структура упаковки вируса иммунодефицита человека 1-го типа влияет на трансляцию, но не действует как вход во внутреннюю рибосому. структура сайта. J. Virol. 70 , 944–951 (1996).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 38.

    Abbink, T. E. и Berkhout, B. Структура РНК модулирует эффективность сплайсинга у основного донора сплайсинга вируса иммунодефицита человека 1 типа. J. Virol. 82 , 3090–3098 (2008).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 39.

    Гендрон К., Фербейр Г., Хевекер Н. и Бракье-Гинграс Л. Активность IRES ВИЧ-1 стимулируется окислительным стрессом и контролируется отрицательным регуляторным элементом. Nucleic Acids Res. 39 , 902–912 (2011).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 40.

    Ricci, E.P., Soto, R.R., Herbreteau, C.H., Decimo, D. & Ohlmann, T. Лентивирусные РНК могут использовать различные механизмы для инициации трансляции. Biochem. Soc. Пер. 36 , 690–693 (2008).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 41.

    Рохас-Арайя, Б., Олманн, Т. и Сото-Рифо, Р. Трансляционный контроль геномной РНК ВИЧ без сплайсинга. Вирусов. 7 , 4326–4351 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 42.

    Vallejos, M. и др. . Функциональный и структурный анализ внутреннего сайта входа в рибосому, присутствующего в мРНК природных вариантов ВИЧ-1. PLoS. Один. 7 , e35031 (2012).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 43.

    Харитончик, С. и др. . Гетерогенность сайта старта транскрипции модулирует структуру и функцию генома ВИЧ-1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 113 , 13378–13383 (2016).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 44.

    Масуда, Т. и др. . Судьба промежуточных продуктов кДНК ВИЧ-1 во время обратной транскрипции определяется сайтом инициации транскрипции геномной РНК вируса. Sci. Репутация 5 , 17680 (2015).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 45.

    Bolinger, C. et al. . РНК-геликаза А взаимодействует с дивергентными лимфотропными ретровирусами и способствует трансляции вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1. Nucleic Acids Res. 35 , 2629–2642 (2007).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 46.

    Болинджер, К., Шарма, А., Синг, Д., Ю., Л. и Борис-Лори, К. РНК-геликаза А модулирует трансляцию ВИЧ-1 и инфекционность вирионов потомства. Nucleic Acids Res. 38 , 1686–1696 (2010).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 47.

    Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, TM и Boris-Lawrie, K. 5′-конец РНК вируса некроза селезенки содержит новый посттранскрипционный контрольный элемент, который способствует иммунодефициту человека. вирус Rev / RRE-независимое производство Gag. J. Virol. 73 , 4847–4855 (1999).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 48.

    Hartman, T. R. et al. . РНК-геликаза A необходима для трансляции выбранных информационных РНК. Нат. Struct. Мол. Биол. 13 , 509–516 (2006).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 49.

    Stake, M. и др. . ВИЧ-1 и две нетранслируемые 5′-области птичьего ретровируса связывают ортологичные человеческие и куриные РНК-связывающие белки. Вирусология 486 , 307–320 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 50.

    Soto-Rifo, R. et al. . Различные эффекты структуры TAR на трансляцию геномных РНК ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Nucleic Acids Res. 40 , 2653–2667 (2012).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 51.

    Шарма, А., Йилмаз, А., Марш, К., Кокрейн, А., Борис-Лори, К. Процветание в условиях стресса: селективная трансляция мРНК структурного белка ВИЧ-1 во время Vpr-опосредованного нарушения деятельности по переводу eIF4E. PLoS. Патог. 8 , e1002612 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 52.

    Кеннеди Э. М. и др. . Посттранскрипционное редактирование m (6) A мРНК ВИЧ-1 усиливает экспрессию вирусных генов. Cell Host. Микроб 19 , 675–685 (2016).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 53.

    Личинчи, Г. и др. . Динамика метиломов m (6) A РНК человека и вируса при инфицировании Т-лимфоцитами ВИЧ-1. Нат. Microbiol. 1 , 16011 (2016).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 54.

    Тирумуру, Н. и др. . N (6) -метиладенозин РНК ВИЧ-1 регулирует вирусную инфекцию и экспрессию белка Gag ВИЧ-1. Элиф . 5 (2016).

  • 55.

    Yedavalli, V. S. & Jeang, K. T. Кепирование триметилгуанозина избирательно способствует экспрессии Rev-зависимых РНК ВИЧ-1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107 , 14787–14792 (2010).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 56.

    Миллиган Дж. Ф. и Уленбек О. С. Синтез малых РНК с использованием РНК-полимеразы Т7. Methods Enzymol. 180 , 51–62 (1989).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 57.

    Сингх Д., Борас И., Сингх Г. и Борис-Лори К. Выделение когнитивных клеточных и вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов РНК ВИЧ-1, применимых для протеомных открытий и молекулярных исследований. Methods Mol. Биол. 1354 , 133–146 (2016).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 58.

    Fouchier, RA, Meyer, BE, Simon, JH, Fischer, U. & Malim, MH Инфекция ВИЧ-1 неделящихся клеток: доказательства того, что аминоконцевой основной участок вирусного матричного белка важно для обработки GAG, но не для пост-импортного ядерного импорта. EMBO J. 16, , 4531–4539 (1997).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 59.

    Саймон, Дж. Х. и др. . Белки Vif и Gag вируса иммунодефицита человека типа 1 совместно локализуются в инфицированных Т-клетках человека. J. Virol. 71 , 5259–5267 (1997).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • За пределами резервуара ВИЧ, способного к репликации: резервуары, способные к транскрипции и трансляции | Retrovirology

  • 1.

    Chun TW, Finzi D, Margolick J, Chadwick K, Schwartz D, Siliciano RF.Судьба ВИЧ-1-инфицированных Т-клеток in vivo: количественный анализ перехода к стабильной латентности. Nat Med. 1995; 1: 1284–90.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 2.

    Чун Т.В., Каррут Л., Финзи Д., Шен Х, ДиДжузеппе Дж. А., Тейлор Х. и др. Количественная оценка латентных тканевых резервуаров и общей вирусной нагрузки организма при ВИЧ-1-инфекции. Природа. 1997; 387: 183–8.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 3.

    Chun TW, Stuyver L, Mizell SB, Ehler LA, Mican JA, Baseler M и др. Наличие индуцибельного латентного резервуара ВИЧ-1 во время высокоактивной антиретровирусной терапии. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 13193–7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 4.

    Финци Д., Германкова М., Пирсон Т., Каррут Л. М., Бак С., Чейссон Р. Э. и др. Выявление резервуара для ВИЧ-1 у пациентов, получающих высокоактивную антиретровирусную терапию.Наука. 1997; 278: 1295–300.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 5.

    Wong JK, Hezareh M, Günthard HF, Havlir DV, Ignacio CC, Spina CA, et al. Восстановление репликационно-компетентного ВИЧ, несмотря на длительное подавление плазменной виремии. Наука. 1997; 278: 1291–5.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 6.

    Брунер К.М., Хосмане Н. Н., Силичиано РФ.На пути к излечению от ВИЧ-1: измерение скрытого резервуара. Trends Microbiol. 2015; 23: 192–203.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 7.

    Расмуссен Т.А., Левин С.Р. Шокирование ВИЧ из укрытия: где мы находимся с клиническими испытаниями агентов, обращающих латентный период? Curr Opin ВИЧ СПИД. 2016; 11: 394–401.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 8.

    Имамичи Х., Натараджан В., Адельсбергер Дж. В., Рем Калифорния, Лемпицки Р.А., Дас Б. и др. Продолжительность жизни CD4 + Т-клеток эффекторной памяти определяется некомпетентным к репликации интегрированным провирусом ВИЧ-1. СПИД. 2014; 28: 1091–9.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 9.

    Имамичи Х., Дьюар Р.Л., Адельсбергер Дж. У., Рем Калифорния, О’Догерти У., Паксинос Е.Е. и др. Дефектные провирусы ВИЧ-1 продуцируют новые виды белок-кодирующих РНК у ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих комбинированную антиретровирусную терапию. Proc Natl Acad Sci USA. 2016; 113: 8783–8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 10.

    Вандергитен С., Фроментин Р., Мерлини Е., Лавани М.Б., ДаФонсека С., Бакеман В. и др. Сверхчувствительные кросс-клада-тесты на основе ПЦР для измерения устойчивости ВИЧ в исследованиях с большой группой. J Virol. 2014; 88: 12385–96.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 11.

    Хо YC, Шан Л., Хосман Н.Н., Ван Дж., Ласки С.Б., Розенблум ДИС и др. Компетентные к репликации неиндуцированные провирусы в латентном резервуаре повышают барьер на пути лечения ВИЧ-1. Клетка. 2013; 155: 540–51.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 12.

    Брунер К.М., Мюррей А.Дж., Поллак Р.А., Солиман М.Г., Ласки С.Б., Капоферри А.А. и др. Дефектные провирусы быстро накапливаются во время острой инфекции ВИЧ-1. Nat Publ Group.2016; 22: 1043–9.

    CAS Google Scholar

  • 13.

    Siliciano JD, Kajdas J, Finzi D, Quinn TC, Chadwick K, Margolick JB, et al. Долгосрочные последующие исследования подтверждают стабильность латентного резервуара ВИЧ-1 в покоящихся CD4 + Т-клетках. Nat Med. 2003; 9: 727–8.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 14.

    Laird GM, Eisele EE, Rabi SA, Lai J, Chioma S, Blankson JN, et al.Быстрая количественная оценка латентного резервуара ВИЧ-1 с использованием анализа вирусного роста. PLoS Pathog. 2013; 9: e1003398.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 15.

    Буллен К.К., Лэрд Дж. М., Дюран С. М., Силичиано Дж. Д., Силичиано РФ. Новые подходы ex vivo различают эффективные и неэффективные отдельные агенты для изменения латентного периода ВИЧ-1 in vivo. Nat Med. 2014; 20: 425–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 16.

    Sanyal A, Mailliard RB, Rinaldo CR, Ratner D, Ding M, Chen Y, et al. Новый анализ выявляет большой, индуцибельный, компетентный к репликации резервуар ВИЧ-1 в покоящихся CD4 + Т-клетках. Nat Med. 2017; 73: 5858–6099.

    Google Scholar

  • 17.

    Deeks SGHIV. Шокируй и убивай. Природа. 2012; 487: 439–40.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 18.

    Марголис Д.М., Гарсия СП, Хазуда Д.Д., Хейнс Б.Ф.Обращение латентного периода и вирусный клиренс для лечения ВИЧ-1. Наука. 2016; 353: aaf6517–7.

    Артикул CAS Google Scholar

  • 19.

    Lederman MM, Cannon PM, Currier JS, June CH, Kiem HP, Kuritzkes DR, et al. Лекарство от ВИЧ-инфекции: «не при моей жизни» или «не за горами»? PAI. 2016; 1: 154–64.

    Артикул Google Scholar

  • 20.

    Черчилль М.Дж., Дикс С.Г., Марголис Д.М., Силичиано Р.Ф., Суонстром Р.Резервуары ВИЧ: что, где и как с ними бороться. Nat Rev Microbiol. 2016; 14: 55–60.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 21.

    Силичиано РФ, Грин WC. Латентный период ВИЧ. Cold Spring Harbor Perspect Med. 2011; 1: a007096–6.

    Артикул CAS Google Scholar

  • 22.

    Мюррей Дж. М., Заундерс Дж. Дж., Макбрайд К. Л., Сюй Й., Бейли М., Сузуки К. и др. Подвиды ДНК ВИЧ сохраняются как в активированных, так и в покоящихся CD4 + Т-клетках памяти во время антиретровирусной терапии.J Virol. 2014; 88: 3516–26.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 23.

    Karn J, Stoltzfus CM. Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена ВИЧ-1. Cold Spring Harbor Perspect Med. 2012; 2: a006916.

    Артикул CAS Google Scholar

  • 24.

    Ким С.-И, Бирн Р., Групман Дж., Балтимор Д. Временные аспекты синтеза ДНК и РНК во время инфицирования вирусом иммунодефицита человека: доказательства дифференциальной экспрессии генов.J Virol. 1989; 63: 3708–13.

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 25.

    Рохас-Арайя Б., Олманн Т., Сото-Рифо Р. Трансляционный контроль несплицированной геномной РНК ВИЧ. Вирусы. 2015; 7: 4326–51.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 26.

    Ван Линт С., Бушат С., Марчелло А. Транскрипция и латентность ВИЧ-1: обновление.Ретровирология. 2013; 10: 67.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 27.

    Mohammadi P, di Iulio J, Muñoz M, Martinez R, Bartha I, Cavassini M, et al. Динамика латентного периода и реактивации ВИЧ в модели первичных CD4 + Т-клеток. PLoS Pathog. 2014; 10: e1004156.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 28.

    Pace MJ, Graf EH, Agosto LM, Mexas AM, Male F, Brady T и др. Непосредственно инфицированные покоящиеся CD4 + Т-клетки могут продуцировать Gag ВИЧ, не распространяя инфекцию в модели латентного периода ВИЧ. PLoS Pathog. 2012; 8: e1002818.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 29.

    Пейс MJ, Agosto L, Graf EH, O’Doherty U. Резервуары ВИЧ и модели латентности. Вирусология. 2011; 411: 344–54.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 30.

    Schnittman SM, Greenhouse JJ, Lane HC, Pierce PF, Fauci AS. Частое обнаружение ВИЧ-1-специфических мРНК у инфицированных людей свидетельствует о продолжающейся активной вирусной экспрессии на всех стадиях заболевания. AIDS Res Hum Retrovir. 1991; 7: 361–7.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 31.

    Graziosi C, Pantaleo G, Butini L, Demarest JF, Saag MS, Shaw GM, et al. Кинетика синтеза ДНК и РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) при первичной инфекции ВИЧ-1.Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 6405–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 32.

    Fischer M, Joos B, Niederöst B, Kaiser P, Hafner R, von Wyl V, et al. Кинетика двухфазного распада предполагает прогрессирующее замедление оборота латентно инфицированных ВИЧ-1 клеток во время антиретровирусной терапии. Ретровирология. 2008; 5: 107.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 33.

    Kaiser P, Joos B, Niederöst B., Weber R, Günthard HF, Fischer M. Инфекция продуктивного вируса иммунодефицита человека типа 1 в периферической крови преимущественно происходит в CD4 / CD8 дважды отрицательных Т-лимфоцитах. J Virol. 2007. 81: 9693–706.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 34.

    Пастернак А.О., ДеМастер Л.К., Кутстра Н.А., Рейсс П., О’Догерти Ю., Беркхаут Б. Незначительный вклад химерных считывающих транскриптов хозяина-ВИЧ на уровень ассоциированной с клетками ВИЧ gag РНК.J Virol. 2015; 90: 1148–51.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 35.

    Пастернак А.О., Беркхаут Б. Что мы измеряем, когда измеряем клеточно-ассоциированную РНК ВИЧ. Ретровирология. 2018; 15 (1). https://doi.org/10.1186/s12977-018-0397-2.

  • 36.

    Пастернак А.О., Лукашов В.В. Бен Беркхаут. Клеточно-ассоциированная РНК ВИЧ: динамический биомаркер устойчивости вируса. Ретровирология. 2013; 10: 41.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 37.

    Pantaleo G, Graziosi C, Demarest JF, Butini L, Montroni M, Fox CH и др. ВИЧ-инфекция активна и прогрессирует в лимфоидной ткани на клинически латентной стадии заболевания. Природа. 1993; 362: 355–8.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 38.

    Haase AT, Henry K, Zupancic M, Sedgewick G, Faust RA, Melroe H, et al. Количественный анализ изображений ВИЧ-1-инфекции в лимфоидной ткани. Наука. 1996. 274: 985–9.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 39.

    Бренчли Дж. М., Винтон С., Табб Б., Хао ХР, Конник Е., Пайардини М. и др. Дифференциальные паттерны инфицирования CD4 + Т-клетками и вирусной нагрузки лимфоидной ткани различают прогрессирующие и непрогрессирующие лентивирусные инфекции. Кровь. 2012; 120: 4172–81.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 40.

    Ли К., Скиннер П.Дж., Ха С-Дж, Дуан Л., Маттила Т.Л., Хаге А. и др. Визуализация антиген-специфических и инфицированных клеток in situ позволяет прогнозировать исходы ранней вирусной инфекции. Наука. 2009; 323: 1726–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 41.

    Паттерсон Б.К., Тилл М., Отто П., Гулсби С., Фуртадо М.Р., Макбрайд Л.Дж. и др. Обнаружение ДНК ВИЧ-1 и информационной РНК в отдельных клетках с помощью ПЦР-гибридизации in situ и проточной цитометрии.Наука. 1993; 260: 976–9.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 42.

    Паттерсон Б.К., Мосиман В.Л., Кантареро Л., Фуртадо М., Бхаттачарья М., Гулсби С. Обнаружение ВИЧ-РНК-положительных моноцитов в периферической крови ВИЧ-положительных пациентов путем одновременного проточного цитометрического анализа внутриклеточной РНК ВИЧ и клеточный иммунофенотип. Цитометрия. 1998. 31: 265–74.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 43.

    Паттерсон Б.К., Черневски М.А., Коттедж Дж., Агноли М., Кесслер Х., Лэнди А. Мониторинг лечения ВИЧ-1 в субпопуляциях иммунных клеток с помощью сверхчувствительной флуоресцентной гибридизации in situ. Ланцет. 1999; 353: 211–2.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 44.

    Chargin A, Yin F, Song M, Subramaniam S, Knutson G, Patterson BK. Идентификация и характеристика латентных резервуаров вируса ВИЧ-1 в периферической крови. J Clin Microbiol.2015; 53: 60–6.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 45.

    Ван Ф., Фланаган Дж., Су Н, Ван Л.К., Буй С., Нильсон А. и др. RNAscope: новая платформа для анализа РНК in situ для фиксированных формалином и залитых парафином тканей. J Mol Diagn. 2012; 14: 22–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 46.

    Игрок А.Н., Шен Л.П., Кенни Д., Антао В.П., Кольберг Дж.А.Обнаружение единственной копии гена с использованием гибридизации in situ разветвленной ДНК (бДНК). J Histochem Cytochem. 2001; 49: 603–12.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 47.

    Deleage C, Wietgrefe SW, Del Prete G, Morcock DR, Hao XP, Anderson JL, et al. Определение резервуаров ВИЧ и SIV в лимфоидных тканях. PAI. 2016; 1: 39–68.

    Артикул Google Scholar

  • 48.

    Deleage C, Turkbey B, Estes JD.Визуализация лимфоидных тканей у нечеловеческих приматов, чтобы понять патогенез и устойчивость ВИО. Curr Opin Virol. 2016; 19: 77–84.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 49.

    Эстес Дж. Д., Китио К., Ссали Ф., Свейнсон Л., Макамдоп К. Н., Дель Прете Г. К. и др. Определение бремени вируса СПИДа для всего организма с последствиями для лечебных стратегий. Nat Med. 2017; 23: 1271–6.

    CAS PubMed Google Scholar

  • 50.

    Поричис Ф., Харт М.Г., Грисбек М., Эверетт Х.Л., Хассан М., Бакстер А.Э. и др. Высокопроизводительное обнаружение miRNA и ген-специфической мРНК на уровне отдельной клетки с помощью проточной цитометрии. Nat Commun. 2014; 5: 5641.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 51.

    Прасад В.Р., Калпана Г.В. Выявление скрытого врага: достижения в обнаружении и измерении скрытых ВИЧ-инфицированных клеток. MBio. 2017; 8: e01433–17.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 52.

    Martrus G, Niehrs A, Cornelis R, Rechtien A, García-Beltran W., Lütgehetmann M, et al. Кинетика изменения латентности ВИЧ-1 количественно определена на уровне отдельных клеток с использованием нового метода, основанного на потоке. J Virol. 2016; 90: 9018–28.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 53.

    Бакстер А.Е., Ниссл Дж., Фроментин Р., Ричард Дж., Поричис Ф., Шарлебуа Р. и др. Одноклеточная характеристика вирусных трансляционно-компетентных резервуаров у ВИЧ-инфицированных.Клеточный микроб-хозяин. 2016; 20: 368–80.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 54.

    Бакстер А.Е., Ниссл Дж., Фроментин Р., Ричард Дж., Поричис Ф., Массанелла М. и др. Многопараметрическая характеристика редких ВИЧ-инфицированных клеток с использованием метода FISH с потоком РНК. Nat Protoc. 2017; 12: 2029–49.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 55.

    Grau-Expósito J, Serra-Peinado C, Miguel L, Navarro J, Curran A, Burgos J, et al. Новый одноклеточный анализ FISH-flow идентифицирует эффекторные CD4 (+) Т-клетки памяти как основную нишу для транскрипции ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных пациентов. MBio. 2017; 8: e00876–17.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 56.

    Кирни М.Ф., Виганд А., Шао В., Гроб Дж. М., Меллорс Дж. В., Ледерман М. М. и др. Происхождение отскока плазмы ВИЧ включает клетки с идентичными провирусами, которые транскрипционно активны до прекращения антиретровирусной терапии.J Virol. 2015; 90: 1369–76.

    PubMed Статья CAS Google Scholar

  • 57.

    Бартон К., Хинер Б., Винкельманн А., Расмуссен Т.А., Шао В., Байт К. и др. Широкая активация латентного ВИЧ-1 in vivo. Nat Commun. 2016; 7: 12731.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 58.

    Поллак Р.А., Джонс Р.Б., Пертеа М., Брунер К.М., Мартин А.Р., Томас А.С. и др.Дефектные провирусы ВИЧ-1 экспрессируются и могут быть распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые формируют провирусный ландшафт. Клеточный микроб-хозяин. 2017; 21: 494–4.

    Артикул CAS Google Scholar

  • 59.

    Imamichi H, Smith M, Rehm CA, Catalfamo M, Lane HC. Доказательства продукции белков ВИЧ-1 из «дефектных» провирусов ВИЧ-1 in vivo: значение для стойкой иммунной активации и патогенеза ВИЧ-1. Тезисы конференции IAS, Париж; 2017 г.

  • 60.

    Briggs JAG, Simon MN, Gross I., Kräusslich H-G, Fuller SD, Vogt VM, et al. Стехиометрия белка gag в ВИЧ-1. Nat Struct Mol Biol. 2004; 11: 672–5.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 61.

    Graf EH, Pace MJ, Peterson BA, Lynch LJ, Chukwulebe SB, Mexas AM, et al. Gag-положительные резервуарные клетки чувствительны к ВИЧ-специфическому цитотоксическому T-лимфоцитов-опосредованному клиренсу in vitro и могут быть обнаружены in vivo.PLoS ONE. 2013; 8: e71879.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 62.

    DeMaster LK, Liu X, VanBelzen DJ, Trinité B, Zheng L, Agosto LM, et al. Подмножество CD4 / CD8 дважды отрицательных Т-клеток экспрессирует белки ВИЧ у пациентов, получающих АРТ. J Virol. 2015; 90: 2165–79.

    PubMed Статья CAS Google Scholar

  • 63.

    Garcia JV, Miller AD.Независимое от фосфорилирования серина подавление CD4 на клеточной поверхности с помощью nef. Природа. 1991; 350: 508–11.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 64.

    Вилли Р.Л., Мальдарелли Ф., Мартин М.А., Стребель К. Белок Vpu вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует быструю деградацию CD4. J Virol. 1992; 66: 7193–200.

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 65.

    Aiken C, Konner J, Landau NR, Lenburg ME, Trono D. Nef индуцирует эндоцитоз CD4: потребность в критическом мотиве дилейцина в проксимальном к мембране цитоплазматическом домене CD4. Клетка. 1994. 76: 853–64.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 66.

    Geleziunas R, Bour S, Wainberg MA. Корреляция между высоким уровнем экспрессии gp160 и сниженным биосинтезом CD4 в клональных производных клеток U-937, инфицированных вирусом иммунодефицита человека 1 типа.J Gen Virol. 1994; 75 (Pt 4): 857–65.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 67.

    Rhee SS, Marsh JW. Индуцированное Nef вирусом иммунодефицита человека 1-го типа подавление CD4 происходит из-за быстрой интернализации и деградации поверхностных CD4. J Virol. 1994; 68: 5156–63.

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 68.

    Chen BK, Gandhi RT, Baltimore D.Понижающая модуляция CD4 во время инфицирования человеческих Т-клеток вирусом иммунодефицита человека типа 1 включает независимую активность vpu, env и nef. J Virol. 1996; 70: 6044–53.

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 69.

    Krivacic RT, Ladanyi A, Curry DN, Hsieh HB, Kuhn P, Bergsrud DE, et al. Детектор редких клеток рака. Proc Natl Acad Sci USA. 2004. 101: 10501–4.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 70.

    Се Х. Б., Марринуччи Д., Бетел К., Карри Д. Н., Хамфри М., Кривачич Р. Т. и др. Высокая скорость обнаружения циркулирующих опухолевых клеток. Biosens Bioelectron. 2006; 21: 1893–9.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 71.

    Лю X, Се Х. Б., Кампана Д., Брюс Р. Х. Новый метод высокоскоростного и точного обнаружения минимальной остаточной болезни. Cytom Часть A. 2012; 81: 169–75.

    Артикул Google Scholar

  • 72.

    Perreau M, Savoye A-L, De Crignis E, Corpataux J-M, Cubas R, Haddad EK и др. Фолликулярные Т-хелперные Т-клетки служат основным компартментом Т-лимфоцитов CD4 для инфицирования, репликации и продукции ВИЧ-1. J Exp Med. 2013; 210: 143–56. http://jem.rupress.org/content/210/1/143.full.

  • 73.

    Банга Р., Прокопио Ф.А., Ното А, Поллакис Дж., Кавассини М., Охмити К. и др. PD-1 + и фолликулярные хелперные Т-клетки несут ответственность за стойкую транскрипцию ВИЧ-1 у леченных авиремией. Nat Med.2016; 22: 754–61.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 74.

    Палликкут С., Шарки М., Бабич Д.З., Гупта С., Стоун Г.В., Фишл М.А. и др. Периферические Т-фолликулярные хелперы являются основным резервуаром ВИЧ в центральной памяти CD4 Т-лимфоцитов периферической крови хронических ВИЧ-инфицированных лиц, находящихся на КАРТ. J Virol. 2015; 90: JVI.02883–15–45.

    Google Scholar

  • 75.

    Фроментин Р., Бакеман В., Лавани МБ, Хури Г., Хартогенсис В., ДаФонсека С. и др. CD4 + Т-клетки, экспрессирующие PD-1, TIGIT и LAG-3, способствуют сохранению ВИЧ во время АРТ. PLoS Pathog. 2016; 12: e1005761.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 76.

    Eriksson S, Graf EH, Dahl V, Strain MC, Yukl SA, Lysenko ES, et al. Сравнительный анализ показателей вирусных резервуаров в исследованиях эрадикации ВИЧ-1.PLoS Pathog. 2013; 9: e1003174.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 77.

    Паттерсон Б.К., Маккалистер С., Шутц М., Сигель Дж. Н., Шульц К., Фленер З. и др. Сохранение внутриклеточной мРНК ВИЧ-1 коррелирует с ВИЧ-1-специфическими иммунными ответами у инфицированных субъектов, получающих стабильную ВААРТ. СПИД. 2001; 15: 1635–41.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 78.

    Сориано-Сарабия Н., Бейтсон Р. Э., Даль Н. П., Крукс А. М., Курук Д. Д., Марголис Д. М. и др. Количественное определение репликационно-компетентного ВИЧ-1 в популяциях покоящихся CD4 + Т-клеток. J Virol. 2014; 88: 14070–7.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 79.

    Hiener B, Horsburgh BA, Eden J-S, Barton K, Schlub TE, Lee E, et al. Идентификация генетически интактных провирусов ВИЧ-1 в конкретных CD4 (+) Т-клетках эффективно пролеченных участников.Cell Rep. 2017; 21: 813–22.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 80.

    Hurst J, Hoffmann M, Pace M, Williams JP, Thornhill J, Hamlyn E, et al. Иммунологические биомаркеры позволяют прогнозировать рецидив вируса ВИЧ-1 после прерывания лечения. Nat Commun. 2015; 6: 8495.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 81.

    Spina CA, Anderson J, Archin NM, Bosque A, Chan J, Famiglietti M, et al.Углубленное сравнение латентной реактивации ВИЧ-1 в модельных системах с множеством клеток и покоящихся CD4 + Т-клеток от пациентов с авиремией. PLoS Pathog. 2013; 9: e1003834.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 82.

    Киселинова М., Де Шпигелаер В., Бузон М.Дж., Малатинкова Е., Лихтерфельд М., Вандекеркхове Л. Интегрированная и общая ДНК ВИЧ-1 предсказывают рост вируса ex vivo. PLoS Pathog. 2016; 12: e1005472–17.

    Google Scholar

  • 83.

    Генрих Т.Дж., Дикс С.Г., Пиллаи СК. Измерение размера латентного резервуара вируса иммунодефицита человека: настоящее и будущее оценки стратегий ликвидации. J Infect Dis. 2017; 215: S134–41.

    PubMed Статья Google Scholar

  • 84.

    Procopio FA, Fromentin R, Kulpa DA, Brehm JH, Bebin A-G, Strain MC, et al. Новый анализ для измерения величины индуцируемого вирусного резервуара у ВИЧ-инфицированных.EBioMedicine. 2015; 2: 872–81.

    Артикул Google Scholar

  • 85.

    Virgin HW, Wherry EJ, Ahmed R. Новое определение хронической вирусной инфекции. Клетка. 2009; 138: 30–50.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 86.

    Летвин Н.Л., Уокер Б.Д. Иммунопатогенез и иммунотерапия при вирусных инфекциях СПИДа. Nat Med. 2003; 9: 861–6.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 87.

    Day CL, Kaufmann DE, Kiepiela P, Brown JA, Moodley ES, Reddy S и др. Экспрессия PD-1 на ВИЧ-специфических Т-клетках связана с истощением Т-клеток и прогрессированием заболевания. Природа. 2006; 443: 350–4.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 88.

    Kaufmann DE, Kavanagh DG, Pereyra F, Zaunders JJ, Mackey EW, Miura T, et al. Повышение регуляции CTLA-4 ВИЧ-специфическими CD4 + Т-клетками коррелирует с прогрессированием заболевания и определяет обратимую иммунную дисфункцию. Nat Immunol. 2007; 8: 1246–54.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 89.

    Dsouza M, Fontenot AP, Mack DG, Lozupone C, Dillon S, Meditz A, et al. Экспрессия запрограммированной смерти 1 на ВИЧ-специфических CD4 + Т-клетках управляется вирусной репликацией и связана с дисфункцией Т-клеток. J Immunol. 2007; 179: 1979–87.

    CAS Статья Google Scholar

  • 90.

    Уэрри Э. Дж., Курачи М. Молекулярные и клеточные идеи истощения Т-клеток. Nat Rev Immunol. 2015; 15: 486–99.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 91.

    Мальдарелли Ф., Палмер С., Кинг М.С., Виганд А., Полис М.А., Микан Дж. М. и др. АРТ подавляет РНК ВИЧ-1 в плазме до стабильного заданного значения, предсказанного до терапии виремией. PLoS Pathog. 2007; 3: e46.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 92.

    Палмер С., Мальдарелли Ф., Виганд А., Бернштейн Б., Ханна Г.Дж., Брун С.К. и др. Низкая виремия сохраняется не менее 7 лет у пациентов, получающих супрессивную антиретровирусную терапию. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105: 3879–84.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 93.

    Brenchley JM, Price DA, Schacker TW, Asher TE, Silvestri G, Rao S, et al. Микробная транслокация является причиной системной иммунной активации при хронической ВИЧ-инфекции.Nat Med. 2006; 12: 1365–71.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 94.

    Sandler NG, Douek DC. Микробная транслокация при ВИЧ-инфекции: причины, последствия и возможности лечения. Nat Rev Microbiol. 2012; 10: 655–66.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 95.

    Клатт Н.Р., Чомонт Н., Дуек округ Колумбия, Дикс С.Г. Активация иммунитета и устойчивость ВИЧ: значение для лечебных подходов к ВИЧ-инфекции. Immunol Rev.2013; 254: 326–42.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 96.

    Mexas AM, Graf EH, Pace MJ, Yu JJ, Papasavvas E, Azzoni L, et al. Параллельные измерения резервуаров для мониторинга общей и интегрированной ДНК ВИЧ и продолжающееся воспроизведение в испытаниях по искоренению. СПИД. 2012; 26: 2295–306.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 97.

    Аззони Л., Фоулкс А.С., Папасаввас Э., Мексас А.М., Линн К.М., Маунзер К. и др. Монотерапия пегилированным интерфероном альфа-2а приводит к подавлению репликации ВИЧ 1 типа и снижению клеточно-ассоциированной интеграции ДНК ВИЧ. J Infect Dis. 2013; 207: 213–22.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 98.

    Винкельманн А.А., Мунк-Петерсен Л.В., Расмуссен Т.А., Мельхьорсен Дж., Хьелхольт Т.Дж., Монтефиори Д. К. и др. Введение агониста толл-подобного рецептора 9 снижает провирусный резервуар у ВИЧ-инфицированных пациентов с вирусологической супрессией.PLoS ONE. 2013; 8: e62074.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 99.

    Leth S, Schleimann MH, Nissen SK, Højen JF, Olesen R, Graversen ME, et al. Комбинированное действие вакцины Vacc-4x, рекомбинантного человеческого гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора и ромидепсина на резервуар ВИЧ-1 (REDUC): одностороннее испытание, фаза 1B / 2A. Ланцет ВИЧ. 2016; 3: e463–72.

    PubMed Статья Google Scholar

  • 100.

    Когорта совместной антиретровирусной терапии. Ожидаемая продолжительность жизни лиц, получающих комбинированную антиретровирусную терапию в странах с высоким уровнем доходов: совместный анализ 14 когортных исследований. Ланцет. 2008; 372: 293–9.

    Артикул Google Scholar

  • 101.

    Дикс С.Г., Филипс А.Н. ВИЧ-инфекция, антиретровирусное лечение, старение и заболеваемость, не связанная со СПИДом. BMJ. 2009; 338: a3172.

    PubMed Статья Google Scholar

  • 102.

    Lederman MM, Funderburg NT, Sekaly R-P, NR NR, Hunt PW. Синдром остаточной иммунной дисрегуляции при пролеченной ВИЧ-инфекции. Adv Immunol. 2013; 119: 51–83.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 103.

    Chomont N, El-Far M, Ancuta P, Trautmann L, Procopio FA, Yassine-Diab B, et al. Размер и стойкость резервуара ВИЧ обусловлены выживаемостью Т-клеток и гомеостатической пролиферацией. Nat Med. 2009; 15: 893–900.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 104.

    Pinzone MR, Graf E, Lynch L, McLaughlin B, Hecht FM, Connors M, et al. Интеграция мониторинга с течением времени поддерживает роль цитотоксических Т-лимфоцитов и продолжающуюся репликацию как детерминант размера резервуара. J Virol. 2016; 90: 10436–45.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 105.

    Юэ И, Ван Н, Хань И, Чжу Т, Се Дж, Цю З и др. Более высокое соотношение CD4 / CD8 коррелирует со сверхнизким уровнем ДНК ВИЧ-1, ассоциированного с клетками, у хронически инфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию: исследование случай-контроль. BMC Infect Dis. 2017; 17: 771.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 106.

    Гибеллини Л., Пекорини С., Де Биази С., Бьянкини Е., Дигаетано М., Пинти М. и др. Содержание ДНК ВИЧ в различных субпопуляциях CD4 + Т-клеток коррелирует с соотношением CD4 + клетки: CD8 + клетки или продолжительностью эффективного лечения.СПИД. 2017; 31: 1387–92.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 107.

    Laird GM, Bullen CK, Rosenbloom DIS, Martin AR, Hill AL, Durand CM, et al. Анализ ex vivo позволяет определить эффективные комбинации препаратов, обращающих латентный период ВИЧ-1. J Clin Invest. 2015; 125: 1901–12.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 108.

    Согаард О.С., Граверсен М.Э., Лет С., Олесен Р., Бринкманн С.Р., Ниссен С.К. и др.Депсипептид ромидепсин изменяет латентность ВИЧ-1 in vivo. PLoS Pathog. 2015; 11: e1005142.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 109.

    DeChristopher BA, Loy BA, Marsden MD, Schrier AJ, Zack JA, Wender PA. Созданные синтетически доступные аналоги бриостатина сильно индуцируют активацию латентных резервуаров ВИЧ in vitro. Nat Chem. 2012; 4: 705–10.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 110.

    Jiang G, Mendes EA, Kaiser P, Sankaran-Walters S, Tang Y, Weber MG и др. Реактивация латентного периода ВИЧ с помощью недавно модифицированного производного ингенола посредством передачи сигналов протеинкиназы Cδ-NF-κB. СПИД. 2014; 28: 1555–66.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 111.

    Descours B, Petitjean G, López-Zaragoza J-L, Bruel T, Raffel R, Psomas C и др. CD32a является маркером CD4 T-клеточного резервуара ВИЧ, несущего репликационно-компетентные провирусы.Природа. 2017; 543: 564–7.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 112.

    Саттентау QJ, Стивенсон М. Макрофаги и ВИЧ-1: нездоровое созвездие. Клеточный микроб-хозяин. 2016; 19: 304–10.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 113.

    Honeycutt JB, Thayer WO, Baker CE, Ribeiro RM, Lada SM, Cao Y, et al. Персистентность ВИЧ в тканевых макрофагах гуманизированных мышей, содержащих только миелоиды, во время антиретровирусной терапии. Nat Med. 2017; 23: 638–43.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 114.

    Арайнга М., Эдагва Б., Мосли Р.Л., Полуэктова Л.Ю., Горантла С., Гендельман Х.Э. Зрелый макрофаг является основным клеточным резервуаром ВИЧ-1 у гуманизированных мышей после лечения антиретровирусной терапией длительного действия. Ретровирология. 2017; 14:17.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 115.

    Jambo KC, Banda DH, Kankwatira AM, Sukumar N, Allain TJ, Heyderman RS и др. Маленькие альвеолярные макрофаги инфицированы преимущественно ВИЧ и проявляют нарушенную фагоцитарную функцию. Mucosal Immunol. 2014; 7: 1116–26.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 116.

    Bolton DL, McGinnis K, Finak G, Chattopadhyay P, Gottardo R, Roederer M. Комбинированный одноклеточный количественный анализ генов и белков хозяина и SIV ex vivo выявляет взаимодействия между хозяином и патогеном в отдельных клетках. PLoS Pathog. 2017; 13: e1006445.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 117.

    Puray-Chavez M, Tedbury PR, Huber AD, Ukah OB, Yapo V, Liu D, et al. Мультиплексная одноклеточная визуализация нуклеиновых кислот и белка во время ВИЧ-инфекции. Nat Commun. 2017; 8: 1882.

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • Вы проектируете для перевода?

    anton grachev / iStock / Getty

    Перекрестная публикация из «Designing for Translation» на DigitalGov

    Примечание редактора: многим из нас в сообществе ВИЧ необходимо охватить широкую аудиторию и общаться на нескольких языках.Читайте советы по адаптации вашего веб-контента на нескольких языках.

    Вам необходимо создать новый контент — возможно, веб-сайт или другой тип актива. Именно на этом этапе вам нужно определить, будет ли этот контент также использоваться для общения с аудиторией, основным языком которой не является английский.

    Знание о том, что этот контент будет создаваться на других языках, поможет вам сделать выбор, который поможет процессу перевода или транскреации, и обеспечит наличие в контенте элементов, необходимых для успешной адаптации для всех предполагаемых аудиторий.Давайте рассмотрим различные элементы содержания, перечисленные ниже.

    Выбор языка

    Планируйте заранее. О многоязычном предложении не следует думать позже, поскольку не все языки созданы равными. Если вы планируете перевод текста, это сэкономит вам время, деньги и избавит от множества головных болей.

    • Длина текста (также называемая набуханием текста) различается в зависимости от языка. Английский — лаконичный язык, но романтические языки, такие как испанский, португальский, французский, могут занимать на 15–20% больше места (более длинные слова и предложения).
    • Направление и специальные символы. Люди, чей язык написан справа налево (арабский, персидский, урду и т. Д.) Или вертикально в дополнение к письму справа налево (китайский, японский), также будут сканировать страницы таким образом.
    • Даты и числа. Уделите особое внимание датам и числам, поскольку в разных культурах используются разные обозначения, выберите стиль и придерживайтесь его, чтобы избежать путаницы. Вы можете просмотреть Руководство по стилю USAGov «Даты и время» и «Цифровая информация» в качестве примера различий в обращении между английским и испанским стилями.
    • Разбирать голос и тон ; разные культуры могут иметь разные предпочтения.
    • Избегайте разговорной речи и любой другой терминологии, которая может быть незнакомой или иметь совершенно другое значение в других культурах. Это упростит процесс перевода и сократит количество ошибок и, возможно, затраты.
    • Используйте выделенные URL-адреса для каждого языка. Многие люди будут искать контент на своем родном языке; Используя международную конвенцию для URL-адресов, помогите вашим клиентам найти нужный контент на том языке, который они предпочитают. Вот несколько хороших примеров: IRS.gov, содержащий контент на пяти дополнительных языках (см. Раскрывающийся список языков в заголовке), и CDC en español. Кроме того, Консорциум World Wide Web (W3C) дает рекомендации по языковым тегам и интернационализации.

    Принципы простого языка

    Применение принципов простого языка не только поможет читателям понять текст с первого раза, но также поможет переводчикам избежать неясного смысла и проблем с переводом текста.PlainLanguage.gov содержит множество информации и примеров. Ниже приведены некоторые из наиболее часто применяемых принципов:

    • Используйте активные глаголы , они делают текст ясным и кратким.
    • Пишите короткие предложения — это тоже помогает с ясностью (рекомендуется одно предложение на идею).
    • Используйте интервал для разделения разделов / идей ; это помогает читать и понимать.
    • Постарайтесь внести ясность в инструкции — проверьте сами, сможете ли вы им следовать?
    • Избегайте жаргона и технических терминов — если вы должны использовать их, объясните их.
    • Избегайте сокращений — но, если требуется, произнесите их в первый раз по буквам (например, U.S. General Services Administration (GSA) ).
    • Избегайте синонимов и последовательно используйте терминологию для передачи одних и тех же понятий; это увеличивает ясность.
    • Это само собой разумеется, но перед отправкой текста на перевод вычитайте его . Убедитесь в отсутствии опечаток, двусмысленностей и неправильной пунктуации; это поможет переводчику избежать головной боли и избежать затрат на исправление ошибок в дальнейшем.

    Макет и изображения

    Независимо от того, разрабатываете ли вы печатные материалы или цифровой контент, оцените с самого начала, будут ли они предложены многоязычной аудитории, и спланируйте это.

    • Оставьте достаточно места для размещения текста в макете ; сначала подумайте о разработке для более длинных языков.
    • Учитывайте направление текста.
    • Используйте международные символы , они очень успешно передают сообщение независимо от языка или культурных ценностей.Подумайте о знаках в международных аэропортах; они являются отличным примером визуальных эффектов, которые может понять каждый.
    • Используя изображения, думайте о культуре — означает ли ваше изображение одно и то же, независимо от культуры? Изображения несут разное значение в зависимости от культурных ценностей. Возможно, будет целесообразно провести некоторое исследование пользователей, прежде чем вкладывать средства в дорогие изображения или графику, товарные знаки и т. Д.
    • Остерегайтесь автоматической расстановки переносов . Если вы используете текстовые редакторы или программное обеспечение для верстки, автоматическая расстановка переносов может стать кошмаром, поскольку правила расстановки переносов меняются в зависимости от языка.

    Разработка многоязычных предложений — непростая задача, но с некоторой подготовкой и предусмотрительностью она может пройти очень гладко и быть действительно успешной.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.