Лимфоциты 45: Что означает повышение лимфоцитов в крови информация от Врача-иммунолога

Содержание

Шкала оценки тяжести состояния для пациентов с COVID-19

Как рассчитать уровень тяжести состояния: каждый из 9 показателей (см. таблицу) нужно сравнить с порогом. Показатели делятся на 2 категории: для которых балл начисляется за превышение порога (АЧТВ, СРБ, Д-димер, глюкоза, мочевина и общие лейкоциты) и те, у которых балл начисляется за уменьшение ниже порога (гемоглобин, лимфоциты, общий белок). Далее начисленные баллы суммируются.

ПоказательПорогБалл
APTT (АЧТВ)> 42 sec4
CRP (С-реактивный белок)> 146 mg/L3
D-dimer (Д-димер)> 2149 mg/L4
Glucose (Глюкоза)> 9 mmol/L4
Hemoglobin (Гемоглобин)3
Lymphocytes (Лимфоциты)3
Total protein (Общий белок)6
Urea (Мочевина) > 11 mmol/L5
WBC (Общие лейкоциты)> 13,5*10^9/L4

Итого: максимум 36 баллов

Например, у пациента АЧТВ 45 сек, СРБ 180, Д-димер: 1000, глюкоза: 8, гемоглобин 110, лимфоциты: 0. 8, общий белок: 60, мочевина 10, общие лейкоциты: 15.

Как видно, критическое значение наблюдается у: АЧТВ (4 балла), СРБ (3 балла), гемоглобин (3 балла), общий белок (6 баллов), общие лейкоциты (4 балла). Таким образом суммарный балл составляет 4+3+3+6+4 = 20 баллов.

Далее суммарный балл можно сопоставить с рассчитанными диапазонами и вынести вердикт о градации риска.

Подробнее о методике расчета: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2021.02.09.21249859v3

Для удобства оценки предлагаем автоматический калькулятор.

Для корректного расчета необходимо заполнить все поля. Десятичные дроби необходимо вводить с точкой в качестве разделителя целой и дробной частей.

Важно!

В шкале не учитывается информация о сатурации кислородом! Даже низкий балл при дыхательной недостаточности (SpO2

Результаты шкалы не предназначены для самостоятельного применения пациентом и должны оцениваться ТОЛЬКО врачом-специалистом с учетом результатов комплексного клинико-лабораторного обследования.

Страница не найдена |

Страница не найдена |

404. Страница не найдена

Архив за месяц

ПнВтСрЧтПтСбВс

3456789

24252627282930

31      

       

       

     12

       

     12

       

      1

3031     

     12

       

15161718192021

       

25262728293031

       

    123

45678910

       

     12

17181920212223

31      

2728293031  

       

      1

       

   1234

567891011

       

     12

       

891011121314

       

11121314151617

       

28293031   

       

   1234

       

     12

       

  12345

6789101112

       

567891011

12131415161718

19202122232425

       

3456789

17181920212223

24252627282930

       

  12345

13141516171819

20212223242526

2728293031  

       

15161718192021

22232425262728

2930     

       

Архивы

Фев

Мар

Апр

Май

Июн

Июл

Авг

Сен

Окт

Ноя

Дек

Метки

Настройки
для слабовидящих

Загадки иммунитета.

Почему болеть COVID-19 будут не все

Вирус, вызывающий COVID-19, легко передаётся от человека к человеку. Но иногда бывает и так: в семье один болеет, а другой, ухаживающий за ним,— нет. Почему некоторые не заражаются даже при тесном контакте с больным?

Ещё одна загадка: у многих после перенесённого COVID-19 не обнаруживаются защитные антитела. Формируется ли в таком случае у них иммунитет? И есть ли люди, устойчивые к этой инфекции?

Ответы на эти и другие вопросы даёт исследование группы сотрудников Национального медицинского исследовательского центра гематологии Минздрава РФ.

Их статья, только что вышедшая в журнале «Иммунитет» (Immunity), одном из самых авторитетных иммунологических журналов в мире, уже привлекла внимание зарубежных коллег. О своей работе рассказывает один из авторов статьи, к. б. н., завлабораторией трансплантационной иммунологии НМИЦ гематологии Минздрава Григорий Ефимов:

— Мы изучаем, в частности, Т-лимфоциты, которые играют важную роль в противовирусном иммунном ответе. Занявшись их исследованием при COVID-19, мы обнаружили ряд интересных фактов.

Например, выяснили, что Т-лимфоциты, узнающие этот вирус, могут встречаться не только у переболевших, но и у людей, которые никак с вирусом не контактировали. Отдельно мы изучали группу людей, которые были в тесном контакте с больными COVID-19, но не только не имели никаких симптомов заболевания, но и не выработали антител к этому вирусу. Выяснилось, что у многих из них есть Т-лимфоциты, которые узнают коронавирус и, вероятно, обеспечивают им защиту от него.

Здесь нужно объяснить, что система приобретённого иммунитета состоит из двух частей. Первая представлена антителами — это особые белковые молекулы (иммуноглобулины). Они вырабатываются организмом в ответ на атаку вирусов или бактерий и находятся в плазме крови. Такой иммунитет называют гуморальным, от латинского слова «гумор» — жидкость. И сегодня, когда говорят о COVID-19, в основном речь идёт именно о них. Наличие антител в крови используют для подтверждения диагноза. Также эти антитела формируются после вакцинации. Кроме того, сыворотку крови переболевших, содержащую большое количество защитных антител, можно использовать в лечении COVID-19.

Вторая часть приобретённого иммунитета — клеточная. Она представлена особыми клетками — лимфоцитами. Среди которых есть Т-лимфоциты (иногда их называют просто Т-клетки). Одни из Т-лимфоцитов, так называемые Т-киллеры, убивают заражённые вирусом клетки и тем самым препятствуют производству новых вирусных частиц. Другие Т-лимфоциты (их называют Т-хелперами) нужны иммунной системе для выработки противовирусных антител. Т-лимфоциты способны не просто справиться с инфекцией. Они хранят память о столкновении организма с вирусом очень долго, годами. Если вирус снова попадёт в организм человека, то именно благодаря иммунной памяти инфекция не разовьётся или будет протекать значительно легче.

Проводя исследование, мы оценивали количество антител и Т-клеток у 3 групп доноров. В первую вошли те, кто переболел COVID-19, во вторую и третью группы были включены только здоровые доноры, не болевшие коронавирусом.

У доноров из второй группы мы брали кровь весной 2020 г., когда пандемия уже была в разгаре. В качестве доноров из третьей группы выступили люди, сдавшие кровь в банк крови нашего Центра гематологии до 2019 г., т. е. тогда, когда мир ещё не столкнулся с COVID-19.

Результаты оказались любопытными. Во-первых, не у всех переболевших COVID-19 обнаруживаются антитела — у части выздоровевших иммунный ответ обеспечивается только за счёт Т-клеток. По всей видимости, их оказывается вполне достаточно для защиты организма.

Во-вторых, и это самое интересное, иногда Т-клеточный ответ на коронавирус наблюдается у людей, которые им не болели. Причём мы наблюдали Т-клеточный ответ у доноров из обеих групп. При этом здоровые доноры, которых мы набирали уже во время пандемии, в среднем имели более высокий уровень Т-клеточного ответа, чем те, кто сдавал кровь до 2019 г. Это, вероятно, связано с тем, что часть здоровых людей так или иначе контактировала с вирусом, не зная об этом.

Но вот как объяснить, что Т-лимфоциты были обнаружены и у тех, кто не мог иметь контакта с возбудителем COVID-19? Скорее всего, это результат так называемого перекрёстного иммунитета. Многие сезонные простудные заболевания, в частности ОРВИ, также вызываются вирусами из семейства коронавирусов. Вероятно, некоторые из них с точки зрения Т-лимфоцитов похожи на вирус, вызывающий COVID-19. Поэтому Т-клетки оказываются заранее готовы к борьбе с ним. Возможно, это делает обладателей перекрёстного иммунитета невосприимчивыми к COVID-19.

В-третьих, мы выяснили, какие именно участки коронавируса распознаются Т-лимфоцитами. Эти данные могут быть использованы для создания теста, оценивающего Т-клеточный иммунитет. Тест позволит понять, перенёс человек COVID-19 или нет, даже при отсутствии у него антител. Это важно, ведь мы знаем, что антитела после инфекции возникают не всегда, особенно у тех, у кого инфекция протекала легко или бессимптомно. Сегодня в таких случаях диагноз подтвердить нельзя.

Мы уже разработали такой тест. Пока пользуемся им в научных целях, но рассчитываем, что уже в начале 2021 г. он будет зарегистрирован и для клинического применения.

Читать подробнее.

Клинический анализ крови — лейкоцитарная формула « Клиническая лаборатория «НМЛ»

Норма содержания лейкоцитов в крови:


Лейкоциты, *10⁹/л

4,0-9,0

Нейтрофилы, % (10⁹/л)
Палочкоядерные
Сегментоядерные
Эозинофилы
Базофилы
Лимфоциты
Моноциты

 

1,0-6,0% (0,04-0,30 10⁹/л)
47,0-72,0% (2,0-5,5 10⁹/л)
0,5-5,0% (0,02-0,3 10⁹/л)
0-1,0% (0-0,065 10⁹/л)
19,0-37,0% (1,2-3,0 10⁹/л)
3,0-11,0% (0,09-0,6 10⁹/л)

Лейкоцитарная формула

Лейкоцитарная формула – процентное содержание разных форм лейкоцитов от общего их количества. При различных заболеваниях это отношение изменяется, что позволяет предположить причину заболевания.

Нейтрофилы

Больше всего среди лейкоцитов зрелых сегментоядерных нейтрофилов. Они активно перемещаются и фагоцитируют болезнетворные бактерии и мертвые тканевые клетки. Палочкоядерные нейтрофилы – незрелые молодые нейтрофилы, они в норме присутствуют только в костном мозге. Появление их в крови называется

сдвигом лейкоцитарной формулы влево и происходит при мобилизации иммунной системы в случае тяжелого инфекционного или воспалительного процесса, при отравлениях или кровопотере. Увеличение в крови количества старых нейтрофилов, а также увеличение количества сегментов ядер этих клеток более пяти называется сдвигом лейкоцитарной формулы вправо и возникает при хронических заболеваниях легких, анемиях, и у людей, живущих на территориях, загрязненных радиационными отходами.

Количество нейтрофилов повышается при:

  • Инфекциях дыхательных путей –ангина, бронхит, пневмония,, пищеварительного тракта,
  • Гнойные и травматические процессы,
  • Инфаркты внутренних органов,
  • Нарушения обмена веществ (диабет, уремия),
  • При прививках и применении иммуностимулирующих препаратов,
  • Рак.

Количество нейтрофилов уменьшается при:

  • Гриппе, кори, брюшном тифе, ветряной оспе, гепатите, бруцеллезе,
  • Заболеваниях крови – лейкоз, анемия,
  • Гиперфункции щитовидной железы,
  • Последствия радио- и химиотерапии,
  • Применение различных лекарственных препаратов.

Эозинофилы

Этот вид лейкоцитов принимает участие в формировании иммунитета, очищении организма от отравляющих веществ и паразитов. Количество эозинофилов повышается:

  • при развитии большинства видов аллергии,
  • при заболевании кишечными паразитами,
  • при инфекционных заболеваниях – туберкулез, скарлатина, венерические заболевания,
  • ревматические заболевания ,
  • Лимфомы, лейкозы,
  • Раковые заболевания.

Количество эозинофилов понижается:

  • При сепсисе и гнойных процессах,
  • При воспалительных процессах,
  • При отравлении тяжелыми металлами.

Лимфоциты

Вторая по численности группа лейкоцитов. Они обладают свойством превращаться в клетки других типов; очень важны в развитии иммунитета. Каждый тип лимфоцитов отвечает за иммунитет на определенном этапе.
Причины повышения количества лимфоцитов:

  • Острые респираторные заболевания,
  • Вирусные инфекции – вирусный гепатит, краснуха, мононуклеоз,
  • Токсоплазмоз,
  • Лимфолейкоз, лимфосаркома, лейкоз,
  • Отравления мышьяком, винцом и некоторыми другими веществами,
  • Применение лекарственных препаратов.

Причины понижения количества лимфоцитов:

  • Анемия
  • Туберкулез,
  • Красная волчанка, лимфогранулематоз,
  • Почечная недостаточность,
  • ВИЧ,
  • Радио – и химиотерапия.

Моноциты

Самые крупные из лейкоцитов, распознают чужеродные белки и передают эту информацию другим лейкоцитам. Переходят из крови в ткани и превращаются в макрофагов; активно очищают очаги воспаления от погибших клеток и бактерий.
Количество моноцитов повышается:

  • В восстановительном периоде после воспаления,
  • При ревматических заболеваниях — ревматоидный артрит, системная красная волчанка,
  • Инфекции, вызванные грибками, паразитами, вирусами и простейшими,
  • При туберкулезе, сифилисе, бруцеллезе, колите,
  • При лейкозе, лимфогранулематозе,
  • При отравлении фосфором, тетрахлорэтаном.

Количество моноцитов понижается:

  • После хирургических вмешательств,
  • После гнойных абсцессов и флегмон,
  • При апластической анемии,
  • При приеме стероидных препаратов.

Базофилы

Малочисленная и малоизученная группа лейкоцитов, в норме могут не присутствовать в крови. Принимают участие в иммунологических воспалительных процессах. Причины повышения количества базофилов в крови:

  • Пищевая и лекарственная аллергия,
  • Гемолитическая анемия,
  • Понижение количества гормонов щитовидной железы,
  • Нефроз,
  • Ветряная оспа,
  • Лечение гормональными препаратами.

Лимфома Ходжкина — MyPathologyReport.ca

Что такое лимфома Ходжкина?

Лимфома Ходжкина (ранее называвшаяся болезнью Ходжкина) — это тип рака, который начинается со специализированных иммунных клеток, называемых В-лимфоцитами. Лимфома Ходжкина может начаться в любом месте тела, где обычно находятся иммунные клетки, но обычно начинается в лимфатический узел в шее, груди или под мышками.

Иммунная система

Ваша иммунная система состоит из множества различных типов клеток, каждая из которых играет важную роль в защите вашего тела от инфекций и помогает вам вылечиться после травмы. В отличие от других типов органов, ваша иммунная система распространяется по всему телу. Большинство иммунных клеток находится в небольших органах, называемых лимфатический узел. Лимфатические узлы расположены по всему телу. Большое количество иммунных клеток также можно найти в крови, коже, желудочно-кишечном тракте и костях. Нормальные В-лимфоциты — это маленькие клетки, которые помогают организму бороться с инфекциями.

Как патологоанатомы ставят этот диагноз?

Диагноз лимфомы Ходжкина может быть поставлен после того, как патолог исследует образец ткани под микроскопом. В отличие от нормальной ткани иммунной системы, лимфома Ходжкина состоит из аномальных В-лимфоцитов, называемых клетками Рида-Штернберга (или клетками HRS). Клетки Рида-Штернберга обычно легко распознать под микроскопом, потому что они намного больше нормальных лимфоцитов и ядро в центре клетки имеется две и более долей.

Количество клеток Рида-Штернберга используется для разделения лимфом Ходжкина на 2 основные группы:

  1. Классическая лимфома Ходжкина — В этой группе наблюдается много клеток Рида-Штернберга. Классическая лимфома Ходжкина обычно поражает только лимфатические узлы и редко распространяется на другие системы органов. Эта группа далее делится на несколько подтипов (см. Типы лимфомы Ходжкина ниже).
  2. Лимфома Ходжкина с преобладанием узелковых лимфоцитов — В этой группе лимфомы Ходжкина обнаруживается очень мало или совсем не наблюдается клеток Рида-Штернберга.

иммуногистохимия обычно выполняется в случаях лимфомы Ходжкина для подтверждения диагноза и исключения других заболеваний, которые имеют схожий вид под микроскопом.Этот тест позволяет патологам больше узнать о типах белков, производимых конкретными клетками. Клетки, производящие белок, называются положительными или реактивный. Клетки, не производящие белок, называются отрицательными или нереактивный.

Классическая лимфома Ходжкина обычно показывает следующие результаты иммуногистохимии:

  • CD45 — Отрицательно.
  • CD30 — Положительно.
  • CD15 — Положительно.
  • CD20 — Отрицательно.
  • PAX5 — Положительно.
  • CD68 — Положительно, но только в нормальных фоновых ячейках.
  • CD3 — Положительно, но только в нормальных фоновых ячейках.
Типы классического ходжкина лимфома

Классическая лимфома Ходжкина (ХЛ) — это группа рака, которая включает несколько различных лимфома подтипы. Ваш патолог определяет подтип, исследуя опухолевые клетки под микроскопом.

Подтипы классической лимфомы Ходжкина включают:

  • Узловой склероз (НСХЛ) — Это наиболее распространенный тип классической лимфомы Ходжкина. На его долю приходится 60–80% всех случаев. Обычно это происходит у людей в возрасте от 15 до 34 лет и старше 55 лет, но может возникать у людей любого возраста. Заболеваемость NSCHL примерно одинакова у мужчин и женщин. Опухолевые клетки в NSCHL растут в виде узлов, которые выглядят как большие группы раковых клеток, разделенных типом рубцовой ткани, называемой фиброз.
  • Смешанная клеточность (MCCHL) — Это второй по распространенности тип классической лимфомы Ходжкина. На его долю приходится 20-25% всех случаев. Количество пациентов с этим типом лимфома выше в некоторых частях мира за пределами Канады и США, включая Азию. Хотя он может возникать у людей в любом возрасте, он наиболее часто встречается у взрослых в возрасте от 55 до 74 лет, а также у детей в возрасте до 14 лет. MCCHL чаще встречается у мужчин, чем у женщин, причем около 70% пациентов составляют мужчины. . Опухолевые клетки в MCCHL различаются по форме и размеру, и обычно видны многие большие аномальные клетки Рида-Штернберга. В отличие от NSCHL, рубцовая ткань называется фиброз не наблюдается при этом типе лимфомы. Вирус под названием Вирус Эпштейна-Барра (EBV) иногда обнаруживается внутри опухолевых клеток. MCCHL — это агрессивный рак, однако прогноз для многих пациентов это хорошо.
  • Богатые лимфоцитами (LRCHL) — Этот тип классической лимфомы Ходжкина встречается гораздо реже, чем другие подтипы, и составляет примерно 5% всех случаев. Обычно это происходит в верхней половине тела и редко встречается более чем в нескольких лимфатический узел. Люди, затронутые этим типом лимфома обычно старше, чем при других типах классической лимфомы Ходжкина. LRCHL наблюдается у мужчин и женщин, хотя у мужчин он встречается примерно в два раза чаще.
  • Истощение лимфоцитов (LDCHL) — Этот тип классической лимфомы Ходжкина является наименее распространенным подтипом и составляет менее 1% всех случаев. Подобно MCCHL, вирус Эпштейна-Барра (EBV) часто обнаруживается внутри раковых клеток. LDCHL может поражать как мужчин, так и женщин, но чаще всего встречается у мужчин в возрасте от 30 до 71 года. В отличие от других форм классической лимфомы Ходжкина, LDCHL может начинаться в брюшной полости и костном мозге, хотя лимфатический узел любая часть тела также может быть задействована.
трансформация

В редких случаях лимфома Ходжкина может переходить в другой тип. лимфома. Этот тип изменения называется трансформацией. Когда происходит трансформация, это обычно от лимфомы Ходжкина с преобладанием узловых лимфоцитов (NLPHL) до лимфомы Ходжкина. Широкая диффузная В-клеточная лимфома (ДЛБКЛ).

Филип Берарди, доктор медицинских наук, FRCPC (обновлено 16 июля 2021 г.)

Диагностика T-клеточного звена (Т-регуляторные, CD25 активирован.Т-хелперы)

Общая характеристика

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации.
О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+).
При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни.
Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.
CD25 — активированные Т-лимфоциты, стимулирующие антителообразование и цитотоксичность.
Данный показатель отражает способность лимфоцитов к пролиферации и дифференцировке, характеризует функциональное состояние активированных Т-лимфоцитов. Количество этих клеток возрастает при гиперактивности иммунитета.
Снижение наблюдается при недостаточности клеточного звена иммунитета.
Pегуляторные Т- клетки играют существенную роль в поддержании иммунного гомеостаза.
Они могут подавлять активацию, пролиферацию и эффекторные функции широкого круга иммунокомпетентных клеток, включая CD4+ и CD8+ Т-клетки, натуральные киллерные (NK)- и натуральные киллерные Т (NKT)-клетки, В-клетки и антиген-презентирующие клетки.
В периферической крови комбинация CD4, CD25, CD127 выявляет группу Т-клеток с низкой или отсутствующие экспрессией CD127, которая обладает высокой супрессивной активностью и высокой экспрессией FOXP3. CD 127(IL-7) экспрессируется на тимоцитах, Т- и B-предшественниках, зрелых Т-клетках, моноцитах и некоторых других лимфоидных и миелоидных клетках. Он играет важную роль в пролиферации и дифференцировке зрелых Т-клеток.

Показания для назначения

Определение относительного содержания регуляторных Т-клеток может помочь в установлении причин паталогического состоянии, а также помогает мониторить эффективность лечения. Количество активированных Т-лимфоцитов возрастает при гиперактивности иммунитета. Снижение наблюдается при недостаточности клеточного звена иммунитета.

Маркер

Маркер нарушений Т-клеточного звена иммунитета

Клиническая значимость

Рецептор IL-2a на Т-клетках является маркером ранней активации. Используется для мониторнига течения иммунного ответа на равне с определением CD45RA-RO и маркера поздней активации HLA-DR.
Также важен для определения первичных Х-сцепленных комбинированных иммунодефицитов, специфического дефицита IL-2R (CD25), определения септического состояния.
Т-регуляторные клетки играют важную роль в иммуносупрессии.
Они регулируют Т-клеточный гомеостаз, предотвращают аутоиммунные заболевания, аллергию, гиперчувствительность, РТПХ, а также обеспечивают толерантность после трансплантации.
С другой стороны они снижают противоопухолевый иммунитет, могут снижать иммунитет к инфекциям.
Поэтому их изучают в таких областях как аутоиммунные заболевания, трансплантационная иммунология, противоопухолевый ответ, иммуногомеостаз.


Состав показателей:

Лимфоциты (CD45++CD14-) %
: Иммунотурбидиметрический
Диапазон измерений: 0-0
Единица измерения: %

Референтные значения:

Возраст

Комментарии

T-хелперы (CD45+CD3+CD4+CD8-)
: Иммунотурбидиметрический
Диапазон измерений: 0-0
Единица измерения: x10*9/л

Референтные значения:

Возраст

Комментарии

T-хелперы (CD45+CD3+CD4+CD8-) %
: Иммунотурбидиметрический
Диапазон измерений: 0-0
Единица измерения: %

Референтные значения:

Возраст

Комментарии

Активированные Т-хелперы (ранняя активация)(CD45+CD4+25+)
: Иммунотурбидиметрический
Диапазон измерений: 0-0
Единица измерения: %

Референтные значения:

Возраст

Комментарии

Регуляторные Т-клетки (CD45+CD4+CD25brightCD127neg)
: Иммунотурбидиметрический
Диапазон измерений: 0-0
Единица измерения: %

Референтные значения:

Возраст

Комментарии

Лимфоциты (CD45++CD14-)
: Иммунотурбидиметрический
Диапазон измерений: 0-0
Единица измерения: x10*9/л

Референтные значения:

Возраст

Комментарии

Выполнение возможно на биоматериалах:

Биологический материал

Условия доставки

Контейнер

Объем

цельная ВК/Na-He

Условия доставки:

24 час. при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия

Контейнер:

Вакутейнер с натрий-гепарином

Объем:

4 Миллилитров

Правила подготовки пациента

Стандартные условия подготовки (если иное не определено врачом): За 8 часов Выдержать голодание, исключить жирную пищу. Можно пить воду. За 2 часа допускается легкий прием нежирной пищи: детям до 5 лет и взрослым с противопоказаниями по голоданию. Непосредственно перед обследованием не курить. исключить физические нагрузки и стрессы. Согласовать с врачом применение глюкокортикоидных гормонов. Согласовать с врачом цитостатических препаратов. Согласовать с врачом иммуносупрессирующих и иммуностимулирующих препаратов (амиксин, тилорон и др.).

Вы можете добавить данное исследование в корзину на этой странице

Интерпретация:

  • Повышение — различные новообразования, лимфопролиферативные процессы, инфекционные заболевания.
    Повышение уровня CD25:
    • Гиперактивность иммунитета при аллергических и аутоиммунных заболеваниях.
    • Активация реакции отторжения трансплантата.
    • Иммунный ответ на тимусзависимые антигены.
    • Острый период первичной инфекции.
  • Снижение наблюдается при: • Аутоиммунной патологии (сахарный диабет 1-го типа, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, миастения). • Аллергические заболевания (бронхиальная астма, атопический дерматит, пищевая аллергия).
    Снижение уровня CD25:
    • Врожденные иммунодефициты.
    • Тяжелые вирусные инфекции.
    • ВИЧ-инфекция, вторичные иммунодефициты.
    • Злокачественные опухоли.
    • Тяжелые ожоги, обширные травмы.
    • Ионизирующее излучение.
    • Лечение цитостатиками, иммунодепрессантами.

Проточно-цитометрический анализ лимфоцитов периферической крови у больных хронической идиопатической нейтропенией взрослых

Проточно-цитометрический анализ лимфоцитов периферической крови проведен у 96 больных хронической идиопатической нейтропенией взрослых (ХИНА) и у 36 здоровых добровольцев того же пола и возраста (контроль) с использованием панели моноклональных антител. Пациенты были произвольно разделены на группу А (68 пациентов с количеством нейтрофилов 2500-1500/мкл) и группу В (28 пациентов с количеством нейтрофилов ниже 1500/мкл).Мы обнаружили, что у пациентов с CINA было меньшее количество лимфоцитов периферической крови по сравнению с контрольной группой, что коррелировало с количеством циркулирующих нейтрофилов. Это снижение было связано, главным образом, с уменьшением количества Т-лимфоцитов и, в меньшей степени, со снижением числа NK-клеток. И CD4+, и CD8+ Т-клетки уменьшились, так что соотношение CD4+/CD8+ осталось в пределах нормы. При этом снижение Т-лимфоцитов было обусловлено в основном уменьшением субпопуляций CD45RO+ Т-клеток (CD4+/CD45RO+ и CD8+/CD45RO+), в то время как CD45RA+ Т-лимфоциты не изменились.Выявлена ​​высокодостоверная положительная корреляция между количеством CD45RO+ Т-клеток и количеством циркулирующих нейтрофилов. Все эти изменения были более выражены у пациентов группы В, чем у пациентов группы А. Было обнаружено, что NK-клетки значительно снижены у пациентов группы В, но не у пациентов группы А. Количество как CD16+, так и CD56+ клеток коррелирует с числом циркулирующих нейтрофилов. У пациентов группы В также было низкое количество клеток CD57+, вероятно, из-за снижения количества Т-клеток и NK-клеток.В-клетки существенно не изменились. Значимых изменений не было обнаружено и в количестве лимфоцитов, несущих связанные с активацией маркеры клеточной поверхности. Мы пришли к выводу, что уменьшение количества лимфоцитов у пациентов с CINA происходит главным образом за счет уменьшения количества клеток CD45RO+, и мы предположили, что наиболее вероятным объяснением этой аномалии является повышенная экстравазация этих клеток, которые переходят в ткани после ускоренной адгезии к эндотелиальным клеткам. Эта гипотеза и ее связь с лежащей в основе нейтропенией у пациентов с CINA еще предстоит уточнить.

%PDF-1.5 % 5 0 объект >>>/BBox[0 0 595,44 841,68]/длина 115>>поток Икс% @:Ll+gt_- ґǙ%_LtGբK6y:㧰sE>MGWzF\E конечный поток эндообъект 4 0 объект >>>/BBox[0 0 595,44 841,68]/длина 115>>поток Икс% @:Ll+gt_- ґǙ%_LtGբK6y:㧰sE>MGWzF\E конечный поток эндообъект 3 0 объект >>>/BBox[0 0 595,44 841,68]/длина 115>>поток Икс% @:Ll+gt_- ґǙ%_LtGբK6y:㧰sE>MGWzF\E конечный поток эндообъект 1 0 объект >>>/BBox[0 0 595,44 841. 68]/длина 115>>поток Икс% @:Ll+gt_- ґǙ%_LtGբK6y:㧰sE>MGWzF\E конечный поток эндообъект 6 0 объект >>>/BBox[0 0 595,44 841,68]/длина 115>>поток Икс% @:Ll+gt_- ґǙ%_LtGբK6y:㧰sE>MGWzF\E конечный поток эндообъект 7 0 объект >>>/BBox[0 0 595,44 841,68]/длина 115>>поток Икс% @:Ll+gt_- ґǙ%_LtGբK6y:㧰sE>MGWzF\E конечный поток эндообъект 9 0 объект >поток ; изменено с использованием iText 4.2.0 автором 1T3XT2022-01-21T10:30:23-08:00

  • конечный поток эндообъект 10 0 объект >поток x+

    Клиническое значение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов при раке молочной железы

    Предыстория

    Инфильтрация иммунными клетками, особенно инфильтрация противоопухолевыми лимфоцитами типа 1, предсказала улучшение прогноза при многих различных типах опухолей, включая толстую кишку, яичники, легкие и грудь рак [1–4]. Исторически рак груди не считался иммунологически активным, особенно по сравнению с такими опухолями, как меланома. Однако недавно появились доказательства того, что опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TIL), присутствующие при раке молочной железы до лечения, могут предсказывать ответ на терапию и улучшать прогноз [4, 5].

    Не только количество лимфоцитарной инфильтрации, но и фенотип этой инфильтрации определяют клинический исход. Т-клетки типа 1 связаны с благоприятным прогнозом.CD4 + Т-хелперы 1 (Th2) облегчают презентацию антигена за счет секреции цитокинов и активации антигенпрезентирующих клеток. CD8 + цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) необходимы для разрушения опухоли [6]. С другой стороны, тип 2 CD4 + Т-хелперные клетки (Th3), включая регуляторные Т-клетки Forkhead box P3 (FOXP3) CD4 + , ингибируют функцию ЦТЛ, поддерживают пролиферацию В-лимфоцитов и могут способствовать противовоспалительный иммунный ответ, который может усиливать рост опухоли [7].

    Уровни лимфоцитов при раке молочной железы и прогноз

    Адаптивный иммунный ответ на рак молочной железы можно наблюдать в инфильтративных поражениях молочной железы уже при доброкачественной атипии молочной железы и увеличении плотности по мере развития инвазивного злокачественного новообразования. В одном ретроспективном исследовании 53 образцов мастэктомии повышенный B-клеточный и Т-клеточный иммунный инфильтрат был выявлен при доброкачественной протоковой гиперплазии, увеличен при протоковой карциноме in situ (DCIS) и был обнаружен в наибольшей степени при инвазивном раке молочной железы. 8].В исследовании 27 пациентов с DCIS все опухоли демонстрировали некоторый уровень TIL, а 78 % DCIS имели > 5 % инфильтрата. Высокая лимфоцитарная инфильтрация была связана с молодым возрастом и тройным негативным (TN) DCIS, сходным с инвазивным раком, при этом все TN DCIS ( p  = 0,0008) имели запрограммированную экспрессию лиганда смерти 1 (PD-L1) [9]. Также было показано, что фенотип Т-клеточного ответа предсказывает прогноз DCIS. В исследовании 62 образцов DCIS инфильтрат FOXP3 + превышал среднее прогнозируемое снижение безрецидивной выживаемости (RFS) (HR 2.8; 95% ДИ 0,99–7,99, p  = 0,05) [10]. И наоборот, повышенная экспрессия сигнатуры гена Th2 предсказывала улучшение выживаемости у 31 пациента с DCIS [11]. Опухолевой лимфоцитарный инфильтрат может быть разработан для использования для стратификации риска рецидива и потребности в агрессивной терапии при DCIS, а иммунная терапия может обеспечить хорошо переносимые подходы для изучения улучшенного лечения DCIS [12].

    При инвазивном раке молочной железы наибольшая клиническая польза наблюдается при опухолях с лимфоцитарным инфильтратом > 50 % (рак молочной железы с преобладанием лимфоцитов (LPBC)).У пациентов с местнораспространенным раком молочной железы, получавших неоадъювантную химиотерапию, пациенты с LPBC имели 40 % патологический полный ответ (pCR) (OR 1,38, p  = 0,012 95 % CI 1,08–1,78) по сравнению с 7 % pCR у пациентов с опухоли без лимфоцитарной инфильтрации [4]. Также было показано, что увеличение CD8 + Т-клеток предсказывает улучшение клинического исхода, при этом более высокий внутриопухолевый инфильтрат CD8 + Т-клеток связан с улучшением выживаемости при раке молочной железы (HR 0.55 95% ДИ, от 0,39 до 0,78 p  = 0,001) в одном крупном исследовании с участием 1334 пациентов [13]. Это не было воспроизведено в других клинических исследованиях [14-16]. Инфильтрация клеток TBET + (транскрипционный фактор T-box TBX21, маркер Т-клеток типа 1) также может предсказывать улучшение выживаемости без признаков заболевания (DFS) при всех подтипах рака молочной железы у пациентов с раком молочной железы с опухолями, содержащими  < 30 TBET . + клеток со сниженной БСВ по сравнению с пациентами с опухолями, содержащими ≥30 TBET + клеток (RR 5.62 95 % ДИ 1,48–50,19 p  = 0,0027 n  = 617) [17]. С другой стороны, наличие маркера Th3 FOXP3 + в опухоли связано с худшим прогнозом. При оценке более 200 случаев рака молочной железы у пациентов с опухолями, содержащими более 15 клеток FOXP3 + , была снижена RFS ( p  = 0,04 HR 1,58, 95% ДИ от 1,01 до 2,47) и общая выживаемость (OS) ( p = 0,07, ОР 1,62, 95 % ДИ от 0,96 до 2,74) [10]. Даже при одновременном изучении всех подтипов рака молочной железы состав и величина иммунного инфильтрата опухоли влияют на клинический исход и демонстрируют, что рак молочной железы является иммуногенной опухолью.Однако влияние TIL на клинический исход наиболее очевидно, когда подтипы рака молочной железы оцениваются отдельно.

    При HER2 + и TN раке молочной железы даже постепенное увеличение TIL как в опухоли, так и вокруг нее предсказывает как ответ на химиотерапию, так и улучшение выживаемости пациентов [5, 18–20]. Кроме того, LPBC чаще встречается как при TN, так и при HER2 + раках молочной железы, в среднем 20 % опухолей TN и 16 % опухолей HER2 + , имеющих LPBC (рис. 1а) [21]. Одно исследование 256 опухолей TN продемонстрировало, что каждые 10 % увеличения TIL коррелируют со снижением риска рецидива на 17 % ( p  = 0,023, HR 0,83; 95 % ДИ 0,71–0,98) и снижением риска смерти на 27 % ( p  = 0,035, ОР 0,73, 95 % ДИ 0,54–0,98) [5]. Аналогичным образом, на каждые 10 % увеличения стромального TIL наблюдалось увеличение общей выживаемости на 18 % (ОР 0,82, 95 % ДИ 0,69–0,96) у 112 пациентов с HER2 + раком молочной железы [20]. Как для рака молочной железы HER2 + , так и для TN, в то время как лучший ответ наблюдался при LPBC с самым высоким инфильтратом, даже небольшое увеличение TIL приводит к постепенному увеличению улучшенной выживаемости и может свидетельствовать о том, что даже терапия, которая умеренно увеличивает TIL, может принести пользу. клинический исход в этих подтипах.

    Рис. 1

    Большинство видов рака молочной железы имеют признаки лимфоцитарных инфильтратов на момент постановки диагноза, хотя уровень инфильтрата скромный, а наличие инфильтрата CD8 + варьируется в зависимости от подтипа рака молочной железы. % особей (ось x) показан для: a без признаков TIL ( белый ), TIL <50 % ( средне-серый ) и LBPC ( черный ) данных, собранных из 6 исследований. *Только в одном-двух исследованиях отдельно оценивали отсутствие инфильтрата. b Наличие инфильтрата CD8 + ( черный ) или отсутствие инфильтрата CD8 + ( белый ), данные собраны из 3 исследований

    И TN, и HER2 + Т-клеточный инфильтрат примерно с 60 % опухолей, содержащих CD8 + Т-клеток (рис. 1b) [21]. Было показано, что инфильтрат CD8 + предсказывает улучшение выживаемости только при TN раке молочной железы; улучшение выживаемости при раке молочной железы наблюдалось при любом внутриопухолевом инфильтрате CD8 + ( p  = 0.001, ЧСС 0,35; 95% ДИ от 0,23 до 0,54 n  = 927) (таблица 1) [15]. В то время как внутриопухолевые Т-клетки CD8 + не предсказывают улучшение клинического исхода при раке молочной железы HER2 + , опухолевой инфильтрат TBET + предсказывает улучшение RFS ( p  = 0,04 HR 4,76, 95 % ДИ от 1,07 до 20). Опухоли HER2 лечили трастузумабом [22]. Для рака молочной железы HER2 + влияние опухолевого инфильтрата CD8 + может потребовать оценки гормоноположительных опухолей HER2 + отдельно от гормонотрицательных опухолей HER2 + .Единственное исследование, которое стратифицировало HER2 + опухолей по гормоному рецептору статус, обнаружено, что инфильтрат опухоли CD8 + был связан с RFS ( P = 0,041) ( P = 0,064, HR 0,75% CI 0,51-1.11 N = 227) при раке молочной железы с отрицательным гормональным рецептором HER2 + , но не положительном по гормональному рецептору раке молочной железы HER2 + [15]. Эти данные свидетельствуют о том, что на иммунный инфильтрат при раке молочной железы HER2 + может больше влиять статус гормонального рецептора, чем гиперэкспрессия белка HER2.

    Влияние на исход опухолевого инфильтрата LPBC, CD8+ или FOXP3 в зависимости от подтипа

    По сравнению с подтипами TN или HER2 + , гормон-рецептор-положительные HER2-отрицательные (HR) опухоли имеют меньше TIL, а опухоли с LPBC не проявляются такое же улучшенное преимущество выживания. Только 6 % опухолей HR имеют LPBC и менее половины имеют CD8 + Т-клеточный инфильтрат (рис. 1) [21]. Уменьшение лимфоцитарного инфильтрата может быть связано с экспрессией рецептора эстрогена, который, как было показано, способствует созданию иммунной среды Th3 и снижает экспрессию MHC класса II в клетках рака молочной железы [23, 24].Тем не менее, HR рак молочной железы является единственным подтипом рака молочной железы, где инфильтрат FOXP3 + предсказывает худшую выживаемость [10, 21, 25]. В 148 HR + опухолей, увеличенные инфильтрат FOXP3 + , были связаны с уменьшенным RFS ( P = 0,006 HR 2,20 95% CI 1.26-3.85) и ОС ( P = 0,006, HR 2,57 95% CI 1.31 –5,60) [10]. Потенциально терапия, которая может эффективно уменьшить инфильтрат FOXP3 + , может увеличить величину лимфоцитарного инфильтрата в опухолях HR и может улучшить клинический ответ в условиях неоадъювантной терапии (таблица 2).

    Окрашивание биомаркеров с помощью ИГХ и прогноз при подтипах рака молочной железы

    Терапия ингибиторами контрольных точек иммунного ответа при раке молочной железы

    Экспрессия PD-L1 связана с увеличением TIL и лучшим прогнозом при раке молочной железы. В исследовании 45 первичных раков молочной железы 89 % PD-L1 + и 24 % PD-L1 имели умеренные или диффузные TIL. Кроме того, ни у одного из пациентов с раком молочной железы PD-L1 + на момент постановки диагноза не развился отдаленный рецидив, тогда как у 15 % пациентов с раком молочной железы PD-L1 на момент постановки диагноза не развился отдаленный рецидив [26].Инфильтрат PD-L1 был связан с TN раком молочной железы и инфильтратом CD8+ T-клеток (таблица 2) [27]. Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия PD-L1 является маркером иммунологически активного рака молочной железы. Хотя увеличение TIL также было связано с увеличением инфильтрата PD-L1, связь между увеличением TIL и реакцией на иммунную контрольную точку еще не установлена ​​[28, 29]. Ранние испытания моноклональных антител, специфичных к ингибиторам иммунных контрольных точек, показали лишь скромную клиническую эффективность при раке молочной железы.Ни у одной из пациенток с раком молочной железы, включенных в начальное исследование пембролизумаба (анти-PD-1), не было отмечено какого-либо ответа на лечение, а комбинация тремелимумаба (анти-CTLA4) и экземестана при HR метастатическом раке молочной железы продемонстрировала развитие стабильного заболевания как лучший ответ в 42 % пациентов [30, 31]. Несколько исследований показали умеренный клинический ответ при TN раке молочной железы на монотерапию пембролизумабом и ингибитором атезолизумаба (анти-PD-L1), включая некоторых полных респондентов. В исследовании Keynote 012, в котором сообщалось о 27 пациентах с PD-L1-положительным метастатическим TN раком молочной железы, получавших пембролизумаб в качестве монотерапии, общий уровень ответа составил 19 % с одним полным ответом и четырьмя частичными ответами, а также у 26 % пациентов со стабильным заболеванием [32]. .Аналогичные результаты были получены при использовании моноклональных антител против PD-L1. Исследование 21 пациентки с метастатическим TN раком молочной железы, получавшей монотерапию атезолизумабом, продемонстрировало общую частоту ответа 19 % с двумя полными ответами и двумя частичными ответами [33]. Ранние данные также показали, что сочетание химиотерапии и терапии ингибиторами контрольных точек может увеличить количество клинических ответов на терапию ингибиторами контрольных точек иммунного ответа при TN раке молочной железы. В исследовании 24 пациентов с метастатическим TN раком молочной железы комбинация ингибитора авелумаба (анти-PD-L1) и наб-паклитаксела показала частоту ответа 42 % (95 % ДИ 22.от 1 до 63,4 %), включая частоту полного ответа 4 %, частоту частичного ответа 67 % и стабилизацию заболевания у 21 % пациентов [34]. Эти данные обнадеживают, несмотря только на 12 месяцев наблюдения, что использование ингибиторов контрольных точек в сочетании с химиотерапией может увеличить число пациентов с раком молочной железы, которые реагируют на терапию ингибиторами иммунных контрольных точек, особенно при раке молочной железы TN.

    Число пациентов с подтипами рака молочной железы HER2 + и HR, которые реагируют на терапию ингибиторами контрольных точек, намного ниже.В одном исследовании с участием 27 пациентов с HER2 + и 72 пациентов с HR, получавших терапию авелумабом, только 4 % пациентов с HER2 + и 3 % пациентов с HR продемонстрировали клинический ответ [35]. В одном исследовании 25 PD-L1-положительных пациентов с раком молочной железы с HR, получавших пембролизумаб, наблюдалась общая частота ответа 12 %, и это были только частичные ответы [36]. Новые иммунные контрольные точки, которые активируют иммунный ответ Т-клеток, а не блокируют ингибирование активности Т-клеток, включая OX40 (CD134), лиганд OX40 и 41BB (CD137), могут усиливать иммуноассоциированную противоопухолевую активность при раке молочной железы. .В доклинических моделях опухоли молочной железы у мышей лечение моноклональными антителами OX40 или 41BB было способно значительно снизить как рост опухоли, так и развитие метастазов [37–39]. Несколько клинических испытаний с использованием комбинированной терапии контрольных точек в настоящее время продолжаются.

    Повышение иммунитета посредством традиционной химиотерапии рака молочной железы и терапии моноклональными антителами

    Основной механизм действия терапии трастузумабом при раке молочной железы HER2 + может быть иммунологическим. Моноклональные антитела могут вызывать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ), которая приводит к активации NK Т-клеток, макрофагов и дендритных клеток. Активация клеток врожденной иммунной системы приводит к секреции цитокинов Th2, усилению процессинга антигенов и презентации эндогенных опухолевых антигенов Т-клеткам, вызывая адаптивный иммунный ответ [40, 41]. Кроме того, усиленный HER2-специфический иммунитет, связанный с терапией трастузумабом, был связан с улучшением клинического прогноза.В исследовании 87 пациентов с местнораспространенным раком молочной железы HER2, получавших трастузумаб, 94 % пациентов с высоким иммунитетом к HER2-специфичному гамма-интерферону (IFN-g) Th2 имели pCR по сравнению с 33 % пациентов, у которых не было pCR (90 030 pCR).  = 0,0002). В многофакторном анализе высокий HER2-специфический иммунный ответ Th2 предсказывал, разовьется ли у пациента pCR (ОШ 8,82 95% ДИ от 1,50 до 51,83 p  = 0,016) [42]. В исследовании адъювантной химиотерапии 95 пациентов с раком молочной железы HER2 высокий HER2-специфический иммунитет Th2 предсказывал улучшение RFS (HR 16. 9 95% ДИ от 3,9 до 71,4 p  < 0,001) [43]. Оба этих исследования показали, что трастузумаб был необходим для стимуляции усиленных Th2-HER2-специфических иммунных ответов, поскольку у пациентов, не получавших трастузумаб, развился высокий Th2-HER2-специфический иммунитет. Аналогичным образом, в исследовании FINHER, включавшем 209 пациентов с раком молочной железы HER2, только у пациентов, получавших трастузумаб, улучшалась отдаленная безрецидивная выживаемость с каждым 10 % увеличением TIL (HR 0,82, 95 % ДИ от 0,58 до 1,16, p  = 0,025 n  = 94) [19].Для рака молочной железы HER2 + иммунологическая функция трастузумаба по индукции иммунитета типа 1, по-видимому, важна для его терапевтической эффективности.

    Также было показано, что цитотоксическая химиотерапия усиливает Т-клеточный ответ 1 типа. Было показано, что некоторые химиотерапевтические агенты вызывают иммунное распознавание опухоли за счет индукции стрессовых белков, высвобождаемых во время гибели клеток. Например, доксорубицин индуцирует секрецию белка, называемого блоком группы высокой подвижности 1 (HMGB1), из умирающих раковых клеток, который связывается с толл-подобным рецептором (TLR) 4 на дендритных клетках, что приводит к секреции IFN-g, презентации антигена, и активация Т-клеток [44].Толл-подобные рецепторы представляют собой высококонсервативные рецепторы распознавания образов, которые активируют иммунное распознавание и усиливают представление патогенов адаптивной иммунной системе [45]. Этот результирующий адаптивный иммунный ответ может быть основным механизмом ответа на терапию доксорубицином, поскольку было показано, что генетический полиморфизм TLR-4, Asp299Gly, снижает связывание секреции HMGB1 и IFN-g на 50 % ( p  < 0,05) у анализы in vitro. При оценке 280 пациентов с раком молочной железы, получавших адъювантный доксорубицин, у 40 % пациентов, несущих полиморфизм TLR-4 Asp299Gly, развились метастазы в течение 5 лет по сравнению с 27 % пациентов без полиморфизма (RR 1. 53 95 % ДИ от 1,1 до 3,59 90 030 p 90 031  = 0,03) [44]. При сравнении экспрессии генов у 114 пациентов с раком молочной железы, получавших антрациклиновую химиотерапию, и 1062 пациентов с раком молочной железы, не получавших химиотерапию, антрациклиновая терапия усиливала иммунный ответ 1 типа и повышала CD8 + (ОР 0,72 95% ДИ от 0,59 до 0,82 р).  = 0,005) и экспрессия IFN-g (HR 0,56 95% ДИ от 0,56 до 0,89 p  = 0,016) была связана с улучшением pCR у пациентов, получавших антрациклин [46].Также было показано, что паклитаксел увеличивает инфильтрацию опухоли Т-клетками 1 типа за счет увеличения экспрессии цитокинов 1 типа и снижения Th3 CD4 + Т-клеток в опухоли [47, 48]. Было показано, что циклофосфамид снижает количество регуляторных Т-клеток Th3 без снижения циркулирующего иммунного ответа Th2 при низких дозах [49]. Было показано, что карбоплатин и цисплатин увеличивают экспрессию MHC класса 1 в опухоли, а также уменьшают внутриопухолевые супрессорные клетки миелоидного происхождения и регуляторные Т-клетки Th3 в опухоли [50]. Продолжаются исследования, чтобы определить наиболее эффективный способ дозирования или последовательности этих агентов для оптимизации их иммунологических эффектов.

    Новые варианты иммуномодуляции при лечении рака молочной железы

    Ранние клинические испытания метастатического рака молочной железы показали, что локальные методы лечения, включая облучение, криоаблацию и сигналы клеточного стресса, такие как агонисты TLR, индуцируют локальную деструкцию опухоли, а также увеличивают системный противоопухолевый иммунный ответ, демонстрируя клинический ответ в опухолях, удаленных от обрабатываемого поражения.Эти отдаленные ответы возникают из-за того, что локальное клеточное повреждение усиливает сигналы клеточного стресса и запускает высвобождение цитокинов 1-го типа, рекрутируя антигенпрезентирующие клетки в опухоль и улучшая антигенное представление опухолевых антигенов Т-клеткам, превращая опухоль в вакцину in situ [51, 52]. В исследовании 41 пациента с метастатической солидной опухолью, получавших лучевую терапию и одновременную адъювантную терапию гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором, 11 из 41 пациента (26,8 %, 95 % ДИ от 14,2 до 49. 9) имело 30 % уменьшение объема необлученных опухолей. У пяти из 11 ответивших пациенток был рак молочной железы [53]. Точно так же было показано, что криоаблация опухолей молочной железы увеличивает секрецию цитокинов 1 типа, что приводит к усиленной презентации опухолеспецифических антигенов Т-клеткам, вызывая опухолеспецифический Т-клеточный ответ [54, 55]. Криоаблация в настоящее время проходит клинические испытания наряду с ипилимумабом при раке молочной железы и показала как увеличение отношения эффекторных Т-клеток к регуляторным Т-клеткам, так и увеличение клональной экспансии Т-клеток в опухоли [56].Было показано, что агонист TLR7 имихимод вызывает частичный ответ у 20% (95% ДИ от 3 до 56%) из 10 пациентов с раком молочной железы с метастазами в кожу, которые обычно не реагируют на терапию [57]. Для опухолей с низким иммунным инфильтратом местная терапия может усилить системный Т-клеточный ответ против опухоли и, следовательно, усилить противоопухолевый иммунный ответ в областях заболевания, удаленных от терапии.

    Резюме PS6-45: Прогностическое значение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов и соотношения нейтрофилов и лимфоцитов у пациентов с раком молочной железы, получающих неоадъювантную химиотерапию

    Тезисы: Виртуальный симпозиум по раку молочной железы 2020 г. в Сан-Антонио; 8-11 декабря 2020 г.; San Antonio, Texas

    Abstract

    Введение и цели: Инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) и соотношение нейтрофилов к лимфоцитам (NLR) играют прогностическую роль при раке молочной железы на ранней стадии (BC).Данных о комбинированном действии обоих факторов нет. Нашей целью было оценить интегрированную клиническую значимость TIL и NLR у пациентов с ранним РМЖ, получавших неоадъювантную терапию. Материалы и методы: Ретроспективный одноцентровый анализ когорты больных ранним РМЖ, получавших неоадъювантную химиотерапию в период 2001-2010 гг. TIL до лечения (количество CD3 + -TIL) оценивали с использованием микроматрицы опухолевой ткани. NLR рассчитывали в течение одного месяца после постановки диагноза рака.TIL (логарифмическое преобразование) и NLR анализировали как непрерывные переменные. Анализ выживаемости проводили с использованием многомерных регрессионных моделей Кокса. Результаты: Всего был включен 121 пациент. Средний возраст: 56 лет. Стадия рака при постановке диагноза: 16% IIA, 28% IIB, 33% IIIA, 7% IIIB и 16% IIIC. Молекулярный подтип: 64 % положительных по гормональному рецептору (HR) (12 % HER2-положительных), 11 % HER2-положительных HR-отрицательных и 22 % трижды отрицательных. Патологоанатомический полный ответ (pCR): 16,5%. Медиана наблюдения: 12 лет.Анализ TIL до лечения был доступен у 71 пациента (59%), а NLR — у 101 (83%). Между обеими переменными не было корреляции (ро Спирмена: 0,03, р = 0,98). В однофакторном анализе NLR показал отрицательное прогностическое значение для общей выживаемости (ОВ) (ОР 1,23, 95% ДИ 1,11–1,36; p <0,001, С-индекс: 0,64 95% ДИ 0,52–0,77, р = 0,69). Эффект был противоположным для TIL (HR: 0,76 95% ДИ 0,61-0,95, p = 0,02; C-индекс: 0,69 95% ДИ 0,57-0,81, p = 0,69). Линейная аппроксимация была адекватной, и не было никаких подозрений в непропорциональности опасностей.В многофакторном анализе, включая или не включая стадирование рака после неоадъювантной терапии, NLR оставался независимой переменной (ОР 1,18, 95% ДИ 1,04–1,33; p = 0,01), и также наблюдалась статистическая тенденция для TIL (ОР 0,83, 95%). ДИ 0,65–1,07; р = 0,16). Учитывая ограниченный размер выборки, многофакторный анализ не предоставил четких доказательств аддитивного эффекта. Тем не менее, комбинированный анализ обоих параметров показал лучшее соответствие по отношению к двум переменным по отдельности (информационный критерий Акаике для комбинированной модели, для TIL и для NLR: 106, 133 и 214 соответственно). Заключение: Интегрированная характеристика TIL и NLR позволяет выявить различные прогностические подгруппы у пациентов с ранним РМЖ, получающих неоадъювантную химиотерапию. Будущая проверка этих результатов в больших многоцентровых когортах может позволить оптимизировать лечение с помощью новых стратегий, таких как иммунотерапия.

    Формат цитирования: Эсмеральда Гарсия-Торральба, Франсиско Айала де ла Пенья, Беатрис Альварес-Абриль, Пилар де ла Морена Баррио, Алехандра Иварс Рубио, Элиза Гарсия Гарре, Хема Марин Сафра, Альберто Кармона-Байонас, Елена Гарсия Мартинес.Прогностическое значение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов и соотношения нейтрофилов и лимфоцитов у больных раком молочной железы, получающих неоадъювантную химиотерапию [аннотация]. В: Материалы виртуального симпозиума по раку молочной железы в Сан-Антонио, 2020 г .; 2020 8-11 декабря; Сан-Антонио, Техас. Филадельфия (Пенсильвания): AACR; Cancer Res 2021;81(4 Suppl): номер реферата PS6-45.

    • © Американская ассоциация исследований рака, 2021 г.

    Границы | Дифференциальная реакция на повреждение ДНК популяций лимфоцитов периферической крови

    Введение

    Повреждение клеточной ДНК постоянно происходит в каждой клетке.Это может быть вызвано внешними факторами, такими как ионизирующее (ИК) или ультрафиолетовое (УФ) излучение, химические вещества, включая алкилирующие препараты, используемые в качестве противоопухолевой терапии, или эндогенными факторами, такими как репликативный и метаболический стресс, приводящий к накоплению активных форм кислорода. РОС) (1, 2). Хотя эти повреждения могут приводить как к одноцепочечным разрывам ДНК (SSB), так и к двухцепочечным разрывам (DSB), последние более важны с точки зрения выживания клеток и вероятности мутации. Важно отметить, что DSB ДНК также физиологически внедряются в гены Т-клеточного рецептора (TCR) и иммуноглобулина (Ig) во время рекомбинации V(D)J и рекомбинации переключения классов развивающихся лимфоцитов (3).Целостность клеток зависит от сложной системы восстановления, которая обеспечивает немедленное обнаружение и эффективное восстановление для защиты ДНК от любых сохраняющихся повреждений, известных как ответ на повреждение ДНК (DDR). В случае отказа этих механизмов последствиями являются апоптоз, старение или введение хромосомных разрывов и мутаций, потенциально ведущих к неопластической трансформации (4).

    В клетках млекопитающих DSB ДНК могут быть репарированы по крайней мере двумя основными путями: негомологичным соединением концов (NHEJ), которое действует на протяжении всего клеточного цикла, но в первую очередь необходимо в фазе G0/G1, и гомологичной рекомбинацией (HR ), который зависит от присутствия сестринской хроматиды в поздней фазе S/G2 (1). Кроме того, DSB репарируются альтернативными путями соединения концов (A-EJ), включая соединение концов, опосредованное микрогомологией (MHMEJ) и отжиг одиночных цепей (SSA) (5). При репарации, опосредованной NHEJ, Ku70 и Ku80 являются важными сенсорами свободных концов ДНК. Они связывают и стабилизируют ДНК, а также дополнительно рекрутируют каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs). Вместе они образуют активный холофермент серин/треонин ДНК-ПК, принадлежащий к семейству киназ, родственных фосфатидилинозитол-3-киназе (PIKK).Этот комплекс задействует эндонуклеазу ARTEMIS, которая обрабатывает модифицированные концы ДНК с выступающими концами, гетеродимер XRCC4/лигазы 4, белок XLF и PAXX для завершения процесса репарации (6). Генетические дефекты при NHEJ приводят к тяжелому комбинированному иммунодефициту с недостатком Т- и В-лимфоцитов, но также и к повышенной чувствительности клеток к радиации (RS-SCID) (7).

    Основным сенсором DSB ДНК является комплекс MRN, образованный MRE11, RAD50 и NBS1, который зацепляет свободные концы ДНК и активирует протеинкиназу ATM (мутация атаксии телеангиэктазии) (8). Кроме того, киназа ATR (атаксия, телеангиэктазия и связанная с Rad3) реагирует на одноцепочечные разрывы (SSB), включая повреждения, вызванные стрессом репликации (9). ATM и ATR играют центральную роль в регуляции контрольных точек клеточного цикла, выживании клеток и репарации ДНК (10). Вместе с DNA-PKcs они принадлежат к семейству PIKK и активируют специфичные для повреждения сигнальные каскады множества различных эффекторных белков посредством прямого фосфорилирования, таких как белки клеточного цикла CHK1 и CHK2. В то время как CHK1 является мишенью ATR, CHK2 преимущественно активируется ATM, что способствует остановке прогрессирования клеточного цикла в контрольных точках клеточного цикла G1-S и G2-M, чтобы обеспечить репарацию ДНК до репликации или митозов (2). ).Нерепарированное повреждение ДНК вызывает необратимую остановку клеточного цикла (старение) или апоптоз, который уравновешивается белком-супрессором опухоли р53 (11). Параллельно передача сигналов ATM / ATR усиливает репарацию ДНК за счет рекрутирования факторов репарации ДНК посредством модулированного фосфорилирования. В частности, гистоновый белок h3AX фосфорилируется по серину 139 (γh3AX) с помощью PIKK, таких как ATR, ATM и DNA-PKcs, в ответ на DSB ДНК (12). После эффективной репарации γh3AX дефосфорилируется по кинетике, связанной с эффективностью репарации ДНК (13, 14).

    Генетические дефекты в ATM приводят к атаксии-телеангиэктазии (АТ), проявляющейся комбинированным иммунодефицитом, нестабильностью генома с предрасположенностью к раку, выраженной чувствительностью клеток к ИК и дегенерацией мозжечка (15). Лица, страдающие врожденными дефектами репарации ДНК, включая AT, часто имеют лимфопению, преимущественно сниженное количество наивных Т-клеток и В-клеток и гипогаммаглобинемию (16). Чтобы обеспечить адекватное лечение этих пациентов и свести к минимуму диагностические и лечебные процедуры, повреждающие ДНК, ранняя диагностика и классификация этих заболеваний очень важны для пострадавших людей.Факторы DDR, фосфорилированные кинетически в ответ на повреждение ДНК, можно использовать в качестве биомаркеров для оценки способности ДНК к репарации (17–20).

    Дифференциальная выживаемость субпопуляций лимфоцитов в ответ на повреждение ДНК изучалась многими группами (21–25). В то время как NK-клетки более устойчивы к повреждению ДНК, чем Т-лимфоциты, В-клетки, по-видимому, являются наиболее чувствительной популяцией лимфоцитов. Сообщалось о снижении DDR в покоящихся Т-клетках, которые активируют путь АТМ в ответ на DSB ДНК, но не могут образовывать фокусы γh3AX и подвергаются апоптозу в большей степени, чем пролиферирующие Т-клетки (26).

    В этом исследовании мы исследовали ATM-зависимую DDR с помощью масс-цитометрии с использованием γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 в качестве биомаркеров в субпопуляциях лимфоцитов периферической крови. Популяции Т-, В- и NK-клеток характеризовались 20 поверхностными маркерами, и способности DDR были стратифицированы по этим популяциям лимфоцитов. Мы наблюдали повышенное образование γh3AX в NK-клетках и снижение фосфорилирования h3AX в B-лимфоцитах, что обратно коррелировало с индукцией p53 и сообщало об ответах на выживание. Аналогичные результаты были получены для CD4 + и CD8 + наивных по сравнению с Т-клетками памяти.Кроме того, мы выяснили, что пролиферация и клеточный цикл влияли на интенсивность DDR, но не на дифференциальную способность DDR в субпопуляциях лимфоцитов.

    Материалы и методы

    Образцы, клеточные культуры и индукция повреждения ДНК

    Исследование пациентов было одобрено советами по этике Ульмского университета (407/16), Технического университета Дрездена (TUD) (BO-EK-213052020 ) и Ганноверской медицинской школы (9492-BO-K-2020), а пациенты и родители дали информированное согласие на это исследование.Образцы мононуклеарных лимфоцитов периферической крови (PBMC) анонимных доноров лейкоцитарной пленки использовали в качестве контроля. PBMC были выделены от 26 здоровых доноров и 3 пациентов с диагнозом AT с использованием Ficoll Paque Plus (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки замораживали в 50% фетальной телячьей сыворотке (FCS) (Biowhittacker и PAN Biotech), 40% среде RPMI 1640 (Gibco) и 10% ДМСО (Roth) и хранили в жидком азоте. 6/мл в 24-луночной культуральной чашке (CellStar ® , Greiner Bio-One) и инкубировали при 37°С. °C 5% CO 2 в течение 48–96 ч.6 клеток использовали для каждой временной точки и обрабатывали ионизирующим излучением 2 Гр или 100 мДж/м 2 УФС соответственно. Необработанный образец служил отрицательным контролем. В рамках одного эксперимента анализировали до 4 доноров.

    Жизнеспособность и окрашивание поверхности

    Клетки окрашивали маркером жизнеспособности цисплатином Cell ID™ (Fuidigm) и поверхностными маркерами перед фиксацией. Клетки осаждали (300 г, 5 мин) в 5 мл круглодонных пробирках (Folcon ® , Corning) и ресуспендировали в 800 мл 5 мкМ раствора цисплатина Cell ID, разведенного в PBS (Thermo Fisher Scientific).После инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин реакцию останавливали добавлением 4 мл буфера для окрашивания (PBS, 1% FCS, 2 мМ ЭДТА (Thermo Fisher Scientific). После центрифугирования супернатант полностью удаляли, а клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания, содержащего антитело. Использовали следующие поверхностные антитела в концентрациях 1 мкл/100 мкл окрашивающего буфера: мышиные антитела против CD45 человека (HI30)-154Sm (Fluidigm), антитела против CD3 человека (UCHT1)-170Er (Fluidigm), антитела против CD4 человека (SK3 )-174Yb (Fluidigm), античеловеческий CD8 (Sk1)-168Er (Fluidigm), античеловеческий CD45RA (HI100) 169Tm (Fluidigm), античеловеческий CD45RO (UCHL1) 164-Dy (Fluidigm), античеловеческий CD197 /CCR7 (G053H7) 159Tb (Fluidigm), античеловеческий CD69 (FN50) 144Nd (Fluidigm), античеловеческий CD56 (HCD56) 176Yb (Fluidigm), античеловеческий CD16 (3G8)-165Ho/Fluidigm, античеловеческий CD57 (HCD57) 163Dy (Fluidigm), античеловеческий CD19 (HIB19) 142Nd (Fluidigm), античеловеческий CD20 (2H7) 171Yb (Fluidigm), античеловеческий IgD (IA6-2) 146Nd (Fluidigm), античеловеческий IgM (MHM-88) 172Yb (Fluidigm ), античеловеческий IgG каппа (MHK-49) 160Gd (Fluidigm), античеловеческий IgG лямбда (MHL-38) 151Eu (Fluidigm), античеловеческий CD27 (L128) 158Gd (Fluidigm), античеловеческий CD38 (HIT2 ) 167Er (Fluidigm), античеловеческий CD21 (BL-13) 152Sm (Fluidigm). РВМС инкубировали в смесях антител в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем один раз промывали окрашивающим буфером из расчета 2 мл на пробирку.

    Фиксация и пермеабилизация

    Клетки фиксировали в 5 мл круглодонных пробирках через 1 час, 4 часа, 8 часов и 24 часа после индукции повреждения ДНК с использованием раствора А Fix&Perm (Thermo Fisher Scientific), разбавленного 1:1 PBS. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин к каждому образцу добавляли 2 мл охлажденного метанола. Образцы хранили при температуре -20°C в течение по крайней мере от 10 минут до 1 недели.

    Штрих-кодирование и внутриядерное окрашивание

    Все образцы были штрих-кодированы с использованием набора Cell-ID™ 20-Plex PdBarcoding Kit (Fluidigm).После удаления метанола и двух промывок буфером для окрашивания клетки инкубировали с 10 мкл штрих-кода Pd 1-20 в 100 мкл буфера для окрашивания в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы дважды промывали 2 мл буфера для окрашивания и все 5 временных точек (без облучения, 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа) каждого донора объединяли в один образец. Затем клетки окрашивали в 50 мкл буфера для окрашивания, дополненного внутриядерными антителами к p-гистону h3A.X (Ser139) (JBW301) 147Sm (Fluidigm) (2 мкл/100 мкл), к p53 человека (DO-7) 150Nd (Fluidigm) ( 3 мкл/100 мкл), анти-ki-67 (B56) 162Dy (Fluidigm) (1 мкл/образец), антитело к фосфо-CHK2 (Thr68) (12-9508-42) (Thermo Fisher Scientific) (5 мкл/100 мкл) и очищенный люминофор против ATM (Ser1981) (Biolegend) (2 мкл/100 мкл) при комнатной температуре в течение 1 часа.Антитело p-ATM метили 141Pr с использованием набора для мечения несколькими металлами Maxpar ® (Fluidigm) в соответствии с инструкциями производителя. Антитело p-CHK2 PE выявляли с использованием готовых к использованию maxpar очищенных антител против фикоэритрина (PE) (Biolegend), меченных 161Dy. После инкубации с упомянутыми выше внутриядерными антителами клетки дважды промывали и окрашивали в 50 мкл буфера для окрашивания, дополненного вторичным антителом против PE 161Dy (3 мкл/100 мкл), и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После двух промывок клетки фиксировали в 3 мл/образец 1,6% формальдегида (Pierce™ 16% формальдегида без метанола, Thermo Fisher Scientific), разбавленного в PBS, и инкубировали при 4°C в течение ночи.

    Получение образца

    На следующий день клетки метили интеркалятором Cell-ID™ Ir (Fluidigm) путем инкубации в 250 нМ растворе иридия, разведенном в PBS (3 мл/образец) при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания PBS и деионизированной водой клетки ресуспендировали в деионизированной воде, подсчитывали и процеживали через 35-микронный нейлоновый сетчатый фильтр (Falcon ® , Corning).10 6 клеток/1 мл суспензии до конечной концентрации 50 мкМ за 30 минут до начала окрашивания жизнеспособности. IdU встраивается в ДНК реплицирующихся клеток и может считываться в йодном канале цитометра Helios. Для дифференцировки клеток в фазах клеточного цикла G0 и G1 в смесь для внутриклеточного окрашивания был включен маркер пролиферации ki67.

    Гейтирование и анализ данных

    Файлы данных были проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo™ v10 и Cytobank Premium. Стратегии гейтирования показаны на дополнительной фигуре 1. Живые клетки были определены как цисплатин , низкий , и различение отдельных клеток было выполнено с использованием 191Ir и 193Ir. Мы определили следующие популяции CD45 + лимфоцитов: CD3 + , CD3 + CD4 + , Naive CD4 + (CD3 + CD4 + CD45RA + CCR7 + ), Центральная память CD4 + (CD3 + CD4 + CD45RO + CD45RO + CCR7 + ), эффекторная память CD4 + (CD3 + CD4 + CD45RO + CCR7 ), CD3 + CD8 + , Naïve CD8 + (CD3 + CD8 + CD45RA + CCR7 + ), Центральная память CD8 + (CD3 + CD8 + CD45RO + CCR7 + ), эффекторной памяти CD8 + (CD3 + CD8RO + CD45RO + CCR7 ), CD3 CD56 Высокий CD16 , CD3 CD56 высокий CD16 + , CD3 CD56 тусклый CD 16 + , CD56 яркие CD16 + и CD56 + и CD56 + CD56 + CD16 + были дополнительно проанализированы как CD57 , CD57 , CD3 CD19 + / CD20 + , naïve b (CD3 CD19 + CD20 + CD27 CD27 IGD + ), Память B (CD3 CD2019 + CD20 + CD27 + ), Unnwitched Memory B ( CD19 + CD27 + CD27 + CD27 + IgM + ), класс коммутации памяти B IgGκ (CD19 + CD20 + CD27 + IGM IgGκ + ), класс коммутации B Iggλ (CD19 + CD20 + CD27 + Ig27 + IgM IgGλ ), маргинальная зона (MZ)-подобный B (CD19 + CD20 + CD27 + IGM + IGD +), переходный В (CD19 + CD20 + IgM ++ CD38 ++), Ig M только B (CD19 + CD20 + CD27 + CDM + IGM + IGD ), ATYPICAL MEMORY B (CD19 + CD20 + CD27 IGM IGD ) Неразрешенные плазмабласты (CD19 + CD20 CD27 + CD27 + CD27 + IgM + ), класс коммутации плазмабластов (CD19 + CD20 CD27 + CD27 + IGM ) и CD21 низкий CD38 низкий B (CD19 + CD20 + CD21 низкий CD38 низкий ) (27). Средние геометрические интенсивности флуоресценции (MFI) γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали для каждой подгруппы лимфоцитов. Кроме того, клеточный цикл анализировали путем различения клеток ki67 + IdU + (фаза S), клеток ki67 + IdU (фаза G1) и клеток ki67 IdU (фаза G0). Далее была проанализирована экспрессия внутриядерного маркера во всех фазах клеточного цикла всех популяций.

    Premium Cytobank использовался для создания графиков t-SNE (встраивание соседей с t-распределением) с применением тех же ворот, что и для статистического анализа.Интенсивности ядерных маркеров (Z-канал) показаны для всех живых/одиночных/CD45 + клеток. Распределение популяций лимфоцитов показано на ключевых рисунках.

    Статистический анализ

    Для сравнения MFI маркеров DDR, полученных в отдельных экспериментах, была рассчитана кратность индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 путем нормализации MFI необработанных образцов. Следует отметить, что необработанные образцы и все временные точки обработанных образцов от одного донора объединяли и окрашивали в одной пробирке.

    Статистический анализ и построение графиков выполнялись с использованием программного обеспечения Graph pad prism v9. Статистическая значимость экспрессии маркера DDR, рассчитанная с помощью MFI между различными подмножествами лимфоцитов, была рассчитана с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Турции. Параллельное сравнение образцов, обработанных ИЛ-2 и без него, а также образцов ki67 + и ki67 , было проанализировано с использованием теста Шидака. Количество клеток в обработанных IL-2 образцах различных популяций сравнивали с необработанными образцами с использованием Т-критерия Стьюдента.Значения P ≤0,05 считались значимыми (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    Результаты

    Реакция ДНК на повреждение ионизирующей радиации различается среди Т-, В- и NK-лимфоцитов

    Замороженные РВМС 26 здоровых доноров размораживали и культивировали в среде RPMI и 100 ЕД/мл ИЛ-2 в течение 4 дней для выделения из ДНК повреждать. После низкой дозы ионизирующего излучения (ИК) 2 Гр клетки фиксировали через 1 час, 4 часа, 8 часов и 24 часа. Маркеры DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 оценивали в субпопуляциях Т-, В- и NK-лимфоцитов с помощью масс-цитометрии.Все временные точки, полученные от одного человека, объединяли для окрашивания всеми внутриядерными маркерами в одной пробирке. Чтобы сравнить результаты разных людей и экспериментов, кратность индукции маркеров DDR была рассчитана на основе необработанных образцов. В то время как индукция γh3AX, p-ATM и p-CHK2 могла наблюдаться на ранних стадиях и снижалась со временем после восстановления повреждения ДНК, пик p53 достигался через 8 часов после ИР.

    По сравнению с CD3 + Т-клетками, CD3 CD56 dim CD16 + NK-клетки показали значительно повышенную индукцию γh3AX через 1 час, 4 часа и 8 часов после ИР, тогда как значительно более низкий уровень γh3AX был обнаружен в CD3 9001 CD19 + CD20 + В-клетки (рис. 1).Это коррелировало со слегка повышенным ответом р-АТМ в NK-клетках, который не различался между Т- и В-лимфоцитами, и снижением индукции р53 в CD3 CD56 dim CD16 + NK-клетках через 8 ч после ИР. Интересно, что ответ p-CHK2 наблюдался преимущественно в В-клетках и в гораздо меньшей степени в NK- и Т-лимфоцитах.

    Рисунок 1 Реакция повреждения ДНК на ионизирующее излучение различается у Т-, В- и NK-лимфоцитов. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от 26 здоровых доноров облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени.Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR анализировали методом масс-цитометрии. Индукция γh3AX (A) , p-ATM (B) , p-CHK2 (C) и p53 (D) были рассчитаны в лимфоцитах CD45 + , CD45 + Т-клетки, CD45 + CD56 тусклый CD16 + NK-клетки и CD45 + CD19 + CD20 + В-клетки на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной по необлученным образцам. Столбцы представляют средние значения; планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения. Показана значимость для NK- и В-лимфоцитов по сравнению с Т-клетками (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    Жизнеспособность субпопуляций лимфоцитов в ответ на ИК изучали по окрашиванию цисплатином Cell-ID™. Доли Т-, NK- и В-лимфоцитов рассчитывали как процент от жизнеспособной (цисплатин ) CD45 + популяции лимфоцитов до и через 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа после ИР.В то время как доля необлученных В-клеток значительно снизилась через 24 часа после ИР (в среднем с 8,1% до 4,5%), процент компенсаторных Т-клеток увеличился (в среднем с 75,5% до 77,2%), а доля NK-клеток не изменилась (в среднем с 7,0% до 77,2%). 7,2%) (рис. 2А). Эти результаты указывают на более низкую выживаемость В-лимфоцитов в ответ на ионизирующее излучение по сравнению с популяциями Т- и NK-клеток.

    Рисунок 2 Подмножества лимфоцитов демонстрируют различные показатели выживаемости при воздействии ионизирующего излучения. РВМС, полученные от 26 здоровых доноров, облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Подсчет жизнеспособных (цисплатин ) Т-, NK- и В-лимфоцитов (A) , наивных и клеток памяти CD4 + и CD8 + подмножеств Т-клеток (B) , CD56 CD 80018 ярких 90 — , CD56 яркие CD16 + , CD56 тусклые CD16 + подмножества NK-клеток (C) , а также наивные популяции и популяции B-клеток памяти (D) сравнивали после облучения в каждой точке в каждый момент времени.Статистическая значимость была рассчитана для каждой популяции лимфоцитов с использованием теста множественных сравнений Турции и показана для необлученных лимфоцитов против лимфоцитов через 24 часа после облучения (ns, не значимо, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, **** р ≤ 0,0001).

    Наши результаты демонстрируют дифференциальную DDR среди субпопуляций лимфоцитов, тогда как повышенные уровни γh3AX коррелируют со сниженным ответом p-CHK2 и p53. В В-лимфоцитах снижение DDR, отражаемое индукцией γh3AX, было связано со сниженной выживаемостью по сравнению с Т- и NK-лимфоцитами.

    DDR в подмножествах наивных лимфоцитов отличается от популяций зрелых клеток памяти

    DDR исследовали во всех подмножествах T-, B- и NK-лимфоцитов, включенных в эту панель. Наивные CD3 + CD4 + и CD3 + CD8 + Т-клетки реагировали на низкую дозу IR с более низкой индукцией γh3AX, но усиленным ответом p-ATM и p53 по сравнению с центральными и эффекторными клетками памяти (рис. 3A). Следует отметить, что аналогичные результаты были получены для CD4 + , а также CD8 + Т-клеток, и DDR был сильнее в центральных, чем в эффекторных Т-клетках памяти.Индукция p-CHK2 была лишь немного снижена в подмножествах памяти, хотя значительно для центральной памяти CD8 + . Экспрессия маркера активации CD69 не влияла на DDR (данные не показаны). В дополнение к DDR мы проанализировали жизнеспособность подмножеств наивных и памяти CD4 + и CD8 + Т-клеток, рассчитав их доли цисплатина CD45 + CD3 + Т-клеток и их изменения во времени в ответ к ИК. Мы наблюдали значительное снижение числа наивных (в среднем 37.от 6% до 33,1%) и центральной памяти (в среднем от 10,5 до 7,8%) CD4 + Т-клеток через 24 часа после ИР и компенсаторного увеличения эффекторной памяти CD4 + клеток (рис. 2B). Наоборот, доля жизнеспособных наивных CD8 + Т-лимфоцитов увеличилась (в среднем с 36,0% до 39,5%) по отношению к затратам центральной памяти CD8 + .

    Рисунок 3. DDR в подмножествах наивных лимфоцитов отличается от зрелых популяций памяти. РВМС, полученные от 26 здоровых доноров, облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени.Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR оценивали методом масс-цитометрии. Складчатость индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях лимфоцитов CD45 + на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной для необлученных образцов. Т-клеточные подмножества были охарактеризованы как CD3 + , CD3 + CD4 + , CD3 + CD8 + , CD45RA + CD45RA + CD45RA + (Naïve CD4 / CD8), CD45RO + CCR7 +/- (центральная и эффекторная память CD4/CD8) (А) . Ступы NK LymphoCyte были определены как CD3 CD56 CD56 , CD3 CD56 CD56 яркие CD16 + , CD3 CD56 Dim CD16 + (B) , которые были дополнительно стратифицированы по экспрессии CD57 на подмножествах CD56 яркая CD16 + и CD56 тусклая CD16 + . CD3 B Лимфоциты были охарактеризованы как CD19 + CD27 + , CD27 IGD + (Naïve B), CD27 + (Memory B), CD27 + IGM + (не подчеркивается Память б) CD27 + IgM IgGκκ + (класс коммутации памяти B IgGκ), CD27 + IgM IgGλ (коммутация коммутации класса B IgGλ), CD27 + IGM + IgM + IgM + IgD + (маргинальная зона (MZ)-подобный B), IgM ++ CD38 ++ (переходный B), CD27 + IgM + IgD (IgM) IgM IgD (атипичная память B), CD19 + CD20 CD27 CD27 + CDM + IGM + (Unswitched Plasmablasts), CD19 + CD20 CD27 + CD38 + IgM (плазмобласты с переключением классов) и CD21 низкий CD38 низкий B клетки. (C) Столбцы представляют средние значения индукции кратности; планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения. Значимость показана для наивных подмножеств Т- и В-клеток по сравнению с подмножествами памяти и от незрелых CD56 ярких CD16 до зрелых CD56 ярких CD16 + и CD56 тусклых CD16 + лимфоцитов (NK 0,05, **р ≤ 0,01, ***р ≤ 0,001, ****р ≤ 0,0001).

    Несмотря на то, что индукция γh3AX не отличалась между незрелыми CD56 Bright CD16 , CD56 Bright CD16 + и зрелыми CD56 dim CD16 + экспрессия клеток pNK-KATs + значительно увеличилось в популяциях CD56 Bright CD16 + и CD56 тусклого CD16 + по сравнению с CD56 Bright CD16 (рис. 3B).CD56 яркая CD16 NK-клетки в основном расположены во вторичных лимфоидных органах, где они созревают в CD56 тусклый CD16 + NK-клетки, наиболее многочисленную популяцию в периферической крови. В целом экспрессия всех маркеров DDR различалась у разных людей из-за вариабельного распределения трех проанализированных подмножеств NK-клеток. Экспрессия маркера старения CD57, который мы изучали на CD56 Bright CD16 + и CD56 dim CD16 + NK-клетках, не влияла на DDR.CD56 яркие CD16 клетки не экспрессировали CD57. Выживаемость субпопуляций NK-клеток CD56 Bright CD16 , CD56 Bright CD16 + и CD56 dim CD16 + NK-клеток не подвергалась воздействию ИК, так как их пропорции не изменились (рис.

    В то время как наивные В-лимфоциты характеризовались сниженным уровнем γh3AX по сравнению с В-клетками памяти, включая непереключаемые В-клетки памяти и В-клетки с переключением класса, В-клетки, содержащие только IgM, и плазмобласты с переключением класса, не было выявлено различий между другими маркерами DDR, исследованными на субпопуляциях В-клеток (Рисунок 3C). Анализ пропорциональных изменений количества клеток выявил значительное снижение наивных (в среднем от 52,3% до 47,5%) и непереключаемых В-клеток памяти (в среднем от 34,1% до 31,1%) через 24 часа после ИР (рис. 2D).

    Стимуляция ИЛ-2 не влияет на дифференциальную способность DDR в субпопуляциях лимфоцитов на ГДР. РВМС шести здоровых доноров культивировали либо без, либо в присутствии 100 ЕД/мл IL-2 в среде RPMI в течение 4 дней до IR низкой дозы (2 Гр).Сравнение пропорций подмножества лимфоцитов выявило значительное увеличение количества NK-клеток в ответ на IL-2, тогда как количество Т- и В-лимфоцитов не изменилось (дополнительные рисунки 2A, B, D). В популяции NK-клеток можно было наблюдать увеличение популяций CD56

    Bright CD16 -/+ , а доля клеток CD56 dim CD16 + была значительно увеличена в нестимулированных образцах (дополнительная фигура 2C).

    Стимуляция IL-2 приводила к более сильной связанной с ИР индукции γh3AX и p53 в субпопуляциях Т- и NK-клеток, тогда как уровень p-CHK2 был снижен по сравнению с необработанными клетками (рис. 4 и 5).Никаких различий не наблюдалось в отношении ответа p-ATM. Следует отметить, что различия в емкости DDR между наивными и подмножествами памяти можно было наблюдать независимо от уровня индукции γh3AX, p-CHK2 и p53. Как и ожидалось, ИЛ-2 не оказывал влияния на индукцию γh3AX в субпопуляциях В-клеток. Тем не менее, p-CHK2 и p53 усиливались в необработанных В-лимфоцитах, что коррелировало с профилем их клеточного цикла. Параллельное сравнение DDR в образцах, обработанных и необработанных IL-2, показало значительные различия в индукции γh3AX в подмножествах NK-клеток, но не в других популяциях (дополнительные рисунки 3–5).

    Рисунок 4 Стимуляция IL-2 не влияет на DDR в субпопуляциях лимфоцитов. РВМС здоровых доноров культивировали в среде RPMI без (без добавления) IL-2 (A) и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 (B) в течение 48 часов. Затем клетки облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Показаны графики tSNE, демонстрирующие уровень экспрессии маркеров DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 во всех проанализированных популяциях в указанные моменты времени. Масштабные полосы в правой части каждой панели показывают интенсивность маркеров DDR. Нижняя панель (A , B) , соответственно, представляет популяции лимфоцитов, которые кодируются цветом в легенде внизу. На этом рисунке показан один репрезентативный эксперимент одного донора из шести.

    Рисунок 5 Дифференциальный DDR в субпопуляциях лимфоцитов не зависит от стимуляции IL-2. РВМС 6 здоровых доноров культивировали в среде RPMI без и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 48 часов.Клетки облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) маркеров DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 показаны в субпопуляциях T-, NK- и B-лимфоцитов необлученных лимфоцитов и через 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа после IR с дозой 2 Гр (*p ≤ 0,05). , **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    В соответствии с результатами, полученными для образцов, обработанных ИЛ-2, ИР влияла на выживаемость В-лимфоцитов, тогда как доли других субпопуляций лимфоцитов существенно не менялись, за исключением наивных CD8 + T и CD56 dim CD16 + NK ячейки (дополнительные рисунки 6A – D).

    Для изучения влияния IL-2 на клеточный цикл в исследованных субпопуляциях лимфоцитов использовали маркер пролиферации ki67 и IdU. IdU добавляли к клеточным культурам за 30 мин до фиксации и включали в ДНК реплицирующихся клеток в S-фазе клеточного цикла. Ki67 различает клетки в фазах клеточного цикла G0 и G1. ИЛ-2 оказывал лишь незначительное влияние на субпопуляции Т-клеток, активируя до 40% клеток ki67 + в фазе G1 (рис. 6). Напротив, подмножества NK-клеток реплицировались в ответ на стимуляцию IL-2.В то время как до 60% CD56 Bright CD16 NK-клеток можно было обнаружить в S-фазе клеточного цикла, только до 33% CD56 dim CD16 + NK-клеток пролиферировали. Скорость репликации снижалась через 24 ч после ИК. Популяции В-лимфоцитов не пролиферировали в ответ на ИЛ-2, но переходили в G1 (ki67 + ) через 4-24 часа после ИР. Этот эффект можно было наблюдать в присутствии и в отсутствие ИЛ-2, хотя ИЛ-2 усиливал его. Известно, что рекомбинантный IL-2 может способствовать пролиферации В-клеток, опосредованной Tac, экспрессируемым как на активированных Т-, так и на В-лимфоцитах (28).Что движет активацией В-клеток в нашем анализе, необходимо выяснить в будущих исследованиях.

    Рисунок 6 Стимуляция IL-2 влияет на клеточный цикл субпопуляций лимфоцитов. РВМС шести здоровых доноров культивировали в среде RPMI без (без добавления) IL-2 и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 48 часов. Клетки облучали дозой 2 Гр и за 30 минут до фиксации в указанные моменты времени к культуре клеток добавляли IdU для включения в ДНК реплицирующихся клеток. Клеточный цикл оценивали с помощью масс-цитометрии с использованием ki67 и IdU, чтобы различать G0 (ki67 IdU ), G1 (ki67 + IdU ) и S (ki67 + IdU + 90). фазы.Столбцы представляют средние проценты фаз клеточного цикла G0 (серый), G1 (красный) и S (синий) в субпопуляциях T-, NK- и B-лимфоцитов необлученных лимфоцитов и через 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа после IR с дозой 2 Гр. CD45 + лимфоцитов показаны на каждой панели в качестве внутреннего контроля. Столбики погрешностей представляют собой стандартные отклонения.

    Таким образом, эти результаты показывают, что IL-2 влияет на пролиферацию Т- и NK-клеток, хотя реплицируются только последние, что увеличивает разрывы DSB ДНК и, следовательно, уровень γh3AX.Однако возможности DDR субпопуляций T-, B- и NK-лимфоцитов не изменяются при стимуляции IL-2.

    Пролиферация клеток влияет на DDR, но не зависит от дифференциальной способности DDR субпопуляций лимфоцитов

    Хорошо известно, что пролиферация клеток влияет на DDR и чувствительность к повреждению ДНК. Поэтому мы проанализировали индукцию γh3AX, p-CHK2, p-ATM и p53 в ответ на ИР 2 Гр в подмножествах ki67 + и ki67 8 МКПК здоровых доноров, культивируемых в RPMI с добавлением 100 ЕД/мл IL-2 ( Дополнительный рисунок 7).Независимо от пролиферации, на которую указывает экспрессия ki67, Т-клетки памяти CD4 + и CD8 + показали более высокие уровни индукции γh3AX, чем наивные Т-клетки, и значительно сниженный ответ р53. В частности, субпопуляции ki67 + NK-клеток различались по индукции γh3AX и p53, которая была значительно повышена в CD56 Bright Bright CD16 по сравнению со зрелыми NK-клетками. Субпопуляции В-клеток Ki67 + и ki67 реагировали на ИК сходным образом.Параллельное сравнение индукции DDR в клетках ki67 + и ki67 выявило значительные различия в отношении γh3AX, p-ATM и p53 в CD56 брайт CD16 , CD56 брайт CD16 и субпопуляции CD56 dim CD16 + NK-клеток, но не в Т- и В-лимфоцитах (дополнительная фигура 8).

    Таким образом, пролиферация, характеризующаяся экспрессией ki67, не изменяет дифференциальную DDR субпопуляций лимфоцитов.

    Способность DDR к воздействию УФ-С отличается от ИК-излучения

    В дополнение к низкой дозе ИК мы исследовали DDR в ответ на воздействие УФ-С (100 мДж/см 2 ) в РВМС, полученных от 8 здоровых доноров. В отличие от реакции на ИК, γh3AX, p-ATM и p-CHK2 достигли пика примерно через 4-8 часов после УФ-излучения (рис. 7 и 8). Мы наблюдали повышенный ответ γh3AX в CD4 + по сравнению с CD8 + Т-клетками, включая наивные CD4 + . Реакция P-ATM и p-CHK2 была значительно выше в наивных подгруппах по сравнению с памятью (рис. 8).Р53 в меньшей степени индуцировался в ответ на УФС без существенных различий между популяциями Т-лимфоцитов. Интересно, что DDR к повреждению ДНК, индуцированному IR, по сравнению с UVC, было наиболее дифференцированным в субпопуляциях NK-клеток. CD56 яркая CD16 NK-клетки показали сильную индукцию γh3AX, p53 и, в меньшей степени, p-CHK2 и p-ATM по сравнению с CD56 яркая CD16 + и CD56 тусклая CD16 населения в ответ на УФС. Наивные В-лимфоциты имели несколько сниженные уровни γh3AX, как это наблюдалось в ответ на ИР.Другие маркеры ответа не были изменены в субпопуляциях В-клеток.

    Рисунок 7 DDR к ультрафиолетовому излучению C отличается в субпопуляциях лимфоцитов. РВМС здоровых доноров оттаивали и культивировали в среде RPMI с добавлением 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 96 ч перед ионизирующим облучением 2 Гр (A) и УФ-излучением 100 мДж/м 2 (B) . Клетки фиксировали необлученными и через 1, 4, 8, 24 часа после облучения. Показаны графики tSNE, демонстрирующие уровень экспрессии маркеров DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 во всех популяциях в указанные моменты времени.Масштабные полосы в правой части каждой панели показывают интенсивность маркеров DDR. Нижняя панель (A , B) , соответственно, представляет популяции, закодированные цветом легенды внизу. Показан один репрезентативный эксперимент, полученный от одного донора из восьми.

    Рисунок 8 DDR PBMCs к IR отличается от DDR, индуцированной UVC. РВМС, полученные от 8 здоровых доноров, облучали УФС мощностью 2 Гр или 100 мДж/м 2 соответственно. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR анализировали методом масс-цитометрии.Складчатость индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях лимфоцитов CD45 + на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной для необлученных образцов. Столбцы указывают средние значения индукции складки; планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения. Значимость показана для наивных подмножеств Т- и В-клеток по сравнению с подмножествами памяти и незрелыми CD56 яркими CD16 до зрелых CD56 тусклыми CD16 + NK-лимфоцитами (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, * **р ≤ 0.001, ****p ≤ 0,0001).

    Подобно тому, что наблюдалось в лимфоцитах, подвергшихся воздействию ИК, воздействие УФС влияло преимущественно на выживаемость В-клеток (дополнительная фигура 9А) и, в частности, выживаемость наивных В-клеток (дополнительная фигура 9D). Кроме того, пропорции наивных CD8 + T и CD56 ярких CD16 + NK-клеток изменились через 24 часа после IR (дополнительные рисунки 9B, C).

    В то время как DDR был одинаковым среди ki67 + и ki67 T- и B-лимфоцитов, подвергшихся воздействию 100 мДж/м 2 UVC, снижение DDR γh3AX и p53 можно было наблюдать у ki67 NK-клеток. Рисунок 10).γh3AX и p53 были значительно повышены в подмножествах ki67 + CD56 Bright CD16 по сравнению с CD56 dim CD16 + через 4 часа и 8 часов после воздействия. Напротив, ответ на p-ATM был снижен в ki67 CD56 dim CD16 + NK-лимфоцитах. Однако 80-99% субпопуляций NK-клеток экспрессировали ki67 в ответ на обработку IL-2, что усложняет анализ недопредставленных клеток ki67 . Параллельное сравнение индукции DDR в клетках ki67 + и ki67 показало значительно повышенную индукцию γh3AX и p53 в NK-клетках, но не в субпопуляциях Т- и В-лимфоцитов (дополнительная фигура 11).

    Исследования клеточного цикла выявили несколько различий между РВМС, обработанными ИК и УФС (дополнительная фигура 12). Активирующий эффект повреждения ДНК на подмножествах В-клеток, которые перешли от ki67 (G0) к ki67 + (G1) через 4 часа, можно было наблюдать только в ответ на ИК, но не УФС. Интересно, что население макс. 22% (наивные по CD4) клетки ki67 IdU + можно было наблюдать через 4 часа после воздействия УФС в Т-, В- и NK-лимфоцитах. Дю Мануар и соавт. (29) описали клетки ki67 low BrdU + в переходной, покоящейся стадии, которая не прогрессировала до митоза.Эти фракции наиболее чувствительны к факторам роста. Согласно этим предыдущим отчетам, эти популяции, скорее всего, остановили пролиферацию в ответ на воздействие УФС, но еще не индуцировали апоптоз. Однако различная экспрессия ki67 среди субпопуляций лимфоцитов зависела от IL-2, а не от повреждения ДНК.

    Эти результаты подтверждают, что различные возможности DDR не зависят от типа повреждения ДНК, но специфичны для субпопуляций лимфоцитов.

    DDR отменяется у пациентов с атаксией, телеангиэктазией

    ATM является основной киназой PIKK, которая фосфорилирует h3AX, CHK2 и p53. Однако также ATR и DNA-PKcs могут катализировать активацию h3AX. Чтобы исследовать зависимость активации γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 от функции ATM, мы включили в наше исследование трех пациентов с AT. DDR в CD45 + Лимфоциты, CD3 + T CD3 T CD56 CD56 Dim CD56 + NK CD16 + NK CD16 NK CD19 + CD20 + CD20 + B Ступицы клеток были серьезно сокращены у пациентов по сравнению с 26 здоровыми контролями. Хотя количество В-клеток значительно уменьшилось через 24 часа после ИР (в среднем 8.от 7% до 2,8%), это не имело значения, учитывая небольшой размер выборки (дополнительная фигура 13A). Доли Т-лимфоцитов были изменены у пациентов с АТ по сравнению с контрольной группой с уменьшенным количеством наивных CD4 + и CD8 + Т-клеток, которые дополнительно снизились в ответ на ИР, хотя и незначительно (дополнительные рисунки 13B – D).

    Мы дополнительно изучили DDR, распределенную по субпопуляциям лимфоцитов пациентов с АТ. Помимо частичной активации γh3AX в эффекторных Т-клетках памяти и CD56 брайт CD16 и CD56 брайт CD16 + NK-лимфоцитов, среди подмножеств лимфоцитов не наблюдалось дифференциальной DDR (дополнительные рисунки 14, 15).Фосфорилирование h3AX лучше всего компенсируется другими ферментами PIKK, такими как DNA-PKcs и ATR. Тем не менее, ATM является основным фактором, активирующим h3AX.

    По сравнению со здоровым контролем, DDR был значительно нарушен в лимфоцитах и ​​субпопуляциях Т-, NK- и В-клеток пациентов с AT (рис. 9), что можно было использовать в диагностических целях.

    Рисунок 9 DDR снижен во всех субпопуляциях лимфоцитов у пациентов с атаксией-телеангиэктазией. РВМС, полученные от здоровых доноров и 3 пациентов с атаксией-телеангиэктазией (АТ), обрабатывали ионизирующим излучением 2 Гр и фиксировали через 1 час, 4 часа, 8 часов и 24 часа.Индуктивность γh3AX (A) , p-ATM (B) , p-CHK2 (C) и p53 (D) были рассчитаны в CD45 + , CD45 + CD . Коробчатые диаграммы показывают распределение кратных индукций, полученных от 26 здоровых доноров и 3 пациентов с AT; планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения.Показана значимость различий между контролем и пациентами (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,001).

    Обсуждение

    Начальный процесс в ответ эукариотических клеток на ИР характеризуется активацией киназы АТМ, которая автофосфорилируется по серину 1981 в течение нескольких минут после повреждения ДНК (30). Активированная киназа ATM фосфорилирует широкий спектр субстратов, связанных с репарацией повреждений ДНК, клеточным циклом и апоптозом. В то время как CHK1 в основном активируется ATR, CHK2 является основной мишенью ATM и дополнительно участвует в остановке клеточного цикла, репарации ДНК и апоптозе (31).Другим субстратом ATM является белок-супрессор опухоли p53, уравновешивающий выживаемость и апоптотический ответ. Гистоновый белок h3AX в основном фосфорилируется ATM, но также и другими ферментами PIKK, такими как ATR и DNA-PKcs. Фосфорилирование сенсоров DDR и белков-преобразователей можно использовать в качестве биомаркеров способности репарации ДНК для выявления людей с дефектами репарации ДНК. Однако, поскольку у этих пациентов часто наблюдается лимфопения и измененное распределение подмножества лимфоцитов, необходимо учитывать дифференциальную реакцию на повреждение ДНК различных подмножеств лимфоцитов.

    В этом исследовании мы исследовали DDR γh3AX (Ser139), p-ATM (Ser1981), p-CHK2 (Thr68) и p53 в субпопуляциях наивных и памяти Т-, В- и NK-лимфоцитов 26 здоровых доноров с помощью масс-цитометрии. Наши результаты показали, что индукция γh3AX была значительно повышена в подмножествах NK-клеток по сравнению с Т-клетками, а сниженный ответ был обнаружен в В-лимфоцитах. В то время как активация h3AX обратно коррелировала с индукцией p-CHK2 и p53 в NK-клетках, мы обнаружили аналогичные ответы p53 в субпопуляциях Т- и В-клеток через 4-8 часов после повреждения ДНК.P-CHK2 преимущественно активировался в B-лимфоцитах через 1 час после гамма-облучения, а повышенный ответ p-ATM наблюдался в субпопуляциях NK-клеток. Кроме того, сниженная индукция γh3AX была связана с усилением ответов p-ATM и p53 в наивных Т- и В-клетках по сравнению с субпопуляциями памяти.

    Для изучения DDR субпопуляций лимфоцитов, пораженных дополнительными типами повреждений ДНК, помимо IR-индуцированных DSB ДНК, PBMC 8 здоровых доноров подвергались воздействию UVC. По сравнению с лимфоцитами, обработанными ИК, воздействие УФ-С приводило к различной кинетике DDR, которая достигала пика в более поздние моменты времени от 4 до 8 часов.Помимо дифференциальной кинетики, также могут быть изменены клеточные реакции на воздействие УФС. Это было изучено путем сравнительного анализа всех субпопуляций лимфоцитов и выявило различия в способности DDR субпопуляций T-, NK- и B-клеток, наблюдаемые в ответ на IR.

    Количество жизнеспособных В-лимфоцитов значительно уменьшилось в ответ на ИР, о чем свидетельствуют пропорциональные изменения популяций лимфоцитов. Доля наивных CD4 + Т- и наивных В-клеток также снизилась через 24 часа после ИР, но субпопуляции NK-клеток не уменьшились. Эти результаты демонстрируют обратную корреляцию возможностей DDR с потенциалом выживания. Однако отдельные пути DDR могут регулироваться по-разному и могут реагировать на каждый из них как на функциональную резервную копию, что необходимо изучить в дальнейших исследованиях.

    Дифференциальная выживаемость за счет индукции апоптоза в ответ на ИР интенсивно изучалась на субпопуляциях лимфоцитов (24, 25). Наилучшие показатели выживаемости и устойчивости к повреждению ДНК были зарегистрированы у NK-лимфоцитов, а В-клетки очень радиочувствительны.Эти результаты были подтверждены дифференциальными ответами транскрипции на ионизирующее излучение в субпопуляциях лимфоцитов (32). Р53-зависимые проапоптотические гены BAX и TNFRSF10B преимущественно экспрессируются в CD19 + B и CD8 + Т-лимфоцитах и ​​в меньшей степени в CD56 + NK-клетках. Активация ATM индуцирует транскрипцию генов, связанных с репарацией ДНК, а также с развитием лимфоцитов (33, 34). Следует отметить, что регуляция транскрипции генов репарации ДНК различается среди субпопуляций лимфоцитов.Например, в В-клетках периферической крови сообщалось о недостаточной эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) (35).

    Дополнительным аспектом, влияющим на дифференциальную DDR субпопуляций клеток, является структура хроматина. Различные модификации гистонов в месте повреждения ДНК участвуют в рекрутировании связанных с DDR факторов, которые модулируют передачу сигналов (36, 37). В покоящихся Т-клетках описан сильно уплотненный хроматин по сравнению с пролиферирующими Т-клетками, и в последних наблюдались изменения модификации гистонов (38).

    Покоящиеся Т-клетки более радиочувствительны, чем CD3/CD28-стимулированные Т-клетки, подвергающиеся апоптозу в ответ на ИР, хотя они не отличаются по своей способности к репарации ДНК, как показали анализы комет (39). Сходные наблюдения были сделаны на ФГА-стимулированных Т-клетках (40). Наши исследования клеточного цикла подтвердили, что только подмножества памяти переходят в фазу клеточного цикла G1 в ответ на IL-2, таким образом, покоящиеся Т-клетки соответствуют наивным подмножествам Т-клеток. В соответствии с нашими результатами повышенной активации p-ATM в наивных Т-клетках Heylmann et al.сообщили о снижении экспрессии ATM в стимулированных по сравнению с нестимулированными РВМС (39). Уменьшение образования очагов γh3AX и 53BP1 в покоящихся Т-клетках в ответ на повреждение ДНК также было описано другими группами, хотя в анализе комет было обнаружено повышенное количество DSB ДНК (26). Эти наблюдения предполагают недостаточное восстановление из-за уменьшения DDR в наивных Т-клетках.

    Хотя DDR тесно связана с клеточным циклом, пролиферация не влияет на специфичные для типа клеток возможности DDR в Т- и В-лимфоцитах.Стимуляция IL-2 приводила к активации Т-клеток памяти от субпопуляций клеточного цикла G0 до G1 и пролиферации NK-клеток. Впоследствии в NK-лимфоцитах были обнаружены повышенные ответы γh3AX и p53 из-за стимуляции IL-2 и пролиферации. Хотя переход к фазам G1 и S клеточного цикла индуцировал интенсивность DDR, он не влиял на дифференциальную способность DDR, как показал сравнительный анализ в подмножествах ki67 и ki67 + .

    Активация и созревание Т-клеток сопровождается комплексным изменением экспрессии генов и структуры хроматина.Транскрипционное профилирование истощенных клеток и клеток памяти CD8 + выявило различную экспрессию факторов, участвующих в регуляции иммунных ответов, а также генов репарации ДНК (41).

    В отличие от предыдущих отчетов, указывающих на ограниченную активацию или фосфорилирование р53 в не покоящихся клетках (26, 42), мы обнаружили повышенную индукцию р53 в наивных CD4 + и CD8 + T по сравнению с подмножествами памяти. Несмотря на сильный апоптотический ответ, зарегистрированный в В-лимфоцитах, мы не наблюдали увеличения индукции р53 в этих субпопуляциях.Однако есть доказательства того, что помимо р53 могут быть задействованы и другие пути апоптоза (26). P53 преимущественно экспрессировался в ki67 + CD56 Bright CD16 по сравнению с CD16 + подмножествами NK-клеток, что усиливалось под воздействием УФС.

    Интересно, что p-CHK2 преимущественно активировался в В-клетках в ответ на повреждение ДНК, индуцированное как ИК, так и УФС. Хотя CHK2 необходим для эффективной соматической гипермутации и рекомбинации переключения классов (43), конкретная роль в DDR ранее не исследовалась.

    Межиндивидуальные различия были особенно выявлены в NK-лимфоцитах, а также в субпопуляциях переходных B и плазмобластов, которые влияли на DDR. Созревание CD56 ярких CD16 в CD56 тусклых CD16 + NK-клеток зависит от возраста и связано с вирусными инфекциями (44), что объясняет межиндивидуальные различия в нашей когорте.

    DDR отменяли у пациентов с AT, хотя можно было наблюдать ослабленный ответ γh3AX. Фосфорилирование h3AX может быть частично компенсировано другими PIKK, такими как ATR и DNA-PKcs.Фосфорилирование CHK2 выбрано лучше всего между контролем и пациентами, поскольку этот биомаркер наиболее эффективно активировался через 1 час после ИР в PBMC здоровых контролей. CHK2 также может фосфорилироваться ДНК-PKcs, другим членом семейства PI3KK (45), однако в нашем исследовании этого не наблюдалось. Следует отметить, что p-ATM и p53 также не могли быть индуцированы у пациентов с AT.

    AT можно диагностировать путем скрининга кругов эксцизии Т-клеточных рецепторов у новорожденных (TREC) и проводить дифференциальную диагностику с тяжелыми комбинированными синдромами иммунодефицита (46).Исследование от DDR до IR можно использовать в качестве диагностического инструмента для выявления AT. Индукцию γh3AX исследовали у пациентов с комбинированным иммунодефицитом, вызванным дефектами в пути репарации NHEJ (17–20). Из-за различий в возможностях DDR диагностические исследования DDR на клетках периферической крови должны быть разделены на разные субпопуляции.

    Хотя мы не изучали апоптотический ответ, сообщалось о нарушении выживаемости при ИР для В-лимфоцитов и покоящихся Т-клеток.Интересно, что, в частности, количество В-лимфоцитов и наивных Т-клеток снижено у пациентов с дефицитом репарации ДНК (16, 46, 47).

    Ограничением данного исследования является то, что все исследования проводились исключительно на криоконсервированном материале. Хотя контролируемые и проверенные анализы труднее проводить на свежих PBMC, криоконсервация может повлиять на клеточные функции, такие как DDR, которые формально не тестировались в этом исследовании. В большинстве исследований сообщается о снижении жизнеспособности размороженных РВМС, но нет ограничений в отношении иммунного профилирования (48) и ответов пролиферации (49).Кроме того, повреждение ДНК можно надежно проанализировать в криоконсервированных РВМС после 16-часового периода восстановления (50).

    Поэтому размороженные РВМС культивировали в течение 2-4 дней для восстановления после повреждения ДНК.

    Таким образом, наше исследование демонстрирует дифференциальную DDR в субпопуляциях лимфоцитов, которая не зависит от пролиферации. Согласно предыдущим сообщениям, эти наблюдения могут быть связаны с регуляцией транскрипции проапоптотических генов, что приводит к различным реакциям выживания.

    Заключение

    Емкость DDR различается в субпопуляциях лимфоцитов независимо от клеточного цикла и пролиферации.Самая сильная DDR может наблюдаться в NK-клетках по сравнению с самой низкой частотой ответа в B-лимфоцитах, что обратно пропорционально коррелирует с выживаемостью, связанной с повреждением ДНК. Кроме того, наивные Т- и В-клетки характеризуются сниженным DDR по сравнению со зрелыми подмножествами памяти. DDR отменяется во всех подмножествах ATM-дефицитных лимфоцитов, полученных от пациентов, пораженных AT. Масс-цитометрия позволяет провести сопоставимое исследование DDR в определенных субпопуляциях лимфоцитов, к которым следует стратифицировать анализ способности к репарации ДНК.

    Заявление о доступности данных

    Доступ к данным можно получить в Harvard Dataverse, https://dataverse.harvard.edu/ doi: 10.7910/DVN/L2DRDV.

    Заявление об этике

    Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены советами по этике Ульмского университета (407/16), Технического университета Дрездена (TUD) (BO-EK-213052020) и Ганноверской медицинской школы (9492). -БО-К-2020). Письменное информированное согласие на участие в этом исследовании было предоставлено законным опекуном/ближайшим родственником участников.

    Вклад авторов

    К.Ф. и К.С. разработали концепцию, спланировали исследование и руководили им. KF провел эксперименты и проанализировал данные. UB, CK, DV и CS включали пациентов с AT и предоставляли материал для пациентов. SU выполнял оперированные анализы с использованием масс-цитометра, поддерживаемого MH. E-MJ помог техническими советами и стратегией гейтирования. AS и K-MD помогли с этическим одобрением этого исследования. К.Ф. и К.С. написали рукопись, которая была одобрена всеми соавторами. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

    Финансирование

    Это исследование финансировалось немецким фондом Else-Kroener-Fresenius (EKFS) (2017_A57).

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Примечания издателя

    Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов.Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

    Благодарности

    Авторы хотели бы поблагодарить Сару Варт и основной центр цитометрии Ульмского университета, Дилека Даянакли, Еву-Марию Рамп и Сару Радеке за техническую и консультативную поддержку.

    Дополнительный материал

    Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.739675/full#supplementary-material

    Дополнительный рисунок 1 | Стратегия гейтирования субпопуляций лимфоцитов, проанализированных с помощью масс-цитометрии. Мононуклеарные клетки периферической крови фиксировали и окрашивали, как описано в материалах и методах. Живые клетки идентифицировали путем мечения ДНК окрашиванием с исключением иридия и цисплатина. Субпопуляции Т-, NK- и В-клеток анализировали на CD45+ лимфоцитах. Подмножества Т-клеток были охарактеризованы как CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD45RA+CCR7+ (наивные CD4/CD8), CD45RO+CCR7+/- (центральная и эффекторная память CD4/CD8).Субпопуляции NK-лимфоцитов, определенные как CD56brightCD16-, CD56brightCD16+, CD56dimCD16+, анализировали на CD3-лимфоцитах. CD57 исследовали на CD56brightCD16+ и CD56dimCD16+ NK-клетках. CD3-B-лимфоциты были охарактеризованы как CD19+CD20+, CD27-IgD+ (наивные B), CD27+ (память B), CD27+IgM+ (непереключаемая память B), CD27+IgM-IgGκ+ (переключаемая память класса B IgGκ), CD27+ IgM-IgGλ+ (переключение класса памяти B IgGλ), CD27+IgM+IgD+ (маргинальная зона (MZ)-подобный B), IgM++CD38++ (переходный B), CD27+IgM+IgD- (только IgM B), CD27 -IgM-IgD- (атипичная память B), CD19+CD20-CD27+CD38+IgM+ (непереключенные плазмобласты), CD19+CD20-CD27+CD38+IgM- (переключенные классы плазмобластов) и CD21lowCD38low B-клетки.

    Дополнительный рисунок 2 | Стимуляция IL-2 влияет на количество NK-клеток. РВМС 6 здоровых доноров культивировали в среде RPMI без и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 48 часов. Клетки облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Подсчет жизнеспособных (цисплатин-) Т-, NK- и В-лимфоцитов (A), наивных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти (B), субпопуляций CD56brightCD16-, CD56brightCD16+, CD56dimCD16+ NK-клеток (C) и наивных и Популяции B-клеток памяти (D), культивированные с IL-2 и без него, сравнивают в каждый момент времени после облучения.Статистическую значимость рассчитывали для каждой популяции лимфоцитов с использованием Т-критерия Стьюдента (*p ≤ 0,05).

    Дополнительный рисунок 3 | DDR в субпопуляциях Т-лимфоцитов не зависит от стимуляции IL-2. РВМС 6 здоровых доноров культивировали в среде RPMI без и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 48 часов. Клетки облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR оценивали методом масс-цитометрии.Средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) маркеров DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях T-, NK- и B-лимфоцитов необлученных лимфоцитов и через 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа после IR с дозой 2 Гр. MFI маркеров DDR сравнивают бок о бок в подмножествах Т-клеток, культивируемых с IL-2 и без него, в каждый момент времени после IR. Статистическую значимость рассчитывали с использованием критерия множественных сравнений Шидака (ns, незначимо, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 4 | Стимуляция IL-2 влияет на DDR в субпопуляциях NK-лимфоцитов.РВМС 6 здоровых доноров культивировали в среде RPMI без и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 48 часов. Клетки облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR оценивали методом масс-цитометрии. Средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) маркеров DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях T-, NK- и B-лимфоцитов необлученных лимфоцитов и через 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа после IR с дозой 2 Гр. MFI маркеров DDR сравнивают бок о бок в субпопуляциях NK-клеток, культивируемых с IL-2 и без него, в каждый момент времени после IR.Статистическую значимость рассчитывали с использованием критерия множественных сравнений Шидака (ns, незначимо, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 5 | DDR в субпопуляциях B-лимфоцитов не зависит от стимуляции IL-2. РВМС 6 здоровых доноров культивировали в среде RPMI без и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 48 часов. Клетки облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR оценивали методом масс-цитометрии.Средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) маркеров DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях T-, NK- и B-лимфоцитов необлученных лимфоцитов и через 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа после IR с дозой 2 Гр. MFI маркеров DDR сравнивают бок о бок в подмножествах B-клеток, культивируемых с IL-2 и без него, в каждый момент времени после IR. Статистическую значимость рассчитывали с использованием критерия множественных сравнений Шидака (ns, незначимо, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 6 | Стимуляция IL-2 не влияет на дифференциальную выживаемость лимфоцитов в ответ на ионизирующее излучение.РВМС 6 здоровых доноров культивировали в среде RPMI без и в присутствии 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 48 часов. Клетки облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Подсчет жизнеспособных (цисплатин-) Т-, NK- и В-лимфоцитов (A), наивных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти (B), субпопуляций CD56brightCD16-, CD56brightCD16+, CD56dimCD16+ NK-клеток (C) и наивных и Популяции B-клеток памяти (D) сравнивали в каждый момент времени после облучения. Статистическая значимость была рассчитана для каждой популяции лимфоцитов с использованием теста множественных сравнений Турции и показана для необлученных лимфоцитов по сравнению с необлученными лимфоцитами. лимфоциты через 24 ч после ИР (нс, недостоверно, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 7 | Дифференциальный ИР-индуцированный DDR субпопуляций лимфоцитов не зависит от пролиферации. РВМС, полученные от 8 здоровых доноров, облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR анализировали методом масс-цитометрии. Складчатость индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях CD45+ лимфоцитов на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной для необлученных образцов.Анализ подмножеств был дополнительно распределен по экспрессии маркера пролиферации ki67. Столбцы показывают средние значения индукции складки; планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения. Значимость, рассчитанная с помощью теста множественного сравнения Турции, показана для наивных подмножеств Т- и В-клеток по сравнению с подмножествами памяти и незрелых CD56brightCD16- по сравнению со зрелыми CD56dimCD16+ NK-лимфоцитами (* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, * ***р ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 8 | Клеточная пролиферация субпопуляций NK-клеток влияет на индуцированную ИР DDR.РВМС, полученные от 8 здоровых доноров, облучали дозой 2 Гр и фиксировали в указанные моменты времени. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR анализировали методом масс-цитометрии. Складчатость индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях CD45+ лимфоцитов на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной для необлученных образцов. Анализ подмножеств был дополнительно распределен по экспрессии маркера пролиферации ki67. MFI маркеров DDR в подмножествах k67+ и ki67- T-, NK- и B-клеток сравнивают бок о бок в каждый момент времени после IR.Статистическую значимость рассчитывали с использованием критерия множественных сравнений Шидака (ns, незначимо, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 9 | Субпопуляции лимфоцитов демонстрируют разные показатели выживаемости при воздействии УФС. РВМС, полученные от 8 здоровых доноров, подвергали воздействию УФС мощностью 100 мДж/м2 и фиксировали в указанные моменты времени. Подсчет клеток жизнеспособных (цисплатин-) Т-, NK- и В-лимфоцитов (A), наивных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти (B), субпопуляций CD56brightCD16-, CD56brightCD16+, CD56dimCD16+ NK-клеток (C) и наивных субпопуляций клеток памяти B популяции клеток (D) сравнивали в каждый момент времени после воздействия УФС.Статистическая значимость была рассчитана для каждой популяции лимфоцитов с использованием теста множественного сравнения Турции и показана для необлученных лимфоцитов по сравнению с лимфоцитами через 24 часа после облучения (ns, не значимо, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, * ***р ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 10 | Дифференциальный DDR подмножества лимфоцитов, вызванный УФ-С, не зависит от пролиферации. РВМС, полученные от 8 здоровых доноров, обрабатывали УФ-излучением 100 мДж/м2 и фиксировали в указанные моменты времени. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR анализировали методом масс-цитометрии. Складчатость индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях CD45+ лимфоцитов на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной для необлученных образцов. Анализ подмножеств был дополнительно распределен по экспрессии маркера пролиферации ki67. Столбцы показывают средние значения индукции складки; планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения. Значимость, рассчитанная с помощью теста множественных сравнений Турции, показана для наивных подмножеств Т- и В-клеток по сравнению с подмножествами памяти, а также незрелых CD56brightCD16- и зрелых CD56dimCD16+ NK-лимфоцитов (*p ≤ 0.05, **р ≤ 0,01, ***р ≤ 0,001, ****р ≤ 0,0001).

    Дополнительный рисунок 11 | Воздействие УФС приводит к увеличению DDR ki67+ по сравнению с ki67- подмножествами NK-клеток, но DDR не отличается в ki67+ и ki67- популяциях T- и B-клеток. РВМС, полученные от 8 здоровых доноров, подвергали воздействию УФС мощностью 100 мДж/м2 и фиксировали в указанные моменты времени. Поверхностные маркеры субпопуляций лимфоцитов и внутриядерные биомаркеры DDR анализировали методом масс-цитометрии. Складчатость индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях CD45+ лимфоцитов на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной для необлученных образцов.Анализ подмножеств был дополнительно распределен по экспрессии маркера пролиферации ki67. MFI маркеров DDR в подмножествах k67+ и ki67- T-, NK- и B-клеток сравнивают бок о бок в каждый момент времени после IR. Статистическую значимость рассчитывали с использованием мультипликатора Шидака.

    Дополнительный рисунок 12 | Повреждение ДНК, вызванное ИК и УФС, оказывает сходное влияние на профили клеточного цикла субпопуляций лимфоцитов человека. PBMC, полученные от 8 здоровых доноров, культивировали в среде RPMI с добавлением 100 ЕД/мл человеческого IL-2 в течение 96 часов перед ионизирующим облучением 2 Гр или воздействием УФ-излучения 100 мДж/м2 соответственно. За 30 минут до фиксации в указанные моменты времени к культуре клеток добавляли IdU для включения в ДНК реплицирующихся клеток. Клеточный цикл оценивали с помощью масс-цитометрии с использованием ki67 и IdU, чтобы различать фазы клеточного цикла G0/ki67-IdU-, G1/ki67+IdU- и S/ki67+IdU+. После воздействия УФС также могут быть обнаружены популяции ki67-IdU+. Столбцы представляют средние проценты фаз клеточного цикла G0 (серый), G1 (красный), S (светло-синий) и ki67-IdU+ (темно-синий) в субпопуляциях T-, NK- и B-лимфоцитов необлученных лимфоцитов и 1h, 4h, 8h, 24h после воздействия ИК или УФС.Лимфоциты CD45+ показаны на каждой панели в качестве внутреннего контроля. Столбики погрешностей представляют собой стандартные отклонения.

    Дополнительный рисунок 13 | Субпопуляции лимфоцитов, полученные от пациентов с AT, не показывают существенно отличающейся реакции выживания на ионизирующее излучение. РВМС, полученные от 3 пациентов с диагнозом АТ, были облучены дозой 2 Гр и зафиксированы в указанные моменты времени. Количество жизнеспособных (цисплатин-) Т-, NK- и В-лимфоцитов (A), наивных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти (B), субпопуляций CD56brightCD16-, CD56brightCD16+, CD56dimCD16+ NK-клеток (C) и наивных субпопуляций клеток памяти B клеточные популяции (D) сравнивали в каждый момент времени после облучения.Статистическую значимость рассчитывали для каждой популяции лимфоцитов с использованием критерия множественных сравнений Турции (ns, не значимо).

    Дополнительный рисунок 14 | DDR отменяется у пациентов с атаксией-телеангиэктазией. РВМС, полученные от здоровых доноров и 3 пациентов с атаксией-телеангиэктазией (АТ), обрабатывали ионизирующим излучением 2 Гр и фиксировали через 1 час, 4 часа, 8 часов и 24 часа. Уровень экспрессии маркеров DDR γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 во всех популяциях в анализируемые моменты времени показан на графиках tSNE.Масштабные полосы в правой части каждой панели показывают интенсивность маркеров DDR. Нижняя панель представляет популяции, закодированные цветом легенды внизу. Показан один здоровый донор (ГД) из 26 вместе с 3 пациентами (АТ1-3).

    Дополнительный рисунок 15 | IR-индуцированная DDR отменяется в субпопуляциях лимфоцитов пациентов с атаксией-телеангиэктазией. РВМС, полученные от здоровых доноров и трех пациентов с атаксией-телеангиэктазией (АТ), обрабатывали ионизирующим излучением 2 Гр и фиксировали через 1 час, 4 часа, 8 часов и 24 часа.Складчатость индукции γh3AX, p-ATM, p-CHK2 и p53 рассчитывали в субпопуляциях CD45+ лимфоцитов на основе средней интенсивности флуоресценции, нормализованной для необлученных образцов. Столбцы показывают средние значения индукции складки; планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения. Не было никаких существенных различий между подмножествами лимфоцитов, рассчитанными с помощью теста множественных сравнений Турции.

    Каталожные номера

    1. Lieber MR. Механизм восстановления двухцепочечных разрывов ДНК путем негомологичного соединения концов ДНК. Annu Rev Biochem (2010) 79:181–211. doi: 10.1146/annurev.biochem.052308.093131

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    3. Руни С., Чаудхури Дж., Альт. Ф.В. Роль негомологичного пути соединения концов в развитии лимфоцитов. Immunol Rev (2004) 200:115–31. doi: 10.1111/j.0105-2896.2004.00165.x

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    5. Truong LN, Li Y, Shi LZ, Hwang PY, He J, Wang H, et al.Соединение концов, опосредованное микрогомологией, и гомологичная рекомбинация разделяют начальный этап резекции концов для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК в клетках млекопитающих. Proc Natl Acad Sci USA (2013) 110(19):7720–5. doi: 10.1073/pnas.1213431110

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    6. Ochi T, Blackford AN, Coates J, Jhujh S, Mehmood S, Tamura N, et al. Восстановление ДНК. PAXX, аналог XRCC4 и XLF, взаимодействует с Ku, чтобы способствовать восстановлению двухцепочечных разрывов ДНК. Наука (2015) 347(6218):185–8.

    Реферат PubMed | Google Scholar

    9. Haahr P, Hoffmann S, Tollenaere MA, Ho T, Toledo LI, Mann M, et al. Активация киназы ATR RPA-связывающим белком ETAA1. Nat Cell Biol (2016) 18(11):1196–207. doi: 10.1038/ncb3422

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    12. Рогаков Е.П., Пильч Д.Р., Орр А.Х., Иванова В.С., Боннэр В.М. Двухцепочечные разрывы ДНК вызывают фосфорилирование гистона h3AX по серину 139. J Biol Chem (1998) 273(10):5858–68. doi: 10.1074/jbc.273.10.5858

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    13. Назаров И.Б., Смирнова А.Н., Крутилина Р.И., Светлова М.П., ​​Соловьева Л.В., Никифоров А.А. Дефосфорилирование гистона гамма-h3AX во время восстановления двухцепочечных разрывов ДНК в клетках млекопитающих и его ингибирование каликулином А. Radiat Res (2003) 160(3):309–17. doi: 10.1667/RR3043

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    14. Муслимович А., Исмаил И.Х., Гао Ю., Хаммарстен О. Оптимизированный метод измерения гамма-h3AX в мононуклеарных и культивируемых клетках крови. Nat Protoc (2008) 3(7):1187–93. doi: 10.1038/nprot.2008.93

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    15. Ротблюм-Овиатт С., Райт Дж., Лефтон-Грейф М.А., МакГрат-Морроу С.А., Кроуфорд Т.О., Ледерман Х.М. Атаксия-телеангиэктазия: обзор. Orphanet J Rare Dis (2016) 11 (1): 159. doi: 10.1186/s13023-016-0543-7

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    16.Слэттер М.А., Дженнери А.Р. Обновленная информация о дефектах репарации разрывов двойных цепей ДНК при комбинированном первичном иммунодефиците. Curr Allergy Asthma Rep (2020) 20(10):57. doi: 10.1007/s11882-020-00955-z

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    18. Felgentreff K, Lee YN, Frugoni F, Du L, van der Burg M, Giliani S, et al. Функциональный анализ встречающихся в природе мутаций DCLRE1C и корреляция с клиническим фенотипом дефицита ARTEMIS. J Allergy Clin Immunol (2015) 136(1):140–50.е147. doi: 10.1016/j.jaci.2015.03.005

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    19. Felgentreff K, Baxi SN, Lee YN, Dobbs K, Henderson LA, Csomos K, et al. Дефицит лигазы-4 вызывает характерные иммунные нарушения у бессимптомных людей. J Clin Immunol (2016) 36(4):341–53. doi: 10.1007/s10875-016-0266-5

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    20. Бухбиндер Д., Смит М.Дж., Кавахара М., Коуэн М.Дж., Базби Дж.С., Абрахам Р.С.Применение проточного анализа радиочувствительности у пациента с дефицитом ДНК-лигазы 4. Blood Adv (2018) 2(15):1828–32. doi: 10.1182/bloodadvances.2018016113

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    21. ван Ренсбург Э.Дж., Лоу В.К., Изатт Х., ван дер Ватт Дж.Дж. Сверхспиральные домены ДНК и радиочувствительность субпопуляций лимфоцитов периферической крови человека. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med (1985) 47(6):673–9. doi: 10.1080/09553008514550911

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    24.Уилкинс Р.К., Уилкинсон Д., Махарадж Х.П., Белье П.В., Цибульский М.Б., Маклин Дж.Р. Дифференциальный апоптотический ответ на ионизирующее излучение в субпопуляциях лейкоцитов человека. Mutat Res (2002) 513 (1-2): 27–36. doi: 10.1016/S1383-5718(01)00290-X

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    25. Falcke SE, Ruhle PF, Deloch L, Fietkau R, Frey B, Gaipl US. Клинически значимое радиационное воздействие по-разному влияет на формы гибели клеток в клетках врожденной и адаптивной иммунной системы человека. Int J Mol Sci (2018) 19(11). doi: 10.3390/ijms174

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    26. Hu Q, Xie Y, Ge Y, Nie X, Tao J, Zhao Y. Отдыхающие Т-клетки сверхчувствительны к повреждению ДНК из-за дефектного пути восстановления ДНК. Cell Death Dis (2018) 9(6):662. doi: 10.1038/s41419-018-0649-z

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    27. Sanz I, Wei C, Jenks SA, Cashman KS, Tipton C, Woodruff MC, et al.Проблемы и возможности для согласованной классификации популяций В-клеток и плазматических клеток человека. Фронт Иммунол (2019) 10:2458. doi: 10.3389/fimmu.2019.02458

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    28. Mingari MC, Gerosa F, Carra G, Accolla RS, Moretta A, Zubler RH, et al. Человеческий интерлейкин-2 способствует пролиферации активированных В-клеток через поверхностные рецепторы , сходные с рецепторами активированных Т-клеток. Nature (1984) 312 (5995): 641–3.doi: 10.1038/312641a0

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    29. du Manoir S, Guillaud P, Camus E, Seigneurin D, Brugal G. Маркировка Ki-67 в постмитотических клетках определяет различные пути Ki-67 внутри 2c-компартмента. Цитометрия (1991) 12(5):455–63. doi: 10.1002/cyto.9511

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    32. Мори М., Бенотмане М.А., Тироне И., Хуге-Питерс Э.Л., Десентес С. Транскрипционная реакция на ионизирующее излучение в субпопуляциях лимфоцитов. Cell Mol Life Sci (2005) 62(13):1489–501. doi: 10.1007/s00018-005-5086-3

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    33. Bredemeyer AL, Helmink BA, Innes CL, Calderon B, McGinnis LM, Mahowald GK, et al. Двойные разрывы ДНК активируют многофункциональную генетическую программу развития лимфоцитов. Природа (2008) 456(7223):819–23. doi: 10.1038/nature07392

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    34.Mazan-Mamczarz K, Hagner PR, Zhang Y, Dai B, Lehrmann E, Becker KG, et al. ATM регулирует посттранскрипционный РНК-оперон реакции на повреждение ДНК в лимфоцитах. Кровь (2011) 117(8):2441–50. doi: 10.1182/blood-2010-09-310987

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    35. Hyka-Nouspikel N, Lemonidis K, Lu WT, Nouspikel T. Циркулирующие В-лимфоциты человека лишены эксцизионной репарации нуклеотидов и накапливают мутации при пролиферации. Кровь (2011) 117(23):6277–86.doi: 10.1182/blood-2010-12-326637

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    37. Солли Г., Ди Микко Р., д’Адда ди Фаганья Ф. Взаимосвязь между состоянием хроматина и реакцией на повреждение ДНК при клеточном старении и раке. Nat Rev Cancer (2012) 12(10):709–20. doi: 10.1038/nrc3344

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    38. Rawlings JS, Gatzka M, Thomas PG, Ihle JN. Конденсация хроматина через комплекс Condensin II необходима для покоя периферических Т-клеток. EMBO J (2011) 30(2):263–76. doi: 10.1038/emboj.2010.314

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    39. Heylmann D, Badura J, Becker H, Fahrer J, Kaina B. Чувствительность CD3/CD28-стимулированных и нестимулированных лимфоцитов к ионизирующему излучению и генотоксическим противоопухолевым препаратам: ключевая роль ATM в дифференциальном ответе на облучение . Cell Death Dis (2018) 9(11):1053. doi: 10.1038/s41419-018-1095-7

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    40.Карлони М., Мескини Р., Овиди Л., Палитти Ф. Пролиферация клеток, индуцированная PHA, спасает лимфоциты периферической крови человека от апоптоза, индуцированного рентгеновским излучением. Mutagenesis (2001) 16(2):115–20. doi: 10.1093/mutage/16.2.115

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    41. Деринг Т.А., Кроуфорд А., Ангелосанто Дж.М., Палей М.А., Зиглер К.Г., Уэрри Э.Дж. Сетевой анализ выявляет центрально связанные гены и пути, участвующие в истощении CD8+ Т-клеток по сравнению с памятью. Иммунитет (2012) 37(6):1130–44.doi: 10.1016/j.immuni.2012.08.021

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    42. Виласова З., Резакова М., Ваврова Дж., Тичи А., Вокуркова Д., Зельцер Ф. и соавт. Изменения фосфорилирования гистонов h3A.X и Р53 в ответ лимфоцитов периферической крови на гамма-облучение. Acta Biochim Pol (2008) 55(2):381–90.

    Реферат PubMed | Google Scholar

    43. Davari K, Frankenberger S, Schmidt A, Tomi NS, Jungnickel B. Checkpoint Kinase 2 необходима для эффективной диверсификации иммуноглобулинов. Cell Cycle (2014) 13(23):3659–69. doi: 10.4161/15384101.2014.964112

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    44. Кампос С., Пера А., Санчес-Корреа Б., Алонсо С., Лопес-Фернандес I, Моргадо С. и др. Влияние возраста и ЦМВ на субпопуляции NK-клеток. Exp Gerontol (2014) 54:130–7. doi: 10.1016/j.exger.2014.01.008

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    45. Li J, Young CS, Lizardi PM, Stern DF. In Situ Обнаружение специфических разрывов двойных цепей ДНК с использованием амплификации по катящемуся кругу. Cell Cycle (2005) 4(12):1767–73. doi: 10.4161/cc.4.12.2211

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    46. Мандола А.Б., Рейд Б., Сиррор Р., Брагер Р., Дент П., Чакроборти П. и др. Атаксия-телеангиэктазия, диагностированная в когорте скрининговых случаев новорожденных за 5 лет опыта. Фронт Иммунол (2019) 10:2940. doi: 10.3389/fimmu.2019.02940

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    47. Staines Boone AT, Chinn IK, Alaez-Verson C, Yamazaki-Nakashimada MA, Carrillo-Sanchez K, Garcia-Cruz MLH, et al.Неспособность свести концы с концами: широкий клинический спектр дефицита ДНК-лигазы IV. Серия случаев и обзор литературы. Передний педиатр (2018) 6:426. doi: 10.3389/fped.2018.00426

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    48. Дракслер Д.Ф., Мадондо М.Т., Ханафи Г., Плебански М., Медкалф Р.Л. Проточный цитометрический анализ для эффективного количественного определения множественных врожденных иммунных клеток и субпопуляций Т-клеток в крови человека. Cytomet A (2017) 91(4):336–50. дои: 10.1002/cyto.a.23080

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    49. Domogala A, Madrigal JA, Saudemont A. Криоконсервация не влияет на функцию натуральных клеток-киллеров, дифференцированных In Vitro из CD34(+) клеток пуповинной крови. Цитотерапия (2016) 18(6):754–9. doi: 10.1016/j.jcyt.2016.02.008

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    50. Bankoglu EE, Stipp F, Gerber J, Seyfried F, Heidland A, Bahner U, et al.Влияние криоконсервации на повреждение ДНК и активность репарации ДНК в образцах крови человека в анализе комет. Arch Toxicol (2021) 95(5):1831–41. doi: 10.1007/s00204-021-03012-4

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    NAD-связанные механизмы дерепрессии генов и новая роль CtBP в персистирующей аденовирусной инфекции лимфоцитов | Virology Journal

  • 1.

    Edwards KM, Thompson J, Paolini J, et al. Аденовирусные инфекции у детей раннего возраста.[Интернет]. Педиатрия. 1985; 76:420–4. Доступно по адресу: http://pediatrics.aappublications.org/content/76/3/420.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 2.

    Garnett CT, Talekar G, Mahr JA, et al. Аденовирусы латентного вида С в тканях миндалин человека. Дж Вирол. 2009; 83: 2417–28.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 3.

    Lion T. Аденовирусные инфекции у иммунокомпетентных пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом. Clin Microbiol Rev. 2014; 27:441–62.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 4.

    Thounaojam AD, Balakrishnan A, Mun AB. Обнаружение и молекулярное типирование аденовирусов человека, связанных с респираторными заболеваниями, в штате Керала. Jpn J Infect Dis. 2016;69:500–4.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 5.

    Garnett CT, Erdman D, Xu W, et al. Распространенность и количественный анализ ДНК аденовируса вида С в лимфоцитах слизистой оболочки человека. Дж Вирол. 2002; 76: 10608–16.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 6.

    ЭВАНС А.С. Латентные аденовирусные инфекции дыхательных путей человека. Am J Hyg. 1958; 67: 256–66.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 7.

    ХОГГ Дж.К. Роль латентных вирусных инфекций в развитии хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 164:S71–5.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 8.

    Косулин К., Гейгер Э., Вечей А. и др. Персистенция и реактивация аденовирусов человека в желудочно-кишечном тракте. Клиническая микробиология и инфекции. 2016;22:381.e1–8.

    Артикул КАС Google Scholar

  • 9.

    Косулин К., Беркович Б., Маттес С. и др. Выделение кишечного аденовируса перед аллогенной трансплантацией стволовых клеток является фактором риска инвазивной посттрансплантационной инфекции. ЭБиоМедицина. 2018;28:114–9.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google Scholar

  • 10.

    Mynarek M, Ganzenmueller T, Mueller-Heine A, et al. Пациент, вирус и связанные с лечением факторы риска аденовирусной инфекции у детей после трансплантации стволовых клеток: результаты рутинной программы мониторинга.Трансплантация костного мозга Биол. 2014;20:250–6.

    ПабМед Статья ПабМед Центральный Google Scholar

  • 11.

    Wurzel DF, Mackay IM, Marchant JM, et al. Аденовирус вида С ассоциирован с хроническими гнойными заболеваниями легких у детей. Клин Инфекция Дис. 2014;59:34–40.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 12.

    Kampmann B, Cubitt D, Walls T, et al.Улучшение исхода у детей с диссеминированной аденовирусной инфекцией после аллогенной трансплантации стволовых клеток. Бр Дж Гематол. 2005; 130: 595–603.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 13.

    DSouza A, Fretham C. Текущее использование и результаты трансплантации гемопоэтических клеток (HCT): Сводные слайды CIBMTR, 2018 [Интернет]. ЦИБМТР. Доступно по адресу: https://www.cibmtr.org, [цитировано 30 августа 2019 г.].

  • 14.

    Waye MMY, Sing CW. Противовирусные препараты против аденовирусов человека. Фармацевтика. 2010;3:3343–54.

    Центральный пабмед Статья КАС Google Scholar

  • 15.

    Lee YJ, Prockop SE, Papanicolaou GA. Подход к аденовирусным инфекциям в условиях трансплантации гемопоэтических клеток. Curr Opin Infect Dis. 2017;30:377–87.

    ПабМед Статья ПабМед Центральный Google Scholar

  • 16.

    Fox JP, Brandt CD, Wassermann FE и др. Программа наблюдения за вирусами: постоянное наблюдение за вирусными инфекциями в столичных семьях Нью-Йорка. VI. Наблюдения за аденовирусными инфекциями: характер экскреции вируса, реакция антител, эффективность эпиднадзора, характер инфекций и связь с заболеванием. Am J Эпидемиол. 1969; 89: 25–50.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 17.

    Zhang Y, Huang W, Ornelles DA, et al.Моделирование латентности аденовируса в клеточных линиях лимфоцитов человека. Дж Вирол. 2010; 84: 8799–810.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 18.

    Markel D, Lam E, Harste G, et al. Типозависимые модели персистенции аденовируса человека в клеточных линиях Т-лимфоцитов человека. J Med Virol. 2014; 86: 785–94.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 19.

    Krzywkowski T, Ciftci S, Assadian F, et al. Одновременный одноклеточный In Situ анализ паттернов экспрессии ДНК и мРНК аденовируса человека типа 5 при литической и персистирующей инфекции. Дж Вирол. 2017;91:e00166–17.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 20.

    Furuse Y, Ornelles DA, Cullen BR. Постоянно инфицированные аденовирусом лимфоидные клетки экспрессируют микроРНК, полученные из вирусной РНК VAI и особенно РНК VAII.Вирусология. 2013; 447:140–5.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 21.

    Мурали В.К., Орнеллес Д.А., Гудинг Л.Р. и др. Белок смерти аденовируса (АДФ) необходим для литической инфекции лимфоцитов человека. Дж Вирол. 2014; 88: 903–12.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 22.

    Racioppi L, означает AR.Кальций/кальмодулинзависимая киназа IV в иммунных и воспалительных реакциях: новые пути для древнего путешественника. Тренды Иммунол. 2008; 29: 600–7.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 23.

    Гиберсон А.Н., Дэвидсон А.Р., Паркс Р.Дж. Хроматиновая структура ДНК аденовируса на протяжении всей инфекции. Нуклеиновые Кислоты Res. 2012;40:2369–76.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 24.

    Мацумото К., Окуваки М., Кавасэ Х. и др. Стимуляция транскрипции ДНК фактором репликации из генома аденовируса в хроматин-подобной структуре. Дж. Биол. Хим. 1998; 270:9645–50.

    Артикул Google Scholar

  • 25.

    Okuwaki M, Nagata K. Фактор-I, активирующий матрицу, ремоделирует структуру хроматина и стимулирует транскрипцию с матрицы хроматина*. Дж. Биол. Хим. 1998; 273:34511–8.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 26.

    Boyd JM, Subramanian T, Schaeper U, et al. Область на С-конце белка E1a аденовируса 2/5 необходима для ассоциации с клеточным фосфопротеином и важна для отрицательной модуляции опосредованной T24-ras трансформации, онкогенеза и метастазирования. EMBO J. 1993; 12: 469–78.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 27.

    Schaeper U, Boyd JM, Verma S, et al. Молекулярное клонирование и характеристика клеточного фосфопротеина, который взаимодействует с консервативным С-концевым доменом аденовируса E1A, участвующим в негативной модуляции онкогенной трансформации.Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92:10467–71.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 28.

    Stankiewicz TR, Gray JJ, Winter AN, et al. С-концевые связывающие белки: центральные игроки в развитии и заболевании. Биомолекулярные концепции. 2014;5:489–511.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 29.

    Sewalt RGAB, Gunster MJ, van der Vlag J, et al.С-концевой связывающий белок представляет собой репрессор транскрипции, который взаимодействует с определенным классом белков Polycomb позвоночных. Мол Селл Биол. 1999; 19: 777–87.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 30.

    Bellesis AG, Jecrois AM, Hayes JA, et al. Сборка С-концевого связывающего белка человека (CtBP) в тетрамеры. Дж. Биол. Хим. 2018; 293:9101–12.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 31.

    Ши Ю, Савада Дж.И., Суй Г. и др. Скоординированные модификации гистонов, опосредованные ко-репрессорным комплексом CtBP. Природа. 2003; 422: 735–8.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 32.

    Чжан К., Поршень Д.В., Гудман П.Х. Регуляция функции корепрессора ядерным НАДН. Наука. 2002; 295:1895–7.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 33.

    Kumar V, Carlson JE, Ohgi KA, et al. Транскрипция Corepressor CtBP представляет собой NAD+-регулируемую дегидрогеназу. Мол Ячейка. 2002; 10: 857–69.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 34.

    Мани-Теланг П., Сутриас-Грау М., Уильямс Г. и др. Роль связывания НАД и каталитических остатков в корепрессоре С-концевого связывающего белка. ФЭБС лат. 2007; 581:5241–6.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 35.

    Shen Y, Kapfhamer D, Minnella AM, et al. Биоэнергетическое состояние регулирует врожденные воспалительные реакции через транскрипционный корепрессор CtBP. Нац коммун. 2017: 1–13.

  • 36.

    Дэн Ю, Ли Х, Инь Х и др. С-концевой связывающий белок 1 модулирует окислительно-восстановительный потенциал клеток посредством обратной регуляции MPC1 и MPC2 в клетках меланомы. Медицинский научный монит. 2018;24:7614–24.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 37.

    Pelka P, Ablack JNG, Fonseca GJ, et al. Внутреннее структурное нарушение аденовируса E1A: вирусный молекулярный узел, связывающий множество разнообразных процессов. Дж Вирол. 2008; 82: 7252–63.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 38.

    Брутон Р.К., Пелка П., Мапп К.Л. и др. Идентификация второго сайта связывания CtBP в консервативной области E1A аденовируса типа 5 3. J Virol. 2008; 82: 8476–86.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 39.

    Subramanian T, Zhao LJ, Chinnadurai G. Взаимодействие CtBP с аденовирусом E1A подавляет иммортализацию первичных эпителиальных клеток и усиливает репликацию вируса при продуктивной инфекции. Вирусология. 2013; 443:313–20.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 40.

    Земке Н.Р., Берк А.Я. С-конец аденовируса E1A подавляет отсроченный противовирусный ответ и модулирует передачу сигналов RAS. Клеточный микроб-хозяин.2017;22:789–800.e5.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 41.

    Subramanian T, La Regina M, Chinnadurai G. Усиленная трансформация клеток, опосредованная онкогеном ras, и онкогенез мутантов аденовируса 2, лишенных C-концевой области белка E1a. Онкоген. 1989; 4: 415–20.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 42.

    Subramanian T, Malstrom SE, Chinnadurai G. Необходимость C-концевой области аденовируса E1a для трансформации клеток в сотрудничестве с E1b. Онкоген. 1991; 6: 1171–3.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 43.

    Cohen MJ, Yousef AF, Massimi P, et al. Рассечение С-концевой области E1A переопределяет роли CtBP и других клеточных мишеней в онкогенной трансформации. Дж Вирол. 2013;87:10348–55.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 44.

    Zhao LJ, Subramanian T, Chinnadurai G. Изменения в C-концевом связывающем белке 2 (CtBP2) корепрессорного комплекса, индуцированные E1A, и модуляция транскрипционной активности E1A с помощью CtBP2. Дж. Биол. Хим. 2006; 281:36613–23.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 45.

    Чжао Л-Дж., Субраманиан Т., Чжоу Ю. и др. Ацетилирование p300 регулирует ядерную локализацию и функцию транскрипционного Corepressor CtBP2. Дж. Биол. Хим. 2006; 281:4183–9.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 46.

    Чжао Л.Дж., Субраманиан Т., Виджаялингам С. и др. PLDLS-зависимое взаимодействие E1A с CtBP: регуляция ядерной локализации CtBP и транскрипционных функций. Онкоген.2007; 26:7544–51.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 47.

    Кляйн Г., Линдал Т., Джондал М. и др. Непрерывные линии лимфоидных клеток с характеристиками В-клеток (полученные из костного мозга), лишенные генома вируса Эпштейна-Барр и полученные из трех лимфом человека. Proc Natl Acad Sci. 1974; 71: 3283–6.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 48.

    Bett AJ, Krougliak V, Graham FL. Последовательность ДНК делеции/вставки в ранней области 3 Ad5 dl 309. Virus Res. 1995; 39: 75–82.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 49.

    McNees AL, Mahr JA, Ornelles D, et al. Постинтернализационное ингибирование экспрессии генов аденовирусов и продукции инфекционных вирусов в линиях Т-клеток человека. Дж Вирол. 2004; 78: 6955–66.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 50.

    Ornelles DA, Gooding LR, Dickherber ML, et al Ограниченные, но устойчивые изменения экспрессии клеточных генов в модели латентной аденовирусной инфекции отражаются в лейкозных клеточных линиях у детей. [Интернет]. Virology 2016; 494 IS -:67–77. Доступно по адресу: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682216300356.

  • 51.

    Livak KJ, Schmittgen TD. Анализ данных об относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2-ΔΔCT. Методы. 2001; 25: 402–8.

    Артикул КАС Google Scholar

  • 52.

    Берк А. Аденовирусные промоторы и трансактивация Е1А. Анну Рев Жене. 1986; 20:45–79.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 53.

    Берк А.Дж. Аденовирусы. В: Knipe DM, Howley PM, редактор (ы). Вирусология Филдса, 6-е издание. Филадельфия, Пенсильвания: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс; 2013. с. 1704–1731 гг.

  • 54.

    Crisostomo L, Soriano AM, Mendez M, et al. Временная динамика экспрессии гена аденовируса 5 в нормальных клетках человека.ПЛОС Один. 2019;14:e0211192–18.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 55.

    Nevins JR, Ginsberg HS, Blanchard JM, et al. Регуляция первичной экспрессии ранних единиц транскрипции аденовируса. Дж Вирол. 1979; 32: 727–33.

    ПабМед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • 56.

    Логан Дж. С., Шенк Т. Транскрипционный и трансляционный контроль экспрессии гена аденовируса.Microbiol Rev. 1982;46:377–83.

    ПабМед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • 57.

    Шипкова М., Виланд Е. Поверхностные маркеры активации лимфоцитов и маркеры клеточной пролиферации. Клин Чим Акта. 2012; 413:1338–49.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 58.

    Гай Кью, Джеймс К.Б.Л. Идентификация области гена аденовируса E1A, ответственной за индукцию промотором опухоли сложного эфира форбола.Биология клеточного развития in vitro. 2001; 37: 465–70.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 59.

    Buckbinder L, Miralles VJ, Reinberg D. TPA может преодолеть потребность в EIa и совместно действовать синергетически, стимулируя экспрессию промотора аденовируса EIII. EMBO J. 1989; 8: 4239–50.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 60.

    Scharer CD, Barwick BG, Youngblood BA и др. Глобальное ремоделирование метилирования ДНК сопровождает эффекторную функцию CD8 Т-клеток. Дж Иммунол. 2013; 191:3419–29.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 61.

    Scharer CD, Bally APR, Gandham B, et al. Передовой край: доступность хроматина программирует память Т-клеток CD8. Дж Иммунол. 2017;198:2238–43.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 62.

    Акимова Т., Бейер У.Х., Лю Ю. и др. Гистоновые/протеиновые деацетилазы и Т-клеточный иммунный ответ. Кровь. 2012;119:2443–51.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 63.

    Berger NA, Berger SJ, Sikorski GW, et al. Амплификация пулов пиридиновых нуклеотидов в митоген-стимулированных лимфоцитах человека. Разрешение ячейки опыта. 1982; 137: 79–88.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 64.

    ван дер Кнаап Дж.А., Веррейзер КП. Под прикрытием: контроль генов с помощью метаболитов и метаболических ферментов. Гены Дев. 2016;30:2345–69.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 65.

    Прусинкевич М.А., Мымрик Ю.С. Метаболическое перепрограммирование клетки-хозяина аденовирусной инфекцией человека. Вирусы. 2019;11:141–21.

    Центральный пабмед Статья КАС Google Scholar

  • 66.

    Сантидриан А.Ф., Мацуно-Яги А., Ритланд М. и др. Активность митохондриального комплекса I и баланс NAD+/NADH регулируют прогрессирование рака молочной железы. Джей Клин Инвест. 2013; 123:1068–81.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 67.

    Флинт Дж., Шенк Т. ВИРУСНЫЕ ТРАНСАКТИВИРУЮЩИЕ БЕЛКИ. Анну Рев Жене. 1997; 31: 177–212.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 68.

    Gooding LR, Aquino L, Duerksen-Hughes PJ, et al. Белок E1B 19000 молекулярной массы аденовирусов группы C предотвращает цитолиз фактора некроза опухоли клеток человека, но не клеток мыши. Дж Вирол. 1991;65:3083–94.

    ПабМед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • 69.

    Gomez-Gutierrez JG, Nitz J, Sharma R, et al. Комбинированная терапия онколитическим аденовирусом и темозоломидом усиливает виротерапию рака легкого in vitro и in vivo.Вирусология. 2016; 487: 249–59.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 70.

    Блевинс М.А., Кузнецова Ю., Крюгер А.Б., и соавт. Небольшая молекула, NSC95397, ингибирует взаимодействие CtBP1-белок-партнер и опосредованную CtBP1 репрессию транскрипции. J Биомоль Экран. 2015;20:663–72.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 71.

    Rodríguez E, Ip WH, Kolbe V, et al. Гуманизированные мыши воспроизводят острую и персистентную аденовирусную инфекцию человека. J заразить Dis. 2017;215:70–9.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 72.

    Greiner EF, Guppy M, Brand K. Необходим для пролиферации и индукции гликолитических ферментов, провоцирующих переход к гликолитической выработке энергии. Дж. Биол. Хим. 1994; 269:31484–90.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 73.

    Макивер, штат Нью-Джерси, Михалек Р.Д., Ратмелл, Дж.К. Метаболическая регуляция Т-лимфоцитов. Анну Рев Иммунол. 2013; 31: 259–83.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 74.

    Хван Э.С., Сонг С.Б. Никотинамид является ингибитором SIRT1 in vitro, но может быть стимулятором в клетках. Cell Mol Life Sci. 2017;74:3347–62.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 75.

    Zhang X, Liu J, Cao X. Метаболический контроль Т-клеточного иммунитета посредством эпигенетических механизмов. Селл Мол Иммунол. 2018;15:203–5.

    ПабМед Статья ПабМед Центральный Google Scholar

  • 76.

    Алмейда Л., Лохнер М., Берод Л. и др. Метаболические пути активации Т-клеток и дифференцировки клонов. Семин Иммунол. 2016;28:514–24.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 77.

    Чиннадурай Г. CtBP, нетрадиционный транскрипционный корепрессор в развитии и онкогенезе. Молекулярная клетка. 9: 213–24.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 78.

    Madison DL, Wirz JA, Siess D, et al. Индуцированная никотинамидадениндинуклеотидом мультимеризация корепрессора CtBP1 зависит от переключения триптофана. Дж. Биол. Хим. 2013; 288:27836–48.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 79.

    Субраманиан Т., Чиннадураи Г. Ассоциация деацетилаз гистонов класса I с корепрессором транскрипции CtBP. ФЭБС лат. 2003; 540: 255–8.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 80.

    Sollerbrandt K, Chinnadurai G, Svensson C. Связывающий домен CtBP в аденовирусном белке E1A контролирует CR1-зависимую трансактивацию. Нуклеиновые Кислоты Res. 1996; 24: 2578–84.

    Артикул Google Scholar

  • 81.

    Эберт О., Финке С., Салахи А. и др. Апоптоз лимфоцитов: индукция методами переноса генов. Джин Тер. 1997; 4: 296–302.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 82.

    Zhao Y, Zheng Z, Cohen CJ, et al. Высокоэффективная трансфекция первичных Т-лимфоцитов человека и мыши с использованием электропорации РНК. Мол Тер. 2005; 13:151–9.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 83.

    Линь Х., Сунь Б., Лян М. и др. Противоположная регуляция Corepressor CtBP путем SUMOylation и связывания PDZ. Мол Ячейка. 2003; 11:1389–96.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 84.

    Бергман Л.М., Моррис Л., Дарли М. и др. Роль уникального N-концевого домена CtBP2 в определении субклеточной локализации белков семейства CtBP. BMC клеточная биология. 2006;7.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 85.

    Criqui-Filipe P, Ducret C, Maira S-M, et al. Net, отрицательный Ras-переключаемый TCF, содержит второй домен ингибирования, CID, который опосредует репрессию посредством взаимодействия с CtBP и деацетилирования. EMBO J. 1999; 18:3392–403.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 86.

    Алпатов Р., Мунгуба Г.К., Катон П. и др. Ядерный спекл-ассоциированный белок Pnn/DRS связывается с корепрессором транскрипции CtBP и снимает опосредованную CtBP репрессию гена E-кадгерина.Мол Селл Биол. 2004; 24:10223–35.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 87.

    Zheng Y, Stamminger T, Hearing P. Белки семейства E2F/Rb опосредуют индуцированную интерфероном репрессию аденовирусной непосредственной ранней транскрипции, что способствует персистентной вирусной инфекции. PLoS Патог. 2016;12:e1005415–24.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • 88.

    Коюнджу Э., Будаева Х.Г., Митева Ю.В. и др. Сиртуины являются эволюционно законсервированными факторами рестрикции вирусов mBio. 2014;5:e02249–14.

  • 89.

    Матиас А.А., Серра А.Т., Силва А.С. и др. Остатки португальского виноделия как потенциальный источник природных антиаденовирусных агентов. Int J Food Sci Nutr. 2010;61:357–68.

    ПабМед Статья КАС ПабМед Центральный Google Scholar

  • 90.

    Пиччионе К.Е., Бхаттачарджи А.Замалчивание вирусного генома нейрональным сиртуином 1. J Neuro-Oncol. 2010;17:184–188.

    Google Scholar

  • 91.

    Небензал-Шарон К., Шарф Р., Амер Дж. и др. Взаимодействие с PARP-1 и ингибирование парилирования способствуют ослаблению передачи сигналов о повреждении ДНК аденовирусным белком E4orf4. Дж Вирол. 2019; 93: 738–20.

    Google Scholar

  • 92.

    Гибсон Б.А., Краус В.Л. Новое понимание молекулярных и клеточных функций поли(АДФ-рибозы) и PARP.2012: 1–14.

  • 93.

    Kraus WL. Транскрипционный контроль с помощью PARP-1: модуляция хроматина, связывание энхансера, коререгуляция и изоляция. Curr Opin Cell Biol. 2008; 20: 294–302.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google Scholar

  • ИНГИБИТОР ПРОТЕИН-КИНАЗЫ-С Н7 БЛОКИРУЕТ СТИМУЛЯЦИЮ НОРМАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ИНДУЦИРУЕТ АПОПТОЗ КАК НОРМАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ, ТАК И КЛЕТОК ЛЕЙКОЗА MOLT-4

    • Авторы:
      • Ф ТРАГАНОС
      • Дж КНУТТИХОТЦ
      • М ХОТЗ
      • В ГОРЧИЦА
      • БАРДЕЛТ
      • З ДАРЖИНКЕВИЧ
    • Посмотреть филиалы


      Принадлежности: Принадлежности не указаны

    • Опубликовано в Интернете: 1 января 1993 г.     https://doi.орг/10.3892/ijo.2.1.47
    • Страницы: 47-59
    Показатели: Всего Просмотров: 0 (Публикации Spandidos: | Статистика ЧВК: )

    Показатели: Всего загрузок PDF: 0 (Публикации Spandidos: | Статистика PMC: )

    Эта статья упоминается в:

    Аннотация

    Изохинолинсульфонамид (H7) является ингибитором протеинкиназы C (PKC), который также ингибирует активность циклических нуклеотид-зависимых протеинкиназ.Влияние Н7 на митогенную стимуляцию (переход от G0 к G1) нормальных лимфоцитов человека и на их последующее продвижение по клеточному циклу исследовали и сравнивали с действием этого ингибитора на пролиферацию лимфоцитарных лейкемических клеток MOLT-4 человека. При концентрациях Н7 10 и 50 мкМ переход G0-лимфоцитов в клеточный цикл подавлялся на 45 и 98% соответственно. Прогрессирование клеточного цикла стимулированных лимфоцитов не влияло на 10 мкМ H7, тогда как при 50 мкМ общая скорость прогрессирования снижалась на 50% без признаков остановки клеток на определенной фазе цикла.Близкие концентрации Н7 (45 мкМ) подавляли пролиферацию клеток MOLT-4 на 50%, однако в последнем случае происходил переход клеток к более высокой плоидности ДНК, скорее всего, за счет эндоредупликации. Таким образом, переход от G0 к G1 оказывается событием, наиболее чувствительным к H7. Воздействие на клетки MOLT-4 100 мкМ H7 в течение 24 ч индуцировало обширный апоптоз: активация эндогенной нуклеазы с предпочтением участков ДНК межнуклеосомного линкера приводила к деградации ДНК (выявленной с помощью электрофореза в агарозном геле и потере ДНК, измеренной с помощью проточной цитометрии), которая параллельно происходил внутриклеточный протеолиз, при этом сохранялась целостность плазматической мембраны, митохондрий и лизосом.Морфологическое исследование этих апоптотических клеток подтвердило деградацию ДНК. Однако перинуклеарная и мелкозернистая локализация оставшейся ДНК и отсутствие типичной конденсации хроматина и ядерной фрагментации отличались от классической картины апоптоза, наблюдаемой в других клеточных системах, что позволяет предположить, что некоторые события апоптоза (ядерная фрагментация) могут быть затронуты H7.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *