Метод выявления инфицирования туберкулезом: Методы профилактики и раннего выявления туберкулёза у детей и подростков

Содержание

Как можно обследовать ребенка на туберкулез без реакции Манту

Это очень распространенный вопрос среди родителей. Многим родителям не нравится регулярно водить ребенка в туб.диспансер по результатам реакции Манту.  Они ищут ей замену. Попробуем разобраться, существует ли на сегодняшний день более совершенный вариант массовой диагностики туберкулеза у детей.

Диаскинтест — это новый кожный диагностический препарат, официально зарегистрирован в августе 2008г. Применяется для диагностики инфицирования туберкулезом в России с 2009г. Принцип его действия такой же, как у туберкулина. Но этот препарат обладает более высокой специфичностью.

Диаскинтест — это белок, содержащий 2 антигена, присутсвующие в вирулентных штаммах Mycobacteriumtuberculosis  — возбудителя человеческого туберкулеза. Поэтому и реакция при внутрикожном введении этого препарата развивается, только если человек инфицирован Mycobacteriumtuberculosis, Поствакцинальный иммунитет после БЦЖ на этот тест не влияет, т. к. вакцина БЦЖ содержит другой вид M.bovis —  Поэтому у привитых здоровых детей он будет отрицательным. Более того, этот тест положителен только у людей, в организме которых возбудитель находится в состоянии активного размножения. При стихании активности процесса реакция становится отрицательной. Это дает возможность применять его для оценки эффективности лечения. Самого возбудителя туберкулеза он не содержит, поэтому заболевание вызвать не может. Аналогично туберкулину он является неполным антигеном (гаптеном): на его введение иммунитет не вырабатывается, а уже имеющиеся в организме.готовые специфические антитела вступают с ним в реакцию. В остальном состав этого препарата аналогичен туберкулину (фенол, полисорбат 80 и т. д.) — препарат белковый, поэтому без консервантов не обойтись.

Техника  проведения теста, техника его оценки, противопоказания и рекомендации при его проведении аналогичны таковым при Манту.

Оценка результатов.

Положительным тест считается при наличии папулы любого размера.

Сомнительной реакцией считается гиперемия любого размера без папулы.

Отрицательной: след от укола.

Лица с сомнительной и положительной реакцией ( в соответствии с инструкцией к препарату) обследуются на туберкулез.

Диаскинтест является Российской разработкой, выпускается отечественным производителем,  в настоящее время он активно рекламируется.

Манту официально признается неточной (точность ее результатов оценивается, как 50-70%), а у диаскинтеста – 90%. Обсуждается возможность заменить Манту диаскинтестомдлямассовой диагностике туберкулеза у детей. С октября 2009г. внесены изменения в приказ № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации», согласно которым при отрицательных результатах диаскинтеста профилактическое противотуберкулезное лечение детям не назначается (но обследование в т.ч. рентгенологическое по этому же приказу все же проводится).

Почему же Манту до сих пор не заменили на этот современный тест?

Потому что  у него тоже есть недостатки. Если туберкулин  достаточно часто дает ложно положительные результаты, то диаскинтест опасен ложно отрицательными:

1. Этот тест не чувствителен в отношении M.bovis — возбудителя коровьего туберкулеза, который также может вызывать болезнь у человека в 5 -15% случаях от всех форм заболевания, а также в отношении атипичных микобактерий, при вялотекущей инфекции. В разных источниках информация в отношении возбудителя коровьего туберкулеза и чувствительности к нему диаскинтеста расходится: из приказа 109 следует что тест чувствителен к наличию в организме вирулентных M.bovis , а из инструкции препарата — спавочникVidal — следует, что тест чувствителен только к Mycobacteriumtuberculosis — возбудителю человеческого туберкулеза . Хотя типичный возбудитель человеческого туберкулеза лидирует, как причина заболевания, другие патогенные для человека микобактерии туберкулеза не должны упускаться при диагностике заболевания. Поэтому рентгенологическое обследование детям с виражом по результатам Манту и отрицательным диаскинтестом  —  проводится.

2. Диаскинтест может быть отрицательным на ранних стадиях инфицирования, и на ранних стадиях развития туберкулезного процесса, поэтому при вираже Манту и отрицательном диаскинтесте, последний рекомендуется повторить через 2 месяца.

3. Ложно отрицательный результат может быть у больных с тяжелыми формами туберкулеза в стадии распада и у больных с иммунодефицитнымисостояними (ВИЧ, иммуносупрессивная терапия и т. д.), на фоне других тяжелых хронических заболеваний.

Поэтому не все фтизиатры настроены оптимистично в отношении этого препарата, как замены Манту для массовой туберкулинодиагностики.

Диаскинтест в настоящее время применяется в сети тубдиспансеров, как дополнительный метод в совокупности с другими, в том числе у детей направленных на консультацию к фтизиатру по поводу увеличения р.Манту  —  для уточнения активности бактерий.

Его можно проводить одновременно с Манту на разных руках, или после нее. Интервал между ними значения не имеет,  т. к.

то и другое –  кожные пробы, а не прививки. При этом, если по результатам Манту выставляется вираж, то отрицательный результат диаскинтеста не снимает этот диагноз. В данном случае отрицательный результат говорит о том, что организм ребенка на данный момент успешно справляется с возбудителем попавшим извне и дополнительного лечения не требуется. Зато положительный результат является показанием к назначению профилактического лечения изониазидом.

Выводы:

Как у любого медицинского препарата у диаскинтеста имеется 2 стороны: преимущества и недостатки. 

Диаскинтест очень ценное достижение современной науки, но для скрининговой диагностики туберкулеза он не подходит из-за достаточно высокой вероятности ложно отрицательных результатов.

Знать о наличии этого препарата родителям очень полезно, чтобы иметь возможность грамотно задать вопросы фтизиатру, если этот метод диагностики Вам не предлагают.

Многие родители не хотят делать ребенку кожные пробы и рентгенографию, считая это вредным. Они пытаются найти замену этим методам. Существует ли на сегодняшний день такой абсолютно достоверный и безопасный метод, который можно использовать для массовой диагностики туберкулеза?

Анализы крови.

Остановимся на методах обследования, которые основаны на заборе крови (или других биологических жидкостей) у ребенка, следовательно, являются безвредными.

1.ПЦР – полимеразная цепная реакция.

Этот метод основан на обнаружении частичек ДНК возбудителя туберкулеза в биологических жидкостях: крови, моче, мокроте и т. д. Метод достаточно чувствителен, позволяет обнаружить возбудителя при наличии нескольких сотен микробов в 1 мл биологической жидкости. Но возбудитель может находиться внутри очажка или внутри клеток, в этом случае в биологических  жидкостях невозможно обнаружить даже фрагментов его ДНК – следовательно, ПЦР будет отрицательной. У детей с клиническим туберкулезом легких чувствительность этого метода колеблется от 25 до 83% т.

е. при наличии клинически подтвержденного туберкулеза, а следовательно наличии возбудителя в организме, положительный результат ПЦР был от 25 до 83% больных детей, у остальных отрицательным. А специфичность ПЦР — 90%, т. е. в 10% случаев возможны ложноположительные результаты. Отсюда следует, что отрицательный результат ПЦР не исключает диагноза туберкулез и как самостоятельный метод для диагностики туберкулеза не используется. Этот метод выгодно отличается от других тем, что он обнаруживает непосредственно антиген (частички ДНК бактерий), а не антитела, как все другие методы диагностики. Поэтому его с успехом можно применять в тех случаях, когда возбудитель в организме присутствует, а иммунитет к нему не вырабатывается. Этот тест применяют в основном у детей с тяжелыми формами туберкулеза, у детей с иммунодефицитами, при различных формах внелегочного туберкулеза, когда диагноз не удается установить другими методами.

2.РПГА. Реакция непрямойгемаглютинации.

Метод основан на выявлении специфических антител в крови больного тубекулезом. Для анализа используется кровь больного и препарат: Диагностикумэритроцитарный туберкулезный антигенный сухой – бараньи эритроциты, на которых осажден антиген микобактерий туберкулеза. При туберкулезе реакция бывает положительной в 70-90% случаев, т. е. возможны ложноотрицательные результаты. Используют его как иммунологический тест для определения активности процесса и эффективности лечения.

3.ИФА. Иммуноферментный анализ.

Метод основан на обнаружении антител к возбудителю туберкулеза в крови больного. У пациента берется кровь и тестируется на наличие антител, при этом используется: Тест система иммуноферментная для определения антител к возбудителю туберкулеза. Чувствительность метода составляет 60-70%, специфичность 90%, что не позволяет использовать метод для скринингового (массового), обследования населения на туберкулез. Метод используется для подтверждения диагноза и определения активности процесса.

4.Квантифероновый тест.

Тест проводится в пробирке: у больного берется кровь из вены и исследуется. Широко применяется для диагностики скрытого (латентного) туберкулеза за рубежом. У нас так же проводится в крупных городах: Москве, Санкт-Петербурге, но широкого распространения пока не получил.

Этот метод основан на определении в крови пациента специфического интерферрона. Т-лимфоциты пациента стимулируются специфическими антигенами М.tuberculosis. Только у людей инфицированных именно этим видом микобактерий тест будет положительным. У вакцинированных БЦЖ, а также инфицированных возбудителем коровьего туберкулеза тест будет отрицательным. 

Недостатки.

Квантифероновый тест имеет чувствительность  89% (в 11% возможны ложноотрицательные результаты), т.е. отрицательный тест не исключает диагноз туберкулез, поэтому применяется он у нас в России не вместо Манту и рентгена, а вместе с ними для уточнения диагноза.

Специфичность у него 99,2 %, это выше, чем у других методов диагностики туберкулеза. Поэтому положительный тест практически в 100% случаев служит доказательством инфицированности человека туберкулезом. Именно инфицированности, а не болезни.

Для взрослого населения  он не представляет большой ценности и для скрининговой диагностики туберкулеза  использоваться не может, т.к. в России микобактерией туберкулеза инфицирована большая часть взрослого населения.

А для ребенка его положительный результат подтверждает инфицированность микобактерией человеческого туберкулеза, но не показывает интенсивность (активность) этой инфицированности. Для подтверждения или исключения диагноза туберкулез все-равно нужен рентген, а для решения вопроса о назначении ребенку профилактического лечения кожные пробы: Манту или диаскинтест.

Этот тест широко используется для диагностики скрытого туберкулеза у лиц с иммунодефицитами и ВИЧ-инфекцией, когда Манту может быть ложно отрицательной. Этот тест может помочь подтвердить или снять диагноз туберкулез в сомнительных случаях. Но заменой Манту он не является.

Выводы:

Все выше перечисленные методы, включая диаскинтест, дают достаточно большой % ложно отрицательных результатов, при их массовом применении есть большая вероятность пропустить больных туберкулезом, поэтому для скринингового обследования детей ни один из них не подходит.

При всей своей неточности (50-70%), единственным методом подходящим для массового обследования детей на туберкулез по-прежнему остается реакция Манту. Она дает много ложно положительных реакций, но минимум ложно отрицательных. Она выявляет всех детей у которых в организме присутствуют любые микобактерии туберкулеза: патогенные и не патогенные для человека; в любом состоянии: активном и дремлющем. Педиатр по результатам  реакции Манту получает возможность выделить группу детей нуждающихся в дополнительном обследовании на туберкулез и отсечь не нуждающихся в этом детей, без риска пропустить больных и инфицированных.

У выделенной по результатам Манту группы детей проводится дальнейшее обследование, включающее традиционное рентгенологическое, которое хорошо дополняется перечисленными выше методами. По совокупности всех методов обследования выставляется окончательный диагноз.

Безопасный и 100% достоверный метод диагностики туберкулеза пока не изобрели.

Среди взрослого населения  России около 90% людей инфицировано туберкулезом, поэтому все мероприятия направлены на выявление явных клинических форм болезни, особенно легочных форм с бактериовыделением.  Поэтому у взрослого населения скринингом служит обязательнаяфлюрография, а другие методы являются дополнительными (уточняющими).

Родители, категорически не желающие делать ребенку реакцию Манту, а также родители детей, у которых есть противопоказания к Манту, обязаны обследовать детей рентгенологически не реже 1 раза в год. Обязательное обследование детей на туберкулез контролируется санитарными правилами РФ. В случае отказа – ребенок может не допускаться в коллектив.

Рентгенологический метод обследования органов грудной клетки, с наибольшей долей вероятности, исключает выраженные клинические формы туберкулеза органов дыхания, т. е. исключает попадание в детский коллектив детей – бактериовыделителей, т.е. являющихся заразными для других.

Следовательно, ответ на вопрос в заголовке статьи звучит так:

вместо Манту – только рентген.

Источники информации:

Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.1295-03 «Профилактика туберкулеза»

Приказ Министерства Здравоохранения РФ № 109 от 21марта 2003г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»

Флюорография – основной метод раннего выявления туберкулёза

Туберкулёз – это хроническое инфекционное заболевание, социально значимое. Туберкулёзом болеют люди разного возраста и пола. Возбудителем является палочка Коха, которая устойчива во внешней среде и может сохраняться в пыли, земле и пищевых продуктах долгое время, особенно при отсутствии солнечного света. Заражение туберкулёзом происходит: при кашле, чихании больного, вдыхании пыли, в которой находится микобактерия туберкулёза, через предметы гигиены. В России на сегодняшний день существует три метода выявления туберкулёза: иммунодиагностика (туберкулинодиагностика, диаскинтест), флюорографический метод и бактериологическое исследование мокроты. Основным методом раннего выявления у взрослого населения и подростков с 15 лет является флюорографическое исследование.

Довольно часто приходится сталкиваться со стереотипом, что туберкулёзом болеют исключительно люди с низким уровнем жизни. Каждый третий житель Земли носит в себе туберкулёзную палочку. Конечно, качество питания, бытовые условия, алкоголизм и наркомания являются факторами, способствующими возникновению и развитию заболевания. Однако риск заболеть есть у каждого человека.

Высокий темп жизни, информационное давление, нерегулярное и несбалансированное питание – это стрессовые моменты, которые приводят к снижению защитных сил организма и способствуют развитию заболевания. Кроме того, ВИЧ-инфекция, гепатиты, диабет, хронические неспецифические заболевания лёгких, язвенная болезнь желудка также снижают уровень иммунной защиты организма. Необходимо помнить, что туберкулёз может длительное время развиваться бессимптомно. Заболевший человек может внешне выглядеть совершенно здоровым, поэтому нужно более бережно относиться к своему организму.

Если обратиться к статистическим данным, то в Можайском районе за 2017 год выявлено 19 человек, из них четыре иностранца, прибывшие на заработки из Ближнего зарубежья. Умерли от туберкулёза девять человек, из них трое – в первый год заболевания.

В основном туберкулёз выявляется при обращении с жалобами, когда отмечается у таких больных деструктивные формы туберкулёза лёгких с бактериовыделением. Имеются случаи заболевания туберкулёзом детей и подростков. А это говорит о неблагополучной эпидемиологической обстановке в районе. Ежегодно заболевают один-два ребёнка. Под наблюдением в диспансере находятся 42 ребёнка (от одного года до 17 лет). Это дети, контактировавшие с больными туберкулёзом, с гиперергическими пробами на туберкулин, инфицированные и из группы риска.

В настоящее время среди взрослых с активным туберкулёзом выявлено 46 человек, из них один ребёнок. А сколько в районе лиц, без определённого места жительства, лица, страдающие хроническим алкоголизмом, наркоманией, неработающие, которые годами не обращаются к врачу, будучи больными. В основном эти люди не проходят флюорографию много лет. Недовыявленные пациенты ведут к скрытым очагам туберкулёзной инфекции. Отмечается рост ВИЧ-инфицированных, подверженных любой инфекции и туберкулёзом тоже, так как у них снижен иммунитет. Отмечается рост случаев больных туберкулёзом с множественной лекарственной устойчивостью, которые нуждаются в лечении до 24 месяцев дорогостоящими противотуберкулёзными резервными препаратами. Один не леченный больной активной формой туберкулёза лёгких в год может заразить от 10 до 15 человек.

В последние годы туберкулёз начал поражать преимущественно лиц молодого возраста, на которых в основном лежит максимальная трудовая и семейная нагрузка. Многие из них не проходили флюорографическое обследование в течение длительного времени, не обращались в поликлиники.

Преимущества флюорографии

Быстрота и простота делают флюорографию незаменимой для массовых обследований населения. Наиболее распространённым диагностическим методом является флюорография органов грудной клетки, которая применяется, прежде всего, для скрининга туберкулёза и злокачественных новообразований лёгких. Разработаны как стационарные, так и мобильные флюорографические аппараты.

Сегодня наука даёт возможность внедрения цифровых аппаратов для флюорографии. Они позволяют упростить работу с изображением (изображение может быть выведено па экран монитора, распечатано, передано по сети, сохранено в медицинской базе данных и т.п.), уменьшить лучевую нагрузку на пациента и расходы на дополнительные материалы (плёнку, проявитель). Современная аппаратура стала гораздо более безопасной, что не может не сказаться на отношении человека к процедуре.

Приказом Министерства Здравоохранения РФ от 21.03.2017 года № 124 н «Об утверждении порядка и сроков проведения профилактических медицинских осмотров граждан в целях выявления туберкулёза» в России каждый здоровый человек обязан не реже одного раза в два года пройти флюорографическое обследование. Если ваша профессиональная деятельность связана с детскими коллективами, пищевыми продуктами, вы работник вредной профессии или относитесь к группе риска по заболеванию туберкулёзом из-за имеющихся у вас заболеваний (хронические неспецифические заболевания лёгких, сахарный диабет, заболевания желудочно-кишечного тракта), вы должны обследоваться флюорографически ежегодно.

Обязательно должны обследоваться члены семьи беременной женщины и члены семей, имеющие детей. Регулярность профилактических осмотров населения позволяет выявить заболевание в начальной форме и тем самым сократить сроки его лечения, уменьшись смертность от этого грозного заболевания. Регулярное прохождение флюорографии даёт гарантию того, что человек здоров.

Сейчас во всех больницах проводят раннюю диагностику, в которой главную роль играет именно флюорография, позволяющая выявить болезнь в её зародышевом состоянии, когда ещё нет явных симптомов. Туберкулёз на ранних стадиях протекает вяло и бессимптомно, и только флюорографическое обследование лёгких может обнаружить заболевание.

В настоящее время обязательному флюорографическому обследованию подлежат все пациенты, обратившиеся в поликлиники и необследованные в текущем году рентгенологическим методом, а также лица, входящие в группы повышенного риска заболевания туберкулёзом.

Внимательное отношение к собственному здоровью, своевременное прохождение профилактических флюорографических обследований, своевременное обращение к врачу при появлении симптомов, характерных для туберкулёза, помогут избежать тяжёлых форм заболевания. Берегите себя и своих близких!

 

О.И. ЛЮБИМОВА, заведующая протовотуберкулёзным отделением ГБУЗ «Можайская ЦРБ»

Источник: http://inmozhaisk.ru/novosti/zdorove/flyuorografiya-osnovnoy-metod-rannego-vyyavleniya-tuberkulyoza

Статья «Профилактика туберкулеза» — ГБУЗ «Районная больница с. Варна»

Профилактика туберкулеза

 

                Туберкулез-инфекционное заболевание, может иметь острое или хроническое течение, с периодами обострений и затиханий, с многолетним течением и высокими показателями инвалидности и смертности. Изначально туберкулез считали болезнью только социально незащищенных людей, безработных, мигрантов, имеющих вредные привычки, но согласно последним данным ,туберкулезом стали болеть люди трудоспособного возраста , со средним и высоким уровнем жизни. .Больной туберкулезом является основным источником заражения, поэтому изоляция больного и его лечение-это один из факторов предупреждения распространения туберкулеза. Профилактика туберкулеза-это одновременно оздоровительные, социальные ,гигиенические мероприятия, направленные на укрепление здоровья населения, предотвращение возникновения и массовому распространению туберкулеза и своевременное выявление инфицированных микобактериями туберкулеза детей, подростков методом ежегодной туберкулинодиагностики и больных туберкулезом среди населения .

                    Виды профилактики:

1. Социальная профилактика- это совокупность мероприятий, оказывающих положительное влияние на состояние здоровья широких масс населения и повышающих этим устойчивость организма к туберкулезу. Направлена на оздоровление условий внешней среды, повышение материального благосостояния населения, укрепления его здоровья, улучшение питания и жилищно-бытовых условий, развитие массовой физической культуры и спорта, проведение мероприятий по борьбе с алкоголизмом, наркоманией, табакокурением и др.вредными привычками, борьбе с профвредностью. Важна и индивидуальная профилактика туберкулеза-это прежде всего здоровый образ жизни. Что касается больных:- каждый больной имеет право на: отдельную жилую площадь, бесплатное лечение, лист временной нетрудоспособности в течение 10-12 мес., отпуск только в летнее время года, бесплатное диетическое питание на производстве, бесплатное санаторное лечение в течение 2-3 мес.

2.Санитарная профилактика–направлена на максимальную охрану здоровья людей от заражения и заболевания туберкулезом- предупредить инфицирование микобактерией туберкулеза здоровых людей, ограничить и сделать безопасным контакт с больным туберкулезом в активной форме окружающих его здоровых людей в быту, на работе, или по месту учебы. ЗАДАЧИ санитарной профилактики:

 — раннее выявление заболевания, которое  возможно только при ежегодном флюорографическом обследовании населения

  — госпитализация больных в специализированные учреждения

 — лечение непрерывное и полученное в полном объеме в зависимости от формы туберкулеза (  3 этапа: стационар, амбулаторный этап и санаторное лечение )        

— проведение санитарно-гигиенических,  противоэпидемических мероприятий в очагах туберкулеза (т.е. где проживает больной открытой формой туберкулеза или жил в течение последнего месяца или умер) – по месту работы или обучения .Сюда относится проведение текущей или заключительной дезинфекции, лечение больного, изоляция детей. Постановка всех контактных на учет в противотуберкулезное учреждение , флюорографическое  обследование всех взрослых членов семьи, а детей и подростков методом туберкулинодиагностики –проба Манту и проба ДИАСКИНТЕСТ- 2 раза в год и 2 раза в год профилактические курсы лечения. Взрослые наблюдаются до прекращения бактериовыделения у больного, дети  и подростки до перевода больного в диспансерную группу –клиническое излечение. Дети до 3-х лет наблюдаются до снятия больного с учета. Снабжение дезинфицирующими средствами, обучение больного  и  его семьи санитарно-гигиеническим навыкам-мытье рук, посуды с использованием моющих средств и проточной воды, обязательная обработка мяса и молока, пользование индивидуальными гигиеническими средствами и посудой.

 

3. Специфическая профилактика– направлена против возбудителя туберкулеза, предотвращения инфицирования и предупреждения развития заболевания. Самую первую противотуберкулезную защиту здоровый новорожденный получает на 4-7 день жизни  в роддоме вакциной БЦЖ-М.В результате вырабатывается специфический иммунитет против микобактерии туберкулеза. Иммунитет после вакцинации БЦЖ в среднем сохраняется 3-5 лет. Для контроля состояния данного иммунитета детям и подросткам проводят туберкулинодиагностику (проба Манту ) с 12 месячного возраста. Эффективность противотуберкулезных прививок БЦЖ проявляется в том, что значительно уменьшилась заболеваемость детей и подростков тяжелыми формами туберкулеза-милиарным туберкулезом, туберкулезным менингитом, казеозной пневмонией, многие дети при встрече с микобактерией и вовсе не инфицируются, либо отмечается развитие малых форм туберкулеза . Смертность от туберкулеза у вакцинированных детей и подростков значительно ниже, чем среди невакцинированных. Уважаемые родители не отказывайтесь от вакцинации БЦЖ новорожденного в родильном доме, от проведения туберкулинодиагностики, помните, что Ваш отказ может привести к заболеванию.

Соблюдая и выполняя  санитарные и специфические  профилактические мероприятия   вы сможете уберечь себя и свои семьи от главного инфекционного врага человечества-ТУБЕРКУЛЕЗ. 

 

Профилактика туберкулеза

Профилактика туберкулеза

Туберкулез (ТБ) является инфекционной бактериальной болезнью, вызываемой микобактерией туберкулеза, которая наиболее часто поражает легкие.

Изначально туберкулез считали болезнью только социально незащищенных людей, безработных, мигрантов, имеющих вредные привычки, но согласно последним данным, туберкулезом стали болеть люди трудоспособного возраста, со средним и высоким уровнем жизни.

Источником инфекции являются больные активной формой туберкулеза люди и животные (крупный рогатый скот, козы, собаки).

Туберкулез распространяется от человека человеку по воздуху. При кашле, чихании или отхаркивании люди с легочным туберкулезом выделяют в воздух бактерии туберкулеза. Для инфицирования человеку достаточно вдохнуть лишь незначительное количество таких бактерий.

Основным механизмом передачи возбудителя инфекции является воздушно-капельный (аэрозольный). Возможны также воздушно-пылевой, контактный, алиментарный, вертикальный механизмы передачи.

Основным фактором передачи возбудителя туберкулезной инфекции является воздушная среда.


Каждый человек с активным бациллярным туберкулёзом за время болезни заражает в среднем 10-15 человек.


Опасность представляют  больные туберкулёзом животные. Заражение обычно происходит при употреблении продуктов (чаще всего молочных), не подвергшихся термической обработке.

Общими симптомами активного легочного туберкулеза являются кашель иногда с мокротой и кровью, боль в груди, слабость, потеря веса, лихорадка и ночной пот.

Профилактика туберкулеза.

Существуют специфические и неспецифические методы профилактики туберкулеза.

Специфические методы профилактики  туберкулеза включают: проведение противотуберкулезных прививок (вакцинацию и ревакцинацию БЦЖ). Вакцинация БЦЖ в нашей стране проводится всем здоровым новорожденным  на 3-7 день жизни, непосредственно в родильном доме.  На введение вакцины против туберкулёза у новорожденных развивается иммунитет  к этой инфекции, но к 7 годам он снижается. Поэтому в возрасте 7 лет проводится повторное введение вакцины (ревакцинации).

К неспецифическим методам профилактики относятся: соблюдение режима труда и отдыха, правил личной гигиены, рациональное питание, отказ от курения и употребления алкоголя, закаливание, занятия физкультурой, благоприятные жилищно-бытовые условия и труда, своевременное обращение к врачу в случае симптомов заболевания (длительный кашель, небольшое длительное повышение температуры тела, постоянная беспричинная слабость, потливость по ночам, плохое самочувствие, потеря веса, боли в груди и одышка).

Методы раннего выявления туберкулёза. Основным методом, применяемым для профилактического обследования детского населения в целях раннего выявления туберкулеза, а также  инфицирования  возбудителями туберкулеза у детей и подростков, рекомендуемым Всемирной организацией здравоохранения,  является туберкулинодиагностика (постановка реакции Манту), которая в нашей стране проводится с 40-х годов прошлого века и зарекомендовала себя как эффективный метод, позволяющий предупредить заболевание, а также  инвалидизацию и смертность от туберкулеза среди детей.

Туберкулинодиагностика (проба Манту) у детей (до 18 лет) осуществляется ежегодно, а в группах высокого риска инфицирования и заболевания туберкулезом — 2 раза в год (дети  с заболеваниями желудочно- кишечного тракта, сахарным диабетом и др., а также  не вакцинированные против туберкулеза).

Внимание: туберкулин не является вакциной, это не прививка! 

Обращаем  внимание, что существуют альтернативные методы обследования на туберкулез,  которые позволяют получить заключения фтизиатра о наличии или отсутствии заболевания туберкулезом и решения вопроса о допуске детей в детскую организацию. Такими методами являются внутрикожный диагностический тест-аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении (Диаскинтест),  рентгенография органов грудной клетки (малодозные рентгеновские аппараты).

Всё население в возрасте старше 15 лет подлежит флюорографическому обследованию 1 раз в 2 года, кроме профессиональных  и других групп населения, определённых законодательством Российской Федерации подлежащих обследованию 1 или 2 раза в год. При флюорографии выявляется не только туберкулёз, но и онкологические заболевания.

Где  можно пройти флюорографию?

В поликлинике  по месту жительства, при наличии паспорта и страхового полиса. При этом необходимо помнить, что своевременно пройденное флюорографическое обследование – залог  раннего выявления туберкулеза и, в конечном итоге, первый шаг к выздоровлению.

Берегите своё здоровье и здоровье близких людей!
 

Страница не найдена |

Страница не найдена |

404. Страница не найдена

Архив за месяц

ПнВтСрЧтПтСбВс

22232425262728

       

       

     12

       

     12

       

      1

3031     

     12

       

15161718192021

       

25262728293031

       

    123

45678910

       

     12

17181920212223

31      

2728293031  

       

      1

       

   1234

567891011

       

     12

       

891011121314

       

11121314151617

       

28293031   

       

   1234

       

     12

       

  12345

6789101112

       

567891011

12131415161718

19202122232425

       

3456789

17181920212223

24252627282930

       

  12345

13141516171819

20212223242526

2728293031  

       

15161718192021

22232425262728

2930     

       

Архивы

Мар

Апр

Май

Июн

Июл

Авг

Сен

Окт

Ноя

Дек

Метки

Настройки
для слабовидящих

Как попасть в детский сад, если нет возможности сделать манту? | ЗДОРОВЬЕ: Медицина | ЗДОРОВЬЕ

Действительно, в федеральном законодательстве прописано, что те дети, которые не прошли диагностику на туберкулез, не допускаются в дошкольное учреждение. Чтобы попасть в сад, родителям необходимо взять заключение врача-фтизиатра об отсутствии заболевания у ребенка. Это требование направлено на защиту прав других детей, посещающих сад. Т.е. законодательство гарантирует, что в одну группу не попадут здоровые дети с отрицательными пробами и непроверенных малыш — потенциальный носитель инфекции.

Более чем в 50% случаев туберкулез у детей протекает бессимптомно, поэтому основным методом выявления заболевания у дошкольников является туберкулинодиагностика, основанная на выявлении реакции чувствительности в ответ на присутствие бактерий туберкулёза организме — проба Манту или Диаскинтест, сообщает пресс-служба Департамента здравоохранения Тюменской области.

Кроме бесплатных методов обследования по полису обязательного медицинского страхования, с 2015 года в Тюмени есть возможность обследования детей на туберкулез альтернативным методом на коммерческой основе — тест T-SPOT-TB. Данный тест может быть применен в случаях, когда нет возможности провести внутрикожную пробу (дерматиты, токсико-аллергические реакции на туберкулин, отказ родителей). На основании этого теста врач-фтизиатр может выдать заключение для детского сада, пояснили в областном департаменте образования.

В детский сад предоставляется только справка фтизиатра об отсутствии у ребёнка заболевания. Периодичность ее предоставления определена приказом Министерства здравоохранения РФ. Начиная с 12-месячного возраста и до 7 лет включительно, обследование проводится ежегодно, для детей группы риска – с 6 месячного возраста дважды в год. Диаскинтест проводят один раз в год всем детям с 8 до 17 лет включительно, независимо от результата предыдущих проб.

Чтобы врач-фтизиатр смог оформить для вашего ребенка справку или медицинское заключение, необходимы: результаты скринингового обследования на туберкулез; результаты альтернативных методов обследования; результаты флюорографического обследования окружения ребенка давностью не более 6 месяцев; данные рентгенологических методов исследования органов грудной клетки ребёнка; данные о контакте с больными туберкулезом; отсутствие или наличие у ребенка жалоб или симптомов, похожих на заболевание туберкулезом.

Справка

В России ситуация с заболеваемостью туберкулезом оценивается как неблагополучная. Болеют люди из всех социальных слоев. Высокая инфицированность и заболеваемость туберкулезом детей также свидетельствует о наличии источников инфекции среди населения. Своевременное прохождение иммунодиагностики препятствует проникновению в организованные детские коллективы больных туберкулёзом, а также позволит своевременно выявить инфицирование, что вносит существенный вклад в снижение заболеваемости у детей.

Смотрите также:

Возможности иммунологических тестов в диагностике латентной туберкулезной инфекции и туберкулеза | Слогоцкая

1. Богородская Е. М., Белиловский Е. М., Пучков К. Г., Сенчихина О. Ю., Шамуратова Л. Ф. Заболеваемость туберкулезом детей раннего возраста в городе Москве и факторы, влияющие на нее // Туберкулез и социально значимые заболевания. – 2014. – № 5. – C. 16-23.

2. Борисов С. Е., Лукина Г. В., Слогоцкая Л. В. и др. Скрининг и мониторинг туберкулезной инфекции у ревматологических больных, получающих генно-инженерные биологические препараты // Туб. и болезни легких. – 2011. – № 6. – C. 42-50.

3. Киселев В. И., Барановский П. М., Пупышев С. А. и др. Новый кожный тест для диагностики туберкулеза на основе рекомбинантного белка ESAT-CFP // Молекулярная медицина. – 2008. – № 4. – C. 4-6.

4. Мейснер А. Ф., Овсянкина Е. С., Стахеева Л. Б. Выявление туберкулеза у подростков в Москве // Пробл. туб. – 2009. – № 1. – С. 40-45.

5. Мейснер А. Ф., Овсянкина Е. С., Стахеева Л. Б. Туберкулиндиагностика у детей. Скрытая (латентная) туберкулезная инфекция? // Пробл. туб. – 2008. – № 6. – С. 29-32.

6. Приказ Минздрава России от 21.03.2003 г. № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».

7. Приказ Минздрава России от 21.03.2017 г. № 124н «Об утверждении порядка и сроков проведения профилактических медицинских осмотров граждан в целях выявления туберкулеза».

8. Приказ Минздрава России от 29.12.2014 г. № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания» / М-во здравоохранения России. – М., 2014. – URL: https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70749840/.

9. Приказ Минздравсоцразвития России от 29.10.2009 г. № 855 «О внесении изменения в приложение № 4 к Приказу Минздрава России от 21 марта 2003 г. № 109».

10. Синицын М. В. Совершенствование противотуберкулезной помощи больным ВИЧ-инфекцией в условиях мегаполиса: Автореф. дис. … д-ра мед. наук. – М., 2019. – 47 с.

11. Слогоцкая Л. В. Эффективность кожного теста с аллергеном туберкулезным, содержащим рекомбинантный белок CFP10-ESAT6, в диагностике, выявлении и определении активности туберкулезной инфекции: Автореф. дис. … д-ра мед. наук. – М., 2011. – 45 с.

12. Слогоцкая Л. В., Богородская Е. М., Сенчихина О. Ю., Никитина Г. В. Кудлай Д. А. Формирование групп риска заболевания туберкулезом при различных иммунологических методах обследования детского населения // Рос. педиатрический журнал. – 2017. – № 20 (4). – С. 207-213.

13. Слогоцкая Л. В., Кочетков Я. А., Сенчихина О. Ю., Сельцовский П. П., Литвинов В. И. Динамика кожной пробы (диаскинтест) у детей при оценке активности туберкулезной инфекции // Туб. и болезни легких. – 2011. – № 2. – С. 59-63.

14. Слогоцкая Л. В., Сенчихина О. Ю., Никитина Г. В., Богородская Е. М. Эффективность кожного теста с аллергеном туберкулезным рекомбинантным при выявлении туберкулеза у детей и подростков Москвы в 2013 г. // Педиатрическая фармакология. – 2015. – № 1. – С. 99-103.

15. Фролова К. С., Борисов С. Е., Слуцкая О. М. Туберкулез у больных с воспалительными заболеваниями на фоне лечения ингибиторами ФНО-альфа // Туб. и социально значимые заболевания. – 2018. – № 2. – С. 31-41.

16. Aagaard C., Hoang T., Dietrich J., Cardona P-J., Izzo A. , Dolganov G. et al. A multistage tuberculosis vaccine that confers efficient protection before and after exposure // Nat. Med. Nature Publishing Group. – 2011. – Vol. 17. – P. 189-194. https://doi.org/10.1038/nm.2285.

17. Abubakar I., Drobniewski F., Southern J., Sitch A., Jackson C., Lipman M. et al. Prognostic value of interferon-γ release assays and tuberculin skin test in predicting the development of active tuberculosis (UK PREDICT TB): a prospective cohort study // Lancet. Infect. Dis. – 2018. – Vol. 18, № 10. – P. 1077-1087. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(18)30355-4.

18. Affronti L., Lind A., Ouchterlony O. et al. An evaluation of the polyacrylamide gel electrophoresis fractionation method for the production of Mycobacterium tuberculosis skin test preparations. I. Production, physiochemical characterization and serological analyses // J. Biol. – 1986. – Vol. 26. – P. 1-18.

19. Ahmad S. Pathogenesis, immunology, and diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection // Clin. Developmen. Immunol. – 2010. – Vol. 2011. – P. 1-17.

20. Aichelburg J., Tittes F., Breitenecker et al. Prognostic value of indeterminate IFN-γ release assay results in HIV-1 infection // J. Clin. Microbiol. – 2012. – Vol. 50, № 8. – P. 2767-2769.

21. Akahoshi T., Sasahara T., Namai R. et al. Production of macrophage inflammatory protein 3a (MIP-3a) (CCL20) and MIP-3a (CCL19) by human peripheral blood neutrophils in response to microbial pathogens in response to microbial pathogens // Infect. Immun. – 2003. – Vol. 71. – P. 524-526.

22. Al-Orainey I. Diagnosis of latent tuberculosis: can we do better? // Ann. Thorac. Med. – 2009. – Vol. 4. – P. 5-9.

23. Andersen P., Andersen A., Sorensen A., Nagai S. Recall of long-lived immunity to Mycobacterium tuberculosis infection in mice // J. Immunol. – 1995. – Vol. 154, № 7. – P. 3359-3372.

24. Andersen P., Munk M., Pollock J., Doherty T. Specific immune-based diagnosis of tuberculosis // Lancet. – 2000. – Vol. 356. – P. 1099-1104.

25. Auguste P., Tsertsvadze A., Pink J. et al. Accurate diagnosis of latent tuberculosis in children, people who are immunocompromised or at risk from immunosuppression and recent arrivals from countries with a high incidence of tuberculosis: systematic review and economic evaluation // Health Technology Assessment. – 2016. – Vol. 20, № 38. – P. 1-678. doi: 10.3310/hta20380.

26. Cardona P. A dynamic reinfection hypothesis of latent tuberculosis infection // Infection. – 2009. – Vol. 37, № 2. – P. 80-86.

27. Chegou N., Black G., Kidd M. et al. Host markers in QuantiFERON supernatants differentiate active TB from latent TB infection: preliminary report // BMC Pulm. Med. – 2009. – Vol. 16. – P. 9-21.

28. Chegou N., Heyckendorf J., Walzl G., Lange C., Ruhwald M. Beyondthe IFN-γhorizon: Biomarkers forimmunodiagnosisof infection with Mycobacterium tuberculosis // Eur. Respir. J. – 2014. – Vol. 43. – P. 1472-1486. https://doi.org/10.1183/09031936.00151413.

29. Chiappini E., Accetta G., Bonsignori F. , Boddi V. et al. Interferon-γ release assays for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in children: a systematic review and meta-analysis // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. – 2012. – Vol. 14. – P. 557-564.

30. Cole S., Brosch R., Parkhill J. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. – 1998. – Vol. 393. – P. 537-544.

31. Connell T., Curtis N., Ranganathan S., Buttery J. Performance of a whole blood interferon gamma assay for detecting latent infection with Mycobacterium tuberculosis in children // Thorax. – 2006. – Vol. 61. – P. 616-620.

32. Consensus meeting report: development of a Target Product Profile (TPP) and a framework for evaluation for a test for predicting progression from tuberculosis infection to active disease / World Health Organization. – Geneva, 2017 (WHO/HTM/TB/2017.18). Licence: CC BY-NC-SA3.0 IGO.

33. Cooper A., Mayer-Barber K, Sher A. Role of innate cytokines in mycobacterial infection // Mucosal Immunol. – 2011. – Vol. 4. – P. 252-260.

34. Daniel Т., Anderson P. The isolation by immunoabsorbent affinity chromatography and physiochemical characterization of Mycobacterium tuberculosis antigen // Am. Rev. Respir. Dis. – 1978. – Vol. 117. – P. 533-539.

35. Del Corral H., Paris S., Marin D. et al. IFNgamma response to Mycobacterium tuberculosis, risk of infection and in household contacts of tuberculosis patients in Colombia // PloSOne. – 2009. – Vol. 4, № 12. – Р. e8257.

36. Della Bella C., Spinicci M. , Grassi A., Bartalesi F., Benagiano M., Truthmann K. et al. Novel M tuberculosis specific IL-2 ELISpot assay discriminates adult patients with active or latent tuberculosis // PLoS ONE. – 2018. – Vol. 13, № 6. – e0197825.https://doi.org/10.1371/iournal.pone.0197825.

37. Demissie A., Leyten E., Abebe M., Wassie L., Aseffa A., Abate G. et al. Recognition of stage-specific mycobacterial antigens differentiates between acute and latent infections with Mycobacterium tuberculosis // Clin. Vaccine. Immunol. – 2006. – Vol. 13, № 2. – P. 179-186. doi.org/10.1128/CVI.13.2.179-186.2006.

38. Diel R., Goletti D., Ferrara G., Bothamley G., Cirillo D. et al. Interferon-gamma release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: a systematic review and meta-analysis // Eur. Respir. J. – 2011. – Vol. 37. – Р. 88-99.

39. Diel R., Loddenkemper R., Niemann S. et al. Negative and positive predictive value of a whole-blood interferon-gamma release assay for developing active tuberculosis: an update // Amer. J. Resp. Crit. Care Med. – 2011. – Vol. 183. – P. 88-95.

40. Diel R., Loddenkemper R., Nienhaus A. Evidence-based comparison of commercial interferon-gamma release assay for detecting active TB: a metaanalysis // Chest. – 2010. – Vol. 137, № 4. – P. 952-968.

41. Dietrich J., Aagaard C., Leah R. et al. Exchanging ESAT6 with ТВ 10.4 in an Ag85B fusion molecule-based tuberculosis subunit vaccine: efficient protection and ESAT6-based sensitive monitoring of vaccine efficacy // J. Immunol. – 2005. – Vol. 174. – P. 6332-6339.

42. Dogra S., Narang P., Mendiratta D. et al. Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India // J. Infect. – 2007. – Vol. 54, № 3. – P. 267-276.

43. Doherty Т., Wallis R., Zumla A. Biomarkers for tuberculosis disease status and diagnosis // Curr. Opin. Pulm. Med. – 2009. – Vol. 15, № 3. – P. 181-187.

44. Erkens G., Slump E., Verhagen M. et al. Monitoring latent tuberculosis infection diagnosis and management in the Netherlands // Eur. Resp. J. – 2016. – Vol. 47, № 5. – P. 1492-1501.

45. Esmail H., Barry С., Young, D., Wilkinson R. The ongoing challenge of latent tuberculosis // Phil. Trans. R. Soc. – 2014. – В. 369, 20130437.

46. Fox W., Ellard G., Mitchison D. Studies on the treatment of tuberculosis under taken by the British Medical Research Council tuberculosis units, 1946-1986, with relevant subsequent publications // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. – 1999. – Vol. 3. – P. 231-279.

47. Geluk A., van Meijgaarden K., Joosten S., Commandeur S., Ottenhoff T. Innovative strategies to identify M. tuberculosis antigens and epitopes using genome-wide analyses // Front. Immunol. – 2014. – Vol. 5. – P. 1-8.

48. Getahun H., Matteelli A., Chaisson R., Raviglione M. Latent Mycobacterium tuberculosis infection // N. Engl. J. Med. – 2015. – Vol. 372. – P. 2127-2135. doi: org/10.1056/NEJMra1405427 PMID: 26017823.

49. Gourgouillon N., de Lauzanne A., Cottart C.-H. et al. TNF-a/IL-2 ratio discriminates latent from active tuberculosis in immunocompetent children: a pilot study // Pediatr. Res. – 2012. – Vol. 72. – P. 370-374.

50. Guidelines on the management of latent tuberculosis infection / World Health Organization. ‒ Geneva, 2015 (WHO/HTM/TB/2015.01; http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/136471/1/9789241548908_eng.pdf?ua=1&ua=1.

51. Hanson C., Sotgiu G., Loddenkemper R. Ensuring that the diagnosis of tuberculosis accelerates progress towards the Millennium Development Goals // Eur. Respir. J. – 2014. – Vol. 44. – P. 1-4.

52. Harboe M., Oettinger T., Wiker H. et al. Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovisand for its absence in Mycobacterium bovis BCG // Infect. Immun. – 1996. – Vol. 64. – P. 16-22.

53. Hauck F., Neese B., Panchal A., El-Amin W. Identification and management of latent tuberculosis infection // Am. Fam. Physician. – 2009. – Vol. 79. – P. 879-886.

54. Hawn T., Day T., Scriba T., Hatheril l M., HanekomW., Evans T. et al. Tuberculosis vaccines and prevention of infection / Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2014. – Vol. 78. – P. 650-671. https://doi.org/10.1128/MMBR.00021-14.

55. Hill P., Fox A., Jeffries D. et al. Quantitative T-cell assay reflects infectious load of Mycobacterium tuberculosis in an endemic case contact model // Clin. Infect. Dis. – 2005. – Vol. 40. – P. 273-278.

56. Hinks T., Dosanjh D., Innes J. et al. Frequencies of region of difference 1 antigen-specific but not purified protein derivative-specific gamma interferon-secreting T cells correlate with the presence of tuberculosis disease but do not distinguish recent from remote latent infections // Infect. Immun. – 2009. – Vol. 77, № 12. – P. 5486-5495.

57. Implementing the end TB strategy: the essentials / World Health Organization. – Geneva, 2015 (WHO/HTM/TB/2015.31; http://www.who.int/tb/publications/2015/end_tb_essential.pdf?ua=1, accessed 18 July 2017).

58. Ishigame H., Kakuta S., Nagai T. et al. Differential roles of interleukin-17A and -17F in host defense against mucoepithelial bacterial infection and allergic responses // Immunity. – 2009. – Vol. 30. – P. 108-119.

59. JasenoskyL., Scriba T., Hanekom W., Goldfeld A. T-cells and adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans // Immunol. Rev. – 2015. – Vol. 264. – P. 74-87. https://doi.org/10.1111/imr.12274.

60. Jeong Y., Hur Y.-G., Lee H. et al. Discrimination between active and latent tuberculosis based on ratio of antigen-specific to mitogen-induced IP-10 production // J. Clin. Microbiol. – 2015. – Vol. 53. – P. 504-510.

61. Kamakia R., Kiazyk S., Waruk J., Meyers A., Ochanda J., Ball T., Oyugi J. Potential biomarkers associated with discrimination between latent and active pulmonary tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung.Dis. – 2017. – Vol. 21, № 3. – P. 278-285. http://dx.doi.org/10.5588/ijtld.16.0176.

62. Kim S., Park M., Kim Y. et al. The responses of multiple cytokines following incubation of whole blood from TB patients, latently infected individuals and controls with the TB antigens ESAT-6, CFP-10 and TB7.7 // Scand. J. Immunol. – 2012. – Vol. 76. – P. 580-586.

63. Latent tuberculosis infection: updated and consolidated guidelines for programmatic management / World Health Organization. – Geneva, 2018.

64. Lienhardt C., Fielding K., Hane A. et al. Evaluation of the Prognostic Value of IFN-γ Release Assay and Tuberculin Skin Test in Household Contacts of Infectious Tuberculosis Cases in Senegal // PLoS ONE. – 2010. – Vol. 5, № 5. – Р. e10508. doi:10.1371/journal.pone.0010508.

65. Lin P., Rodgers M., Smith L., Bigbee M., Myers A., Bigbee C. et al. Quantitative comparison of active and latent tuberculosis in the cynomolgus macaque model // Infect. Immun. – 2009. – Vol. 77. – P. 4631-4642. https://doi.org/10.1128/IAI.00592-09.

66. Lindestam A. C., Gerasimova A., Mele F., Henderson R., Swann J., Greenbaum J. et al. Memory T-cells in latent Mycobacterium tuberculosis infection are directed against three antigenicis lands and largely contained in aCXCR3+CCR6+Th2subset // PLoSPathog. – 2013. – Vol. 9. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003130.

67. Lönnroth K., Castro K., Chakaya J., Chauhan L., Floyd K., Glaziou P. et al. Tuberculosis control and elimination 2010-50: cure, care, and social development // Lancet. – 2010. – Vol. 375, № 9728. – P. 1814-1829. doi:10.1016/S0140-6736(10) 60483-7.

68. Lopez-Castejon G., Brough D. Understanding the mechanism of IL-1 b secretion // Cytokine Growth Factor Rev. – 2011. – Vol. 22. – P. 189-195.

69. Machingaidze S., Wiysonge C., Gonzalez-Angulo Y., Hatherill M., Moyo S., Hanekom W., Mahomed H. The utility of an Interferon Gamma release assay for diagnosis of latent tuberculosis infection and disease in children: a systematic review and meta-analysis // Pediatr. Infect. Dis. J. – 2011. – Vol. 14. – P. 694-700.

70. Mack U., Migliori G., Sester M. et al. LTBI: latent tuberculosis infection or lasting immune responses to Mycobacterium tuberculosis? A TBNET consensus statement // Eur. Respir. J. – 2009. – Vol. 33. – P. 956-973.

71. Mandalakas A., Detjen A., Hesseling A., Benedetti A., Menzies D. Interferon-gamma release assays and childhood tuberculosis: systematic review and meta-analysis // Int. J. Tuberc. Dis. – 2011. – Vol. 14. – P. 1018-1032.

72. Marın N., Parıs S., Rojas M., Garcıa L. Functional profile of CD4+ and CD8+ Tcellsin latently infected individuals and patients with active TB // Tuberculosis (Edinb). – 2013. – Vol. 93. – P. 155-166. https://doi.org/10.1016/j.tube.2012.12.002.

73. Matteelli A., Olliaro P., Signorini L. et al. Tolerability of twice-weekly rifabutin-isoniazid combinations versus daily isoniazid for latent tuberculosis in HIV-infected subjects: a pilot study // Int. J. Tuberc. Lung Dis. – 1999. – Vol. 3. – P. 1043-1046.

74. Menzies D., Pai M., Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research // Ann. Intern. Med. – 2007. – Vol. 146. – P. 340-354.

75. Metcalfe J., Everett C., Steingart K. et al. Interferon-gamma release assays for active pulmonary tuberculosis diagnosis in adults in low- and middle-income countries: systematic review and meta-analysis // J. Infect. Dis. – 2011. – Vol. 204 (Suppl. 4). – Р. 1120-1129.

76. Michelsen S. , Soborg B., Agger E., Diaz L., Hoff S., Koch A. et al. Host immunity to Mycobacterium tuberculosis and risk of tuberculosis: a longitudinal study among Greenlanders // Vaccine. – 2016. – Vol. 34. – P. 5975-5983. http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2016.09.047.

77. Michelsen S., Soborg B., Diaz L., Hoff S., Agger E., Koch A. et al. The dynamics of immune responses to Mycobacterium tuberculosis during different stages of natural infection: A longitudinal study among Greenlanders // PLoSONE – 2017. ‒ Vol. 12, № 6. – e0177906.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177906.

78. Mitchison D. Basic mechanisms of chemotherapy // Chest. – 1979. – Vol. 76, № 6. – P. 771-781.

79. Modlin R., Bloom B. TB or not TB: that is no longer the question // Sci. Transl. Med. – 2013. – Vol. 5. – P. 1-15. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3007402.

80. Noelle R., Nowak E. Cellular sources and immune functions of interleukin-9 // Nature Rev. Immunol. – 2010. – Vol. 10. – P. 1-12.

81. Nunes-Alves C., Booty M., Carpenter S., Jayaraman P., Rothchild A., Behar S. In search of a new paradigm for protective immunity to TB // Nat. Rev. Microbiol. – 2014. – Vol. 12. – P. 289-299. doi:10.1038/nrmicro3230.

82. Ottenhoff T., Kaufmann S. Vaccines against tuberculosis: Where are we and where do we need to go? // PLoSPathog. – 2012. – Vol. 8. – Р. e1002607. doi:10.1371/journal.ppat.1002607.

83. Pai M. Innovations in tuberculosis diagnostics: progress and translational challenges // EBioMedicine. – 2015. – Vol. 2, № 3. – P. 182-183. doi: 10.1016/j.ebiom.2015.01.018.

84. Pai M. Interferon-gamma assays in the immunodiagnosis of tuberculosis: a systematic review // Lancet. Infectious. Dis. – 2004. – Vol. 4, № 12. – P. 761-776.

85. Pai M., Behr M., Dowdy D., Dheda K., Divangahi M., Boehme C. et al. Tuberculosis // Nat. Rev. Dis. Primers. – 2016. – Vol. 2. – doi: 10.1038/nrdp.2016.76.

86. Pai M., Denkinger C., Kik S., Rangaka M., Zwerling A., Oxlade O. et al. Gamma interferon releaseassays for detection of Mycobacterium tuberculosis infection // Clin. Microbiol. Rev. – 2014. – Vol. 27. – P. 3-20. https://doi.org/10.1128/CMR.00034-13.

87. Pai M., Sotgiu G. Diagnostics for latent TB infection: incremental, not transformative progress // Eur. Respir. J. – 2016. – Vol. 47. – P. 704-706.

88. Penn-Nicholson A., Nemes E., Hanekom W., Hatherill M., Scriba T. Mycobacterium tuberculosis-specific CD4 Tcells are the principal source of IFN-γ in QuantiFERONassays in healthy persons // Tuberculosis. – 2015. – Vol. 95, № 3. – P. 6-7. https://doi.org/10.1016/j.tube.2015.03.002.

89. Rangaka M., Wilkinson K., Glynn J. et al. Predictive value of interferon-γ release assays for incident active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis // Lancet. Infect. Dis. – 2012. – Vol. 12. – Р. 45-55.

90. Rothel J, Andersen P. Diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: is the demise of the Mantoux test imminent? Expert Rev. // Anti. Infect. Ther. – 2005 – Vol. 3. – P. 981-993.

91. Santin M., Munoz L., Rigau D., Santin M. Interferon-γ release assays for the diagnosis of tuberculosis and tuberculosis infection in HIV-infected adults: a systematic review and meta-analysis // PLOS One. – 2012. – Vol. 7, № 3. – Р. e32482.

92. Slogotskaya L., Bogorodskaya E., Ivanova D., Sevostyanova T. Comparative sensitivity of the test with tuberculosis recombinant allergen, containing ESAT6-CFP10 protein, and Mantoux test with 2 TU PPD-L in newly diagnosed tuberculosis children and adolescents in Moscow // Plos ONE. – 2018. – Vol. 13, № 12. – Р. e0208705.

93. Slogotskaya L., Litvinov V., Kochetkov Ya., Ovsyankina E., Kudlay D., Seltsovsky P., Nikolenko N., Ivanova D., New skin test with recombinant protein CFP10-ESAT6 in patients (children and adults) with tuberculosis, non-tuberculosis disease and latent TB infection // Eur. Respir. J. – 2012. – Vol. 40, № 56. – P. 416.

94. Slogotskaya L. V., Bogorodskaya E., Sentchichina O., Ivanova D., Nikitina G., Litvinov V., Seltsovsky, P., Kudlay D. A., Nikolenko N., Borisov S. Effectiveness of tuberculosis detection using a skin test with allergen recombinant (CFP-10-ESAT-6) in children // Eur. Respir. J. – 2015. – Vol. 46, № S59. – РА4524.

95. Slogotskaya L. V., Bogorodskaya Е., Ivanova D., Makarova M., Guntupova L., Litvinov, V., Seltsovsky P., Kudlay D. A., Nikolenko N. Sensitivity and specificity of new skin test with recombinant protein CFP10-ESAT6 in patients with tuberculosis and individuals with non- tuberculosis diseases // Eur. Respir. J. – 2013. – Vol. 42, № S57. – P. 1995.

96. Slogotskaya L. V., Litvinov V., Ovsyankina E. , Seltsovsky P., Kudlay D. A. Results of Quantiferon-TB GOLD IN-TUBE and skin testing with recombinant proteins CFP-10-ESAT-6 in children and adolescents with TB or latent TB infection // Paediatric. Respir. Rev. – 2013. – Vol. 14, № 2. – P. 65.

97. Steingart К., Dendukuri N., Henry M. et al. Performance of purified antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis: meta-analysis // Clin. Vac. Immunol. – 2009. – Vol. 16, № 2. – P. 260-276.

98. Sun L., Xiao J., Miao Q., Feng W., Wu X., Yin Q., Jiao W., Shen C., Liu F., Shen D., Shen A. Interferon gamma release assay in diagnosis of pediatric tuberculosis: a meta-analysis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. – 2011. – Vol. 14. – P. 165-173.

99. Tuberculosis: сlinical diagnosis and management of tuberculosis, and measures for its prevention and control / National Сollaborating Сentre for Chronic Conditions, Centre for Clinical Practice at the National Institute for Health and Clinical Excellence. ‒ London: NICE; 2011.

100. Wang S., Diao N., Lu C. et al. Evaluation of the diagnostic potential of IP-10 and IL-2 as biomarkers for the diagnosis of active and latent tuberculosis in a BCG-vaccinated population // PLOS ONE. – 2012. ‒ Vol. 7. ‒ Р. e51338.

101. Wood R., Middelkoop K., Myer L. et al. Undiagnosed tuberculosis in a community with high HIV prevalence: implications for tuberculosis control // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. – 2007. – Vol. 175. – P. 87-93.

102. Zak D., Penn-Nicholson A., Scriba T. et al. A blood RNA signature for tuberculosis disease risk: a prospective cohort study // Lancet. – 2016. – Vol. 387. – P. 2312-2322. http://dx.doi.org/10.10l6/S0140-6736(15)013l6-1.

Специфическое и быстрое обнаружение комплекса Mycobacterium tuberculosis в клинических образцах с помощью полимеразной цепной реакции

Предпосылки . Туберкулез — глобальная проблема здравоохранения, широко распространенная в Индии, — всегда была серьезной проблемой при постановке окончательного диагноза. Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время широко используются для раннего обнаружения и видовой дифференциации микобактерий, но в основном со своими ограничениями. Мы стремимся обнаруживать и дифференцировать Mycobacterium tuberculosis (Mtb) инфекций, выбирая соответствующие последовательности-мишени, идеально присутствующие во всех видах микобактерий (комплекс MTB ) и отсутствующие у других. Методы . Амплификация трех целевых последовательностей из неродственных генов, а именно hsp 65 (165 п.н.), dnaJ (365 п.н.) и вставочного элемента IS 6110 (541 п.н.), с помощью ПЦР была проведена в клинических образцах из подозрительных случаев. туберкулеза / микобактериозов и здорового контроля. Результаты . Чувствительность этого метода колебалась от 73,33% до 84,61%, а специфичность — 80%. Метод ПЦР был значительно лучше (и), чем методы мазка и посева. Заключение . Наш метод ПЦР на основе тримаркеров может специфически обнаружить M. tuberculosis и MTB комплексную инфекцию от основных патогенных NTM и непатогенных микобактерий. Этот метод, хорошо различая комплекс MTB и NTM, представляет собой быстрый и точный метод более эффективного обнаружения и диагностики микобактериальных инфекций и, таким образом, может помочь в улучшении ведения пациентов, особенно с учетом роста микобактериальных инфекций из-за появления NTM в течение прошлые десятилетия.

1. Введение

Туберкулез является серьезной проблемой общественного здравоохранения, в 2006 г. от туберкулеза (ТБ) зарегистрировано 9,2 миллиона новых случаев заболевания и 1,7 миллиона случаев смерти. На Индию приходится пятая часть глобального бремени ТБ (ВОЗ, 2008) число которых растет из-за множественной лекарственной устойчивости и высоковирулентных штаммов Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) [1] и комбинированного действия ВИЧ. Точный диагноз туберкулеза желателен до начала противотуберкулезной терапии [2].Лабораторная диагностика Mtb в зависимости от мазка на кислотоустойчивые бациллы (КУБ) может дать результат в течение 24 часов. Однако мазок не очень специфичен для Mtb , а также требует от 10 3 до 10 4 организмов на мл мокроты. Бактериальный посев превосходит мазок на КУБ как по чувствительности, так и по специфичности. Но, поскольку микобактерии предъявляют очень строгие требования к росту, методы диагностики на основе культуры работают медленно. Кроме того, диагностика, включающая радиологическое обследование и туберкулиновую пробу, в некоторой степени помогает выявить заболевание, но не очень надежна в случае внелегочного туберкулеза.Однако система BACTEC дает очень быстрый результат по сравнению с культивированием, но она дорогая и требует работы с радиоизотопами (BACTEC 460). Флуорометрический BACTEC MGIT 960 — быстрый, эффективный и чувствительный, но дорогостоящий для использования в бедных странах. В связи с этим точная и ранняя диагностика туберкулеза (ТБ) является критическим шагом в ведении и контроле туберкулеза. Полимеразная цепная реакция до сих пор была очень полезным инструментом для быстрого обнаружения микобактериальной ДНК в клинических образцах, таких как мокрота, бронхиальный лаваж, спинномозговая жидкость (CSF) и асцитическая жидкость.Однако внутренние тесты сильно различаются по своей точности, а факторы, способствующие неоднородности в точности тестов, недостаточно изучены. Окончательная диагностика туберкулеза и микобактериозов (нетуберкулезные микобактерии (НТМ) инфекции) всегда была серьезной проблемой. Эти методы также имеют свои ограничения из-за региональных вариаций генома микобактерий [3–5]. В нашем исследовании описан анализ ПЦР с использованием MTB -специфичных ДНК-маркеров, включающих целевые фрагменты 165, 365 и 541 п.н. трех неродственных генов, а именно hsp 65, dnaJ и вставочного элемента IS 6110 , соответственно, из М.tuberculosis у пациентов с подозрением на туберкулез из Калькутты, Индия. Принимая во внимание рост микобактериальных инфекций в результате появления НТМ за последние десятилетия, также существует потребность в методе, который может обнаруживать практически любой глубоко укоренившийся микобактериальный организм, присутствующий в небольшом количестве в предполагаемых клинических образцах, независимо от принадлежности к микобактериальным видам.

2. Материалы и методы
2.1. Субъекты

Образцы исследования представляли собой подозреваемые случаи туберкулеза легких, посещавшие амбулаторное отделение грудной клетки Калькуттского национального медицинского колледжа и больницы (CNMCH).Это исследование было одобрено этическими комитетами участвующих учреждений, и все субъекты подписали документы об информированном согласии перед тем, как участвовать в этом исследовании. Всего было изучено 60 субъектов, включая подозреваемых и здоровых людей. Случаи с подозрением на ТБ были дополнительно разделены на три группы (Группы I – III) на основании результатов лабораторной диагностики (мазок на КУБ, посев и переднезадний рентген грудной клетки), клинических симптомов и анамнеза. Клинико-демографические данные по исследуемым предметам представлены в таблице 1.У всех пациентов было собрано от пяти до десяти мл образцов мокроты ранним утром. Все образцы были смазаны и подвергнуты скринингу с помощью обычного микробиологического теста, такого как быстрое окрашивание кислотой Циля-Нильсена для регистрации положительных результатов мазка, и затем культивированы на наклонных поверхностях Левенштейна-Йенсена в соответствии со стандартным методом. В группе I () были случаи, которые были положительными по окрашиванию мазка по Цилю-Нильсену, а также положительными по культуре, тогда как в группе II () были отрицательные по мазку, но положительные по культуре и радиологии образцы.У некоторых пациентов () лабораторный диагноз инфекции Mtb был отрицательным, но на основании их клинических симптомов они были сочтены имеющими другие респираторные заболевания (кроме PTB) или микобактериозы (группа III). Однако у этих пациентов не было истории болезни туберкулеза и последующего лечения. У здоровых контрольных субъектов (обозначенных как Gr IV) не было клинических симптомов или истории болезни, и им был поставлен отрицательный диагноз на инфекцию Mtb (бактериологически отрицательный).Все 60 образцов были дополнительно проанализированы методом ПЦР.


Категория Статус образцов Образцы
( n )
Возраст
(Диапазон)
Пол (мужской / женский)
( n )
* Окрашивание КБП
(ZN) #
Культура Рентген Другое

Группа I + + + + 26 14– 72 19/7
Группа II + + + 15 14–65 10/5
Группа III + 9 14–75 4/5
Группа IV 10 15–60 8/2

* КУБ: кислотоустойчивые бациллы; # Z-N: ziehl-neelsen; +: положительный; -: отрицательный.
2.2. Выделение ДНК из образцов мокроты

Образцы мокроты обеззараживали с последующим выделением ДНК в соответствии с ранее опубликованным методом [6].

2.3. ПЦР-амплификация

ПЦР-амплификация нацелена на две консервативные области и один элемент вставки микобактериального генома. Консервативную область размером 165 п.н. гена, кодирующего белок антигена Дальтона размером 65 кДа M. tuberculosis , амплифицировали с использованием набора праймеров, опубликованного ранее [7].Аналогичным образом, участок длиной 365 п.н. (между положениями последовательности 1377–1741) гена dnaJ M. tuberculosis амплифицировали с использованием специфичных для рода праймеров, описанных ранее Takewaki et al. (1993) [8]. Область длиной 541 п.н. внутри вставочного элемента IS6110 из M. tuberculosis амплифицировали с использованием олигонуклеотидов, обозначенных Kox et al. Как Pt-8 и Pt-9. 1994 [9]. Десять микролитров амплифицированного продукта ПЦР фракционировали электрофоретически на 2% агарозном геле, окрашивали бромидом этидия и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе для точности и специфичности амплификации ПЦР, используя гидролизат PhiX174 HaeIII в качестве гена-линейки. Все амплификации ПЦР были подвергнуты внутренней лабораторной стандартизации с использованием матричной ДНК из эталонного штамма M. tuberculosis h47Rv в качестве положительного контроля (рис. 1). Вкратце, 50–100 нг очищенной тотальной клеточной ДНК амплифицировали с помощью термостабильной ДНК-полимеразы Taq в системе Gene Amp PCR 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Чтобы установить положительный результат, мы добавили 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 1,5–2,5 мм MgCl 2 , 0,01% (мас. / Об.) Желатина, 20–50 пмоль соответствующего праймеры (описанные ранее), 2.0–2,5 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), 1 ед. ДНК-полимеразы Taq (Applied Biosystems, Foster City, CA). Условия цикла ПЦР были небольшими модификациями ранее опубликованного для фрагмента гена hsp размером 165 пар оснований (94 ° C в течение 20 секунд для денатурирования ДНК, затем охлаждение до 63 ° C в течение 20 секунд, нагревание до 72 ° C в течение 1 минуты для удлинения. , цикл повторяется 30 раз с окончательной инкубацией при 72 ° C в течение 10 мин), для фрагмента гена dnaJ длиной 365 п.н. (94 ° C в течение 30 с для денатурирования ДНК, затем охлаждают до 65 ° C в течение 60 с, нагревают до 72 ° C для 2.5 мин для удлинения, цикл повторяется 35 раз с окончательной инкубацией при 72 ° C в течение 10 мин) и для последовательности IS6110 541 п.н. (94 ° C в течение 60 с для денатурирования ДНК, затем охлаждают до 65 ° C в течение 1,5 мин, нагревают до 72 ° C в течение 3,5 минут для продления, цикл повторяется 38 раз с окончательной инкубацией при 72 ° C в течение 10 минут) микобактериальной ДНК. На рисунке 2 показано усиление всех вышеупомянутых генетических маркеров в клинических образцах.



2.4. Статистический анализ

Чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) и тесты хи-квадрат были рассчитаны с использованием программного обеспечения ACASTAT [10]. Результаты и значения критериев хи-квадрат были нескорректированными, если не указано иное. Статистически значимым считалось значение ≤0,05.

3. Результаты

Из 60 исследованных образцов 26 были положительными по окраске мазка по Цилю-Нильсену, а также положительны по культуре (группа I). Мы определили 22 образца Gr I как положительные с помощью ПЦР (84,62%). Из 15 образцов группы II (отрицательный мазок, но посев и радиологически положительный) 11 образцов (73,33%) оказались положительными по методу ПЦР.Таким образом, наша полимеразная цепная реакция на основе тримаркерной системы выявила 33 (80,5%) положительных из 41 пациента (вместе группы Gr I и II). Мы также обнаружили, что 7 образцов (77,78%) из 9 из Группы были положительными для гена dnaJ длиной 365 п.н. (но не для остальных двух генов), что указывает на то, что они могут быть случаями микобактериоза, но не туберкулеза. В контроле (Gr IV,) ни один из 3 маркеров, используемых в этом исследовании, не был положительным по результатам ПЦР. Однако было 4 образца в Gr I и 2 в Gr II, которые не могли быть амплифицированы для IS6110, , возможно, из-за присутствия ингибиторов ПЦР.Точно так же 2 образца в Gr II не амплифицировались для маркера гена hsp 65 . Результаты ПЦР-амплификации для Gr III четко продемонстрировали инфицирование нетуберкулезными микобактериями. Специфичность этого исследования составляла 80%, а диапазон чувствительности — от 73,33% (группа II) до 84,61% (группа I). Кроме того, PPV и NPV составили 77,78–91,67% и 66,67–80% соответственно. По сравнению с методами мазка и посева результаты были статистически значимыми (и, соответственно), показывая, что метод ПЦР имел значительно более высокую способность обнаруживать туберкулез, вызванный комплексом Mycobacterium tuberculosis .Результаты этого исследования представлены в таблицах 2, 3 и 4.


Категория Образцы ( n ) Результаты ПЦР Без ПЦР-амплификации днк J
Положительный
n (%)
Чувствительность
(%)
Специфичность
(%)
ППС (%) ЧПС (%) Для ( n [%])
IS6110 hsp 65

Группа I 26 22 ( 84. 62) * 84,6 80 91,67 66,67 4 (15,38)
Группа II 15 11 (73,33) * 73,33 80 84,62 66,67 2 (13,33) 2 (13,33)
Группа III 9 7 (77,78) # 77,78 80 77,78 80 2 (22.22)
Группа IV 10 0 (0) 10 (100) 10 (100) 10 (100)

* Указывает на положительный результат для всех трех маркеров; # указывает положительный результат только для ДНК Дж; PPV: положительная прогностическая ценность; NPV: отрицательная прогностическая ценность.

Образцы Мазок n (%) PCR n (%) P

69
26 (43,33) 42 (70) 0,030 *
Отрицательный 34 (56,66) 18 (30)

* P значение <0.05.
Положительный

Образцы Культура n (%) PCR n (%) P

69
41 (68,33) 42 (70) 0,009 *
Отрицательный 19 (31,67) 18 (30)

* P значение <0. 05.
4. Обсуждение

Туберкулез легких — одно из очень инфекционных заболеваний, наиболее распространенных в Индии, но оно все еще сопряжено с проблемой окончательного диагноза. ПЦР-амплификация микобактериальной ДНК — это высокочувствительный и специфический метод выявления туберкулеза. Он также работает лучше, чем мазок (для обнаружения которого требуется образец> 10 000 бацилл / мл), а также метод культивирования (который имеет ограниченные условия роста). В этих случаях ПЦР помогает диагностировать, вызван ли положительный результат (мазок или посев) комплексными бактериями MTB или другой нетуберкулезной инфекцией.В случае отрицательного окрашивания по Цилю-Нильсену ПЦР помогает подтвердить диагноз. Наши данные ясно показали, что существует значительная разница между методами мазка и ПЦР () и между методами посева и ПЦР (), что еще раз свидетельствует о том, что в этом исследовании метод ПЦР оказался лучше, чем методы мазка и посева. Однако многие из микобактериальных ПЦР-тестов с использованием видоспецифичных праймеров позволяют обнаруживать один или ограниченное количество видов микобактерий [11–16]. Эффективность и успех любого метода быстрой диагностической ПЦР зависят от соответствующих последовательностей ДНК-мишеней, выбранных для амплификации.В этом исследовании выбранная система маркеров идеально подходит для большинства видов микобактерий ( M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum и M. microti ) комплекса MTB . Успех этого метода для обнаружения и идентификации микобактерий еще больше увеличился за счет включения одной целевой последовательности ( dnaJ ген) для NTM. Недавно опубликованный метаанализ [17] продемонстрировал, что использование IS6110 в качестве мишени для амплификации в значительной степени связано с повышенной точностью детекционного теста на основе ПЦР.Однако, хотя эта последовательность присутствует в нескольких копиях в бактериальном геноме, у некоторых штаммов из определенных частей мира она отсутствует [18, 19], и это может привести к ложноотрицательным результатам, которые еще больше повлияют на чувствительность анализа. Возможное решение этой проблемы — амплификация более чем одной целевой последовательности. Следовательно, в нашем исследовании мы также использовали последовательности ДНК-мишени размером 165 и 365 п.н. Генный маркер dnaJ длиной 365 п.н. является специфичным для рода, он имеет более широкий спектр обнаружения и может быть амплифицирован от всех микобактериальных (включая нетуберкулезные и непатогенные) виды, тогда как генный маркер с 541 п.н. IS6110 и 165 п.н. Последовательности гена антигенного белка kDa могут быть амплифицированы практически от всех видов микобактерий комплекса MTB (но не из NTM) [7, 9], что объясняет их более высокую чувствительность.До сих пор ни одна целевая последовательность не обеспечивала 100% чувствительность и полное отсутствие ложноположительных результатов при использовании отдельно. Также было замечено, что мультиплексная ПЦР не способствовала повышению диагностической точности в большом метааналитическом исследовании [17]. Наш метод ПЦР на основе тримаркера может точно и точно определять клинически важные микобактериальные инфекции, такие как M. tuberculosis , M. tuberculosis , за исключением M. tuberculosis (особенно M.bovis ) и дифференцировать их от основных патогенных NTM и непатогенных микобактерий. Таким образом, этот метод представляет собой быструю и эффективную технику диагностики туберкулезной инфекции и дифференциации ее от других микобактериальных инфекций с целью улучшения ведения пациентов. Однако, поскольку некоторые образцы не могли быть должным образом амплифицированы для определенных последовательностей ДНК в этом исследовании, важно учитывать ингибиторы ПЦР, и чувствительность анализа может дополнительно улучшиться при эффективном контроле таких ингибиторов.

5. Выводы

В исследовании представлена ​​методика ПЦР на основе тримаркеров, которая также применима к широкому спектру клинических образцов и, следовательно, оценивается как полезная методика при диагностике туберкулеза легких. Этот метод очень полезен в случаях, когда окрашивание по Цилю-Нильсену и / или результаты посева отрицательны. За счет включения одного относительно менее специфичного маркера (365 п.н., dnaJ ген) этот метод ПЦР также способствует различению комплексно-специфической инфекции MTB от нетуберкулезных или непатогенных микобактериальных инфекций.Тот факт, что амплификация ДНК может обнаруживать последовательности ДНК микобактерий в присутствии избыточных количеств ДНК человека, делает ее особенно полезной, когда в определенных клинических обстоятельствах требуются быстрые результаты. Это также может быть полезно, когда требуется крупномасштабный скрининг микобактерий, например, в некоторых странах, где туберкулез все еще является эндемическим заболеванием и остается серьезной проблемой общественного здравоохранения.

Благодарности

Авторы выражают искреннюю благодарность доктору Р.Триведи за ее добрые предложения. Доктору Индранату Гхошу за его помощь в сборе клинических образцов и доктору С. К. Саха за его огромную помощь в диагностике и категоризации субъектов исследования. А. Сингх благодарит Управление судебной экспертизы Министерства внутренних дел правительства Индии за стипендию для старшего научного сотрудника. Эта работа была поддержана финансовым грантом Центральной лаборатории судебной экспертизы, Калькутта, в рамках пятилетнего плана правительства Индии. Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Рекомендации по подходу, мазок мокроты, тесты на амплификацию нуклеиновых кислот

Автор

Thomas E Herchline, MD Профессор медицины, Государственный университет Райта, Медицинский факультет Буншофт; Медицинский консультант, Общественное здравоохранение, Туберкулезная клиника округа Дейтон и Монтгомери (Огайо)

Томас Э. Херклайн, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американского общества инфекционных болезней, Общества инфекционных болезней Огайо

Раскрытие информации: Выступать (г) в качестве докладчика или члена бюро докладчиков для: Med Learning Group
Получил исследовательский грант от: Regeneron.

Соавтор (ы)

Джудит К. Амороса, доктор медицины, FACR Клинический профессор радиологии и заместитель председателя по развитию профессорско-преподавательского состава и медицинского образования, Медицинская школа Рутгерса Роберта Вуда Джонсона

Джудит К. Амороса, доктор медицины, FACR является членом следующих медицинских обществ: Американский колледж радиологии, Американское общество рентгеновских лучей, Ассоциация университетских радиологов, Радиологическое общество Северной Америки, Общество торакальной радиологии

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Главный редактор

Майкл Стюарт Бронз, доктор медицины Дэвид Росс Бойд Профессор и председатель медицинского факультета, кафедра внутренней медицины, кафедра медицины, Научный центр здоровья Университета Оклахомы; Магистр Американского колледжа врачей; Научный сотрудник Американского общества инфекционных болезней; Член Королевского колледжа врачей, Лондон

Майкл Стюарт Бронз, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американский колледж врачей, Американская медицинская ассоциация, Ассоциация профессоров медицины, Общество инфекционных болезней Америки, Медицинская ассоциация штата Оклахома, Южное общество клинических исследований

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Благодарности

Эрика Банг Медицинский центр Медицинского центра Университета штата Нью-Йорк, Нижний штат Нью-Йорк,

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Дайана Брейнард, MD Консультант, Отделение инфекционных заболеваний, Массачусетская больница общего профиля

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Памела С. Чавис, доктор медицины Профессор кафедры офтальмологии и неврологии Медицинского университета Южной Каролины, Медицинский колледж

Памела С. Чавис, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии неврологии, Американской академии офтальмологии и Североамериканского общества нейроофтальмологов

Дирк М. Элстон, доктор медицины Директор, Академия дерматопатологии Акермана, Нью-Йорк

Дирк М. Элстон, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Теодор Дж. Гаэта, DO, MPH, FACEP Клинический доцент кафедры неотложной медицины Медицинского колледжа Вейл Корнелл; Заместитель председателя и программный директор резидентуры по неотложной медицине, Департамент неотложной медицины, Методистская больница Нью-Йорка; Академический руководитель, адъюнкт-профессор кафедры неотложной медицины, медицинский факультет Университета Святого Георгия

Теодор Дж. Гаэта, DO, MPH, FACEP является членом следующих медицинских обществ: Альянса клинического образования, Американского колледжа врачей неотложной помощи, руководителей отделов неотложной медицины, Совета директоров резидентур по неотложной медицине, Нью-Йоркской медицинской академии и Общество академической неотложной медицины

Аарон Глатт, доктор медицины Профессор клинической медицины Нью-Йоркского медицинского колледжа; Президент и генеральный директор, бывший главный врач отделения медицины и инфекционных заболеваний больницы Святого Иосифа (ранее — больница Нью-Айленд)

Аарон Глатт, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа грудных врачей, Американского колледжа врачей, Американского колледжа врачей, Американского колледжа врачей — Американского общества внутренней медицины, Американской медицинской ассоциации, Американского общества микробиологии. , Американское торакальное общество, Американская ассоциация венерических заболеваний, Американское общество инфекционных заболеваний, Международное общество по СПИДу и Общество здравоохранения и эпидемиологии Америки

Саймон К. Лоу, доктор медицины, фармацевт Клинический профессор медицинских наук, кафедра офтальмологии, Глазной институт Жюля Стейна, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, медицинская школа Дэвида Геффена

Саймон К. Лоу, доктор медицинских наук, фармацевт является членом следующих медицинских обществ: Американской академии офтальмологии, Американского общества глаукомы и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Джон М. Лидом, доктор медицины Заслуженный профессор медицины Медицинской школы Кека Университета Южной Калифорнии

Джон М. Лидом, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американский колледж врачей — Американское общество внутренней медицины, Американское общество микробиологии, Американское общество инфекционных болезней, Международное общество по СПИДу и Phi Beta Kappa

Джеймс Ли, доктор медицины Бывший доцент, Отделение неотложной медицины, Гарвардская медицинская школа; Совет директоров Remote Medicine

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Джеффри Мефферт, доктор медицины Ассистент клинического профессора дерматологии, Школа медицины Техасского университета в Сан-Антонио

Джеффри Мефферт, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии дерматологии, Американской медицинской ассоциации, Ассоциации военных дерматологов и Техасского дерматологического общества

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Монте С. Мельцер, доктор медицины , начальник дерматологической службы, госпиталь Юнион Мемориал

Монте С. Мельцер, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha и Американской академии дерматологии

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Susannah K Mistr, MD Врач-ординатор, отделение офтальмологии, Медицинский центр Университета Мэриленда

Сюзанна К. Мистр, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии офтальмологии, Американского колледжа хирургов, Американской медицинской ассоциации, Американской ассоциации студентов-медиков / фонда, Американского общества катарактальной и рефракционной хирургии и Медицинской ассоциации Южной Каролины.

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Кэрол Э. Нэйси, доктор философии Адъюнкт-профессор, факультет биологии, Католический университет Америки; Адъюнкт-профессор кафедры тропической медицины и микробиологии, Университет Джорджа Вашингтона

Кэрол Нейси, доктор философии, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии микробиологии и Американского общества микробиологии

Раскрытие информации: Sequella, Inc. Доли собственности Занятость; Sequella, Inc. Инвестор, владеющий долей владения

Джеймс Роузи, доктор медицины Бывший директор службы роговицы, Институт катаракты и лазера Св. Луки

Джеймс Роуси, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии офтальмологии, Американской ассоциации развития науки, Американской медицинской ассоциации, Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии, Флоридской медицинской ассоциации, Панамериканской ассоциации офтальмологов. , Sigma Xi и Южная Медицинская Ассоциация

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Хэмптон Рой-старший, доктор медицины Доцент кафедры офтальмологии Медицинского университета Арканзаса

Хэмптон Рой старший, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии офтальмологии, Американского колледжа хирургов и Панамериканской ассоциации офтальмологов

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Джон Д. Шеппард-младший, доктор медицины, MMSc Профессор офтальмологии, микробиологии и молекулярной биологии, клинический директор, Центр глазной фармакологии Томаса Р. Ли, директор исследовательской программы ординатуры офтальмологии Медицинской школы Восточной Вирджинии; Президент, Virginia Eye Consultants

Джон Шеппард-младший, доктор медицины, MMSc является членом следующих медицинских обществ: Американской академии офтальмологии, Американского общества микробиологов, Американского общества катарактальной и рефракционной хирургии, Американского общества увеитов и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Ричард Х. Синерт, DO Профессор скорой помощи, клинический доцент медицины, директор по исследованиям Медицинского колледжа Государственного университета Нью-Йорка; Консультанты, отделение неотложной медицины, госпиталь округа Кингс

Ричард Х. Синерт, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа врачей и Общества академической неотложной медицины

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Франсиско Талавера, фармацевт, доктор философии Адъюнкт-профессор фармацевтического колледжа Медицинского центра Университета Небраски; Главный редактор Medscape Drug Reference

Раскрытие информации: Medscape Salary Employment

Кейт Цанг, MD Врач-резидент, клинический помощник инструктора, Отделение неотложной медицины, Государственный университет Нью-Йорка, Нижний штат Нью-Йорк, Госпиталь округа Кингс

Кейт Цанг, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа врачей скорой помощи, Ассоциации резидентов скорой медицинской помощи и Общества академической неотложной медицины

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Шьям Верма, MBBS, DVD, FAAD Клинический адъюнкт-профессор кафедры дерматологии Университета Вирджинии; Адъюнкт-профессор кафедры дерматологии Государственного университета Нью-Йорка в Стоунибруке, адъюнкт-профессор кафедры дерматологии Пенсильванского университета

Шьям Верма, MBBS, DVD, FAAD является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Ричард П. Винсон, доктор медицины Ассистент клинического профессора, кафедра дерматологии, Центр медицинских наук Техасского технического университета, Медицинская школа Пола Л. Фостера; Консультант, Дерматология Маунтин-Вью, PA

Ричард П. Винсон, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии дерматологии, Ассоциации военных дерматологов, Техасского дерматологического общества и Техасской медицинской ассоциации

.

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Эрик Л. Вайс, доктор медицины, DTM и H Медицинский директор, Управление непрерывности обслуживания и планирования на случай стихийных бедствий, директор по стипендии, Стипендия по медицине стихийных бедствий Медицинского центра Стэнфордского университета, председатель SUMC и LPCH Целевая группа по биотерроризму и готовности к чрезвычайным ситуациям, младший клинический исследователь, Департамент Хирургия (неотложная медицина), Медицинский центр Стэнфордского университета

Эрик Л. Вайс, доктор медицины, DTM & H является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа врачей скорой помощи, Американского колледжа медицины труда и окружающей среды, Американской медицинской ассоциации, Американского общества тропической медицины и гигиены, Врачи за социальную ответственность, Юго-восточный хирургический Конгресс, Южная ассоциация онкологии, Южное клиническое неврологическое общество и Общество дикой медицины

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Применение молекулярных методов для обнаружения и анализа передачи лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis у пациентов, посещающих референтную больницу в Италии | Журнал инфекционных болезней

Абстрактные

Молекулярный анализ лекарственно-устойчивых изолятов Mycobacterium tuberculosis был проведен в популяции с высокой распространенностью инфекции вируса иммунодефицита человека. Семьдесят один последовательный изолят был протестирован на генотипическую устойчивость к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу с помощью анализа полиморфизма однонитевой конформации полимеразной цепной реакции и автоматического секвенирования целевых областей.Фенотипическая и генотипическая устойчивость к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу была обнаружена у 23,4%, 11,2%, 7% и 5,6% изолятов и у 87%, 88%, 40% и 100% резистентных изолятов соответственно. Специфичность составила 100% для всех целевых регионов. При объединении анализа мутаций rpoB, katG и ahpC было идентифицировано 86% изолятов, устойчивых к любому лекарству. В изолятах, устойчивых к изониазиду, мутаций в inhA не обнаружено. Молекулярное определение лекарственной устойчивости, особенно к изониазиду и рифампицину, может представлять собой чувствительный и очень специфический метод.Стратегия выбора rpoB, katG и ahpC до позволяет быстро идентифицировать наиболее устойчивые изоляты с соответствующей экономией ресурсов.

Широкое распространение изолятов Mycobacterium tuberculosis , устойчивых к одному или нескольким противотуберкулезным препаратам, представляет собой одно из наиболее тревожных последствий туберкулеза, связанного со СПИДом, за последние годы. Задержка обнаружения, идентификации и тестирования на чувствительность изолятов, устойчивых к лекарствам, а также невозможность надлежащим образом изолировать заразных пациентов и начать адекватную химиотерапию были определены как факторы, предрасполагающие к внутрибольничной и внебольничной передаче устойчивых к лекарствам M.tuberculosis [1]. Молекулярные основы лекарственной устойчивости были идентифицированы для всех основных противотуберкулезных препаратов, а лекарственная устойчивость является результатом изменений в нескольких генах-мишенях, некоторые из которых все еще не определены [2–8]. Эти факторы подчеркивают необходимость быстрого выявления лекарственной устойчивости для лучшего ведения пациентов, а также для контроля вспышек и предотвращения будущей нозокомиальной передачи лекарственно-устойчивого туберкулеза.

Это исследование было разработано, чтобы установить молекулярные особенности устойчивых к лекарствам изолятов M.tuberculosis в популяции с высокой распространенностью инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), за которыми наблюдали в одном клиническом учреждении, где осуществляется специальная программа контроля для предотвращения внутрибольничной передачи туберкулеза. Чтобы оценить экспресс-методы тестирования лекарственной чувствительности, мы проанализировали эффективность автоматизированного анализа однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP) и автоматического прямого секвенирования при определении чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам.

Методы

В исследование были включены все пациенты, последовательно поступившие на отделение инфекционных болезней Католического университета с 1 октября 1994 г. по 1 июня 1997 г. с лихорадкой и / или респираторными заболеваниями и включенные в расширенную программу борьбы с туберкулезом. Клинические данные, включая ВИЧ-статус, иммиграционный статус, эпидемиологические контакты и предыдущее противотуберкулезное лечение или профилактику, были проспективно собраны для всех пациентов.

Обнаружение микобактерий проводилось с помощью кислотостойкого анализа; для выделения и идентификации использовали радиометрическую систему BACTEC 12B (Becton Dickinson, Sparks, MD) в сочетании с молекулярной гибридизацией.Тестирование фенотипической чувствительности проводилось с использованием системы BACTEC: изониазид был протестирован в концентрации 0,1 мкм г / мл, рифампицин в концентрации 2,0 мкм г / мл, стрептомицин в концентрации 6,0 мкм г / мл и этамбутол в концентрации 7,5 мкм г / мл. Результаты тестирования чувствительности BACTEC считались эталонным стандартом для расчета чувствительности и специфичности молекулярных тестов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и анализ нуклеотидной последовательности

Материал, собранный из культур BACTEC (индекс роста> 30), был подготовлен для ПЦР методом быстрой очистки, включая расщепление протеазой K (QIAmp; Qiagen, Hilden, Германия).Препараты ДНК амплифицировали в смеси для ПЦР 50- мкл л, содержащей 50 мкл M KCl, 10 мкМ M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 мкМ M MgCl 2 , 10% глицерин, 200 мкл. мкл M dNTP и 1,25 ед. Taq-полимеразы (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Экстрагированная ДНК в 2,5- мкл аликвотах л из каждого изолята и из полностью чувствительного эталонного штамма h47Rv использовалась в каждом цикле амплификации. Амплифицированные продукты подвергали электрофорезу в 2% агарозных гелях, окрашивали 0.5 мкг г / мл бромистого этидия и визуализировано с помощью просвечивания в УФ.

Используемые праймеры и условия ПЦР для каждой из целевых областей были взяты из опубликованных последовательностей [2–4, 6–8] (таблица 1). Подготовка матриц ДНК, амплификация ПЦР и пост-анализ продуктов ПЦР проводились в отдельных комнатах. Пипетки с положительным вытеснением использовались для всех дозировок реагентов и образцов.

Таблица 1

Условия для мутационного анализа полимеразной цепной реакции целевых областей, анализируемых на устойчивость к лекарствам у больных туберкулезом.

Таблица 1

Условия для мутационного анализа полимеразной цепной реакции целевых регионов, анализируемых на устойчивость к лекарствам у пациентов с туберкулезом.

SSCP и прямое автоматическое секвенирование ДНК

Анализ

SSCP выполняли, как описано ранее [6], в автоматическом секвенаторе (ALF Express; Pharmacia, Piscataway, NJ). Все паттерны SSCP сравнивали с паттернами полностью чувствительного эталонного штамма h47Rv, который проводили параллельно в каждом эксперименте.Автоматическое секвенирование ДНК проводили с использованием ранее описанных условий, за исключением 5′-биотинилирования одного из праймеров. Обе нити амплифицированной ДНК затем разделяли магнитным полем с использованием покрытых стрептавидином M-280 Dynabeads (Dynal, Осло), и реакции секвенирования проводили с помощью системы AutoRead Sequencing с использованием полимеразы Т7 (Pharmacia). Данные о последовательностях анализировали с помощью программного обеспечения DNASIS V2.1 (Hitachi Software Engineering, Маунтин-Вью, Калифорния), и ссылки GenBank для каждой последовательности были предоставлены CD-DATA Genetic Database (Hitachi Software Engineering).

Анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (ПДРФ)

Был применен стандартный протокол для определения ДНК M. tuberculosis с IS6110 [9]. Полученные образцы RFLP анализировали с помощью программного обеспечения Dendron 2.2 (Solltech, Iowa City, IA). Значения сходства рассчитывались по формуле S AB = 2 E / ( 2E + a + b ), где E — количество полос, общих для изолятов A и B, и a и b — количество полос, уникальных для штаммов A и B, соответственно; дендрограммы, основанные на значениях S AB , были созданы методами UPGA и показывают генетические отношения между изолятами.

Результаты

Описание настройки

За каждый год исследования в палату поступали 250 пациентов с респираторными симптомами. В общей сложности 950 M. tuberculosis культур в год из респираторных образцов были отправлены в лабораторию, и 80 (8,4%) из них дали положительный результат на 27 больных туберкулезом в год.

Фенотипическая устойчивость

Оценивались

клинических изолятов из 71 респираторного образца (мокрота, индуцированная мокрота, жидкость бронхоальвеолярного лаважа) от такого же количества последовательных пациентов, у которых наблюдались туберкулез с подтвержденным посевом.Пятьдесят два (73%) из них были ВИЧ-инфицированными. Фенотипическая устойчивость хотя бы к одному противотуберкулезному препарату обнаружена в 29,5% случаев; 23,4% были устойчивы к изониазиду, 11,2% — к рифампицину, 7% — к стрептомицину и 5,6% — к этамбутолу. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая как устойчивость как минимум к изониазиду и рифампицину, была обнаружена у 8,4% клинических изолятов. Устойчивые изоляты были обнаружены у 11 (21%) из 52 ВИЧ-инфицированных и у 10 (53%) из 19 не инфицированных ВИЧ пациентов. Четыре пациента (19%) из 21 с резистентными изолятами были иностранцами, а 7% пациентов, все ВИЧ-инфицированные, ранее получали три или четыре противотуберкулезных препарата.

Генотипическая устойчивость

Измененный паттерн SSCP был обнаружен у 15 из 17 устойчивых к изониазиду, у 7 из 8 устойчивых к рифампицину, у всех 4 устойчивых к этамбутолу и у 2 из 5 устойчивых к стрептомицину изолятов. У чувствительных штаммов не было обнаружено изменений в паттерне SSCP для каждой из тестируемых областей.

Устойчивость к рифампицину

Все 7 штаммов с измененным паттерном SSCP имели специфические мутации в области Rif r гена rpoB ; Были идентифицированы четыре различные мутации rpoB .Мутации в rpoB не наблюдались в чувствительных изолятах.

Устойчивость к изониазиду

Все изоляты с измененными паттернами SSCP показали специфические мутации в последовательности katG . Две новые мутации были обнаружены в кодоне 172 в двух случаях и в кодоне 294 в одном случае, и они были подтверждены после ресеквенирования нуклеотидного сегмента. Все штаммы имели идентичный аллель inhA дикого типа. Мутации в гене ahpC были обнаружены в 4 (23%) из 17 изониазид-устойчивых изолятов; во всех этих случаях была связана мутация в гене katG .Все 6 изолятов с множественной лекарственной устойчивостью были идентифицированы с помощью SSCP и прямого секвенирования генов rpoB и katG .

Устойчивость к стрептомицину

Одно генотипическое изменение было обнаружено в гене rpsL в обоих изолятах с измененным паттерном SSCP. Подробные базовые изменения для каждого целевого региона показаны в таблице 2.

Таблица 2

Анализ устойчивых к лекарствам изолятов Mycobacterium tuberculosis на мутации, придающие устойчивость к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу.

Таблица 2

Анализ устойчивых к лекарствам изолятов Mycobacterium tuberculosis на мутации, придающие устойчивость к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу.

Чувствительность, специфичность и прогностические значения мутационного анализа

Для рифампицина чувствительность, специфичность, а также положительная и отрицательная прогностическая ценность SSCP и анализа секвенирования составили 87,5% (95% доверительный интервал [ДИ], 47–99%), 100% (95% ДИ, 92.8–100%), 100% (95% ДИ, 56,1–100%) и 98,4% (95% ДИ, 90,5–99,9%). Для изониазида эти значения составляли 88,2% (95% ДИ, 62,3–97,9%), 100% (95% ДИ, 91,7–100%), 100% (95% ДИ, 74,7–100%) и 96,4. % (95% ДИ, 86,6–99,4%). Для стрептомицина эти значения составляли 40% (95% ДИ, 7,3–83%), 100% (95% ДИ, 93,1–100%), 100% (95% ДИ, 19,8–100%) и 95,7 % (95% ДИ, 87–98,9%). Для этамбутола эти значения составляли 100% (95% ДИ, 39,6–100%), 100% (95% ДИ, 93,2–100%), 100% (95% ДИ, 39,6–100%) и 100%. % (95% ДИ, 93,2–100%).Одновременные анализы с использованием rpoB, katG (кодоны 463, 135 и 122–125) и промоторной области ahpC имели чувствительность 86% для изолятов, устойчивых к любому лекарству. Время, необходимое для анализа SSCP и секвенирования всех регионов, составляло 4 дня на образец, что на 3 недели меньше по сравнению с классическим фенотипическим анализом (данные не показаны).

RFLP Анализ

M. tuberculosis Изолятов

Всего у 71 проанализированного изолята было обнаружено 65 различных паттернов ПДРФ, причем 90% изолятов показали более 6 копий (диапазон 5–13).Три образца полос ( S AB ,> 0,8) были общими для изолятов от 8 пациентов. Паттерн I был обнаружен у 2 изолятов, один из которых был чувствительным, а другой — устойчивым к рифампицину и изониазиду (мутационный профиль: rpoB [H526Y], katG [Del122> 125], ahpC [A684stop]). Паттерн II был обнаружен у 3 изолятов, 1 из которых был полностью восприимчивым, а остальные оба были устойчивыми к изониазиду ( katG [A172V]). Паттерн III был обнаружен у 3 штаммов: 1 устойчивый к изониазиду ( katG, [Q294H], ahpC, [W690S]) и 2 чувствительных.Эпидемиологическое расследование документально подтвердило, что из пациентов, инфицированных изолятами III типа, двое жили вместе в течение 1 года после эпизода туберкулеза, тогда как из пациентов с изолятами II типа двое были госпитализированы в одну палату за 8 месяцев до этого. Все остальные пациенты, чьи изоляты имели общие паттерны, не имели заметной связи друг с другом.

Обсуждение

Целью настоящего исследования было сопоставить характерные мутации, придающие устойчивость, в M.tuberculosis с восприимчивостью in vitro приводит к ВИЧ-инфицированной популяции, среди которой широко распространен туберкулез, которая посещала единственный референтный клинический центр в среднем регионе Италии. Результаты документально подтвердили высокий уровень соответствия между устойчивостью in vitro к изониазиду и рифампицину и наличием генотипических мутаций.

Значения чувствительности и специфичности выявления мутаций, связанных с устойчивостью к изониазиду, позволяют предположить, что этот анализ имеет важное значение для быстрого выявления лекарственной устойчивости в популяциях с высокой распространенностью устойчивости к изониазиду.Однако лучший выбор областей-мишеней, по-видимому, имеет решающее значение для быстрого распознавания устойчивости к этому лекарственному средству, учитывая, что секвенирование области> 2000 п.н. гена katG требует чрезмерной задержки. По нашему опыту, выбор трех генетических областей katG (кодоны 463, 315 и 122–125) и, в конечном итоге, промоторной области гена ahpC , даже если нет изолятов с образцом дикого типа для katG были обнаружены мутации в ahpC , что позволило выявить 85% устойчивых к изониазиду изолятов менее чем за 72 часа, и теперь мы используем эти целевые области для быстрого обнаружения устойчивости к изониазиду в нашей лаборатории.

Все миссенс-мутации, которые мы обнаружили в katG , были связаны с фенотипической устойчивостью, в том числе в кодоне 463. Значение мутации R463L все еще неясно. В предыдущем отчете эта мутация была обнаружена у 21% устойчивых к изониазиду изолятов с высокой специфичностью [10], хотя в недавнем отчете мутация R463L была обнаружена в высокой доле чувствительных к изониазиду изолятов, что указывает на общий аллельный полиморфизм у этот регион [11]. До сих пор отсутствуют данные о распространенности специфических мутаций, приводящих к устойчивости к изониазиду у M.tuberculosis из Италии. Наши результаты показывают, что мутации в кодоне 463 могут быть связаны с устойчивостью к изониазиду с большей частотой, чем это наблюдалось в других географических регионах. Географические различия также могут объяснить отсутствие обнаружения мутированных аллелей inhA среди изониазид-устойчивых изолятов исследования. Необходимы молекулярные исследования потенциального участия недавно идентифицированного гена kasA в изониазид-устойчивых изолятах, в которых отсутствуют мутации в генах inhA, katG и ahpC .

Было обнаружено, что восемьдесят процентов устойчивых к рифампицину изолятов мутировали по кодонам 526 и 511 rpoB: . Они коррелируют с устойчивостью к рифампицину у> 30% изолятов, о которых сообщалось на данный момент. Как и в предыдущих наблюдениях, подтверждено, что тестирование rpoB является высокочувствительным и специфичным в отношении устойчивости к рифампицину. Важное значение имеет наблюдение, что одновременные генотипические анализы выбранных областей rpoB и katG могут позволить правильную идентификацию 86% устойчивых изолятов к любому лекарственному средству.Этот результат предполагает, что анализ мутаций пяти целевых областей (rpoB; 463, 135 и 122–125 из katG; и промоторная область ahpC ) является предпочтительным для получения соответствующей экономии ресурсов.

Единственная мутация в кодоне 43 rpsL была обнаружена в штаммах, устойчивых к стрептомицину. В связи с крайней редкостью изменений в кодоне 88 в европейских изолятах [12], мы никогда не обнаружили специфических мутаций в нашей серии. Однако низкая частота мутаций, ответственных за устойчивость к стрептомицину в исследуемых регионах, предполагает необходимость анализа альтернативных мишеней.Анализ SSCP для выявления устойчивости к этамбутолу у всех изолятов, включенных в исследование, подтвердил тесную связь между генотипическим изменением в гене embB и фенотипической устойчивостью к этому препарату, что уже было подтверждено в других популяциях [8].

Наше исследование не выявило повышенного риска развития лекарственно-устойчивого туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов. В наших условиях наблюдалась высокая доля устойчивых штаммов среди пациентов, не инфицированных ВИЧ, и это могло повлиять на относительный риск заражения лекарственно-устойчивым туберкулезом среди ВИЧ-инфицированных пациентов, даже если распространенность среди ВИЧ-инфицированных составляет 21%. уже актуально.Ранее многие из связанных с ВИЧ случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью происходили во время нозокомиальных вспышек [1, 13, 14], и высокий уровень полиморфизма ПДРФ обнаруживался среди наших устойчивых изолятов, что согласуется с отсутствием предыдущих или продолжающихся крупных вспышек , может дополнительно объяснить относительно более низкую распространенность устойчивого туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов, выявленную в ходе исследования.

В нескольких исследованиях было подчеркнуто, что быстрое начало соответствующей терапии является наиболее сильной переменной, связанной с благоприятным исходом при туберкулезе с множественной лекарственной устойчивостью [15].Мы думаем, что результаты настоящего исследования показывают, что определенная экономически эффективная стратегия молекулярного обнаружения мутаций, вызывающих резистентность, может представлять собой очень полезный инструмент в клинической практике как для быстрого ведения пациентов, так и для оптимизации политики местной респираторной изоляции. Сопоставление ПДРФ и анализа мутаций показало, что все 4 пациента с лекарственно-устойчивыми изолятами среди 8 пациентов, у которых изоляты имели общие паттерны, имели специфические мутации, придающие устойчивость.Соответственно, перспективное и быстрое применение обоих методов могло позволить раннюю идентификацию кластерных устойчивых изолятов.

В заключение, применение быстрых методов для выявления мутаций, придающих устойчивость в M. tuberculosis , может иметь большое влияние на стратегию лечения туберкулеза в популяциях с высокой распространенностью лекарственной устойчивости. Рентабельные модели внедрения, основанные на соответствующем выборе целевых регионов и разработке быстрых молекулярных методов для клинических образцов, являются оправданными.

Благодарность

Особая благодарность Амалио Теленти за полезные предложения, поддержку и критическую редакцию рукописи.

Список литературы

1.« и др.

Вспышка туберкулеза с высокой лекарственной устойчивостью в нескольких учреждениях

,

JAMA

,

1996

, vol.

276

(стр.

1229

35

) 2.,,,,.

Ген каталазы-пероксидазы и устойчивость к изониазиду Mycobacterium tuberculosis

,

Nature

,

1992

, vol.

358

(стр.

591

3

) 3.,,, Et al.

InhA , ген, кодирующий мишень для изониазида и этионамида в Mycobacterium tuberculosis

,

Science

,

1994

, vol.

263

(стр.

227

30

) 4.,.

AhpC , ген, участвующий в устойчивости к изониазиду комплекса M. tuberculosis

,

Mol Microbiol

,

1996

, vol.

19

(стр.

1025

34

) 5.,,, И др.

Ингибирование Mycobacterium tuberculosis β -кетоацил АПФ-синтазы изониазидом

,

Science

,

1998

, vol.

280

(стр.

1607

10

) 6.,,,,.

Прямое автоматическое определение устойчивости к рифампицину Mycobacterium tuberculosis с помощью полимеразной цепной реакции и анализа однонитевого конформационного полиморфизма

,

Антимикробные агенты Chemother

,

1993

, vol.

37

(стр.

2054

8

) 7.,.

Устойчивость микобактерий к стрептомицину

,

Противомикробные агенты Chemother

,

1994

, т.

38

(стр.

238

42

) 8.,,, Et al.

Оперон emb , кластер генов M. tuberculosis , участвующий в устойчивости к этамбутолу

,

Nat Med

,

1997

, vol.

3

(стр.

567

70

) 9.,,,,.

Возникновение и стабильность инсерционной последовательности в комплексных штаммах Mycobacterium tuberculosis : оценка зависимого от инсерционной последовательности ДНК-полиморфизма как инструмента в эпидемиологии туберкулеза.

,

J Clin Microbiol

,

1991

, vol.

29

(стр.

2578

86

) 10.,,,,,.

Характеристика гена каталазы-пероксидазы (katG) и локуса inhA в устойчивых к изониазиду и чувствительных к изониазиду штаммах Mycobacterium tuberculosis с помощью автоматического секвенирования ДНК: ограниченный набор мутаций, связанных с устойчивостью к лекарствам

,

J Infect

,

1996

, т.

173

(стр.

196

202

) 11.,,,,,.

Отсутствие клинической значимости обычной замены аргинина на лейцин в кодоне 463 гена katG в устойчивом к изониазиду Mycobacterium tuberculosis в Сингапуре [письмо]

,

J Infect Dis

,

1997

, vol.

176

стр.

1125

12.,,,,,.

Характеристика мутаций rpsL и rrs в устойчивых к стрептомицину изолятов Mycobacterium tuberculosis из различных географических регионов

,

Антимикробные агенты Chemother

,

1996

, vol.

40

(стр.

1024

6

) 13.,,, Et al.

Вспышка туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью среди госпитализированных пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита

,

N Engl J Med

,

1992

, vol.

326

(стр.

1514

21

) 14.,,, Et al.

Клиническая картина и исходы у пациентов с ВИЧ-инфекцией и туберкулезом, вызванным бациллами с множественной лекарственной устойчивостью

,

Ann Intern Med

,

1992

, vol.

117

(стр.

184

90

) 15.,,,,.

Исход больных МЛУ-ТБ, 1983–1993 гг. Длительная выживаемость при соответствующей терапии

,

Am J Respir Crit Care Med

,

1996

, vol.

153

(стр.

317

24

)

© 1999 Американского общества инфекционных болезней

% PDF-1.5 % 105 0 объект > endobj xref 105 276 0000000016 00000 н. 0000008121 00000 н. 0000008326 00000 н. 0000008346 00000 п. 0000008472 00000 н. 0000008494 00000 п. 0000008694 00000 п. 0000010048 00000 н. 0000010267 00000 п. 0000272212 00000 н. 0000272388 00000 н. 0000272564 00000 н. 0000272740 00000 н. 0000272916 00000 н. 0000273091 00000 н. 0000273273 00000 н. 0000273455 00000 н. 0000273637 00000 н. 0000273819 00000 н. 0000274014 00000 н. 0000274209 00000 н. 0000274404 00000 н. 0000274585 00000 н. 0000274765 00000 н. 0000274946 00000 н. 0000275126 00000 н. 0000275306 00000 н. 0000275487 00000 н. 0000275667 00000 н. 0000275848 00000 н. 0000276028 00000 н. 0000276209 00000 н. 0000276389 00000 н. 0000276569 00000 н. 0000276749 00000 н. 0000276929 00000 н. 0000277109 00000 н. 0000277289 00000 н. 0000277464 00000 н. 0000277639 00000 н. 0000277814 00000 н. 0000277989 00000 н. 0000278178 00000 н. 0000278367 00000 н. 0000278556 00000 н. 0000279863 00000 н. 0000281171 00000 н. 0000281346 00000 н. 0000281521 00000 н. 0000281696 00000 н. 0000282999 00000 н. 0000283174 00000 н. 0000283349 00000 н. 0000283524 00000 н. 0000283699 00000 н. 0000283874 00000 н. 0000284049 00000 н. 0000285364 00000 н. 0000285539 00000 п. 0000286862 00000 н. 0000288179 00000 н. 0000289492 00000 н. 00002

00000 н. 00002

00000 н. 0000292290 00000 н. 0000292475 00000 н. 0000292660 00000 н. 0000292845 00000 н. 0000293030 00000 н. 0000293215 00000 н. 0000293402 00000 н. 0000293589 00000 н. 0000293776 00000 н. 0000293955 00000 н. 0000294134 00000 н. 0000294313 00000 н. 0000294491 00000 н. 0000294667 00000 н. 0000294866 00000 н. 0000300612 00000 н. 0000310174 00000 н. 0000317599 00000 н. 0000328000 00000 н. 0000328203 00000 н. 0000342976 00000 н. 0000343178 00000 п. 0000351438 00000 н. 0000351638 00000 н. 0000362493 00000 н. 0000362698 00000 н. 0000372749 00000 н. 0000382531 00000 н. 0000382735 00000 н. 0000398177 00000 н. 0000408655 00000 н. 0000408853 00000 н. 0000415960 00000 н. 0000417081 00000 п. 0000417272 00000 н. 0000420181 00000 п. 0000420362 00000 н. 0000421350 00000 н. 0000422573 00000 н. 0000424417 00000 н. 0000425372 00000 н. 0000426596 00000 н. 0000428436 00000 н. 0000429252 00000 н. 0000430259 00000 н. 0000431719 00000 н. 0000432534 00000 н. 0000433503 00000 н. 0000434838 00000 н. 0000434989 00000 п. 0000435373 00000 п. 0000435585 00000 н. 0000435776 00000 п. 0000436755 00000 н. 0000438010 00000 н. 0000439602 00000 н. 0000440590 00000 н. 0000441889 00000 н. 0000443753 00000 н. 0000444643 00000 н. 0000445704 00000 п. 0000447708 00000 н. 0000448325 00000 н. 0000448827 00000 н. 0000449480 00000 н. 0000449684 00000 н. 0000450658 00000 н. 0000451920 00000 н. 0000453524 00000 н. 0000454503 00000 н. 0000455764 00000 н. 0000457684 00000 н. 0000458623 00000 п. 0000459815 00000 н. 0000461866 00000 н. 0000462051 00000 н. 0000462949 00000 н. 0000464152 00000 н. 0000465935 00000 н. 0000466912 00000 н. 0000468167 00000 н. 0000469757 00000 н. 0000470747 00000 н. 0000471970 00000 н. 0000472956 00000 н. 0000474249 00000 н. 0000476201 00000 н. 0000477152 00000 н. 0000478380 00000 н. 0000480254 00000 н. 0000481211 00000 н. 0000482435 00000 н. 0000483193 00000 н. 0000484116 00000 н. 0000485566 00000 н. 0000486382 00000 н. 0000487389 00000 н. 0000488174 00000 н. 0000489017 00000 н. 00004 00000 н. 00004

00000 н. 0000492326 00000 н. 0000493139 00000 н. 0000494087 00000 н. 0000495911 00000 н. 0000496062 00000 н. 0000496446 00000 н. 0000497218 00000 н. 0000498040 00000 н. 0000499469 00000 н. 0000500336 00000 н. 0000501416 00000 н. 0000503018 00000 н. 0000503913 00000 н. 0000504959 00000 н. 0000506472 00000 н. 0000507074 00000 н. 0000507901 00000 н. 0000508962 00000 н. 0000601527 00000 н. 0000601729 00000 н. 0000602708 00000 н. 0000603963 00000 н. 0000604951 00000 н. 0000606250 00000 н. 0000607144 00000 н. 0000608217 00000 н. 0000610269 00000 п. 0000610886 00000 н. 0000611388 00000 п. 0000699319 00000 п. 0000699534 00000 н. 0000700508 00000 н. 0000701770 00000 н. 0000703369 00000 п. 0000704348 00000 п. 0000705609 00000 н. 0000707421 00000 н. 0000708360 00000 н. 0000709552 00000 п. 0000711622 00000 н. 0000711807 00000 н. 0000712726 00000 н. 0000713636 00000 н. 0000714614 00000 н. 0000715869 00000 н. 0000716855 00000 н. 0000718148 00000 н. 0000719097 00000 н. 0000720325 00000 н. 0000721236 00000 н. 0000721994 00000 н. 0000722917 00000 н. 0000723702 00000 н. 0000724545 00000 н. 0000725360 00000 н. 0000726308 00000 н. 0000727080 00000 н. 0000727902 00000 н. 0000728768 00000 н. 0000729848 00000 н. 0000730742 00000 н. 0000731788 00000 н. 0000731984 00000 н. 0000732897 00000 н. 0000733498 00000 н. 0000734325 00000 н. 0000735238 00000 п. 0000736151 00000 п. 0000736345 00000 п. 0000737254 00000 н. 0000738170 00000 н. 0000739144 00000 н. 0000740399 00000 н.

7: L8q4 * ZǠtfvkfjk} ~ {ݟ

Какой метод анализа крови лучше всего подходит для выявления туберкулеза?

Изображение Катерины Кон, Shutterstock.

Стэнфордский медицинский прицел — 23 апреля 2019 г. — Автор Hanae Armitage

В 2014 году Всемирная организация здравоохранения объявила благородную цель: покончить с инфекционным бактериальным туберкулезом к 2035 году. Но чтобы избавить мир от туберкулеза, врачи и ученые должны иметь возможность обнаруживать его более надежно и раньше.

Это основная предпосылка исследования Стэнфордского специалиста по обработке данных Пурвеша Хатри, доктора философии. Он входит в группу ученых, которые отказываются от традиционного метода выявления туберкулеза, при котором пациенты должны откашливать «мокроту» или глоток от инфекции в легких.

«Проблема в том, что вы не можете приказать пятилетнему ребенку сдавать образцы мокроты по требованию, и существуют другие заболевания, такие как ВИЧ, которые затрудняют получение образца», — сказал Хатри. Еще более проблематично то, что человек с туберкулезом может производить достаточно мокроты только для выявления болезни после того, как инфекция перешла в активную форму.

В Стэнфорде и за его пределами прилагаются все более активные усилия по созданию тестов на туберкулез, которые надежно выявляют инфекцию раньше, точнее и без мокроты.Например, Ниаз Банаеи, доктор медицины, доцент патологии и медицины, и Хуан Сантьяго, доктор философии, профессор машиностроения, создали методику, которая может определять ДНК бактерий ТБ в образцах крови или мочи пациента, тем самым пропуская необходимость на мокроту совсем.

Хатри и другие, однако, ищут не следы самих бактерий, а признаки того, что иммунная система человека или хозяина реагирует на инфекцию ТБ. Эти типы диагностики считаются «основанными на ответах хоста».«

Хатри и его коллеги разработали подход, называемый трехгенной шкалой ТБ, который рассматривает изменения трех генов человека в ответ на инфекцию ТБ. Он опубликовал результаты этого анализа крови в 2016 году и провел дополнительное исследование в 2018 году.

Сейчас разработано несколько из этих тестов на основе хоста, поэтому Хатри решил уменьшить масштаб. «После появления нашей сигнатуры из трех генов у меня постоянно возникали вопросы типа« Какой из них работает лучше всего? » и «Вы когда-нибудь сравнивали диагностику на основе ответов хоста?» — сказал Хатри.«И я подумал, что это неплохая идея».

Хатри решил провести исследование, чтобы увидеть, какой метод является наиболее эффективным, то есть который может точно определить туберкулез среди более широкой популяции пациентов. Он и его лаборатория оценили сигнатуры 16 генов в опубликованных статьях, посвященных выявлению туберкулеза.

Подробная информация об их исследовании содержится в PLOS Medicine . Хатри — старший автор, а Хейли Варсинске, доктор философии, бывший научный сотрудник Стэнфордского университета, — первый автор.

Группа основывала свою оценку на трех основных параметрах:

  1. Может ли тест на основе ответа хоста точно обнаружить ТБ?
  2. Каков процент ложных срабатываний теста? (Ложноположительный результат предполагает наличие туберкулеза, хотя его нет.)
  3. И дает ли тест обобщаемые результаты для различных групп населения и регионов?

Первые два параметра соответствуют стандартам ВОЗ, которые требуют, чтобы 90 процентов пациентов с активным туберкулезом выявлялись с точностью 70 процентов, при этом количество ложных срабатываний сводилось к минимуму.Однако важен и последний параметр, подчеркнул Хатри. ТБ распространен в Индии, Китае и Африке, и в каждом регионе есть разные штаммы туберкулеза, поэтому диагностический тест должен учесть эту вариабельность.

В анализе

Хатри использовались общедоступные наборы данных, которые включали информацию об экспрессии генов пациентов с туберкулезом и пациентов без него. Один за другим его группа оценивала каждый из 16 методов обнаружения на основе крови, ища присутствие каждой сигнатуры гена среди общедоступных данных, которые включали информацию об экспрессии генов от смешанной популяции людей с туберкулезом и без него.

Он обнаружил, что только две генные сигнатуры указывают на активный ТБ с достаточной точностью, чтобы соответствовать стандартам ВОЗ. Только один, тест подписи трех генов Хатри, прошел проверку, когда дело дошло до поддержания такого уровня точности во многих географических регионах и группах населения.

Хатри сказал, что, хотя трехгенная подпись его группы показала себя относительно хорошо, она не была идеальной: она пометила несколько пациентов как больных туберкулезом, хотя, как сообщается, этого не произошло. Тем не менее, он видит в подписи многообещающее средство для проведения «сортировочного теста», который можно использовать для быстрого выявления тех, кто, по всей видимости, болен активным туберкулезом или подвержен риску его развития.

По словам Хатри, такой тест будет иметь решающее значение для продвижения к искоренению инфекции к 2035 году.

Первоначально опубликовано в Stanford Medicine Scope Blog

Датчики

| Бесплатный полнотекстовый | Неинвазивный метод обнаружения инфекции, вызываемой комплексом Mycobacterium tuberculosis у дикого кабана путем измерения летучих органических соединений, полученных из фекалий, с помощью электронной системы носа

1. Введение

Туберкулез крупного рогатого скота (bTB), вызванный Mycobacterium bovis (M.bovis) — это развивающееся заболевание среди диких животных во многих частях мира, которое угрожает распространиться как потенциальный источник инфекции для домашнего скота и людей [1]. bTB может легко передаваться от инфицированного животного к неинфицированному, с которым он живет в одной среде обитания, при этом преобладает аэрогенная передача. Он также может передаваться от животных к человеку через потребление мясных продуктов инфицированных животных, при контакте с кровью инфицированных животных во время убоя или при вдыхании воздуха, выдыхаемого инфицированными животными [2,3].У людей bTB вызывает тяжелую заболеваемость и даже смерть, особенно в случае людей, участвующих в охоте и забое животных без достаточного санитарного контроля.Стандартное тестирование на bTB у живых животных состоит из однократных внутрикожных тестов на туберкулин для скрининга (тест хвостовой складки или одиночный цервикальный тест). кожная проба) со сравнительным цервикальным тестом или тестом на высвобождение гамма-интерферона в качестве дополнительных или подтверждающих тестов [4,5,6]. Окончательный диагноз туберкулеза крупного рогатого скота требует посмертного лабораторного подтверждения заболевания с помощью гистопатологии, полимеразной цепной реакции и бактериологического посева [5,6].Выявление туберкулеза крупного рогатого скота в дикой природе, как правило, осуществляется с помощью таких методов, как обследования убитых охотниками, обследования убитых на дорогах или активный отлов и / или умерщвление животных для серологического тестирования и / или патологоанатомического исследования [7,8,9]. Существует потребность в менее инвазивных и менее дорогостоящих методах дистанционного обнаружения заболевания bTB в популяциях диких животных. Обнаружение специфических для болезни летучих органических соединений (ЛОС) в фекалиях может стать решением для удаленного наблюдения за дикой природой. Они отражают метаболические изменения, вызванные заболеванием у хозяина, и их анализ стал многообещающим подходом для диагностики и мониторинга заболеваний [10].Обычно для анализа ЛОС применяются два дополнительных метода: аналитические методы и системы электронного носа. Аналитические методы позволяют идентифицировать биомаркеры конкретных заболеваний. Тем не менее, концентрация многих соединений, выделяемых биологическими образцами, ниже предела обнаружения аналитического оборудования, и не все возможные биомаркеры обнаруживаются [11]. Системы электронного носа состоят из массива перекрестно-реактивных химических газовых сенсоров, где каждый сенсор не обладает достаточной избирательностью для обнаружения отдельных ЛОС в газовой смеси, но вместо этого система электронного носа обучена обнаруживать характерные для конкретного заболевания образцы ЛОС. [12].Системы электронного носа обладают такими преимуществами, как портативность, простота в эксплуатации, легкость интерпретации результатов и низкая стоимость [12]. По-видимому, уникальные ЛОС или образцы ЛОС были обнаружены посредством аналитических исследований в фекалиях крупного рогатого скота и белохвостых оленей, инфицированных вирусом. M. bovis [13,14], а также в фекалиях коз, инфицированных Mycobacterium avium paratuberculosis [15,16]. Совсем недавно в первом исследовании такого рода, проведенном на кабане (Sus scrofa), мы сообщили об идентификации M.Характерные для bovis образцы ЛОС в кале и дыхании кабана [17]. Аналогичным образом было показано, что системы электронного носа способны обнаруживать структуру ЛОС M. bovis в свободном пространстве сыворотки крупного рогатого скота и барсуков [18,19], а также в дыхании крупного рогатого скота [20]. мы впервые сообщаем об обнаружении M. bovis путем измерения ЛОС, выделяемых с фекалиями, с помощью системы электронного носа. Это исследование было проведено на диких кабанах, обитающих на свободном выгуле, в национальном парке Доньяна, Испания, где bTB является эндемичным для сообщества копытных-хозяев, включая кабана [21].Успешная разработка этой технологии может привести к созданию устройств, предназначенных для дистанционного и неинвазивного обнаружения M. bovis и других патогенов в популяциях диких животных.

4. Обсуждение

Для выполнения этого исследования мы создали систему электронного носа, состоящую из набора перекрестно-реактивных химических газовых сенсоров на основе органически функционализированных наночастиц золота. Датчики такого типа продемонстрировали очень хорошую пригодность для обнаружения низких концентраций ЛОС в биологических образцах и работы при комнатной температуре, что является ключевой особенностью этих наноматериалов [28,29,30].Органические лиганды были тщательно отобраны с целью продемонстрировать сродство к широкому спектру ЛОС, которые обычно обнаруживаются в образцах фекалий, таких как ароматические соединения, спирты, кетоны, сложные эфиры, альдегиды, алканы, алкены и фураны [14,16, 17]. Чувствительные материалы были нанесены методом AGD, что позволяет изготавливать сверхчистые наноматериалы [31]. Сопротивление сенсора находится в диапазоне от нескольких кОм до нескольких МОм, что является идеальным значением для датчиков газа.

Животные, отловленные в разных местах, расположенных на большой площади из 4 человек.4-километровый радиус внутри национального парка Доньяна был включен в это исследование, чтобы иметь дело с возможными источниками загрязнения, присутствующими в национальном парке, которые могут повлиять на состав фекалий (например, естественные источники полива и контакты с другими дикими животными).

Датчиками, которые продемонстрировали хороший отклик на образцы фекальных летучих органических соединений, проанализированных в этом исследовании, были датчики S5, S6, S8 и S9 (подробности см. В таблице 3). S5 и S8, с органическими лигандами с ароматической функциональной группой в их хвосте, вероятно, будут иметь высокое сродство к ЛОС с ароматическими функциональными группами в их структуре, в то время как органический лиганд S6 с длинноцепочечной полярной группой в его хвосте имеет хорошее сродство к полярным молекулам, таким как кетоны.Эта особенность согласуется с предыдущим исследованием, в котором ароматические соединения и кетоны были зарегистрированы как предварительные фекальные биомаркеры ЛОС для bTB у свиней [17]. S9, в котором в качестве органического лиганда использовался 1-бутантиол, имеет высокое сродство к неполярным молекулам ЛОС, таким как алканы и производные алканов, и, безусловно, расширил диапазон обнаруживаемых ЛОС. Тем не менее, другие сенсоры имели такие же органические функции, как сенсоры, которые ответили на анализ образцов фекальных летучих органических соединений (например, S7 и S8 или S1 и S5 соответственно).Однако они могли иметь очень разную морфологию из-за немного разных экспериментальных условий во время их изготовления [25]. На это указывают их различные значения сопротивления, представленные в таблице 3. Следовательно, их потенциал обнаружения фекальных летучих органических соединений, возможно, не был полностью настроен. Режим работы динамических датчиков, используемый в этом исследовании, реализован путем подачи коротких импульсов напряжения на датчики (10 с), за которыми следуют более длительные периоды бездействия (продолжительность 90 с), что позволяет анализировать кинетику реакции адсорбции-десорбции на поверхности, которая происходит между чувствительным материалом и обнаруживаемыми ЛОС.Этот режим работы предоставляет больше информации, чем статический режим работы, когда датчик постоянно работает при постоянном напряжении [32]. Во время коротких импульсов напряжения, когда датчик находился в активном состоянии, ток через датчик изменялся между двумя значениями, которые либо уменьшается, либо увеличивается, в зависимости от органической функциональности, связывающей наночастицы золота (см. отклики датчиков, представленные на рисунках 3 и 4). Важно отметить, что датчики не достигли устойчивого состояния (т.е.е. постоянный стабилизированный ток) во время их работы, что гарантирует, что в данном исследовании оценивалась только их динамическая работа. Принимая во внимание датчики, которые продемонстрировали хороший отклик на проанализированные образцы фекальных летучих органических соединений, для 2-меркаптобензоксазола и 11-меркаптоундекановой кислоты ток уменьшился во время подачи напряжения, что вызывает небольшой эффект нагрева, что свидетельствует о полупроводниковом поведении p-типа, в то время как для 4-метокси-α-толуолтиол и 1-бутантиол, ток увеличивался во время подачи напряжения, что свидетельствует о полупроводниковом поведении n-типа.Для анализа данных учитывался только первый период работы каждого датчика во время воздействия образца ЛОС для извлечения характеристик датчика, соответствующий первым 100 секундам воздействия ЛОС, поскольку каждый датчик последовательно был активен в течение 10 секунд в течение этого рабочего периода. Фактически, ожидается, что более высокая концентрация ЛОС, десорбированных в установке термодесорбции, будет перенесена потоком N 2 в испытательную камеру сенсора в первые моменты воздействия на образец. На рисунке 3d показано, что даже S9, предпоследний активированный датчик, продемонстрировал заметную реакцию на пробу ЛОС во время своего первого периода работы, предполагая, что концентрация ЛОС все еще присутствовала на подходящем уровне в измерительной камере.Модели классификации, построенные на основе откликов сенсоров, показали очень хорошую точность обнаружения bTB для взрослых и суб-взрослых животных, в то время как для молодых животных результаты были недостаточными (см. Таблицу 5). Вслед за предыдущими аналитическими исследованиями, которые предположили, что метаболомический путь bTB у свиней зависит от возраста [17], в этом исследовании были выбраны различные сенсорные особенности, чтобы построить более надежные модели классификации bTB для разных возрастных групп (см. Таблицу 4). Взрослым и суб-взрослым животным вводили седативную терапию комбинацией тилетамин-золазепама и медетомидина, что позволяло избежать стресса во время сбора образцов, не влияя на состав ЛОС, как сообщалось в нашем предыдущем исследовании [17].Молодых животных удерживали вручную во время сбора пробы фекалий, что могло вызвать стрессовую реакцию, что, возможно, изменило состав ЛОС, выделяемых биологическими пробами [17]. Тем не менее, другие метаболические факторы у молоди могли заставить их ЛОС принять другой характер. Чтобы прояснить этот момент, необходимо провести дальнейшие исследования путем введения седативных препаратов молодым животным аналогично взрослым и половозрелым животным во время сбора образцов фекалий или пассивным сбором образцов без обращения с ними.

Нельзя не учитывать влияние количества животных каждой возрастной группы на полученные результаты. Классификация суб-взрослых животных может быть проще из-за меньшего размера этой возрастной группы. Большой размер выборки из группы молодых людей мог усложнить их классификацию с помощью алгоритма DFA, использованного в этом исследовании. Другие алгоритмы распознавания образов, которые могут лучше адаптироваться к набору данных по молодым животным, могут быть оценены, чтобы попытаться получить лучшие результаты.

В целом, настоящее исследование дополняет текущую исследовательскую тенденцию, направленную на изучение альтернативных методов, основанных на измерении летучих органических соединений, выделяемых биологическими образцами, с помощью систем электронного носа для более простой и менее дорогой диагностики заболеваний. В то время как многочисленные исследования такого рода были выполнены на людях, исследования, выполненные на животных, довольно скудны [12]. Фактически, настоящее исследование является первым отчетом, который оценивает диагноз болезни животных на основе измерения ЛОС, выделяемых фекалиями, с помощью электронной носовой системы.Для диагностики M. bovis у крупного рогатого скота многообещающие результаты были получены при анализе образцов дыхания с помощью системы электронного носа NA-NOSE, разработанной Израильским технологическим институтом Техниона, состоящей из шести химических газовых сенсоров на основе органически функционализированных наночастиц золота (86,4 % точности на популяции из 22 животных) [20], а также при анализе летучих органических соединений, выделяемых образцами сыворотки, с помощью коммерческой системы электронного носа αFOX3000 MOS, разработанной Alpha MOS Co. (Толуз, Франция) на основе набора из девяти металлооксидных полупроводниковых газовых сенсоров (95.Точность 2% на популяции из 21 животного) [19].

5. Выводы

В этом исследовании сообщается об исследовании, подтверждающем концепцию диагноза bTB, вызванного Mycobacterium bovis, у диких кабанов на основе анализа ЛОС, выделяемых фекалиями животных с помощью системы электронного носа. Был выбран анализ образцов фекалий, потому что они могут быть собраны неинвазивным способом и обладают большим потенциалом для обеспечения удобных средств обнаружения M. bovis в популяциях диких животных.

Исследование проводилось на диких кабанах, отловленных в национальном парке Доньяна, Испания, где заболевание bTB является эндемическим для копытных животных.Чтобы противодействовать влиянию возможных мешающих факторов на состав фекалий (например, естественные источники полива, контакт с другими дикими животными), в исследование были включены животные, отловленные на большой территории в радиусе 4,4 км внутри парка.

Образцы были проанализированы с помощью самодельной системы электронного носа, которая включала массив из 10 химических газовых сенсоров на основе органически функционализированных наночастиц золота, изготовленных с использованием технологии AGD, которая обеспечивает синтез сверхчистых наночастиц узкого диапазона размеров.Во время измерения образца датчики работали в динамическом режиме, последовательно подавая короткие импульсы напряжения на каждый из них в режиме переключения, что позволяло исследовать кинетику реакции, которая происходит между чувствительной пленкой и образцом ЛОС.

Исследование было проведено отдельно на трех возрастных группах животных: взрослых, суб-взрослых и молодых. Результаты классификации, построенные с помощью алгоритма распознавания образов DFA, обеспечили 100% точность как во время обучения модели, так и во время проверки для суб-взрослых животных, 100% точность во время обучения модели и 88.9% во время проверки модели для взрослых животных и 88,9% точности во время обучения модели и 62,5% во время проверки модели для молодых животных. На полученные результаты мог повлиять размер выборки в каждой возрастной группе (меньшая у суб-взрослых и больше у молодых животных), а также обращение с животными во время сбора образцов (суб-взрослые и взрослые животные были анестезированы, в то время как молодые удерживается вручную).

В целом, принимая во внимание необходимость одинакового обращения со всеми животными в будущих исследованиях, результаты, полученные в этом исследовании, могут проложить путь для дальнейшей разработки и внедрения неинвазивного и менее дорогостоящего подхода к обнаружению заболевания bTB в дикой природе. населения.Тем не менее, представленные результаты необходимо проверить на более крупных когортах животных, в то время как другие методы распознавания образов могут быть оценены для изучения алгоритмов, которые могут более эффективно адаптироваться к набору данных о молодых животных.

Анализ крови на туберкулез позволяет провести более ранний скрининг для быстрого выявления

Результаты проверочного исследования на людях показывают, что новый анализ крови, используемый для выявления туберкулеза (ТБ) и паратуберкулеза у домашнего скота, может быть адаптирован в качестве быстрой основной диагностики инфекции Mycobacterium tuberculosis (Mtb) у людей, а также как инструмент скрининга для выявления людей, подверженных риску развития ТБ.

Тест под названием Actiphage TM был разработан исследователями из Ноттингемского университета. Сообщая о своей экспериментальной оценке Actiphage для диагностики туберкулеза у людей, исследователи и сотрудники Национального института медицинских исследований (NIHR) Лестерского биомедицинского исследовательского центра (BRC) предполагают, что их результаты подтверждают существование инфекции ТБ в бессимптомном переходном периоде. состояние, которое впоследствии может перерасти в активное заболевание.

Команда описывает свои выводы в Клинических инфекционных заболеваниях .«Наши наблюдения дают новое понимание того, как развивается туберкулез у людей, и подтверждают недавние доказательства существования переходного состояния туберкулезной инфекции, называемого зарождающимся туберкулезом, которое не вызывает симптомов, но несет высокий риск перехода в активный туберкулез», — заявил Пранабашис Халдар, доктор философии , старший преподаватель клинической практики в Лестерском университете и консультант по респираторной медицине в больницах Лестера. «В качестве анализа крови он особенно подходит для пациентов, не способных выделять мокроту, в том числе для детей, и может помочь в диагностике в группах с недостаточным медицинским обслуживанием, которым трудно получить доступ к бесплатным медицинским ресурсам.”

Опубликованная работа команды озаглавлена: «Новый высокочувствительный анализ на основе бактериофагов выявляет бактериемию M. tuberculosis низкого уровня у иммунокомпетентных пациентов с активным и начинающимся туберкулезом».

Около четверти населения мира является носителем инфекции M. tuberculosis, которая является основной причиной смерти от инфекционного заболевания, пояснили авторы. «Чаще всего он поражает легкие и от этого места передается другим при кашле и чихании», — прокомментировал Халдар.«Из-за отсутствия диагностических инструментов для людей, неспособных собрать мокроту, диагностика откладывается, что увеличивает вероятность распространения болезни».

В большинстве случаев бактерия Mtb выявляет так называемую латентную туберкулезную инфекцию (ЛТИ), которая не вызывает никаких симптомов, но примерно у 5–10% людей с ЛТИ развивается ТБ, как правило, в течение двух лет. Исследователи пишут, что механизмы, лежащие в основе этого перехода в активный туберкулез, не совсем понятны.

Обнаружение Mtb может быть проблематичным, потому что организм очень медленно растет, что делает традиционные методы культивирования неэффективными.Молекулярные тесты, которые идентифицируют ДНК Mtb, также ограничены, потому что прочная клеточная стенка бактерии затрудняет извлечение ДНК. «Туберкулез — основная причина смерти от инфекционного заболевания. Чаще всего он поражает легкие и от этого места передается другим при кашле и чихании », — отметил Халдар. «Из-за отсутствия диагностических инструментов для людей, неспособных собрать мокроту, диагностика откладывается, что увеличивает вероятность распространения болезни».

Тест на актифаг, разработанный исследователями из Ноттингема, использует бактериофаг, который специфически заражает Mtb, проникая через стенку бактериальной клетки и высвобождая ДНК Mtb.Затем ДНК можно амплифицировать и детектировать. Весь процесс тестирования занимает около шести часов. Актифаг коммерциализируется PBD Biotech для диагностики заболеваний Mtb у домашнего скота, и прежде всего в качестве теста крови или молока на туберкулез крупного рогатого скота и болезнь Джона. «Актифаг — это новый анализ крови на микобактерии, который был разработан для выявления микобактериальных инфекций у сельскохозяйственных животных, помогая фермерам контролировать эти сложные заболевания», — пояснила соавтор исследования Кэтрин Риз, доктор философии, доцент микробиологии в Ноттингемском университете, и CSO в PBD Biotech.

Для своей первой оценки теста на людях исследователи набрали 66 человек в четырех когортах, включая 15 пациентов с активным туберкулезом легких (ЛТБ), 18 человек с латентной инфекцией ТБ (ЛТБИ), контрольную группу из 5 пациентов с неинфекционными заболеваниями. ТБ респираторного заболевания и контрольная группа здоровых лиц. Актифаг был использован для тестирования всех пациентов дважды с интервалом в 12 месяцев.

Было обнаружено, что тест продемонстрировал 73,3% чувствительность и 100% специфичность. Важно отметить, что ни один из контрольных пациентов не дал положительных результатов, и ни у одного из пациентов с ЛТИ, у которых был отрицательный результат теста на актифаг, не развился активный туберкулез.Интересно, что у двух из трех участников с ЛТИ, у которых был положительный результат теста на Актифаг, действительно развился активный ТБ более чем через шесть месяцев. Хотя у этих пациентов не было клинических или радиологических свидетельств активного туберкулеза на этапе последующего наблюдения в течение трех месяцев, в их крови обнаруживались Mtb.

«Наши данные показывают, что зарождающееся заболевание связано с обнаружением Mtb в крови во время раннего инфицирования и может быть идентифицировано по нему», — пишут авторы. Фактически, тесты обнаружили циркулирующий Mtb у большинства участников с активным PTB и клиническими признаками заболевания одного органа, что указывало на бактериемию низкой степени, которая была ниже порога чувствительности существующих методов.Авторы отметили, что бактериемия также была связана с большей степенью заболевания. «Напротив, неспособность обнаружить Mtb в крови четырех участников PTB с клинически более легким выражением заболевания предполагает наличие отличного фенотипа более раннего заболевания, характеризующегося эффективным иммуноопосредованным удержанием Mtb в легких, с любыми циркулирующими бактериями, присутствующими на уровнях ниже чувствительности. порог анализа ».

«Данные нашего первоначального исследования на людях предполагают, что после заражения Mtb циркулирует в крови на уровнях, которые ранее не были обнаружены, и что иммунная система может быть не в состоянии эффективно сдерживать бактерии в легких», — отметил Рис.

Исследователи пришли к выводу, что, хотя их результаты могут быть предварительными, исследование демонстрирует «ранние перспективы использования Актифага в качестве диагностического инструмента на основе крови для инфекционных ЛТБ для улучшения ранней диагностики у пациентов, неспособных отхаркивать мокроту». В то время как тест потребует некоторых изменений, чтобы упростить подготовку образцов и молекулярное обнаружение для использования в условиях ограниченных ресурсов. «Хотя мы с осторожностью относимся к обобщениям на основе небольшого размера выборки, мы с оптимизмом полагаем, что эти первоначальные результаты указывают на то, что Actiphage можно использовать в качестве инструмента, который поможет нам лучше понять динамику инфекции у людей», — заявил Рис.«Новый анализ крови на актифаг дает возможность ориентироваться на людей из группы риска туберкулеза и позволяет рано начать лечение. Это очень интересное событие, требующее дальнейшего изучения ».

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *