Методы ранней диагностики туберкулеза: Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза

Содержание

Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза

Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза

Профилактика туберкулеза среди детей и подростков остается актуальным для Тамбовской области. Случаи заболеваний лиц указанных возрастных категорий регистрируются в области ежегодно. В 2015г зарегистрировано 17 случаев заболевания детей в возрасте до 17 лет. Среди заболевших в 2015г детей и подростков 12 посещали организованные коллективы (в 2014г -9).

 

Туберкулез — инфекция известная с глубокой древности и названная «чахоткой», так как заболевшие чахли на глазах, увядали, является хронической инфекцией определенным типом бактерии (Mycobacterium tuberculosis), которая обычно поражает легкие. Туберкулезные микобактерии обладают значительной устойчивостью во внешней среде. В темном месте в мокроте они могут сохранять жизнеспособность в течение многих месяцев. Под действием прямых солнечных лучей микобактерии гибнут через несколько часов.

Источником инфекции является больной человек, больные домашние животные и птицы. Наиболее опасны больные открытой формой туберкулеза легких, выделяющие возбудителей с мокротой, каплями слизи при кашле, разговоре и т. д. Менее опасны больные с туберкулезными поражениями кишечника, мочеполовых и других внутренних органов.

Среди домашних животных наибольшее значение как источник инфекции имеет крупный рогатый скот, выделяющий возбудителей с молоком, и свиньи.

Пути передачи инфекции различны. Чаще заражение происходит капельным путем через мокроту и слюну, выделяемые больным при кашле, разговоре, чиханье, а также воздушно-пылевым путем.

Немаловажную роль играет и контактно-бытовой путь распространения инфекции как непосредственно от больного (испачканные мокротой руки), так и через различные предметы обихода, загрязненные мокротой. Пищевые продукты может инфицировать больной туберкулезом; кроме того, инфекция может передаваться от больных туберкулезом животных через их молоко, молочные продукты и мясо.

Течение инфекционного процесса зависит от состояния организма и его сопротивляемости, питания, жилищно-бытовой обстановки, условий труда и пр.

Чем раньше диагностируется болезнь, тем больше вероятность того, что ее удастся вылечить. Этот принцип справедлив как для туберкулеза, так и для многих других недугов.

Основными методами ранней диагностики туберкулеза у детей и подростков является туберкулинодиагностика туберкулеза и флюорографической обследование.

Туберкулинодиагностика, скриниговые кожные диагностические тесты — основной метод раннего выявления туберкулеза среди детей и подростков и применяется всем вакцинированным детям с 12-месячного возраста и подросткам до достижения возраста 18 лет систематически один раз в год, независимо от предыдущего результата. Эффективность метода туберкулинодиагностики не вызывает сомнения; 90% заболевших туберкулезом детей в 2015году и 100% в 2016 году выявлены при проведении кожных диагностических тестов.

Одна из основных причин недостаточного охвата детей туберкулинодиагностикой — отказы родителей от постановки детям реакции Манту.

25.07.2014г. вступили в силу новые СП 3.1.2.3114-13 «Профилактика туберкулеза», утвержденные Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 22.10.2013г. № 60, в соответствии с п. 5.7. которых: «Дети, туберкулинодиагностика которым не проводилась, допускаются в детскую организацию при наличии заключения врача-фтизиатра об отсутствии заболевания. Дети, направленные на консультацию в противотуберкулезный диспансер, родители или законные представители которых не представили в течение 1 месяца с момента постановки пробы Манту заключение фтизиатра об отсутствии заболевания туберкулезом, не допускаются в детские организации». Согласно п.6.8. санитарных правил: «Подростки, направленные на консультацию в противотуберкулезный диспансер, не представившие руководителю организации в течение 1 месяца с момента постановки пробы Манту заключение фтизиатра об отсутствии заболевания туберкулезом, не допускаются к работе (учебе)».

Профилактика туберкулёза у детей направлена на предотвращение инфицирования и предупреждение развития заболевания. Основные методы профилактики заболевания туберкулёзом у детей — вакцинация против туберкулеза и химиопрофилактика. В соответствии с Национальным календарём профилактических прививок вакцинацию проводят в роддоме при отсутствии противопоказаний в первые 3-7 дней жизни ребенка. Вакцина БЦЖ-М является ослабленным штаммом микобактерий, которые в достаточной мере иммуногены, но у здоровых детей не обуславливают инфицирование. Для поддержания приобретенного иммунитета повторную прививку проводятся подлежащего контингента в настоящее время в 7 лет.

С целью выявления туберкулёза на ранних стадиях подростки и взрослое население проходят флюорографическое обследование.

ПРОФИЛАКТИКА И ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА — Мои статьи — — Каталог статей

Туберкулез остается одним из самых распространенных заразных инфекционных заболеваний во всем мире. Он  представляет глобальную опасность для населения всех государств, наносит значительный ущерб экономике стран за счет высокого уровня заболеваемости, нетрудоспособности и смертности населения.

В настоящее время в Российской Федерации и Приморском крае заболеваемость туберкулезом находится на высоком уровне; продолжается рост и распространение тубинфекции с множественной лекарственной устойчивостью, сочетанного с ВИЧ- инфекцией. Распространению инфекции способствует миграция  населения, рост социально дезадаптированных слоев, широкое распространение вредных привычек

( табакокурение, злоупотребление алкоголем).  Определенный вклад в ситуацию вносит отказ родителей от вакцинации (прививки) детей и подростков, а также  от постановки диагностической пробы Манту – единственного метода ранней диагностики инфицирования ребёнка микобактерией туберкулёза.

Вакцинопрофилактика   туберкулеза

 

   Туберкулез занимает 2-е место среди инфекционных  заболеваний по частоте       смертельных исходов, уступая только СПИДу. Заболевание может проявляться поражением любых органов и тканей. Последние годы проблема отягощена появлением форм туберкулезной инфекции с множественной лекарственной    устойчивостью , что требует длительного комплексного лечения, поиска новых противотуберкулезных препаратов.

   Вопросы профилактики туберкулеза приобретают очень важное значение.

   Ведущим методом специфической профилактики туберкулеза , надежность которого  доказана многолетним применением во всех странах мира, является вакцинация БЦЖ , которая входит в Национальный календарь прививок России.

   Высокий риск развития туберкулеза отмечается у детей и подростков часто и длительно болеющих хроническими и рецидивирующими заболеваниями различных органов и систем. Большую опасность представляет проживание ребенка в семье , где имеется контакт с больным открытыми формами заболевания.

   Первая прививка (вакцинация ) проводится в роддоме на 3-7 день после рождения ребенка. Пред прививкой проводится  тщательное обследование ребенка ,  оценка уровня его здоровья и только           здоровым  детям разрешается введение вакцины  БЦЖ.

   Последующая прививка ( ревакцинация) проводится в 6-7-летнем возрасте после постановки пробы Манту, при отрицательном результате. Перед  ревакцинацией дети также тщательно  осматриваются медработником; учитываются заболевания, которыми ребенок болел ранее. И только после обследования проводится ревакцинация БЦЖ.

   Вакцину БЦЖ вводят строго внутрикожно на границе верхней и средней трети наружной поверхности левого плеча после обработки кожи 70% спиртом.    На месте введения вакцины появляется реакция   виде ограниченного воспаления кожи.

   Обратите внимание!  Не допускайте обработки места введения вакцины лекарственными препаратами.

   Вакцинация туберкулеза – надежная защита наших детей и подростков от тяжелого и опасного заболевания!

 

ПРОЙДИТЕ РЕНТГЕН !     

 

      Туберкулез – одно      из тяжелых инфекционных   заболеваний, которое в последние годы приняло характер эпидемии.     Рост заболеваемости среди детей и подростков опережает темпы распространения         инфекции среди взрослого населения. Увеличилось количество заболеваний такими формами туберкулеза , как скоротечная чахотка, туберкулезный менингит, поражение костей и суставов.  Почти каждый второй выявленный больной туберкулезом имеет открытую (заразную) форму  заболевания, что чревато инфицированием окружающих. В своем начале туберкулез легких может протекать бессимптомно, но его можно выявить при проведении рентгеновского обследования грудной клетки.  Одним из видов      рентгеновского обследования является флюорография  легких.   Она позволяет в 50% случаев выявить туберкулез легких      на самых ранних стадиях процесса.

 Часть населения боязливо относится к флюорографии и старается избегать этого обследования, не предполагая, что современная рентген аппаратура сводит к минимуму лучевое воздействие.  Результаты исследования состояния  здоровья людей, проходивших флюорографию более 40 раз, не обнаружили повышения заболеваемости онкологическими болезнями. Профилактические медицинские осмотры населения в Приморском крае в целях выявления  туберкулеза легких с обязательным проведением  флюорографии легких должна быть не реже 1 раза в 2 года, начиная с 15-летнего возраста.

   Людям, страдающим хроническими заболеваниями органов дыхания, мочеполовой и пищеварительной систем, сахарным диабетом, получающим гормональную, лучевую и противораковую терапию, проводят флюорографию легких ежегодно. К ним относятся также группы «высокого риска» ( бомжи, мигранты, вынужденные переселенцы, беженцы) и работники детских и спортивных учреждений. По  эпидпоказаниям профосмотр проводится 2 раза в год военнослужащим, ВИЧ-инфицированным, контактным из очагов туберкулезной  инфекции, пациентам наркологических и психиатрических учреждений. Важно знать, что  пожилого и старческого возраста, уже давно неработающие также должны проходить флюорографическое  обследование 1 раз в 2 года. Нередко именно  пожилой человек, ранее болевший туберкулезом, становится источником тубинфекции для своих родственников. Учитывая рост заболеваемости туберкулезом и то, что каждый больной открытой формой заболевания способен заразить за год до 30 человек, убедительно рекомендуем вам своевременно сделать флюорографию легких.

 Флюорографическое обследование легких можно пройти в поликлинике по месту жительства при наличии паспорта и страхового полиса.

   ПРИМИТЕ К  СВЕДЕНИЮ: чем раньше выявлено заболевание, тем больше шансов на выздоровление! Пока не случилось беды – посетите рентген-кабинет!

 

КАК МОЖНО ЗАРАЗИТЬСЯ ТУБЕРКУЛЕЗОМ

 

   Туберкулез – широко распространенное заразное инфекционное заболевание. Относится к группе социально значимых болезней, зависимых от экономических, социальных, медицинских причин. Многое  определяется образом жизни самого человека, прежде всего наличием вредных привычек: табакокурением, злоупотреблением алкоголем, употреблением наркотиков.

   Возбудители туберкулеза – микобактерии ( палочки Коха ) высоко устойчивы во внешней среде и  к воздействию физических и химических факторов. Во влажной  мокроте выдерживают нагревание до 75 о С в течении10 минут; при кипячении погибают через 5 минут; при комнатной температуре сохраняют жизнеспособность в течение 4 месяцев. Под воздействием прямых солнечных лучей микобактерии погибают через нескольких часов. В молоке, масле сохраняются до 10 месяцев,  мягком сыре – до 1,5 лет, замороженном мясе – до  года.

   Естественная восприимчивость людей к туберкулезу высока. Наиболее подвержены заболеванию дети до 3 лет; лица, находящиеся в очагах тубинфекции, пожилые люди и страдающие хроническими заболеваниями.

   Пути заражения туберкулезом:

  • Воздушно-капельный. Основной источник возбудителей —  больной заразной формой туберкулеза. При кашле, чихании, разговоре он выделяет в окружающую среду миллионы микобактерий, которые попадают в легкие здорового человека.
  • Пищевой  путь: при употреблении в пищу молока или мяса от больного туберкулезом животного( крупный рогатый скот, свиньи ), а также яиц и мяса больных птиц. Заражение связано с плохой термической обработкой пищевых продуктов.
  • Контактный путь: инфекция попадает в организм через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки.

   При туберкулезе могут поражаться практически все органы и ткани: легкие, кожа, лимфоузлы, кости и суставы. Мозговые оболочки, почки и мочевыделительная система, детородные органы  и др.

   Меры профилактики туберкулеза : выполнение принципов здорового образа жизни ( закаливание, полноценное питание, богатое витаминами  и белками, отказ от вредных привычек ), соблюдение правил личной гигиены.

   Специфические меры : обязательные прививки противотуберкулезной вакциной БЦЖ. Первая прививка делается в роддоме новорожденным, вторая прививка в 7-летнем возрасте.

     Вакцинопрофилактика туберкулеза – надежная защита от тяжелого и опасного заболевания!

  

Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза у детей

Многие люди считают, что туберкулез —  это где-то там, в тюрьме, среди БОМЖей, алкоголиков и прочих социальных элементов. Но это заблуждение, эта инфекция совсем рядом и ее очень много. Туберкулезом страдает большое количество людей разного возраста, пола, статуса и достатка во многих странах мира.

24 марта 2017 исполнилось 135 лет со дня открытия немецким ученым Робертом Кохом микобактерии туберкулеза, возбудителя болезни, которая по сей день остается актуальной и волнующей в планетарном масштабе. Ежегодно в мире заболевает туберкулезом около 9 миллионов людей и умирает от туберкулеза около полутора миллиона людей (по данным ВОЗ). А каждый третий человек в мире является инфицированным туберкулезом. Значит ли это, что все они заболеют? Нет, болезнь развивается только у 10% инфицированных. Однако, что же позволяет этой болезни оставаться так долго злободневной, несмотря на значительные успехи в науке и медицине в частности?

Во-первых, аэрогенный механизм передачи инфекции, реализуемый как через воздушно-капельный путь (при кашле, чихании, близкой беседе – аэрозоль может сохраняться до 6 часов), так и через воздушно-пылевой (микобактерии с частичками пыли с участка высохшей мокроты разносятся потоками воздуха). Также возможен алиментарный путь (реже):микобактерия туберкулеза попадает в организм человека через рот с молоком, мясом от больных животных, которые не прошли должной термической обработки, при использовании необработанной посуды (в кафе и ресторанах посуду кипятят или обрабатывают дезинфицирующими растворами редко), при недостаточной гигиене рук после контакта с предметами, на которых остались палочки Коха (например, после поездки в транспорте, лифте, игры в песочнице, контакта с денежными купюрами и монетами).

Во-вторых, высокая устойчивость самой микобактерии к факторам внешней среды. В почве, воде, в жилых помещениях, в некоторых продуктах (молоко, масло, сыр) бактерии остаются жизнеспособными около года, в книгах — до 3-х месяцев, в уличной пыли — до 8-12 дней, в воде — до 5 месяцев. Характерна устойчивость к кислотам, щелочам, спиртам. Прямые солнечные и ультрафиолетовые лучи убивают микобактерию в течение нескольких минут, при кипячении они разрушаются через 45 минут.

В-третьих, способность микобактерии вырабатывать устойчивость к противотуберкулезным препаратам. Сейчас все чаще регистрируется не просто монорезистентные штаммы (устойчивые к одному противотуберкулезному препарату), а штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (устойчивы к основным противотуберкулезным препаратам), вплоть до штаммов с широкой лекарственной устойчивостью (на них не действуют практически все препараты). При этом всё чаще и чаще устойчивые штаммы высеваются у пациентов с впервые выставленным диагнозом, не получавших терапии до этого.

У большинства специалистов фтизиатрии одно мнение: туберкулез у детей можно победить только при ликвидации туберкулеза среди взрослых. Пока это не произошло, медикам приходится проводить огромную организационную работу по своевременному выявлению и профилактике туберкулеза среди детского населения стран с неблагополучной ситуацией по туберкулезу.

Основа профилактики – вакцинация. Вакцинация БЦЖ проводится в роддоме на 3-5 сутки жизни малыша. Как и любая вакцина, БЦЖ не даёт 100% защиты, со временем защитные свойства ослабевают, но это остается самым действенным способом контроля над болезнью.

При туберкулезе чаще всего не бывает своих особенных симптомов. Болезнь может протекать как острое респираторное вирусное заболевание, после которого ребенок долго чувствует недомогание, как затяжной бронхит, пневмония, не поддающиеся лечению, увеличение лимфатических узлов во многих группах и т.д. Иногда начало болезни протекает незаметно, без особых признаков. Дети раннего возраста становятся раздражительными, плаксивыми, капризными, ухудшается аппетит, плохо прибавляют в весе. Дети старшего возраста могут жаловаться на головную боль, усталость, головокружение, сонливость, субфебрильную температуру (37,0 – 37,2).Если болезнь прогрессирует, может присоединиться кашель (с или без мокроты), одышка, иногда – боли в грудной клетке. Если ребенок продолжает находиться в тесном контакте с больным и лечение не начато, то легкая форма первичного туберкулеза может осложниться бронхо – легочным поражением, воспалением плевры, туберкулезом почек, костно – суставной или центральной нервной системы.

Как вовремя распознать туберкулез?Возможна активная и пассивная диагностика туберкулеза. Пассивная диагностика – больной обращается к врачу с жалобами. Но у детей жалобы появляются, когда процесс уже очень запущен. Поэтому в Мире, и в Беларуси также, применяют активную диагностику туберкулеза, используя туберкулиновые пробы – реакцию Мантуи Диаскинтест.

Туберкулинодиагностика основывается на определении повышенной чувствительности замедленного типа к туберкулину, то есть туберкулиновой аллергии, возникшей в результате заражения вирулентными микобактериями туберкулеза (МБТ) или вакцинации БЦЖ. Проще сказать, что туберкулин выявляет специфические антитела (Ig A, M, G) к туберкулезу, которые выработались в процессе формирования туберкулезных гранулем. Туберкулин является очищенным туберкулезным токсином, который выступает как аллерген, на который у инфицированного МБТ ребенка происходит иммунный ответ. Туберкулезные аллергены не содержат в себе микробных тел, поэтому не может вызвать заболевание туберкулезом.

Проба Манту проводится один раз в год детям с 1 года до 7 лет из групп риска. Детям от 8 лет до 17 лет из групп риска плановая иммунодиагностика проводится с помощью Диаскинтеста (рекомбинантный туберкулезный аллерген).  Он отличается от обычного туберкулина тем, что он выявляет только антитела, которые были выработаны после контакта с палочкой Коха и не реагирует на антитела, выработанные после вакцинации БЦЖ. Как следствие – более достоверный результат, при выявлении положительных или сомнительных реакций на Диаскинтест высокий процент выявления локальных форм туберкулеза. Диаскинтест имеет более высокую чувствительность и специфичность, чем туберкулин.

При сомнительных либо положительных результатах туберкулинодиагностики, ребенок направляется на консультацию к фтизиатру, где с помощью дополнительных методов (рентгенография, компьютерная томография, посев мокроты и т.д.) будет выставляться соответствующий диагноз и назначаться лечение. Единственным самым эффективным методом терапии является прием противотуберкулезных препаратов. Занимаясь самолечением, неадекватным приемом препаратов, использованием только народных средств лечения туберкулеза больные обрекают себя на смерть.Современные методы в руках опытных врачей позволяют правильно установить диагноз, своевременно назначить адекватное лечение туберкулеза с индивидуальным подбором лекарственных средств и излечить пациента от туберкулеза и неспецифических заболеваний легких. Благодаря внедрению современных технологий в ведущих лечебных учреждениях страны достигнута высокая эффективность лечения – прекращение бактериовыделения достигнуто у 100 % пациентов.

Своевременное выявление туберкулеза у взрослых, окружающих детей,поможет значительно снизить риск инфицирования и заболевания малышей. Для этого всем взрослым и подросткам старше 17 лет рекомендовано проходить ежегодную флюорографию. Начните с себя, пройдите обследование на туберкулез, не подвергайте опасности здоровье свое и своих детей.

 

Врач-инфекционист

учреждения здравоохранения   «5-я городская детская поликлиника»

Кузнецов Илья Евгеньевич

ГБУЗ ОТБ №1 — Диагностика и профилактика туберкулеза

Диагностика туберкулеза


 

У детей младше 14 лет для диагностики туберкулеза большую ценность представляют внутрикожные туберкулиновые пробы (реакция Манту, Диаскинтест), которые являются основным методом выявления туберкулеза у детей младше 14 лет.  Данный метод считается наиболее безопасным.


 

Проба Манту заключается во введении внутрикожно туберкулина – туберкулезного аллергена.

Пробу Манту производит по назначению врача специально обученная медицинская сестра.

Результаты туберкулиновой пробы оценивает врач или специально обученная медсестра, проводившая эту пробу  спустя 72 часа после проведения пробы путем измерения размера инфильтрата (папулы) в миллиметрах.

Положительная реакция Манту возможна у тех людей, в чьем организме присутствуют микробактерии туберкулеза.
 

Кому необходимо проводить реакцию Манту:         

  • всем здоровым детям, привитым БЦЖ, реакцию Манту проводят 1 раз в год.
  • детям из групп риска (не привитые БЦЖ, страдающие сахарным диабетом, язвенной болезнью, заболеваниями крови, системными заболеваниями, получающие гормональную терапию больше 1 месяца, ВИЧ-инфицированные, часто болеющие, страдающие хроническими заболеваниями почек и органов дыхания).
  • при необходимости (обследование ребенка на туберкулез, подготовка к прививке БЦЖ).

Существуют некоторые противопоказания к проведению пробы Манту, которые могут дать ложноположительный результат:
 

  • кожные заболевания
  • аллергические заболевания
  • карантин в детском саду
  • противопоказанием к проведению реакции Манту является эпилепсия.

Перед проведением пробы ребенку необходимо исключить из рациона высокоаллергенные продукты (шоколад, какао, сладости, цитрусовые, клубнику, персики, яйца, блюда из курицы), а также другие продукты, которые вызывали у ребенка аллергическую реакцию.

Оценку результатов проводит врач через 72 часа.

Почему пробу Манту необходимо проводить ежегодно?

Ответ прост: если проба Манту проводится ежегодно, врач, имея данные прошлогодней пробы, увидит разницу и своевременно заподозрит инфицирование, благодаря чему заболевание можно будет победить в кратчайшие сроки.

Проба Манту безвредна как для здоровых детей и подростков, так и для лиц с соматическими заболеваниями.

Помимо реакции Манту в диагностике туберкулеза используют диаскинтест – инновационный


 

препарат, используемый для диагностики туберкулезной инфекции.

Диаскинтест рекомендован для использования в качестве скрининга с 8-летнего возраста, а также по показаниям у детей до 7 лет.

Диаскинтест предназначен для постановки внутрикожной пробы, которая проводится по тем же правилам что и проба Манту с туберкулином. Оценка результатов проводится также через 72 часа.

В состав препарата входит аллерген – белок,  состоящий из двух антигенов, являющихся специфическими для микобактерии туберкулеза.

Т-спот и квантифероновый тест – два теста, в основе которых лежит иммунологический способ диагностики туберкулеза по крови. Этот способ определения носительства туберкулеза очень информативен. Он позволяет исключить ложноположительные реакции. Для проведения исследований осуществляется забор крови из вены.

Существует ряд показаний к проведению данных исследований, среди которых ложноположительные или положительные результаты пробы Манту, контакты с людьми, болеющими активной формой туберкулеза, наличие ВИЧ-инфекции и другие.

Противопоказаний к применению не имеет, так как является абсолютно безопасным и не имеет побочных реакций. Ограничений по возрасту также не имеет.


 

У подростков старше 14 лет и взрослых основным методом определения ранних форм туберкулеза является флюорография. Массовая флюорография является традиционным методом выявления туберкулеза. Ее проводят гражданам 1 раз в 2 года.

Если после флюорографии или других методов исследования возникло подозрение на туберкулез, – проводят рентгенографию органов грудной клетки.

Для диагностики туберкулеза проводят бактериологическое исследование (микроскопия мазков мокроты от кашляющих больных).

Диагноз туберкулезной интоксикации устанавливается только после обследования в условиях специального противотуберкулезного учреждения.

Профилактика туберкулеза.

Всемирная Организация здравоохранения (ВОЗ) разработала стратегию  ликвидации туберкулеза, цель которой – «Остановить глобальную эпидемию туберкулеза».

«К 2035 году ни одна из семей, где есть больные туберкулезом, не должна нести катастрофических расходов» — ВОЗ.

Основными компонентами стратегии являются комплексное лечение и профилактика ориентированные на пациента (ранняя диагностика, скрининг контактных лиц, лечение всех больных туберкулезом, включая больных туберкулезом с лекарственной устойчивостью).

В рамках этой стратегии планируется к 2035 году снизить вероятность летального исхода от туберкулеза на 95%.

Профилактика туберкулеза у детей


 

Профилактика туберкулеза – это комплекс мероприятий, направленных на предупреждение возникновения, распространения туберкулеза, а также его выявление.

Наиболее эффективным мероприятием является предупреждение контакта  с больным активной формой туберкулеза.

Во многих странах туберкулез встречается чаще, чем в нашей стране. Это говорит о том, что во время поездок за границу необходимо избегать опасных и продолжительных контактов с вероятно инфицированными людьми.

Основным способом профилактики туберкулеза у детей является прививка БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена) и БЦЖ-м (для щадящей первичной иммунизации).

Вакцина БЦЖ была создана в 1919 году на основе ослабленного штамма микобактерии.

Вакцинация БЦЖ высокоэффективна для профилактики тяжелых форм туберкулеза у детей.

В соответствии с Национальным календарем профилактических прививок вакцинацию проводят в роддоме при отсутствии противопоказаний в первые 3-7 дней жизни ребенка.

Если ребенок не был привит в роддоме при отсутствии противопоказаний, прививка проводится в поликлинике после снятия противопоказаний. После прививки иммунитет вырабатывается через 2 месяца. Если ребенок не привит до 6-месячного возраста, то в 6 месяцев необходимо ему провести туберкулиновую пробу Манту. Если она положительная – ребенка направляют  к фтизиатру.

Вакцину БЦЖ вводят внутрикожно на границе средней и верхней трети наружной поверхности левого плеча.

На месте внутрикожного введения вакцины БЦЖ развивается специфическая реакция в виде папулы размером 5-10 мм в диаметре. У новорожденных нормальная прививочная реакция развивается спустя 4-6 недель. Обратному развитию реакция подвергается в течение 2-3 месяцев.

У 90-95% вакцинированных на месте образуется поверхностный рубчик.

Иммунитет, приобретенный после прививки БЦЖ, сохраняется в среднем 5 лет. Для поддержания приобретенного иммунитета повторные прививки проводятся в 7 и 14 лет при отрицательной пробе Манту.

 Дети, привитые от туберкулеза, болеют в 15 раз реже и значительно легче, чем непривитые.

В случае, если ребенок имеет медицинский отвод, и в роддоме ему не провели вакцинацию БЦЖ, перед тем, как он будет выписан, – вся семья должна быть обследована флюорографически.

Существуют противопоказания к вакцинации БЦЖ, среди которых недоношенность (масса тела при рождении менее 2500 г.), первичное иммунодефицитное состояние, туберкулез в семье и др.).

Дети, не вакцинированные в период новорожденности, получают вакцину БЦЖ-м. Детям в возрасте 2 месяцев и старше предварительно проводят пробу Манту.
 

Профилактика туберкулеза у взрослых


 


 

Профилактикой туберкулеза у взрослых является ежегодное диспансерное наблюдение и выявление заболеваний на ранних стадиях (флюорография).

 

В целях выявления туберкулеза периодически проводятся медицинские осмотры.

Порядок и сроки проведения профилактических  медицинских осмотров граждан установлены законодательно.

В семье, где проживает беременная женщина , все лица должны быть обследованы флюорографически на туберкулез.

Очень важно в профилактике туберкулеза соблюдать правила ведения здорового образа жизни,
 

  • отказ от вредных привычек,
  • полноценное питание,
  • физическая активность,
  • пребывание на свежем воздухе
  • своевременное лечение любых заболеваний
  • борьба со стрессами
  • соблюдение правил личной гигиены.

Мероприятия в очаге

Больной туберкулезом (бактериовыделитель) должен быть госпитализирован для проведения курса противотуберкулезной терапии до прекращения выделения им бактерий. После изоляции больного проводят заключительную дезинфекцию.

Лица, находящиеся или находившиеся в контакте с больным туберкулезом, в соответствии с законодательством Российской Федерации проходят обследование в целях выявления туберкулеза.

При кашле больной должен отворачиваться и соблюдать правила личной гигиены. Мокроту сплевывать в отдельную плевательницу.

Помещение, где находится больной, должно подвергаться ежедневной влажной уборке с дезинфицирующими средствами.

Благодаря вакцинопрофилактике и наличию эффективных противотуберкулезных препаратов, можно контролировать данное заболевание.


 

От туберкулеза не застрахован никто, особенно ребенок.

Берегите себя, своих детей и близких от туберкулеза!
 

СП  3.1.2.3114-13 «Профилактика туберкулеза»

Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации (ред. от 29.10.2009)»

Письмо Минздрава России от 07.04.2017 n 15-2/10/2-2343 «о направлении клинических рекомендаций «выявление и диагностика туберкулеза у детей, поступающих и обучающихся в образовательных организациях»» (вместе с «клиническими рекомендациями «выявление и диагностика туберкулеза у детей, поступающих и обучающихся в образовательных организациях», утв. Российским обществом фтизиатров 07.03.2017.

 

Ранняя диагностика туберкулеза и его профилактика у детей дошкольного возраста из групп «риска»

1. Абдулаева З.К. Группы риска и профилактика туберкулеза у детей и подростков в новых социально-медицинских условиях : автореф. дис. . канд. мед. наук / З.К. Абдулаева. — Махачкала, 2000. 25 с.

2. Авдюхина Т.И. Современный взгляд на проблему гельминтозов у детей и эффективные пути ее решения / Т.И. Авдюхина, Т.Н. Константинова, М.Н. Прокошева // Лечащий Врач.- 2004.- № 1. С. 14-18.

3. Аксенова В.А. Инфицированность и заболеваемость туберкулезом детей как показатель общей эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России / В.А. Аксенова // Пробл. туб.- 2002. № 1. — С. 6-9.

4. Аксенова К.И. Формирование групп риска у детей и подростков школьников по результатам туберкулинодиагностики в условиях напряженной эпидемиологической ситуации : автореф. дис. . канд. мед. наук / К.И. Аксенова. — М., 2000. — 22 с.

5. Аксенова К.И. Влияние вакцинопрофилактики и химиопрофилактики на заболеваемость детей туберкулезом при напряженной эпидемической ситуации / К.И. Аксенова // Пробл. туб. 2002. — № 1. — С. 12-14.

6. Аксенова К.И. Методы контроля качества работы при массовой туберкулинодиагностике / К.И. Аксенова, Е.С. Овсянкина, Т.М. Александрова // Пробл.туб. 2002. — № 2. — С. 35.

7. Андреева Е.И. Патогенетические основы врачебной тактики оздоровления ЧБД, посещающие дошкольные учреждения / Е.И. Андреева, Б.К. Мусина // Педиатрия. 1990. — № 9. — С. 63-67.

8. Артемов В.Г. Нормализация физиологических функций человека ионизатором воздуха индивидуального пользования / В.Г. Артемов // Наука производству. — 2002. — № 4. — С. 52-53.

9. Балаболкин И.И. Современная концепция патогенеза и принципы терапии аллергических заболеваний у детей / И.И. Балаболкин // Педиатрия. 2003. — № 4. — С. 52-57.

10. Балуева В.А. Физиологическое обоснование модели здоровьесберегающей среды для детей 4-6лет в условиях детского образовательного учреждения : автореф. дис. . канд. биол. наук /

11. B.А. Балуева. Волгоград, 2002. — 25 с. : ил.

12. Балчугов В.А. Метод неспецифической профилактики острых респираторных заболеваний в организованных коллективах : автореф. дис. . канд. мед. наук / В.А. Балчугов. Н.Новгород, 2000. — 20 с. : ил.

13. Баранов A.A. Организация оздоровления часто болеющих детей в яслях-садах / A.A. Баранов, В.Ю. Альбицкий, И.И. Пуртов // Педиатрия. 1984. — № 11. — С. 38-41.

14. Баранов A.A. Состояние здоровья детей на рубеже веков: проблемы и решения / A.A. Баранов // Пробл. туб. 2001. — № 1.1. C. 3-9.

15. Барнаулов О.Д. Фитотерапия больных легочным туберкулезом / О.Д. Барнаулов. СПб. : ЗАО «ВЕСЬ», 1999. — 416 с.

16. Барнаулов О.Д. Фитотерапия простудных заболеваний : руководство / О.Д. Барнаулов. СПб., 1998. — 160 с.

17. Бенсман В.М. Облегченные способы статистического анализа в клинической медицине / В.М. Бенсман. Краснодар, 2002. — 30 с.

18. Бердичевская Е.М. Оценка физических возможностей детей дошкольного возраста методом шкалирования / Е.М.

19. Бердичевская, Ю.А. Зузик // Российский педиатрический журнал. -2004. № 4.- С. 58-60.

20. Березенцева Е.В. Оздоровление часто болеющих детей в дошкольных учреждениях : автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.В. Березенцева. М., 2001. — 22 с.

21. Боголюбов В.М. Общая физиотерапия / В.М. Боголюбов, Г.Н. Пономаренко. М.-СПб., 1997. — 480 с.

22. Боряк В.П. Обоснование и эффективность применения новой медицинской технологии фитоаэроионизации для коррекции адаптационных нарушений с лечебной и профилактической целью : автореф. дис. . д-ра мед. наук / В.П. Боряк. Пятигорск, 1999. -34 с.

23. Брилль Г.Е. Молекулярно-клеточные основы терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения / Г.Е. Брилль. — Саратов : Издательство Саратовского медицинского университета, 2000. — 42 с.

24. Васильев И.Г. Физические факторы в лечении деструктивного туберкулеза легких с бактериовыделением : автореф. дис. . канд. мед. наук / И.Г. Васильев. М., 2002. — 23 с.

25. Ваулина О.В. Эффективность комплексной оздоровительной программы «Технология деятельности школьной медицинской сестры» : автореф. дис. . канд. мед. наук / О.В. Ваулина. М., 1998. — 24 с.

26. Вельтищев Ю.Е. Концепция риска болезни и безопасности здоровья ребенка / Ю.Е. Вельтищев // Приложение к журналу : Российский вестник перинатологии и педиатрии : лекция № 2. -М., 1994. 84 с.

27. Влияние изофона в комплексном лечении больных туберкулезом легких на иммунологические показатели крови / П.С.Криволос и др. // Медицинская иммунология. 2001. — Т. 3, № 2. — С. 224.

28. Влияние специфической противотуберкулезной терапии на ЖКТ детей. / В.Л.Пайков и др. // Пробл.туб. 1998. — № 2. — С. 22-24.

29. Влияние фитотерапии на возможность предупреждения и устранения гепатотоксических реакций у больных туберкулезомлегких, носителей маркеров вируса гепатита В. / Л.А.Галицкий и др. // Пробл.туб. 1997. — № 4. — С. 35-38.

30. Возможности реакции активности клеток тимуса при трансцеребральном применении физических факторов / В.М.Боголюбов и др. // Вопр. курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1997. — № 3. — С. 3-8.

31. Вычугжанина Е.Ю. Клинико-иммунологические особенности малых форм туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов у детей дошкольного и младшего школьного возраста : автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.Ю. Вычугжанина. М., 1999. — 25 с.

32. Выявление антигенсвязывающих лимфоцитов при диагностике туберкулеза / Н.А.Гнусарева и др. // Пробл. туб. — 2001.- № 5. С. 41-42.

33. Выявление туберкулеза у детей из новых групп риска и эффективность химиопрофилактики / Л.А.Митинская и др. // Пробл. туб. 1996. — № 6. — С. 33-35.

34. Гамалея Н.Ф. Лазерная иммуномодуляция : вовлечение клеточных путей сигнальной трансдукции / Н.Ф. Гамалея, А.Г. Федорчук, И.В. Прокопенко // Фотобиология и фотомедицина. — 1999. Т. 2. — № 1. — С. 44-49.

35. Ганиев К.Г. Санаторное лечение детей, больных туберкулезом в сочетании с неспецифическими заболеваниями легких / К.Г. Ганиев, Т.А. Вавилова, H.A. Салахутдинова // Пробл. туб. 2000. — № 4. — С. 34-36.

36. Горелик Н.Д. Мероприятия по оздоровлению ЧБД дошкольных учреждений / Н.Д. Горелик // Педиатрия. 1991. — № 3. — С. 86-89.

37. Горяйнов И.И. Иммуномодулирующее действие магнитно-лазерного облучения в норме и при некоторых видахэкспериментальной патологии : автореф. дис. . канд. мед. наук / И.И. Горяйнов. Курск, 1994. — 24 с.

38. Григорьев Ю.Г. Проблема электромагнитной безопасности населения / Ю.Г. Григорьев // Проблема электромагнитной безопасности населения. Фундаментальные и прикладные исследования. М., 1999. — 45 с.

39. Губкина М.Ф. Ценность иммуноферментного анализа в диагностике и дифференциальной диагностике абацилярного туберкулеза у детей старшего возраста и подростков / М.Ф. Губкина, Е.С. Овсянкина, A.B. Баенский // Пробл. туб. 2002. — № 12. — С. 16-18.

40. Гуляева H.A. Клинико-эпидемиологическая характеристика туберкулезной инфекции у детей раннего и дошкольного возраста Якутии : автореф. дис. . канд. мед. наук / H.A. Гуляева. СПб., 1999. — 23 с.

41. Гуляр С.А. Биоптрон новая технология лечения / С.А. Гуляр // Цептер — новости. — К. : Цептер, 1999. — № 6. — С. 10-11.

42. Гуляр С.А. Биоптрон: теория, клиника, перспективы / С.А. Гуляр. К. : Цептер, 1999. — 102 с.

43. Гуляр С.А. Боль и Биоптрон : лечение болевых синдромов поляризованным светом / С.А. Гуляр, Ю.П. Лиманский, З.А. Тамарова. К. : Цептр, 2000. — 80 с.

44. Диагностика и методы определения эффективности химиотерапии туберкулеза у детей / Н.В. Юхименко и др. // Пробл.туб. 2002. — № 1. — С. 9-12.

45. Дифференцированный подход к профилактическому лечению детей, впервые инфицированных туберкулезом / Л.И. Мордовская и др. // Пробл. туб. 2001. — № 2. — С. 14-17.

46. Довгалюк И.Ф. Роль иммунологических факторов в развитии и течении туберкулезной инфекции у детей : автореф. . д-ра мед. наук / И.Ф. Довгалюк. СПб., 1993. — 37 с.

47. Дышель С.Н. Обоснование системы мероприятий по оздоровлению и реабилитации детей в дошкольных образовательных учреждениях на территориях экологического риска : автореф. дис. . канд. мед. наук / С.Н. Дышель. -Н.Новгород, 2001. 24 с. : ил.

48. Езерский Р.Ф. Педиатрические аспекты скрыто протекающей туберкулезной инфекции / Р.Ф. Езерский // Педиатрия. 1995. — № 6. — С. 79-82.

49. Журков Е.Г. Реабилитация детей с заболеваниями органов дыхания в условиях дошкольного санатория общесоматического типа / Е.Г. Журков // Педиатрия. 1992. — № 3. — С. 63-66.

50. Завалев В.И. Пути повышения эффективности методов выявления туберкулеза в современных социально-экономических условиях : автореф. дис. . д-ра мед. наук / В.И. Завалев. М., 2000. — 30 с. : граф.

51. Змановский Ю.Ф. Эффективное закаливание в дошкольных учреждениях / Ю.Ф. Змановский, М.Н. Кузнецова, Ю.Е. Лукоянов // Педиатрия. 1989. — № 4. — С. 74-79.

52. Значение молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования в группах риска и у больных туберкулезом детей / Е.А.Маренина и др. // Пробл. туб. 2003. — № 3. — С. 3033.

53. Иммунный статус больных активным туберкулезным спондилитом / В.Н.Гусева и др. // Пробл. туб. 2003. — № 6. — С. 25-28.

54. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / под ред. М.М. Авербаха. М. : Медицина, 1976. — 309 с.

55. Инструкция по проведению профилактических осмотров детей дошкольного и школьного возрастов на основе медико-экономических нормативов. М., 1995. — 95 с.

56. Информативность показателей иммунной системы при применении в комплексном лечении туберкулеза легких полиоксидония / С.С.Аршинова и др. // Медицинская Иммунология. СПб. РО РААКИ, 2001. — Т. 3, № 4. — С. 567-573.

57. Использование социально-гигиенического скрининга в оценке здоровья детей, посещающих дошкольные учреждения : информационно-методические материалы / И.И.Пуртов и др.. -Н-Новгород, 1996. 43 с.

58. Казаков К.С. Клинико-лабораторная диагностика побочных реакций на противотуберкулезные препараты при их различной комбинации у детей / К.С. Казаков, Р.И. Захарова, Ф.Т. Абсадыкова // Пробл.туб. 1990. — № 9. — С. 40-42.

59. Касаткин В.Н. Результаты трехлетнего катамнеза у ЧБД / В.Н. Касаткин, Н.В. Михайлова, А.Г. Румянцев // Педиатрия. -1998.-№ 2.-С. 43-46.

60. Карандашов В.И. Фототерапия (Светотерапия) : руководство для врачей / В.И. Карандашов, Е.Б. Петухов, B.C. Зродликов ; под ред. академика РАМН Н.Р. Палеева. М. : Медицина, 2001. — 392 с.

61. Карпов A.B. Активное выявление туберкулеза методом иммуноферментного анализа при целевых осмотрах населения : автореф. дис. . д-ра мед. наук / A.B. Карпов. СПб., 1998. — 30 с.

62. Каукнайнен А.Б. Часто болеющие дети : учеб. пособие для врачей-слушателей / А.Б. Каукнайнен. Ленинград, 1990. — 23 с.

63. КВЧ-терапия низкоинтенсивным шумовым излучением / В.А.Балчугов и др.. Н.Новгород : Издательство Нижегородского госуниверситета им. Н.И.Лобачевского, 2002. -192 с.

64. Клиника и течение туберкулеза у детей / Т.Г.Теньковская и др. // Организация борьбы с туберкулезом у детей и подростков. М., 1986. — С. 60-64.

65. Клиническая и иммунологическая характеристика детей с локальными и множественными формами первичного туберкулеза / И.Ф.Довгалюк и др. // Пробл.туб. 1995. — № 5. — С. 24-27.

66. Ковалевский В.А. Внутренняя картина болезни у часто болеющих старших дошкольников / В.А. Ковалевский // Педиатрия. 1998. — № 1. — С. 102-103.

67. Коваленко К.Н. Актуальные вопросы фтизиопедиатрии / К.Н. Коваленко, И.Ф. Довгалюк // Пробл. туб. 1995. — № 5. — С. 19-21.

68. Коваленко Н.М. Эффективность реабилитации детей из экологически неблагоприятных регионов в санаторно-курортных условиях : автореф. дис. . канд. мед. наук / Н.М. Коваленко. -Воронеж, 1999. 26 с. : ил.

69. Кондакова М.Н. Клинико иммунобиохимическая характеристика туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов и генерализованных форм туберкулеза у детей : автореф. дис. . канд. мед. наук / М.Н. Кондакова. — СПб., 2000. — 19 с.

70. Кононенко В.Г. Влияние отрицательных социальных факторов на возникновение туберкулеза у детей / В.Г. Кононенко, Т.Г. Теньковская, JI.B. Подддубная // Пробл.туб. 1991. — № 1. — С. 21-22.

71. Королев Ю.Н. Общие закономерности ультраструктурных реакций при действии электромагнитных излучений / Ю.Н. Королев // Вопр. курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1997. — № 5. — С. 3-7.

72. Кочкин A.B. Реактивность детей, больных и инфицированных туберкулезом, в условиях изменяющейся активности специфического процесса : автореф. дис. . канд. мед. наук / A.B. Кочкин. Новосибирск, 1990. — 23 с.

73. Краснов В.А. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Западной Сибири / В.А. Краснов, Г.С. Мурашкина // Вест. Межрегион. Ассоц. «Здравоохр. Сибири». 2001. — № 1. — С. 1012.

74. Крук H.H. Неспецифическая профилактика гриппа и других острых респираторных заболеваний в детских дошкольных учреждениях : автореф. дис. . канд. мед. наук / H.H. Крук. -СПб., 1998. 15 с.

75. Кузнецова В.Н. Эффективность оздоровления часто болеющих детей в санаторных группах дошкольных учреждений / В.Н. Кузнецова // Педиатрия. 1990. — № 3. — С. 83-85.

76. Кузнецова М.Н. Неспецифическая профилактика респираторных заболеваний у детей : пособие для медицинских и педагогических работников дошкольных учреждений / М.Н. Кузнецова. М. : АРКТИ, 2003. — 88 с. — (Развитие и воспитание дошкольника).

77. Куфакова Г.А. Туберкулез у детей и подростков из групп социального риска : (Выявление, организация лечения) : автореф. дис. . д-ра мед. наук / Г.А. Куфакова. М., 1998. — 30 с.

78. Кучеров A.JL Туберкулез среди социально-отягощенных групп населения / A.JI. Кучеров // Пробл.туб. 1990. — № 6. — С. 20-23.

79. Лебедев К.А. Иммунограмма в клинической практике / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина. М. : Наука, 1990. — 224 с.

80. Лебедева Л.В. Роль специализированных санаторных учреждений в профилактике туберкулеза у детей / Л.В. Лебедева // Пробл. туб. 2002. — № 1. — С. 28-30.

81. Лимфотропная и местная лекарственная терапия инфекционно-воспалительных заболеваний легких: Методические рекомендации / А.В.Никитин и др.. Воронеж, 1990. — 17 с.

82. Лисицын Ю.П. Руководство по социальной гигиене и организации здравоохранения / Ю.П. Лисицын, E.H. Шиган, И.С.

83. Случанко ; под ред. Ю.П. Лисицына, Т. 1. М. : Медицина, 1987. -432 с.

84. Литвинов В.И. Достижения и перспективы исследований в области иммунологии и иммуногенетики туберкулеза / В.И. Литвинов, A.M. Мороз, В.Я. Гергерт // Пробл. туб. 1996. — № 6. -С. 14-18.

85. Майданник В.Г. Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике заболеваний верхних дыхательных путей у детей / В.Г. Майданник. Киев, 2003. — 177 с.

86. Макарова З.С. Особенности состояния здоровья часто болеющих детей раннего возраста / З.С. Макарова, Т.Я. Черток, Р.В. Тонкова-Ямпольская // Педиатрия. 1990. — № 5. — С. 59-64.

87. Макеева И.В. Физиотерапия при туберкулезе / И.В. Макеева // БЦЖ: Большой Целевой Журнал о туберкулезе. 2000. — № 9. -С. 42-44.

88. Макрушина Л.В. Совершенствование методов реабилитации часто болеющих детей в экологически неблагоприятном регионе : автореф. дис. . канд. мед. наук / Л.В. Макрушина. Краснодар, 2002. — 22 с. : ил.

89. Маренина Е.А. Диагностика туберкулеза у детей с использованием метода ПЦР : автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.А. Маренина. М., 2003. — 21 с.

90. Мартынов С.М. Практическая энциклопедия. Лечение детей нетрадиционными методами / С.М. Мартынов. М. : КРОН-ПРЕСС, 1999. — 688 с. — Серия «Будьте здоровы».

91. Маянский А.Н. Микобактерии : туберкулез и микобактериозы / А.Н. Маянский. Н.Новгород, 2000. — 74 с.

92. Мельник В.М. Туберкулиновая чувствительность у больных туберкулезом детей раннего и дошкольного возраста / В.М. Мельник, Л.И. Мыколышин // Пробл. туб. 2003. — № 8. — С. 5-7.

93. Микроволновая резонансная терапия : учебно-методическое пособие для врачей и студентов. Н.Новгород, 1998. — 84 с.

94. Митинская Л.А. Вспомогательные лечебные мероприятия в детских туберкулезных санаториях / Л.А. Митинская, В.А. Гаврилов, В.Ф. Елуфимова // Пробл. туб. 1988. — № 3. — С. 1214.

95. Митинская Л.А. Факторы риска первичного инфицирования туберкулезом детей и подростков / Л.А. Митинская, Г.А. Куфакова // Пробл. туб. 1990. — № 9. — С. 17-19.

96. Митинская Л.А. Туберкулинодиагностика (лекция) / Л.А. Митинская // Пробл.туб. 1998. — № 3. — С. 76-77.

97. Михайлова Н.В. Катамнез часто болеющих детей к школьному возрасту / Н.В. Михайлова, В.Н. Касаткин // Школа здоровья. 1996. — № 4. — С. 76-78.

98. Мордовская Л.И. Комплексное профилактическое лечение впервые инфицированных туберкулезом детей : автореф. дис. . канд. мед. наук / Л.И. Мордовская. М., 2000. — 19 с.

99. Морфофункциональная оценка воздействия биологически активной добавки «Литовит» на органы и системы организма / Ю.И. Бородин и др.. Новосибирск, 1999. — 78 с.

100. Морфофункциональные константы детского организма : справочник / В.А. Доскин и др.. М. : Медицина, 1997. — 288 с. : ил.

101. Насруллаева Г.М. Тактика реабилитации ЧБД с повторными респираторными инфекциями / Г.М. Насруллаева // Педиатрия. 1999. — № 4. — С. 108-110.

102. Некрасов C.B. Диагностическая и прогностическая значимость определения противотуберкулезных антител при инфицировании и заболевании туберкулезом легких у детей и взрослых : автореф. дис. . канд. мед. наук / C.B. Некрасов. М., 1999. — 23 с. : диагр.

103. Николаевский В.В. Биологическая активность эфирных масел / В.В. Николаевский, А.Е. Еременко. М. : Медицина.-1987. — 144 с.

104. Нисевич Н.И. К вопросу о дисбактериозе кишечника у детей / Н.И. Нисевич, М.О. Гаспарян, A.A. Новокшонов // Педиатрия. 1999. — № 1. — С. 98-100.

105. Новикова Н.М. Современные аспекты туберкулезной инфекции у детей в Западной Сибири / Н.М. Новикова, С.Т. Силайкина // Пробл. туб. 2003. — № 2. — С. 17-18.

106. Овсянкина Е.С. Особенности течения туберкулеза у подростков в зависимости от состояния эндокринной и гуморальной систем / Е.С. Овсянкина, И.В. Малютина, Р.Ш. Надыршина // Пробл.туб. 1988. — № 2. — С. 25-28.

107. Овчинникова Е.Л. Факторный анализ развития эпидемического и инфекционного процессов туберкулеза у детей в условиях крупного промышленного центра Западной Сибири : автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.Л. Овчинникова. Омск, 1999. — 18с.: ил.

108. Овчинникова Ю.Э. Клиническая значимость иммунологических и биохимических показателей в диагностике и лечении начальных проявлений туберкулезной инфекции у детей : автореф. дис. . канд. мед. наук / Ю.Э. Овчинникова. СПб., 2000. — 23 с. : ил.

109. Олисова О.Ю. Научно-практическая конференция «Светотерапия» Москва, дек. 2001. / О.Ю. Олисова // Рос. журн. кож. и венер. болезней. 2002. — № 6. — С. 84.

110. Олянишин В.Н. Дифференциальная диагностика первичных форм туберкулеза органов дыхания у детей и подростков с использованием НСТ-теста, ППН и капиляроскопии : автореф. дис. . канд. мед. наук / В.Н. Олянишин. М., 1988. — 28 с.

111. Опыт оздоровительной работы в дошкольных учреждениях с использованием контрастных воздушных ванн / Ю.Ф. Змановский и др. // Вопр.охр.мат. 1988. — № 8. — С. 67-70.

112. Опыт организации работы семейной консультации / Н.Г. Веселов и др. // Педиатрия. 1989. — № 3. — С. 80-82.

113. Организация работы по повышению уровня здоровья в детских коллективах / P.A. Дубинский и др. // Педиатрия. 2003.- № 4. С. 91-94.

114. Орлов B.JI. Характеристика контингентов детей с неспецифическими бронхолегочными заболеваниями, инфицированных туберкулезом / B.JI. Орлов // Пробл. туб. 1988.- № 5. С. 16-18.

115. Осин А.Я. Информативность индексов соотношения лейкоцитов периферической крови при бронхиальной астме у детей / А.Я. Осин, Т.Д. Осина // Лаб.дело. 1987. — № 2. — С. 3539.

116. Особенности иммунологической реактивности у больных туберкулезным спондилитом / Р.И. Шендерова и др. // Медицинская иммунология. — 2001. — Т. 3, № 2. С. 245.

117. Особенности субпопуляционного состава циркулирующих лимфоцитов у больных туберкулезом легких с различным пролиферативным ответом на туберкулин / Т.Е. Кисина и др. // Медицинская Иммунология. СПб. РО РАКИ, 2004. — Т. 6, № 3-5. -С. 312-313.

118. Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при инфицировании микобактериями туберкулеза у детей различных возрастных групп / JI.M. Куртасова и др. // Пробл. туб. 2003. — № 1. — С. 42-45.

119. Оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у тубинфицированных детей / Ж.Г. Полонская и др. // Медицинская иммунология. 2001. — Т. 3, № 2. — С. 234.

120. ПАЙЛЕР-терапия / В.Н. Сокрут и др. // Медицинская реабилитация в терапии : руководство для врачей. Донецк : ОАО УкрНТЭК, 2001. — С. 122-124.

121. Памфилова Ю.В. Новые организационные подходы к наблюдению детей в VI группе диспансерного учета по туберкулезу : автореф. дис. . канд. мед. наук / Ю.В. Памфилова. -М., 1998. 29 с.

122. Панасюкова O.P. Состояние иммунологической реактивности у больных туберкулезом легких с различнымхарактером кожной туберкулиновой чувствительности : автореф. дис. . канд. мед. наук / О.Р. Панасюкова. Киев, 1990.- 25 с.

123. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии : задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонов. М., 2000. — 52 с.

124. Позднякова A.C. Особенности клиники туберкулеза органов дыхания у детей в современных радиоэкологических условиях и профилактика заболевания : автореф. дис. . канд. мед. наук / A.C. Позднякова. М., 1999. — 29 с.

125. Потанина М.А. Анализ состояния здоровья детей, находящихся в дошкольном образовательном учреждении / М.А. Потанина, Н.Е. Санникова // Омский научный вестник. 2002. — № 19. — С. 200-201.

126. Потапенко Е.И. Взаимосвязь моно- и полиорганных форм туберкулеза у детей с иммуногематологическими показателями : автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.И. Потапенко. СПб., 1997. — 25 с.

127. Приказ МЗ и МП РФ от 14.03.95 № 60. Об утверждении инструкции по проведению профилактических осмотров детей дошкольного и школьного возрастов на основе медико-экономических нормативов. М., 1995. — 64 с.

128. Принципы этапной последовательной направленной пролонгированной иммунокоррекции у детей с вторичными иммунодефицитными состояниями / И.В. Нестерова и др. // Педиатрия. 1998. — № 6. — С. 69-72.

129. Присакарь И.В. Иммуномодулирующая активность миллиметровых волн крайне высокой частоты в норме и в условиях экспериментального вторичного иммунодефицита :автореф. дис. . канд. мед. наук / И.В. Присакарь. Курск, 2000. -21 с.

130. Противотуберкулезная помощь детям и подросткам из групп риска по туберкулезу / Е.С. Овсянкина и др. // Пробл. туб.- 2001. № 1. — С. 9-12.

131. Профилактика и ранняя диагностика туберкулеза органов дыхания у детей и подростков / С.А. Кшановский и др. // Пробл.туб. 1986. — № 10. — С. 3-6.

132. Пузырев О.Ю. Клинико-иммуно-метаболические основы этапной реабилитации детей раннего и дошкольного возраста с частой респираторной и повторной бронхолегочной патологией : автореф. дис. . д-ра мед. наук / О.Ю. Пузырев. Иваново, 1999. -38, 1. с. : ил.

133. Пуртов И.И. Пути оптимизации здоровья детей в раннем и дошкольном возрасте : автореф. дис. . д-ра мед. наук / И.И. Пуртов. М., 1994. — 45 с.

134. Пути совершенствования лечения туберкулеза у детей и подростков в условиях санатория / О.И. Король и др. // Пробл. туб. 1987.-№ 8. — С. 37-39.

135. Пучков К.Г. Лечение и реабилитация детей в туберкулезных стационарах и санаториях : автореф. дис. . д-ра мед. наук / К.Г. Пучков. М., 2001. — 44 с. : ил.

136. Раецкая Т.А. Здоровый образ жизни семьи основа профилактики заболеваний у детей / Т.А. Раецкая // Здравоохранение. — Кишинев, 1986. — № 3. — С. 37-39.

137. Рогацевич Т.К. Клинико-морфологическая характеристика нефропатий у тубинфицированных детей / Т.К. Рогацевич // Российский педиатрический журнал. 2004. — № 4. — С. 27-31.

138. Русова Т.В. Состояние здоровья младших школьников с различным умственным и физическим развитием / Т.В. Русова, Л.А. Жданова, Р.Р. Шиляев // Школа здоровья. 1996. — № 2. — С. 5-12.

139. Савельева Т.И. Опыт работы детской поликлиники по снижению заболеваемости детей в детских дошкольных учреждениях / Т.И. Савельева // Вопр.охр.мат. 1987. — Т. 32, № 8. — С. 61-62.

140. Саниев М.А. Клинико-социальные особенности формирования инфицирования детей микобактериями туберкулеза : автореф. дис. . канд. мед. наук / М.А. Саниев. М., 2003. — 23 с.

141. Середа В.Г. Особенности цитокинового статуса при туберкулезной инфекции у детей / В.Г. Середа, Е.В. Маркелова // Медицинская иммунология. — 2001. Т. 3, № 2. — С. 237.

142. Серегина И.Ф. Обоснование комплекса гигиенических и лечебно-реабилитационных мероприятий по укреплению здоровья детского населения : автореф. дис. . канд. мед. наук / И.Ф. Серегина. М., 2002. — 24 с. : ил.

143. Сиренко И.А. Иммунологическая реактивность у подростков с различными проявлениями туберкулезной инфекции / И.А. Сиренко // Пробл. туб. 2001. — № 1. — С. 38-41.

144. Скачкова Е.И. Причины, факторы и группы риска формирования лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза : автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.И. Скачкова. -М., 2003. 29 с. : ил.

145. Слободян JI.M. Часто болеющие дети (медико-социальные аспекты, состояние иммунитета, пути оздоровления) / J1.M. Слободян, Н.С. Воронцова, Н.Б. Процайло // Педиатрия. 1993. -№ 1. — С. 45-48.

146. Совершенствование деятельности туберкулезных санаториев для детей и подростков / М.В. Лобода и др. // Пробл. туб. 1990. — № 3. — С. 6-7.

147. Справочник по физиотерапии / В.Г. Ясногородский и др. ; под ред. В.Г. Ясногородского. М. : Медицина, 1992. — 512 с.

148. Ставицкая Н.В. Показатели иммунологической реактивности детей и их значение в определении лечебной тактики при инфицировании микобактериями туберкулеза : автореф. дис. . канд. мед. наук / Н.В. Ставицкая. Краснодар, 2003. — 22 с.

149. Стефани Д.В. Иммунология и иммунопатология детского возраста : руководство для врачей / Д.В. Стефани, Ю.Е. Вельтищев. М. : Медицина, 1996. — 384 с.

150. Субпопуляционная принадлежность Т-клеток, подверженных анергии и апоптозу у больных туберкулезом легких / Е.Р. Черных и др. // Пробл. туб. 2002. — № 7. — С. 43-48.

151. Суздаленков A.B. Состояние здоровья и современные возможности профилактики ОРЗ у детей в организованных коллективах : автореф. дис. . канд. мед. наук / A.B. Суздаленков.- М., 2002. 22 с. : ил.

152. Сухарев А.Г. Здоровье и физическое воспитание детей и подростков / А.Г. Сухарев // Школа здоровья. 1997. — № 1. — С. 7-13.

153. Талдыкин O.E. Использование фитонцидной активности для оздоровления воздуха закрытых помещений / O.E. Талдыкин // Фитонциды. Киев, 1981. — С. 201-203.

154. Ткачева Т.А. Работа по оздоровлению ослабленных и часто болеющих детей в дошкольных учреждениях г. Борисова / Т.А. Ткачева //Здравоохр. Белоруссии. 1988.- № 7. — С. 51-53.

155. Томан К. Туберкулез : выявление и химиотерапия. Вопросы и ответы : пер. с англ. / К. Томан. Женева : ВОЗ, 1980.- 297 с.

156. Тригуб H.H. Отдаленные наблюдения над детьми, инфицированными туберкулезом в раннем возрасте / H.H. Тригуб // Педиатрия. 1966. — № 1. — С. 26-30.

157. Туберкулезная чувствительность у детей раннего и дошкольного возраста / Е.М. Гусева и др. // Пробл. туб. 2001. -№ 1. — С.15-17.

158. Туберкулез : руководство по внутренним болезням / под ред. А.Г. Хоменко. М. : Медицина, 1996. — 496 с.

159. Туберкулез у детей и подростков : руководство для врачей / под ред. E.H. Янченко, М.С. Греймер. 2-е изд., перераб. и доп.- СПб. : Гиппократ, 1999. 336 с.

160. Тузанкина И. А. Лабораторная диагностика иммунной недостаточности у детей / И.А. Тузанкина, В.Н. Шершнев, O.A. Синявская // Педиатрия. 1999. — № 4. — С. 98-101.

161. Улащик B.C. Популярная физиотерапия / B.C. Улащик. -Мн. : Беларусь, 2003. 383 с. : ил.

162. Уманская A.A. Рефлексотерапия при гриппе, парагриппе и их осложнениях : автореф.дис. . канд. мед. наук / A.A. Уманская. М., 1987. — 34 с. : ил.

163. Урсов И.Г. Профилактика туберкулеза / И.Г. Урсов. -Новосибирск, 1991. 115 с.

164. Феклисова Л.В. Клинические особенности, профилактика и лечение гриппа у детей / Л.В. Феклисова, В.М. Шебекова // Педиатрия. 2002. — № 6. — С. 88-92.

165. Физическое развитие у детей школьного и дошкольного возраста Москвы и Московской области / Т.Ф. Абрамова и др. // Школа здоровья. М., 1996. — № 4. — С. 103-104.

166. Филатов H.H. Состояние здоровья детского населения Москвы / H.H. Филатов // Педиатрия. 1999. — № 1. — С. 10-16.

167. Флетчер И.Н. Новые подходы к диагностике и профилактике детского туберкулеза / И.Н. Флетчер, Н.В. Жебуртович // Пробл. туб. 2002. — № 4. — С. 3-5.

168. Фрейдович А.И. Интенсивное комбинированное лечение туберкулеза / А.И. Фрейдович. М., 2001. — 96 с.

169. Хадарцев A.A. Новые медицинские технологии на основе взаимодействия физических полей и излучений с биологическими объектами / A.A. Хадарцев // Вестн. новых мед. технологий. -Тула, 1999. № 1. — С. 7-15.

170. Хаитов P.M. Современные представления о защите организма от инфекции / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 2000. — № 1. — С. 61-64.

171. Ходзицкая В.К. Комплексная оценка состояния здоровья детей в раннем периоде первичной туберкулезной инфекции с учетом групп здоровья / В.К. Ходзицкая, А.Н. Зосимов // Пробл. туб. 1993. — № 6. — С. 7-9.

172. Ходзицкая В.К. Специфические факторы риска возникновения раннего периода первичной туберкулезной инфекции у детей / В.К. Ходзицкая, А.Н. Зосимов // Сб.научн.трудов. — Новосибирск, 1995. — С. 7-9.

173. Хоменко А.Г. Туберкулез как международная и национальная проблема / А.Г. Хоменко // Пробл. туб. 1994. — № 2. — С. 2-4.

174. Хоменко А.Г. Современные тенденции в эпидемиологии туберкулеза и пути уменьшения резервуара инфекции / А.Г. Хоменко // Пробл. туб. 1997. — № 1. — С. 4-6.

175. Цыганков П.Ю. Факторы, влияющие на формирование группы риска заболевания туберкулезом среди инфицированных детей в неблагоприятных эпидемиологических условиях : автореф. дис. . канд. мед. наук / П.Ю. Цыганков. Иркутск, 2000. — 22 с. : ил.

176. Чижевский A.JI. Руководство по применению ионизированного воздуха в промышленности, сельском хозяйстве и медицине / А.Л. Чижевский. М., 1959. — 228 с.

177. Чистякова А.И. Фитотерапия в педиатрии / А.И. Чистякова // Педиатрия. 1989. — № 10. — С. 69-72.

178. Шатров В.А. Сравнительное изучение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у больных туберкулезом легких с использованием стафилококков и частиц латекса / В.А. Шатров // Лаб.дело. 1984. — № 10. — С. 614-616.

179. Шендерова Р.И. Клеточный, гуморальный ответ и типы индивидуальных сывороточных белков у больных туберкулезом из различных регионов России : автореф. дис. . д-ра биол. наук / Р.И. Шендерова. СПб., 1994. — 40 с.

180. Шилова М.В. Влияние экзогенной инфекции на инфицированность туберкулезом детей и подростков / М.В. Шилова, А.А. Миляев // Пробл. туб. 2003. — № 1. — С. 7-11.

181. Шмаков П.Ю. Медико-социальная характеристика контингента часто болеющих детей с различным иммунным статусом и пути их оздоровления : автореф. . дис. канд. мед. наук / П.Ю. Шмаков. Рязань, 2002. — 23 с.

182. Шумская И.Ю. Роль Chlamydia рпеитошае-инфекции в патологии органов дыхания / И.Ю. Шумская, О.В. Ловачева // Пробл. туб. 2002. — № Ю. — С. 36-39.

183. Щепин О.П. Здоровье и физическое развитие детей в России в 1985 2000 г.г. / О.П. Щепин, Е.А. Тишук // Российский педиатрический журнал. — 2004. — № 1. — С. 47-49.

184. Экспрессия FAS-антигена на лимфоцитах периферической крови и антиген-специфический анализ лимфоцитов при туберкулезе легких / Р.Ш. Юсупова и др. // Медицинская иммунология. 2000. — Т. 2, № 2. — С. 205-206.

185. Эффективность использования иммунологических методов в клинико-лабораторной диагностике / Е.Е. Потемкина и др. // Клин.лаб.диагностика. 1996. — № 3. — С. 24-27.

186. Эффективность комплексной неспецифической защиты детей дошкольного возраста от респираторных вирусных инфекций / A.B. Слободенюк и др. // Педиатрия. 1989. — № 3. -С. 111.

187. Юхименко Н.В. Побочные реакции у детей при укороченных курсах химиотерапии внутригрудного туберкулеза / Н.В. Юхименко // Пробл. туб. 2002. — № 2. — С. 24-27.

188. Яровая Ю.А. Пути выявления и исходы туберкулезной инфекции у детей : автореф. дис. . канд. мед. наук / Ю.А. Яровая. СПб., 2002. — 23 с.

189. Bellanti J. A. Recurrent respiratory tract infections in paediatric patients / J.A. Bellanti // Drugs. 1997; 54 Suppl 1. — P. 14.

190. BIOPTRON. Operating instructions. Monchaltorf. Switzeland. 1998. 54 p.

191. BIOPTRON Patent (European) EP 0 3 11 125 В1. J. Kehrli, A. Ulrich European patent office. — 1989. — 9 p.

192. BIOPTRON Patent (USA) 5,001,608. J. Kehrli, A. Ulrich Therapeutic lamp emitted polarized light. — 1988. — 8 p.

193. Biour M. Bilan des hepatitis médicamenteuses recueillies en 10 ans par le Centre de Pharmacovigilance hospitalière Paris Saint -Antoine / M. Biour, J.D. Hamel, J. Wiessenburger // Therapie. 1984. — Vol. 39, № 5. — P. 501-502.

194. Bolton P. The effect of polarized light on the release of growth factors from the U-937 macrophage-like cell line / P. Bolton, M. Dyson, S. Young // Laser Therapy. 1992. — Vol. 4. — P. 33-42.

195. Cappelletty D. Microbiology of bacterial respiratory infections / D. Cappelletty // Pediatric Infectious Diseases J. 1998, Aug; 17 (8 Suppl). — P. 55-61.

196. Evaluation of DPPD, a single recombinant Mycobacterium tuberculosis protein as an alternative antigen for the Mantoux test / A. Campos-Neto et al. // Tuberculosis. 2001. — 81, № 5-6. — P. 353358.

197. Fenyo M. Theoretical and experimental basis of biomodulation / M. Fenyo // Optic Laser Technology. 1984. — Vol. 16. — P. 209215.

198. Fine P.E.M. The BCG story: Lessons from the past and implications for the future / P.E.M. Fine // Rev.infect. Dis. — 1989. — Vol. 11, № 2. P. 988-992.

199. Gennaro Maria Laura Immunologic diagnosis of tuberculosis : pap. the International Symposium on Tuberculosis Vaccine Development and Evaluation, San Francisco, Calif., 26-28 Aug., 1998

200. Maria Laura Gennaro // Clin. Infec.Diseases. 2000. — 30, № 3. — P. 243-246.

201. Gooch W.M. 3rd. Potential infectious disease complications of upper respiratory tract infections / W.M. Gooch // Pediatric Infectious Diseases J. 1998, Aug; 17 (8 Suppl). — P. 79-82.

202. Horn J. Die Entwicklung der Rontgenreihehunter suchingen in der Deutschen Demokratischen Republik / J. Horn // Mitt. Osterr. Sa-nit-verwaet. 1982. — Bd. 83, № 7/8. — P. 134-141.

203. Ivanyl I. Immunodiagnosis assays for tuberculosis and leprosy / I. Ivanyl, G.H. Bothamley, P.S. Jackett // Brit. med. Bull. 1998. -Vol. 44, № 3. — P. 635-639.

204. Karu T.I. Photobiological fundamentals of low power laser / T.I. Karu // J. Quantum Electronics. 1987. — Vol. 23. — P. 17031717.

205. Kochi A. The global tuberculosis situation and the new control strategy of the World Health Organisation / A. Kochi // Tubercle. 1991. — Vol. 72, № 1. — P. 244-251.

206. Kozma D. Leberschadigungsgefahr bei moderrer antituberkuloser Behandlung / D. Kozma, K. Lapis, L. Debreczeni // Prax. Klin. Pneumol. 1983. -Vol. 37, Soud. 1. — P. 479-481.

207. Kubasova T. Investigations on biological effect of polarized light / T. Kubasova, M. Fenyo, Z. Somosy // Photochem. Photobiol. -1988. Vol. 48. — P. 505-509.

208. Kubasova T. Effect of visible light on some cellular and immune parameters / T. Kubasova, M. Horvath, K. Kocsis // Immunol. Cell. Biol. 1995. — Vol. 73. — P. 239-244.

209. Lockshin M.D. Mechanism of buffy coat migration inhibition test / M.D. Lockshin, I. Waxman, M.W. Jenkins. «Experientia», 1973. — Vol. 29. — P. 340-341.

210. Mansbach A.L. Control of recurrent ENT infections in children / A.L. Mansbach // Rev-Med-Brux. 1994, Jul-Aug ; 15(4). -P. 198-201.

211. Okamoto K. Therapy of chronic tonsillitis / K. Okamoto // Asian Med. J. Jap. 1986. — Vol. 29, № 7. — P. 390-397.

212. Ortutay J. Laser therapy in rheumatology / J. Ortutay, K. Barabas // Lasers in medicine and dentistry : Basic science and up-to-date clinical application of low-energy-level laser therapy-LLLT : ed. Z. Simunovic. Rijeka : Vitagraf, 2000. — P. 329-343.

213. Otto H.S. Aktueller Stand der antituberkulosen Chemotherapie im Kindesalter / H.S. Otto, K. Magdorf // Prax. Klin. Pneumol. -1981. Vol. 35, Soud. 1. — P. 588-595.

214. Park B.H. Infection and nitrobluetetrazolium reduction by neutrophils : a diagnostic aid / B.H. Park, S.M. Fikrig, E.M. Smithwick // Lancet. 1968. — Vol. 11. — P. 532-534.

215. Patients with Multidrug Resistant Tuberculosis with Low CD 4 T Cell Counts Have Impaired Thl.1997. — Vol. 158, № 1. — P. 492-500.

216. Pulmonary Tuberculosis : Decreased Activation of T lymphocyte Subsets in vitro / L.V. Kovalchuk et al. // Russian Journal of Immunology. 1996. — Vol. 1, № 1. — P. 23-28.

217. Rapid detection of M.tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific I cells / A. Lalvani et al. // Quart J. Med. 2000. -93, № 11. — P. 772.

218. Sauer H. Reactive oxygen species as intracellular messengers during cell growth and differentiation / H. Sauer, M. Wartenberg, J. Hescheler // Cell Physiol. Biochem. 2001. — Vol. 11 (4). — P. 173186.

219. Sbarbaro J.A. Skin testing in the diagnosis of tuberculosis / J.A. Sbarbaro // Seminar resp. Infect. 1986. — Vol. 1, № 4. — P. 234238.

220. Schmid P.Ch. Tuberculose beim Kind-eine zykliche Infektionskrankheit / P.Ch. Schmid // Med. Weft. 1980. — Bd. 31, № 18. — P. 282-285.

221. Scvor G. Immunoprofile Studies in Patients with Pulmonary Tuberculosis / G. Scvor, L. Trnka // Scand. J. resp. Dis. 1989. — Vol. 60. — № 4. — P. 161-167.

222. Smith S. Immunolobiology of childhood tuberculosis: A window on the ontogeny of cellular immunity / S. Smith, R. Jacobs, C. Wilson // J. Pediatrics. 1997. — Vol. 131. — P. 16-27.

223. Starke J.R. Resurgence of tuberculosis in children / J.R. Starke // Pediatr. Pulmonol. 1995. — S. n. 11. — P. 16-17.

224. Styblo K. Die gegen wortige tuberculosesituation in der Eubwich Jungslanelern / K. Styblo // Z. Erkr. Atmorg. 1982. — Bd. 158, № i2. — P. 866-869.

225. Styblo K. Overview and epidemiology assessment of the current global tuberculosis situation an control in developing countries / K. Styblo // Rev. Inf. Dis. 1989. — № 11. — S. 339-346.

226. Tokunaga T. Immunology of tuberculosis / T. Tokunaga, T. Hashimoto // Kekkaku. 1985. — V. 60, № l.-P. 31-50.

227. Tuner J. Low laser therapy. Clinical practice and scientific background / J. Tuner, L. Hode. Prima Books in Sweden AB, 1999. — 404 p.

228. Ullrich S.E. The role of cytokines in UV induced systemic immune suppression / S.E. Ullrich, D.A. Schmitt // J. Dermatol. Sci. -, 2000. — Vol. 23. — S. 10-12.

229. Whole-blood lymphocyte cultures / E. Bloemence et al. //

230. J.Immunol. Methods. 1989. — Vol. 122, № 2. — P. 161-167.\

ВЫЯВЛЕНИЕ ТУБЕРКУЛЕЗА В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ | Пунга В.В.

Выявление – составная часть борьбы с туберкулезом. Для выявления и диагностики туберкулеза применяются различные методы (туберкулинодиагностика, рентгено-флюорографические, бактериологические), но наиболее информативным, быстрым и экономичным является бактериоскопия мокроты по Цилю – Нельсену у лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 нед, кровохарканье, боли в грудной клетке, потеря массы тела) и рентгенография грудной клетки.

To detect tuberculosis is part of its control programme. For identification and diagnosis of the disease, different (tuberculin diagnostic, X-ray, fluorographic, and bacteriological) methods are used, but the most informative, rapid, and cost-effective ones are Ziehl-Neelsen’s sputum bacterioscopy in individuals with signs of suspected tuberculosis (over 3-week productive cough, hemoptysis, chest pain, weight loss) and chest X-ray.

В.В. Пунга — доктор мед. наук, руководитель отдела Центрального НИИ туберкулеза РАМН, Москва
V.V. Punga — MD, Head of Department, Central Research Institute of Tuberculosis, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Выявление – составная часть борьбы с туберкулезом, направленная на идентификацию случаев туберкулеза в обществе. Выявление больных туберкулезом осуществляется медицинским персоналом учреждений общей лечебной сети при обследовании пациентов, обратившихся за медицинской помощью, а также при плановых профилактических обследованиях определенных групп населения.
   Основными методами выявления туберкулеза остаются:
   – туберкулинодиагностика;
   – рентгенофлюорографические обследования;
   – бактериологическая диагностика.
   Все эти методы, каждый в отдельности или в комбинации, применяются у разных групп населения: туберкулинодиагностика – у детей и подростков; профилактические флюорографические обследования – у лиц старше 15 лет; бактериологические, рентгенологические обследования, туберкулинодиагностика – у лиц с повышенным риском заболевания туберкулезом, находящихся на диспансерном учете, обращающихся в поликлиники и поступающих в стационар на лечение с симптомами заболевания, подозрительными на туберкулез. Туберкулез поражает различные органы и системы, поэтому для диагностики внелегочного туберкулеза применяются специальные методы обследования в зависимости от локализации заболевания.
   Одним из приоритетных направлений в системе противотуберкулезных мероприятий в сложившихся социально-экономических условиях является выявление туберкулеза в учреждениях общей лечебно-профилактической сети среди лиц, обратившихся за медицинской помощью. У всех лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез органов дыхания (кашель с мокротой более 2 – 3 нед, боли в грудной клетке, потеря массы тела, субфебрильная температура, потливость, кровохарканье), необходимо исследовать мокроту на микобактерии туберкулеза (МБТ) методом микроскопии мазка по Цилю – Нельсену и провести рентгенографию (флюорографию) грудной клетки. Как показали исследования, проводимые в ряде территорий Российской Федерации (Ивановская, Томская области, республика Марий Эл), этот подход позволяет выявить более половины впервые заболевших туберкулезом органов дыхания с бактериовыделением, наиболее опасных в эпидемиологическом отношении, сократить сроки диагностики туберкулеза и время от первого обращения больного в медицинское учреждение до начала противотуберкулезного лечения. Исследования мокроты методом микроскопии мазка по Цилю – Нельсену необходимо осуществлять во всех клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети. Больных, у которых выявлены МБТ, следует направлять в противотуберкулезные диспансеры для дообследования, подтверждения диагноза туберкулеза, лечения и постановки на учет.
   Бактериоскопический метод прост, экономичен и позволяет при положительном результате исследования мазка мокроты установить диагноз туберкулеза органов дыхания. Бактериоскопическому обследованию подлежат обратившиеся в медицинское учреждение лица:
   – с явными симптомами заболевания;
   – с наличием продолжительного (более 3 нед) кашля с выделением мокроты, кровохарканьем и болями в грудной клетке;
   – контактировавшие с бациллярными больными туберкулезом;
   – имеющие рентгенологические изменения в легких, подозрительные на туберкулез.
   Выявление больных туберкулезом легких бактериоскопическим методом должно осуществляться во всех клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений общей сети: взрослых и детских поликлиниках, республиканских, краевых, областных, городских и центральных районных больницах, клиниках научно-исследовательских институтов, участковых больницах и сельских врачебных амбулаториях, психиатрических больницах, медико-санитарных частях пенитенциарных учреждений и др. Как минимум 3 мазка мокроты необходимо исследовать в лаборатории методом микроскопии по Цилю – Нельсену на кислотоустойчивые бактерии. Первую и вторую пробы мокроты берут в присутствии медицинского работника в день обращения пациента (с промежутком 1,5 – 2 ч), затем ему выделяют посуду для сбора утренней мокроты перед вторым посещением врача. Для получения положительного результата важно правильно организовать сбор мокроты, который следует проводить в отсутствии посторонних людей в отдельной, хорошо проветриваемой комнате. Пациенту необходимо объяснить, как следует откашливать мокроту из более глубоких отделов легких. В поликлинике или больнице все медицинские сестры должны быть обучены методике сбора мокроты. Больной должен откашливать мокроту в присутствии медицинской сестры. Следует попросить больного сделать несколько глубоких вдохов и покашлять в емкость, после чего проверить наличие в емкости мокроты. Если больной не может откашлять мокроту или она отсутствует, материал для исследования можно получить с помощью раздражающих ингаляций, промывания бронхов и желудка.
   В первый же день необходимо сделать рентгенографию грудной клетки. В отдельных случаях (например, когда больной живет далеко от лечебного учреждения или ему трудно добираться до него, или его состояние неудовлетворительное) пациента можно госпитализировать на 2 – 3 дня для обследования. В некоторых отдаленных населенных пунктах более целесообразно обучить фельдшеров или других медицинских работников правильному сбору мокроты, консервации и быстрой доставке ее в ближайшую клинико-диагностическую лабораторию; можно также обучить персонал приготовлению мазков мокроты, высушиванию, фиксации с последующей доставкой в ближайшую лабораторию для окрашивания и исследования. Необходимо исследовать не менее 100 микроскопических полей зрения. Если кислотоустойчивые бактерии не обнаружены в 100 полях зрения, необходимо исследовать дополнительно еще 100 полей.
   У взрослых диагноз туберкулеза легких подтверждается обнаружением МБТ в мокроте. У детей до 10 лет в связи с трудностью получения мокроты исследуют промывные воды желудка или мазок из гортани. Процедуру проводят рано утром натощак, полученное содержимое собирают в стерильную посуду и направляют в лабораторию для бактериоскопического и культурального исследования.
   Чтобы предупредить заражение туберкулезом при сборе мокроты, медицинский работник обязан быть в шапочке, маске, клеенчатом фартуке и резиновых перчатках. Меры предосторожности также должны применяться при хранении и доставке мокроты в лабораторию на исследование. Для хранения и перевозки используют специальные контейнеры или металлические биксы. Если первые мазки оказались положительными, а больной не пришел к врачу повторно, его следует срочно разыскать и вызвать для дообследования, установления диагноза и направления на лечение.
   Кроме микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю – Нельсену, в лабораториях, оснащенных люминесцентными микроскопами, возможно исследование материала методом люминесцентной микроскопии. Необходимо обязательно проводить посев мокроты на питательные среды у всех больных, так как у части больных МБТ выявляются только культуральным методом. Посев мокроты или другого материала на выделение возбудителя туберкулеза осуществляют в специализированных лабораториях противотуберкулезных учреждений.
   Посев мокроты или другого материала (крови, промывных вод желудка, бронхоальвеолярных смывов, плевральной жидкости) повышает число положительных результатов, которые становятся известными через 4 – 8 нед. В настоящее время существуют методы, которые позволяют сократить длительность выявления МБТ: применение сред для бифазного посева, системы БАКТЕК-460, сокращающие в среднем наполовину сроки роста МБТ. Использование системы БАКТЕК-460 технически просто и позволяет идентифицировать МБТ, определить их лекарственную чувствительность в течение недели.
   Кроме прямых методов диагностики туберкулеза (бактериоскопия, культуральный метод), используют и непрямые, основанные на серодиагностике и определении в исследуемом материале нуклеиновых кислот МБТ (полимеразно-цепная реакция – ПЦР). Данные, касающиеся чувствительности и специфичности ПЦР, не позволяют еще в настоящее время использовать этот метод в широкой практике. Микроскопическое исследование патологического материала остается пока наиболее быстрым, чувствительным и дешевым методом, позволяющим установить диагноз туберкулеза.
   Активный метод выявления туберкулеза, основанный на массовом рентгенофлюорографическом обследовании населения, для большинства территорий в настоящее время крайне затруднен вследствие его высокой стоимости, изношенности аппаратуры и недостаточной результативности. Проведенный в Ивановской области анализ соотношения стоимости – эффективности выявления случая туберкулеза показал, что на выявление больного по обращаемости затрачивается $ 1590, а при профилактическом осмотре – $ 4000. Сплошные профилактические флюорографические обследования всего населения в возрасте 15 лет и старше, проводимые в прежние годы, в настоящее время также могут быть осуществлены по эпидемиологическим показаниям и при достаточных ресурсах. Профилактические флюорографические обследования для активного выявления туберкулеза в настоящее время следует использовать среди отдельных групп населения, где наиболее часто выявляется туберкулез. Рентгенофлюорографический метод в основном позволяет выявить все случаи “абациллярного” туберкулеза легких (в настоящее время регистрируется 45 – 50% случаев).
   Туберкулинодиагностика является основным методом раннего выявления инфицирования туберкулезом детей и подростков. Туберкулинодиагностика как специфический диагностический тест применяется при массовых обследованиях населения на туберкулез, а также в клинической практике для диагностики туберкулеза. Для этих целей используется единая внутрикожная туберкулиновая проба Манту с 2 туберкулиновыми единицами (ТЕ) очищенного туберкулина PPD-L. Ежегодная постановка пробы Манту с 2 ТЕ позволяет своевременно выявить лиц с гиперергическими и усиливающимися реакциями на туберкулин, у которых высок риск заболевания, возможны начальные и локальные формы туберкулеза. Проба Манту считается положительной при размере папулы более 5 мм.
   Массовую туберкулинодиагностику среди детей и подростков, посещающих детские ясли, сады, школы, колледжи, проводят специальными бригадами (2 медсестры и врач), сформированными при детских поликлиниках. Детям раннего и дошкольного возраста, не посещающим детские учреждения, пробу Манту ставят в детской поликлинике, а в сельской местности ее производят медицинские работники районных сельских больниц и фельдшерско-акушерских пунктов. При правильной организации мероприятий по раннему выявлению туберкулеза ежегодно туберкулинодиагностикой должно охватываться 90 – 95% детского и подросткового населения административной территории.
   Проба Манту с 2 ТЕ безвредна как для здоровых детей и подростков, так и для лиц с различными соматическими заболеваниями. Противопоказаниями для постановки туберкулиновой пробы являются кожные заболевания, аллергические состояния, эпилепсия, острые инфекционные заболевания и хронические заболевания в период обострения. В условиях массовой внутрикожной вакцинации (ревакцинации БЦЖ) проба Манту 2 ТЕ выявляет как послевакцинную, так и инфекционную аллергию. Систематическое проведение детям и подросткам внутрикожных туберкулиновых проб позволяет установить первичное инфицирование и осуществлять поиск очага туберкулезной инфекции среди взрослых.
   Таким образом, в настоящее время для выявления больных туберкулезом применяются различные методы. Наиболее информативными, простыми, достоверными и экономичными являются бактериоскопическое исследование мокроты у лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 нед, боли в грудной клетке, кровохарканье, потеря массы тела), рентгенография грудной клетки и туберкулинодиагностика у детей и подростков.   

Литература:

   1. Джон Крофтон, Норман Хорн, Фред Миллер. // Клиника туберкулеза. – М., 1996.
   2. Диагностика туберкулеза легких бактериоскопическим методом. Метод указания МСБТЛЗ. – Париж, Франция, 1995.

.

Современные методы диагностики туберкулеза у детей Текст научной статьи по специальности «Науки о здоровье»

УДК 616.24-002.5-053.2-07

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ

Турица А.А., Цыганкова Е.А.

ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава РФ

644043 г.Омск, ул. Ленина, 12.

E-mail: [email protected] ru

Резюме. Проведен обзор литературных данных по проблеме современных методов диагностики туберкулеза у детей. Особое внимание уделено квантифероновому тесту, который используется для диагностики латентной туберкулезной инфекции. По данному вопросу были проанализированы работы зарубежных авторов, в которых подчёркивается его высокая специфичность. Однако российские авторы утверждают, что квантифероновый тест не позволяет дифференцировать активный туберкулез и латентную инфекцию.

Большинство авторов положительно оценивают один из последних диагностических методов — кожный тест с препаратом «Диаскинтест». Частота положительных результатов «Диаскинтеста» у больных туберкулезом детей составила 87,9%, что говорит о высокой чувствительности этого метода.

Для этиологической диагностики во фтизиатрии все более широко применяются молекулярно-генетические методы.

Известно, что стандартные методы ранней диагностики туберкулеза у детей на сегодняшний день обладают низкой информативностью, поэтому необходимо применение современных иммунологических тестов в комплексе с уже имеющимися методами.

Ключевые слова: туберкулез, туберкулез у детей, диагностика туберкулеза, диаскинтест, квантифероновый тест.

MODERN DIAGNOSTIC METHODS OF TUBERCULOSIS IN CHILDREN

Turitsa A.A., Tsygankova E.A.

«Omsk state medical university» of the Ministry of Health of the Russian Federation,

644043 g Omsk, Lenin St., 12.

E-mail: [email protected]

Summary. The review of literary data on a problem of modern diagnostic methods of tuberculosis at children is carried out. Special attention is paid to the kvantiferonovy test which is used for diagnostics of a latent tuberculosis infection. On the matter works offoreign authors in which its high specificity is emphasized were analysed. However the Russian authors claim that the Quantiferon test doesn’t allow to differentiate active tuberculosis and a latent infection.

Most of authors assess one of the last diagnostic methods, the dermal test with the drug «Diaskintest» positively. Frequency of positive takes of «Diaskintest» at suffering from tuberculosis children made 87,9% that speaks about high sensitivity of this method.

Molecular and genetic methods are more and more widely applied to etiological diagnostics in a phthisiology.

It is known that standard methods of early diagnostics of tuberculosis at children have today low informational content therefore use of modern immunoassays in a complex with already available methods is necessary.

Keywords: tuberculosis, tuberculosis at children, diagnostics of tuberculosis, a diaskintest, the Quantiferon test.

Введение

Среди детей активный туберкулез, не подтвержденный микробиологическими методами, встречается в 90% случаев и его диагностика основывается на сопоставлении клинико-рентгенологических проявлений заболевания, что может служить причиной как гиподиагностики, так и гипердиагностики туберкулеза [4, 14]. Ввиду малосимптомности детского туберкулеза, своевременное выявление начальных его проявлений, «малых» форм и определение степени активности туберкулезной инфекции, особенно у детей из группы риска, угрожаемых по заболеванию, продолжает оставаться одним из сложных вопросов [12,19]. Преобладание в структуре туберкулеза малых форм, проявляющихся скудной клинико-рентгенологической симптоматикой, маскирующихся под неспецифические заболевания детского возраста, требуют дополнительных диагностических критериев [13,22,27].

В нашей стране методом раннего выявления первичного инфицирования, а также заболевания туберкулезом у детей является туберкулинодиагностика [2,18,23].Однако в последнее время широко обсуждается вопрос о целесообразности ее использования для массового обследования детей в связи с имеющимися данными о недостаточной специфичности теста [6]. При проведении туберкулиновой пробы в условиях массовой вакцинации БЦЖ невозможно достоверно установить уровень инфицированности детей МБТ, отличить поствакцинальную аллергию от инфекционной [3,6,31,39].

Существуют факторы, искажающие туберкулиновую чувствительность. На результат реакции влияют аллергические заболевания, недавно перенесенные инфекции, возраст, прививки, индивидуальные характеристики чувствительности кожи, что затрудняет интерпретацию результатов [2,6,40]. Профессор Е. А. Бородулина (2007) установила, что туберкулиновая чувствительность имеет отличительные особенности при атопических заболеваниях (аллергический ринит, атопический дерматит, бронхиальная астма) и у часто болеющих детей. У детей с атопическими заболеваниями при диагностике инфицирования туберкулезом отмечается меньшая выраженность туберкулиновых проб, а у часто болеющих детей — более выраженная туберкулиновая чувствительность [2].

В последние годы были разработаны новые иммунологические методы диагностики туберкулеза, основанные на оценке способности Т-лимфоцитов продуцировать интерферон-гамма в ответ на стимуляцию микобактериальными антигенами [7,17,21,26,32]. В настоящее время все большую популярность во всем мире приобретает квантифероновый тест (КФТ) для диагностики латентной туберкулезной инфекции, основанный на измерении интерферона-гамма, который продуцируется Т-лимфоцитами крови инфицированного человека под воздействием антигенов ESAT-6, СБР-10 и ТВ7.7. Его преимущества по сравнению с туберкулинодиагностикой: более высокая специфичность используемых антигенов ESAT-6, СБР-10 и ТВ7.7 (эти антигены отсутствуют не только у микобактерий вакцинного штамма, но и у большинства нетуберкулезных микобактерий) [26,31,39].

По данным зарубежных авторов, чувствительность КФТ при диагностике латентной туберкулезной инфекции у детей составляет от 58 до 80%, ТД — от 85 до 90%, специфичность тестов — 98% и 60-95% соответственно [39,40]. Причем чувствительность КФТ при диагностике латентной туберкулезной инфекции у детей зависит от возраста ребенка: по данным одних авторов [13], она ниже у детей до 2 лет, по данным других — до 5 лет [33,37]. Также чувствительность КФТ снижена у ВИЧ-инфицированных больных [38,39]. Вместе с тем высказывается мнение, что КФТ не позволяет дифференцировать активный туберкулез и латентную инфекцию [35].

При оценке теста «QuantiFERON-TBGoldIn-Tube» И. Ю. Никитина, Н. А. Кондратюк, И. А. Васильева, И. В. Лядова (2011) установили, что чувствительность и специфичность метода составили: при сравнении больных с группой здоровых — 80% и 85% соответственно; при сравнении больных с группой контактных — 80% и 56%

соответственно. Авторы также сделали вывод, что данный тест не позволяет дифференцировать активный туберкулез и латентную инфекцию [21].

Выявились существенные недостатки лабораторных тестов — высокие материальные затраты, необходимость оборудованной лаборатории и требования по забору крови с соблюдением предосторожностей для сохранения жизнеспособности лимфоцитов, продуцирующих ИНФ-у, а также внутривенные манипуляции, что особенно ограничивает их применение у детей [26].

Решением проблемы стал кожный тест с препаратом «Диаскинтест» (ДСТ), представляющий собой рекомбинантный белок CFP-10- Б8ЛТ-6 [6]. По данным ряда авторов, проба с ДСТ может быть использована как эффективный скрининговый метод обследования детей с целью выявления лиц с различными проявлениями туберкулезной инфекции [18,20]. Так, Р. Х. Фатыхова и Р. Ш. Валиев (2011) указывают на то, что применение пробы с ДСТ среди детей изменило клиническую структуру заболевших: значительно улучшилось выявление «малых» форм туберкулеза, уменьшился удельный вес осложненных форм с 20% в 2009 г. до 3,4% в 2010 г., увеличился удельный вес детей, выявленных профилактически с 80% в 2009 г. до 96% в 2010 г. [30].

По данным О. В. Касимцева, О. В. Демиховой, Н. Л. Карпиной (2011), частота отрицательных результатов ДСТ у здоровых инфицированных МБТ пациентов составила 56,6% — специфичность метода. Частота положительных результатов ДСТ у больных туберкулезом 87,9% — чувствительность метода. Полученные результаты позволяют использовать ДСТ в комплексе с другими методами для диагностики туберкулеза у детей [5]. Коллектив учёных Ю. В. Богданова, О. К. Киселевич, Т. А. Севостьянова (2011) указывают, что применение кожного ДСТ позволяет использовать его при проведении комплексного обследования детей в условиях специализированных учреждений для дифференциальной диагностики инфекционной и поствакцинной аллергии, повышает эффективность диагностики осложнений вакцинации БЦЖ у детей раннего возраста [1].

ДСТ и КФТ являются ценными методами, помогающими исключить туберкулезную инфекцию или уточнить ее активность [20,21,26]. Так, научные сотрудники А. А. Старшинова, Н. В. Корнева, И. Ф. Довгалюк (2011) при проведении комплексного обследования 106 детей с постановкой КФТ и ДСТ в комплексе с углубленной туберкулинодиагностикой (ТД) пришли к выводу, что каждый второй ребенок с высоким уровнем специфической сенсибилизации при проведении туберкулиновых проб ошибочно трактовался как инфицированный МБТ. В современном комплексе обследования КФТ и ДСТ существенно повышают эффективность диагностики туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов у детей. Определяется достоверно высокий процент положительных реакций по КФТ (65,0%) и ДСТ (68,4%) по сравнению с ТД. Чувствительность тестов (КФТ 79,1%, ДСТ 73,8% против ТД 82,5%) немного ниже, однако специфичность (КФТ 93,2%, ДСТ 79,2% против ТД 20,5%) в 4 раза выше ТД. Диагностическая эффективность КФТ (91,1%) незначительно превышает таковой показатель по ДСТ (74,4%) и в 2 раза превышает по ТД (51,5%) [28].

В литературе имеются сведения о том, что применение пробы с ДСТ в комплексе с компьютерной томограммой органов грудной клетки повышают эффективность диагностики туберкулеза у детей [8,15,16].

Для этиологической диагностики во фтизиатрии все более широко применяются молекулярно-генетические методы [24,25]. Для выявления возбудителя широко используется метод полимеразной цепной реакции, основанный на выявлении в геноме микобактерий видоспецифических последовательностей [4,9,24,34,36].

В последние годы все больше внимания уделяется иммунологическим методам диагностики туберкулеза [4,10,11,29]. Многие авторы считают, что применение в диагностике туберкулеза у детей современных иммунологических тестов в комплексе с уже имеющимися методами позволяет адекватно оценить активность туберкулезной инфекции [6, 38, 40]. Учёные Л. И. Мордовская, М. А. Владимирский, Л. К. Шипина

(2011) указывают на возможность использования метода определения антиген-специфической индукции (туберкулином PPD и смесью антигенов ESAT-6 и CFP-10) фактора некроза опухоли для дифференцирования активной и латентной туберкулезной инфекции и для иммунологической оценки излеченности туберкулеза [10].

По мнению ряда авторов, использование метода определения уровней активности лейкоцитов периферической крови (спонтанной и при стимуляции специфическими и неспецифическими антигенами) позволяет уточнить активность туберкулезного процесса [10,29]. Профессор А. А. Старшинова (2005) считает, что иммуногенетические исследования подтверждают активность туберкулезной инфекции у 80% детей с малой формой ТВГЛУ [27].С помощью данных методов увеличивается вероятность этиологического подтверждения заболевания. В то же время отношение исследователей к информативности современных методов лабораторной диагностики туберкулеза (ИФА и ПЦР) далеко не однозначное [37].

Профессор М. Ф. Губкина (2004) считает, что определение ДНК МБТ методом ПЦР (чувствительность 62,5%, специфичность 55,2%) и ПТАТ методом ИФА (чувствительность 63,0%, специфичность 45,7%) позволяют подтвердить диагноз туберкулеза у больных с отрицательными результатами бактериоскопического исследования мокроты на МБТ на момент диагностики заболевания, причем диагностическая ценность обоих методов возрастает при совпадении положительных результатов [4]. По данным Е. А. Марениной (2003), чувствительность определения ДНК МБТ методом ПЦР 79%, специфичность — 100% [9]. Методы иммунодиагностики применяются во фтизиатрии с целью диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза, для уточнения активности туберкулезного процесса, для разграничения инфекционной и поствакцинальной аллергии, для контроля эффективности лечения и определения прогноза заболевания [10,11].

Таким образом, стандартные методы ранней диагностики туберкулеза у детей на сегодняшний день обладают низкой информативностью, что, с одной стороны, ведет к выявлению больных с запущенными формами туберкулеза, а с другой — приводит к выявлению специфического процесса уже на фазах обратного развития и хроническому течению заболевания [28]. Для ранней диагностики туберкулеза у детей необходимо применение современных иммунологических тестов в комплексе с уже имеющимися методами. Улучшение своевременного выявления заболевания у детей в настоящее время является актуальной проблемой, что требует дальнейшего изучения клинико-иммунологических особенностей течения туберкулеза.

Литература

¡.Богданова Ю.В., Киселевич О.К., Севостьянова Т.А. и др. Использование диаскинтеста в диагностике туберкулеза у детей раннего возраста// Туберкулез и болезни легких. 2011. № 4. С 57.

2.Бородулина Е.А. Особенности диагностики инфицирования туберкулезом при атопических заболеваниях и у часто болеющих детей: автореф. дис. … докт. мед. наук. М., 2007. 43 с.

3.Валеева Г.А., Кравченко Е.Н., Мордык А.В., Пузырева Л.В. Состояние здоровья детей, рожденных от матерей, больных туберкулезом// Туберкулез и болезни легких. 2014. Т. 91. № 8. С. 27-28..

4.Губкина М.Ф. Диагностика и дифференциальная диагностика туберкулеза органов дыхания у детей и подростков без обнаружения микобактерий при выявлении заболевания: автореф. дис. … докт. мед. наук. М., 2004. 41 с.

5.Касимцева О.В., Демихова О.В., Карпина Н.Л. Информативность диаскинтеста в диагностике туберкулеза у детей// Туберкулез и болезни легких. 2011. № 4. С 186.

6.Киселев В.И., Барановский П.М., Пупышев С.А. и др. Новый кожный тест для диагностики туберкулеза на основе рекомбинантного белка ESAT-CFP// Молекулярная медицина. 2008. № 4. С. 28-34.

7.Клинышкова Т.В., Мордык А.В., Яковлева А.А., Леонтьев В.В. Специфические иммунные тесты в комплексном обследовании пациенток с подозрением на генитальный туберкулез// Туберкулез и болезни легких. 2011. Т. 88. № 4. С. 193-194.

8.Листопадова М.В., Мякишева Т.В., Трун Е.В. и др. Эффективность применения компьютерной томографии в диагностике туберкулеза органов дыхания у подростков в условиях стационара// Туберкулез и болезни легких. 2015. № 5. С. 112-113.

9.Маренина Е.А. Диагностика туберкулеза у детей с использованием метода ПЦР: автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2003. 21 с.

10.Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Шипина Л.К. и др. Индукция фактора некроза опухоли (ФНО) в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза в образцах цельной крови в оценке активности туберкулезной инфекции у детей и подростков// Туберкулез и болезни легких. 2011. № 5. С. 54-55.

11.Мордык А.В. Оценка специфического клеточного иммунитета у детей и подростков, больных туберкулезом // Вестник современной клинической медицины. 2010. Т. 3. № 4. С. 60-64.

12.Мордык А.В., Аксютина Л.П., Пузырёва Л.В. Современные международные и национальные концепции борьбы с туберкулезом// Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2013. № 22. С. 92-98.

13.Мордык А.В., Аксютина Л.П., Пузырёва Л.В. Характеристика случаев заболевания туберкулезом детей на территории Омской области с 2007 по 2012 год// Биозащита и биобезопасность. 2013. Т. 5, № 4 (17). С. 18-20.

14.Мордык А.В., Турица А.А., Кондря А.В. и др. Выявление различных форм и локализаций туберкулеза у детей разного возраста: роль скринингового обследования// Российский педиатрический журнал. 2016. Т. 19. № 3. С. 151-156.

15.Мордык А.В., Цыганкова Е.А., Ароян А.Р. Методы выявления туберкулеза у детей раннего возраста в разные временные периоды// Поликлиника. 2015. № 2-2. С. 3842.

16.Мордык А.В., Цыганкова Е.А., Подкопаева Т.Г. и др. Факторы риска развития туберкулеза у детей (обзор литературы)// Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. 2014. Т. 9. № 1. С. 92-95.

17.Мордык А.В., Цыганкова Е.А., Турица А.А., Пузырёва Л.В. Противотуберкулезный иммунитет и механизмы его формирования// Дальневосточный медицинский журнал. 2014. № 1. С. 126-130.

18.Мордык А.В., Цыганкова Е.А., Турица А.А., Пузырёва Л.В. Туберкулез у детей Российской Федерации на современном этапе// Педиатрическая фармакология. 2014. Т. 11, № 3. С. 27-31.

19.Мякишева Т.В., Авдеева Т.Г., Драгунова Н.Ю. Состояние здоровья детей-мигрантов из Украины и детей, постоянно проживающих в г. Смоленске// Вестник Смоленской государственной медицинской академии. 2016. Т. 15, № 2. С 120-125.

20.Мякишева Т.В., Авдеева Т.Г., Рашкевич Е.Е. Дети с ревматоидным артритом как иммунокомпрометированная группа риска по туберкулезу// Туберкулез и болезни легких. 2015. № 6. С. 103-104.

21.Никитина И.Ю., Кондратюк Н.А., Васильева И.А., Лядова И.В. Использование «интерфероновых» тестов для диагностики и оценки активности туберкулеза легких. Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: материалы Всероссийской науч.-практ. конф. СПб., 2011. С. 451-452.

22.Пузырёва Л.В., Мордык А.В., Турица А.А. Анализ влияния способов выявления, эффективности профилактических мероприятий на структуру клинических форм туберкулеза у детей// Уральский медицинский журнал. 2013. № 7 (112). С. 73-76.

23.Романова М.А., Мордык А.В. Современные методы иммунодиагностики для выявления различных форм и локализаций туберкулеза у детей с сопутствующей патологией// Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. 2016. Т. 95. № 2. С. 77-82.

24.Скорняков С.Н., Шульгина М.В., Ариэль Б.М. и др. Клинические рекомендации по этиологической диагностике туберкулеза// Медицинский альянс. 2014. № 3. С. 39-58.

25.Скорняков С.Н., Шульгина М.В., Журавлев Ю.В. и др. Фтизиатрия. Национальные клинические рекомендации. Гл. ред. — Яблонский П.К. Москва, 2015. 240 с.

26.Слогоцкая Л.В., Иванова Д.А., Кочетков Я.А. и др. Сравнительные результаты кожного теста с препаратом, содержащим рекомбинантный белок CFP-10-ESAT-6, и лабораторного теста QuantiFERON. Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: материалы Всероссийской науч.-практ. конф. СПб. 2011. С. 379-381.

27.Старшинова А.А. Диагностика туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов парааортальной группы (малая форма): автореф. дис. … канд. мед. наук. СПб., 2005. 23 с.

28.Старшинова А.А., Корнева Н. В., Довгалюк И. Ф. Современные иммунологические тесты в диагностике туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов у детей// Туберкулез и болезни легких. 2011. № 5. С. 170-171.

29.Тюлькова Т.Е.,. Чугаев Ю.П, Кашуба Э.А. и др. Изменения иммунной системы детей старшей возрастной группы при первичных и вторичных формах туберкулезной инфекции//Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2009. № 1. С. 51-55.

30.Фатыхова Р.Х., Валиев Р.Ш. Роль пробы с диаскинтестом в диагностике туберкулеза среди детей в республике Татарстан// Туберкулез и болезни легких. 2011. № 5. С. 198-199.

31.Чалая Е.В., Демков У., Котула И. Зелковски Я. Роль квантиферонового теста в диагностике инфицирования M. Tuberculosis детей и подростков, состоящих на учете у фтизиатра// Туберкулез и болезни легких. 2011. № 5. С. 220-224.

32.Яковлева А.А., Мордык А.В. Специфические иммунологические тесты в диагностике туберкулеза гениталий// Инфекция и иммунитет. 2014. Т. 4. № 3. С. 207-212.

33.Arend S.M., Thijsen S.F., Leyten E. М. et al. Comparison of two interferon-gamma assays and tuberculin skin test for tracing tuberculosis contacts// Am J. Respir. Crit. Care. Med. 2007. Vol. 175, № 6. P. 618-627.

34.Cannas A., Goletti D., Girardi E. et al. Mycobacterium tuberculosis DNA detection in soluble fraction of urine from pulmonary tuberculosis patients. Int. J Tuberc. Lung Dis. 2008. Vol. 12, № 2. P. 146-151.

35.Diel R., Loddenkemper R., Meywald-Walter K. et al. Predictive value of a whole blood IFN-gamma assay for the development of active tuberculosis disease after recent infection with Mycobacterium tuberculosis// Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2008. Vol. 177, № 10. P. 1164-1170.

36.Driver C.R., Kreiswirth B., Macaraig M. et al. Molecular epidemiology of tuberculosis after declining incidence, New York City, 2001-2003// Epidemiology and Infection. 2007. Vol. 135, № 4. Р. 634 -643.

37.Ferrara G., Losi M., Roversi P. et al. New tools for a better diagnosis of latent tuberculosis infection. Recenti Prog. Med. 2006. Vol. 97, № 3. P. 123-128.

38.Lawn S.D., Bangani N., Vogt M. et al. Utility of interferon-gamma ISPOT assay responses in highly tuberculosis-exposed patients with advanced HIV infection in South Africa. BMC Infect. Dis. 2007. Vol. 7. P. 99-101.

39.Lighter J., Mona R. Diagnosing childhood tuberculosis: traditional and innovative modalities. Curr. Probl. Pediat.r Adolesc. Health Care. 2009. Vol. 39. P. 61-88.

40.Steenhuis T.J., Aalderen van W. M., Bloksma N. et al. Bacille-Calmette-Guerin vaccination and the development of allergic disease in children: a randomized, prospective, single-blind study. Clin. Exp. Allergy. 2009. T. 38, № 1. P. 79-85.

Сведения об авторах:

Турица Анна Анатольевна — доцент кафедры поликлинической педиатрии ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г.Омск, кандидат медицинских наук. Адрес: г. Омск, 644043 ул. Ленина, 12, тел. (3812) 23-03-78. E-mail: [email protected]

Цыганкова Елена Александровна — ассистент кафедры фтизиатрии и фтизиохирургии ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г.Омск, кандидат медицинских наук. Адрес: г. Омск, 644043 ул. Ленина, 12, тел. (3812) 40-45-15. E-mail: [email protected]

Отчет с международного саммита Euroscicon по борьбе с туберкулезом, 2016 г.

РЕЗЮМЕ

Сказать, что туберкулез (ТБ) вернул себе прочную точку опоры в глобальном сценарии здоровья и благополучия человека, было бы преуменьшением. Наряду с ВИЧ / СПИДом в качестве основной причины смертности от одного инфекционного заболевания влияние туберкулеза простирается далеко в социально-экономический контекст во всем мире. По мере того, как глобальные усилия, возглавляемые экспертами и политическими органами, объединяются для смягчения прогнозируемого результата роста устойчивости к противомикробным препаратам, академическое сообщество студентов, практиков и исследователей мобилизовалось для разработки интегрированных междисциплинарных программ, чтобы претворить в жизнь планы первых.Выполнение этого важнейшего требования для беспрепятственного распространения научных открытий было реализовано на Саммите по борьбе с туберкулезом в 2016 году в Лондоне, Соединенное Королевство. В этом отчете критически обсуждаются недавние достижения в диагностике и лечении, а также освещаются основные препятствия в борьбе с этим заболеванием, которые обсуждались в ходе трехдневного международного мероприятия. Конференции и симпозиумы, подобные этим, являются питательной средой для успешного местного и глобального сотрудничества, и поэтому их необходимо поддерживать для расширения понимания и распространения фундаментальных научных исследований.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антибиотики, открытие лекарств, лекарственная устойчивость, тестирование на лекарственную чувствительность, туберкулез

Введение

Из-за болезни, которую необходимо в значительной степени контролировать, туберкулез (ТБ) по-прежнему уносит более 1,5 миллиона жизней каждый год. дети составляют 140 000 из них. 1 Среди множества факторов, способствующих успеху заболевания, можно выделить стойкую природу возбудителя Mycobacterium tuberculosis и растущую лекарственную устойчивость, приобретенную им в результате десятилетий лечения с использованием фиксированного режима приема лекарств.Длительные диагностические процедуры, неправильные диагнозы с последующим неправильным назначением лечения позволяют устойчивым штаммам распространяться внутри и за пределами сообществ. Это еще более усложняется, поскольку туберкулез в основном ассоциируется со странами с ограниченными ресурсами, которые имеют высокую плотность населения, где программы отслеживания контактов скомпрометированы из-за отсутствия инфраструктуры. 2 Однако безрадостная обстановка вызвала потребность в инновационных, быстрых и точных диагностических тестах, основанных на молекулярных методах, таких как GeneXpert® MTB / RIF, которые широко используются во всем мире. 3 Эти технологии требуют дальнейшего развития, чтобы соответствовать потребностям времени в бедных районах с низкой инфраструктурной поддержкой. Для эффективного контроля над заболеванием успехи в диагностике должны отражаться появлением эффективных терапевтических средств для лечения инфекции.

Открытие противомикробных препаратов часто рассматривается как «предприятие с высоким риском и низкой отдачей». И этот сектор игнорировался фармацевтическими компаниями и одновременно игнорировался политикой общественного здравоохранения. Это привело к критической нехватке новых лекарственных препаратов в клинических испытаниях.Поскольку в настоящее время ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) обнаружен в 105 странах, FDA США предоставило ускоренные варианты разработки противотуберкулезных препаратов. 1 Примерно через полвека отсутствия новых лекарств для лечения пациенты с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наконец, имеют возможность, хотя и в соответствии со строгими правилами, получать для лечения бедаквилин или деламанид. 4,5

Государственные расходы на лечение ТБ в большинстве случаев колеблются в пределах 100-500 долларов США, увеличиваясь до 10 000 долларов США в случае пациентов с МЛУ ТБ. 1 Прогнозируется, что рост устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) обойдется мировой экономике от ≤2,1 трлн. До более ≤100 трлн. В 2050 году, в зависимости от предпринятых вмешательств и их эффективности. 6 Это бремя было бы прямым результатом прогнозируемой ежегодной потери 10 миллионов жизней в наиболее продуктивные годы, если бы УПП распространялся бесконтрольно. На туберкулез приходится большая часть бремени, вызванного УПП. Кроме того, воздействие туберкулеза на животноводство имеет серьезные последствия, поскольку отсутствуют вакцины или практические, экономически эффективные средства лечения инфицированных животных.В некоторых частях Уэльса в Соединенном Королевстве сообщается о стремительном росте количества забитого крупного рогатого скота из-за туберкулеза крупного рогатого скота. 7 Эти выбраковки создали непреднамеренную нагрузку на животноводческую отрасль и местные органы власти.

В сегодняшнем глобальном мире и экономике объединение усилий, начиная со студента, сидящего на скамейке, должно пройти до цепочки поставок, которая в конечном итоге приводит к получению готового диагностического или терапевтического продукта, используемого в пункте оказания медицинской помощи или у постели пациента.Ученым необходимо понимать основные реалии и трудности, с которыми сталкиваются медицинские работники, чтобы предлагать эффективные решения и стратегии. Точно так же врачей необходимо информировать о последних достижениях в области фундаментальных научных исследований, чтобы быстрее создавать механизмы обратной связи, которые могут выявить области, в которых существует острая необходимость в развитии. Поэтому очень важно установить каналы связи между этими разнородными людьми, объединенными своими усилиями по борьбе с туберкулезом.

TB Summit 2016, третье мероприятие подобного рода, организованное Euroscicon, было достойно проведено в Северном Гринвиче, Лондон (Великобритания), поскольку это один из районов Лондона с самой высокой заболеваемостью туберкулезом. 8-10 В трехдневном мероприятии приняли участие представители университетов и государственных учреждений со всего мира. Информативная устная презентация и стендовые сессии были разделены на категории для систематического обсуждения различных аспектов туберкулеза, что более подробно обсуждается в следующих разделах отчета.

Туберкулез: заболевание, возбудитель и хозяин

Изучение распространения туберкулеза

Туберкулез в его наиболее распространенной форме представляет собой воздушно-капельное заболевание, которое поражает ткани легких и находится в макрофагах и других фагоцитарных иммунных клетках гостья.Иммунные ответы хозяина служат для изоляции организма в отделах, известных как гранулема. 11 Эти гранулемы в дальнейшем созревают с образованием некротических поражений, которые, наконец, разрушаются механическим сдвигом и выбрасываются в воздух в результате кашля или разговора инфицированного человека. 12 Хотя воздушно-капельный путь передачи широко распространен, необходимо провести адекватное расследование различных стадий заболевания, а именно: изгнание бактерий, передача через воздух, вдыхание и инфицирование нового хозяина.

Кашель считается важным фактором передачи туберкулеза, поскольку он является распространенным симптомом туберкулеза легких. Поскольку M. tuberculosis заключен в полости легких в толстые биопленки, требуется большое усилие, чтобы выбросить бациллы в дыхательные пути и наружу. При кашле выделяется больше капель, чем при других маневрах, таких как разговор или пение, поскольку в первом акте задействована более высокая сила и, таким образом, считается, что это основной фактор, участвующий в механизме передачи. 13,14 Несколько исследований, изучающих характер кашля и передачу инфекции в домашних условиях, показали, что пациенты кашляют чаще днем, чем ночью, и что частота кашля является важным показателем передачи. 15,16 Как отмечает Ричард Тернер (Фонд NHS Foundation Trust, Великобритания), кашель в контексте заразности туберкулеза не изучался. Причина кашля у больного туберкулезом; его необходимость в передаче туберкулеза, корреляция с инфекционными / неинфекционными штаммами патогена и характеристики оптимальных капель от кашля для передачи заболевания еще предстоит полностью понять. Такие факторы, как анатомия дыхательных путей, количество, состав и вязкость мокроты, были упущены из виду, и необходимо разработать методики их исследования.

Изучение моделей передачи туберкулеза может помочь разработать эффективные стратегии вмешательства для борьбы с болезнью. Исчерпывающие исследования по отслеживанию передачи должны быть способны обнаруживать или исключать передачу между случаями, отслеживать последовательное приобретение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) вдоль цепочки передачи и дифференцировать первичный и приобретенный фенотипы устойчивости с учетом разнообразия хозяев. Однако инфекции ТБ печально известны своей неоднородностью в пределах одного и того же хозяина, поскольку длительный период инфицирования позволяет микроэволюции бацилл в течение одного цикла заражения. 17 С другой стороны, патоген имеет низкую скорость репликации и склонность к низкому генетическому разнообразию. Таким образом, бациллы могут либо не демонстрировать генетического разнообразия, либо иметь несколько SNP между контактами, что чрезвычайно затрудняет отслеживание передачи, используя только их генную последовательность. Кэролайн Колин (Имперский колледж Лондона, Великобритания) предлагает объединить датированные филогенетические деревья со статистическим моделированием, чтобы выявить вероятность дерева передачи с использованием моделирования цепи Маркова Монте-Карло / методов байесовского вывода. 18 Однако использование статистических методов для вывода о передаче туберкулезных микобактерий требует вычислительно-интенсивных методов вывода, которые страдают от ограничений доступных данных и предположений, сделанных для построения моделей, как указано в Ярно Линтусаари (Университет Аалто, Финляндия) . 19 Сложность процесса затрудняет получение надежных выводов на основе статистических моделей динамики передачи.

Альберт Ниенхаус (Университетский медицинский центр, Германия), Джеймс Седдон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) и Роберт Уилкинсон (Кейптаунский университет, Южная Америка) обсудили препятствия на пути контроля передачи среди различных групп лица высокого риска — медицинские работники, дети и пациенты с ВИЧ.

Говоря о профессиональном приобретении болезней, профессор Ниенхаус заявил, что туберкулез является одним из наиболее инфекционных заболеваний, поражающих медицинских работников (МР) в Германии. 20 Ситуация хуже в таких странах, как Португалия и Франция, где уровень заболеваемости определенно выше — 33% и 19% по сравнению с 10% в Германии. 21,22

Медицинские работники, особенно врачи и медсестры, подвергаются более высокому риску заражения активной и латентной инфекцией ТБ (ЛТИ) из-за продолжительных и частых контактов с инфицированными пациентами.Напротив, в этой группе уровень передачи контактов контактам ниже, чем в других группах инфицированных людей в результате частых проверок состояния здоровья. 23 После тщательного изучения данных скрининга 32 практикующих врачей профессор Ниенхаус рекомендовал ежегодный скрининг медицинских работников из группы высокого риска из-за контакта с высокоинфекционными пациентами. Однако в руководствах по скринингу, выпущенных системами общественного здравоохранения разных стран, предлагается разнообразная комбинация рентгеновских лучей, туберкулиновой кожной пробы (ТКП) и тестов высвобождения гамма-интерферона (IGRA) без единого мнения о наилучшей стратегии. 24,25 Он предположил, что в обстоятельствах, когда IGRA положительный, а рентгеновский отрицательный, LTBI может быть подтвержден и сопровождаться профилактическими мерами, если считается, что риск отказа от лечения выше, чем риск, связанный с его назначением. Обнадеживает, что выявление ЛТИ у медработников растет с годами по мере совершенствования диагностических технологий, и ожидается, что исследования динамики риска и вознаграждения лечения позволят разработать единое глобальное решение.

Еще одна группа с высоким риском заражения этим заболеванием, главным образом из-за их связи с инфицированными взрослыми, — это дети. Несмотря на то, что у детей зарегистрирован один миллион случаев туберкулеза, очень мало делается для понимания патогенеза и доступных для них вариантов лечения. Д-р Седдон работает над улучшением нашего понимания вариантов лечения и профилактики МЛУ-ТБ у детей. 26 ТБ у детей и младенцев трудно диагностировать, так как затруднен сбор мокроты.Еще больше усложняет ситуацию то, что заболевание проявляется в нескольких формах, включая инфекцию внутри- или внегрудных лимфатических узлов. 27 Следовательно, лечение необходимо подбирать в соответствии с потребностями и состоянием здоровья ребенка. Хотя исследования показывают, что почти все дети, которым поставлен диагноз, завершают курс лечения и имеют очень хорошие результаты, схемы лечения МЛУ-ТБ у детей требуют пересмотра, поскольку фармакокинетика и токсичность лекарств у детей значительно отличаются от таковых у взрослых. 28,29 Схема лечения лекарственно-чувствительного туберкулеза у детей представляет собой стандартную 6-месячную комбинированную терапию, при которой в течение первых 2 месяцев назначают рифампицин, изониазид и пиразинамид, а затем 4 месяца — рифампицин и изониазид. 30 Детям, страдающим ВИЧ и туберкулезом, рекомендуется дополнительный прием этамбутола в первые 2 месяца. Будущие испытания для оценки стратегий профилактики туберкулеза включают TB-CHAMP для оценки левофлоксацина у детей до 5 лет и ACTG A5300 для оценки левофлоксацина и изониазида у взрослых и детей, а также ряд других. 26,31 По мере того, как новые и перепрофилированные лекарственные препараты входят в терапевтические схемы, оценка их фармакокинетических свойств у детей остается важной.

Профессор Уилкинсон и его команда изучают связь между туберкулезом и ВИЧ в Хайелитше, Южная Африка. Хайелитша — бедный городок, в котором распространенность туберкулеза является одной из самых высоких в мире. Сообщается, что распространенность дородовой ВИЧ-инфекции составляет 25% от общей численности населения, при этом почти 40% имеют риск развития активного туберкулеза. 32 Кроме того, 76% случаев туберкулеза также являются ВИЧ-инфицированными. 32 Команда провела рандомизированное контролируемое испытание только антиретровирусной терапии (АРТ) и профилактической терапии изониазидом (ПЛИ) в сочетании с АРТ (АРТ) для профилактики ВИЧ-ассоциированного ТБ. Результаты показали, что изониазид, добавленный к противовирусной терапии, снижает риск туберкулеза на 35%, как это наблюдалось после года терапии IPT. 33 Он также подсчитал, что люди, инфицированные ВИЧ, имеют примерно в 30 раз больше риска заражения активным туберкулезом из-за иммуносупрессии, а в условиях очень высокой заболеваемости повторное инфицирование встречается чаще, чем эндогенная реактивация болезни. 34

Mycobacterium tuberculosis: более пристальный взгляд

Род Mycobacterium претерпел несколько событий видообразования и генетического распада, что привело к появлению множества непатогенных и патогенных видов с различной специфичностью к хозяину. В отличие от других бактерий, виды микобактерий не участвуют в горизонтальном переносе генов, поэтому эволюция происходит постепенно, за счет небольших генетических изменений, регулируемых естественным отбором или связанных с эволюцией человека и его палеомиграцией.Ход этих генетических дрейфов привел к тому, что M. tuberculosis превратились в облигатный патоген со специфичностью к хозяину, ограничиваемой в первую очередь людьми. 35 Frédéric Veyrier (INRS-Institut Armand-Frappier, Канада) использовал технологии секвенирования генов для выявления факторов, которые делают M. tuberculosis специфичным для человека. Были опробованы два подхода: (а) «бесцельный» метод, который включал секвенирование следующего поколения (NGS) и инструмент исследования микобактериальных гомологов (mycoHIT), и (б) «сфокусированный» подход, который ограничивался интересующими локусами.Их главный интерес заключался в исследовании генетических мутаций, которые отбираются в процессе эволюции, чтобы стать облигатным патогеном. 35

Секвенирование всего генома может помочь различить быстро и медленно растущие микобактерии. Эти исследования показали, что M. kansasii может быть потенциальным кандидатом для моделирования образа предков M. tuberculosis , представляющего собой вид окружающей среды, который может вызывать туберкулезное заболевание, которое не может передаваться. 36 Генетический анализ выявил взрыв токсин-антитоксиновых модулей в M.tuberculosis после видообразования, в основном за счет дупликации генов. Еще одна специфическая адаптация — анаэробное дыхание. 37,38 Генетические события предков могут объяснить последовательную эволюцию патогена, и текущая функциональная характеристика этих событий может быть реконструирована в M. kansasii или M. marinum .

Переходя от подсказок в генетическом коде к системе передачи сообщений, Эрик Галбурт (Школа медицины Вашингтонского университета, США) обсудил кинетику и энергетику инициации транскрипции у микобактерий.Хотя это фундаментальный биологический процесс, который является общим для бактерий и сохраняется в них; Скорости транскрипции сильно различаются между E. coli и видами микобактерий из-за различий в стабильности промежуточных комплексов, образующихся в этом процессе. Следовательно, важно изучать центральные процессы в самом патогене, а не наследовать информацию от других модельных организмов. Основные факторы инициации транскрипции CarD (Rv3583c) и RbpA (Rv2050) играют важную роль в биологии M.Туберкулез . 39-42 Инициирование требует образования холофермента РНК-полимеразы (РНКП) со связанными сигма-факторами. Серия кинетических шагов приводит к образованию замкнутого комплекса, ведущего к открытому комплексу с пузырем транскрипции. Факторы инициации расположены рядом с верхним краем пузыря транскрипции. 43,44 Такие методы, как флуоресцентное мечение, были использованы для изучения открытого комплекса с использованием M. bovis RNAP, который, как известно, образует открытые комплексы, которые являются более нестабильными по сравнению с E.coli RNAP. Было обнаружено, что факторы инициации действуют независимо и кооперативно, регулируя транскрипцию, и что только в присутствии обоих факторов кинетика транскрипции у микобактерий, по-видимому, подобна той, которая наблюдается у E. coli . 45,46 Поскольку известно, что оба фактора играют важную роль в патогенезе, глобальных уровнях экспрессии рРНК / генов и устойчивости к стрессу и антибиотикам, они могут служить хорошими мишенями для разработки лекарств.

Основная проблема в разработке эффективных лекарств и схем лечения против M.tuberculosis — это гетерогенность инфицированной популяции бацилл, которая включает активно реплицирующиеся и спящие клетки, известные как персистеры. Клетки-персистеры находятся в состоянии покоя, обладают высокой толерантностью к антибиотикам и другим внешним воздействиям и при благоприятных условиях могут вернуться в состояние активного деления. 47 Обнаружение этих клеток практически невозможно, поскольку обычные микробиологические методы культивирования не могут их идентифицировать. Эти клетки могут быть сгенерированы in vitro, , при длительной стационарной фазе культивирования или постепенном подкислении культуральной среды.Затем они могут быть возвращены к их активно воспроизводящейся физиологии путем воздействия факторов, способствующих реанимации (Rpfs), которые также известны как Rpf-зависимые клетки. 48

Rpfs представляют собой секретируемые или связанные с клеточной стенкой ферменты, продуцируемые активно делящимися микобактериями. Они структурно и функционально подобны лизоцимам и необходимы для оживления спящих клеток. 49 В M. tuberculosis имеется 5 Rpf, и было обнаружено, что они важны для персистенции и реактивации инфекции у мышей.RpfA, B и E секретируются и обнаруживаются в фильтратах культур, тогда как RpfC связывается с клетками. 50 RpfD активируется во время инфекции. После оживления Rpf-зависимые клетки теряют эту характерную зависимость во время пассажей in vitro и пассажей.

Rpf-зависимые микобактерии очень важны в клиническом аспекте. 48 Эти клетки очень распространены в мокроте и образцах внелегочного туберкулеза, их относительные пропорции колеблются от 0 до 99,99% от общего количества M.туберкулез населения. Джайшри Гархиан (Университет Джавахарлала Неру, Индия) сообщил, что костный мозг является нишей для персистеров, поскольку мезенхимальные стволовые клетки выживают в течение длительного периода времени и находятся в среде с подавленным иммунитетом. 51,52 Кроме того, у стволовых клеток есть клетки активного выхода лекарства, обеспечивающие вторую стену защиты для патогена. Их работа показывает, что M. tuberculosis захватывают мезенхимальные стволовые клетки, перепрограммируют их с помощью фактора, индуцируемого гипоксией (Hif-1), и воздействуя на этот путь, могут усилить стандартные схемы лечения.

Rpf-зависимые клетки по своей природе более устойчивы к нескольким лекарствам, таким как рифампицин, изониазид и стрептомицин. 53 Поскольку избавиться от Rpf-зависимых микобактерий труднее, они оказываются более богатыми у пролеченных больных туберкулезом. Поскольку персистеры часто являются причиной неудач лечения и рецидивов после лечения, важно, чтобы оценка схем лечения ТБ учитывала элиминацию / индукцию этой группы клеток. 54 Янминь Ху (Лондонский университет Св. Георгия, Великобритания) считает, что невидимые персистеры представляют собой многообещающую терапевтическую мишень, и более короткие схемы химиотерапии, такие как испытанная с фторхинолонами, могут быть успешными только в том случае, если они эффективны в уничтожении этого подмножества патогенная популяция.В условиях in vitro ее группа заметила, что для уничтожения стационарных культур M. tuberculosis требуются высокие дозы рифампицина. 47 Это происходит главным образом из-за Rpf-зависимых бацилл, которые обладают высокой толерантностью к препарату и, по-видимому, уменьшаются с увеличением концентрации рифампицина, но не могут быть полностью уничтожены. 47 Когда они инкубировали инфицированные ткани легких мышей (2 недели инфицирования) с культуральным фильтратом, содержащим Rpfs, клетки-персистеры могли оживать даже после введения мышам высоких доз рифампицина.Они использовали модель Корнелла для изучения эффективности и частоты рецидивов различных схем лечения лекарствами, при которых инфекции позволяли развиваться в течение 3 недель, а затем лечили комбинациями лекарств в течение 14 недель. В конце периода лечения мышам давали гидрокортизон для подавления иммунной системы для изучения частоты рецидивов. Как отмечалось в более ранней модели, наблюдалось дозозависимое уничтожение бактерий. Также было отмечено, что более высокие дозы рифампицина могут сократить время лечения, однако небольшая подгруппа Rpf-зависимых бацилл все еще сохраняется в тканях хозяина.

Галина Мукамолова (Университет Лестера, Великобритания) представила концепцию лекарственно-индуцированной Rpf-зависимости у M. tuberculosis . Было показано, что лечение рифампицином, изониазидом и этамбутолом вызывает Rpf-зависимость, тогда как в случае лечения стрептомицином и амикацином такого эффекта не наблюдалось. 53 Таким образом, очень важно, чтобы лекарства были проверены на их склонность вызывать Rpf-зависимость. С этой целью Мукамолова и его коллеги стремились разработать простой тест для определения способности лекарств вызывать Rpf-зависимость.Rpf-зависимые микобактерии могут образовываться во время инфицирования мышей. Однако эти модели трудно обрабатывать в условиях высокой производительности. Чтобы адаптировать это к условиям in vitro , группа Мукамоловой синтезировала новые доноры оксида азота, которые могли индуцировать персистирующий фенотип в клетках M. bovis . Таким образом, эти in vitro системы могут быть использованы для валидации новых лекарств и поиска биомаркеров, зависимых от Rpf.

Еще одна модель стойкости, использующая модули токсин-антитоксин (ТА), обнаруженные в M.tuberculosis , обсуждалась Шалин Корч (Университет Среднего Запада, США). Из 88 предполагаемых выявленных модулей ТА около 30 были назначены функции. 55 Обычно это опероны с двумя генами, один из которых кодирует токсичный белок, а другой — антитоксин, который связывается с токсином и ингибирует его. 56 Регуляция этих модулей контролируется в основном за счет авторепрессии транскрипции оперона антитоксином. Однако при воздействии стрессов, возникающих во время заражения, активируется определенная часть этих модулей.Учитывая, что у E. coli эти системы, как известно, участвуют в образовании персистеров, их роль в контроле скорости деления M. tuberculosis во время инфекции требует дальнейшего изучения. 57 Корч решил сосредоточиться на системе RelBE, которая ингибирует трансляцию посредством расщепления мРНК. 58,59 Путем создания штаммов, которые сверхэкспрессируют токсины с последующим спасением от антитоксина, они продемонстрировали фенотип персистенции, при котором наблюдали только 20% от общей трансляции. 60 Эта модель позволит провести дальнейшее исследование стадий персистентности, а именно входа, обслуживания и выхода.

Ответы хозяина на M. tuberculosis

Макрофаги являются стражем врожденной иммунной системы. После того, как M. tuberculosis попадает в дыхательные пути подходящего хозяина, он сталкивается с фагоцитарными клетками и преимущественно вторгается в альвеолярные макрофаги и моноциты. После заражения эти макрофаги высвобождают множество цитокинов, которые привлекают несколько иммунологически активных клеток, таких как Т-клетки, которые выделяют интерферон-γ (IFNγ), который в сочетании с фактором некроза опухоли-α (TNFα) активирует макрофаги для устранения патогена. 61 Марцин Влодарчик (Лодзинский университет, Польша) интересуется профилем цитокиновых ответов, управляемых микобактериальными антигенами, и экспрессией рецепторов передачи сигнала при ТБ. Для исследования были выбраны двести восемнадцать пациентов, вакцинированных БЦЖ и инфицированных ВИЧ / ТБ. Основная цель исследования заключалась в оценке продукции IFNγ, TNFα, интерлейкинов и экспрессии на клеточной поверхности рецепторов, таких как TLR2, LFA-1, CD14, а также растворимого аналога CD14 между пациентами и здоровыми добровольцами.Они сообщают, что наблюдают количественные, а не качественные изменения в уровнях экспрессии изучаемых цитокинов, когда сыворотка инфицированных людей заражается микобактериальными антигенами. Также было обнаружено, что у больных туберкулезом значительно более высокая частота встречаемости моноцитов с рецепторами CD14, TLR2 и LFA-1. 62

Другой член семейства Toll-подобных рецепторов, RP105 (CD180), исследуется группой Antje Blumenthal (Институт Диамантина Университета Квинсленда, Австралия).RP-105 в основном экспрессируется макрофагами и моноцитами. У него короткий цитоплазматический хвост, и было высказано предположение, что он не может передавать сигналы напрямую без партнера по передаче сигналов. CD180 Уровни экспрессии мРНК выше в цельной крови у вылеченных больных туберкулезом по сравнению с теми, у которых наблюдается рецидив. 63 Было также показано, что мыши с дефицитом RP105 более восприимчивы к туберкулезу, а макрофаги с дефицитом RP105 продуцируют значительно меньшее количество воспалительных цитокинов, чем их аналоги дикого типа. 64 Однако ни мРНК, ни экспрессия белков воспалительных цитокинов, таких как TNF, не были затронуты в макрофагах мутантов с дефицитом RP105. 64 Благодаря своей работе группа Blumenthal продемонстрировала, что активация макрофагов, опосредованная RP105, отличается от передачи сигналов классического Toll-подобного рецептора (TLR), где RP105 направляет трафик цитокинов. 65,66 Этот новый сигнальный путь врожденного иммунитета включает RP105, BTK и субъединицу p110δ фосфоинозитид-3-киназы.

Другое семейство малых белков, трансмембранных белков, индуцированных интерфероном (IFITM), и их роль в ограничении инфекции M. tuberculosis было представлено Шахином Ранджбаром (Гарвардская медицинская школа, США). 67 TLR2 и 4 и MyD88-зависимые сигнальные пути участвуют в индукции белков IFITM 1, 2 и 3. Их работа показала, что уровни экспрессии белков IFITM напрямую коррелируют со скоростью роста M. tuberculosis в THP. -1 ячейка.Было замечено, что IFITM3 совместно локализуется с микобактериальными клетками в альвеолярных эпителиальных клетках, а сверхэкспрессия белка усиливает закисление эндосом, тем самым ограничивая инфекцию. 67

Перейдя от рецепторов к сигнальным молекулам, Мария Регина Д’Империо Лима (Университет Сан-Паулу, Бразилия) рассказала о роли пуринов, особенно внеклеточного АТФ (eATP), в иммунном ответе на тяжелый туберкулез. . Гипервирулентные штаммы микобактерий проявляют разную степень патогенности.Тяжесть заболевания часто связана с подавлением выработки эффекторных цитокинов.

eATP и продукт его распада аденозин, как известно, действуют как хемотаксические сигналы, приводящие к усиленной миграции нейтрофилов и макрофагов к месту воспаления. 68,69 eATP, как известно, активирует несколько рецепторов, которые, в свою очередь, вызывают гибель клеток из-за некроза, образования ионных каналов или пироптоза. 70 Эти механизмы обеспечивают высвобождение бактерий из фагоцитарных клеток, и было замечено, что туберкулез, вызванный гипервирулентными микобактериями, ослабляется у мышей, у которых отсутствует рецептор P2X7, и наблюдается снижение распространения болезни. 71 Клетки дикого типа с активным P2X7 погибают от некроза, который способствует высвобождению гипервирулентных микобактерий. 71 Гистологические анализы также выявили меньшее повреждение, вызванное воспалением, у мышей с нокаутом, таким образом демонстрируя, что передача сигналов P2X7 вносит вклад в патологию в модели тяжелой инфекции. Группа также отметила, что специфические клетки CD4 в паренхиме легких мышей, инфицированных вирулентными штаммами микобактерий, подавлены.

Аннемари Х.Meijer (Лейденский университет, Нидерланды) использует однодневные эмбрионы рыбок данио, инфицированные M. marinum , близким родственником M. tuberculosis , для изучения механизмов защиты хозяина на ранних стадиях инфекции. Преимущество изучения этих организмов состоит в том, что они оптически прозрачны, а агрегаты клеток и их распространение можно легко проследить. Молодые эмбрионы не обладают адаптивным иммунитетом, а самые ранние иммунные клетки — это макрофаги и нейтрофилы. Через несколько минут после заражения бактерии фагоцитируются.Инфицированные клетки привлекают новые макрофаги, в результате чего образуются гранулематозные агрегаты. Гранулема защищает патоген от дальнейшего иммунологического вмешательства и тем самым дает ему большое преимущество. 72 Стабильная секреция патогеном раннего секреторного антигена-6 (ESAT-6) обеспечивает сохранение и рост гранулем. Это согласуется с открытием, что мутанты с дефицитом ESAT-6 могут поддерживать только небольшие гранулемы. Профессор Мейер и ее группа сосредотачиваются на сети хемокинов, которая облегчает миграцию макрофагов с образованием гранулемы.

У рыбок данио с мутированным рецептором CXCR3 случайная подвижность макрофагов снижена. 73 Этот дефект подвижности коррелирует с уменьшением количества и размера гранулемы, что приводит к уменьшению общего бремени инфекции. Ингибирование рецептора CXCR3 показало уменьшение образования гранулем, а предыдущие исследования показали, что мыши с дефицитом CXCR3 проявляют повышенную устойчивость к инфекции. 73 Следовательно, нацеливание на формирование гранулемы с помощью иммуномодулирующих препаратов может помочь разработать стратегии, ориентированные на хозяина, которые могут работать синергетически с химиотерапией и снижать риск возникновения новой резистентности.

Используя рыбок данио в качестве доклинической модели, они испробовали несколько методов, чтобы (а) ингибировать рост гранулемы (б) обратить ингибирование слияния фаголизосом и (в) стимулировать антимикобактериальную аутофагию и аутофагический отток. 74 Аутофагия — это система иммунологической защиты, и многочисленные исследования in vitro показывают, что ингибирование аутофагии способствует росту M. tuberculosis в тканях хозяина.

Модулятор аутофагии, связанный с повреждением ДНК 1 (DRAM1), активируется во время M.marinum , зависящая от пути распознавания патогенов TLF / MyD88. 75 При сверхэкспрессии драм1 у личинок рыб развиваются более низкие уровни инфекции и более мелкие гранулемы.

Ранняя диагностика: ключ к борьбе с туберкулезом?

Из 9,6 миллиона предполагаемых случаев во всем мире в 2014 году только 6 миллионов были зарегистрированы через национальные центры эпиднадзора. Считается, что большинство из 3 миллионов недиагностированных случаев происходит из регионов со слабым медицинским обслуживанием.В основном это происходит из-за неполной отчетности и неполной диагностики. Занижение отчетности происходит, когда диагностика и лечение проводятся в частном секторе, который не связан с национализированными схемами. Во-вторых, педиатрические службы часто плохо связаны с национальными противотуберкулезными службами, и у детей часто не диагностируется туберкулез, поскольку выявление туберкулеза в таких случаях особенно сложно. Плохой доступ к медицинскому обслуживанию в странах с низким уровнем дохода является основной причиной неполного диагноза, и многие пациенты теряются для последующего наблюдения.Большинство медицинских центров проводят пассивное выявление случаев, тогда как Луис Э. Куэвас (Ливерпульская школа тропической медицины, Великобритания) считает, что более активный подход, включающий аутрич-услуги, может улучшить ситуацию. Он сравнил 2 тематических исследования активного выявления случаев; один из них был проведен в Эфиопии, где действует активная программа расширения здравоохранения, а другой — в Нигерии, которая прекратила свою программу расширения здравоохранения несколько десятилетий назад. Исследование проводилось в трущобах вокруг Абуджи в Нигерии.С помощью вышедших на пенсию медицинских работников (HEW) и с использованием таких ресурсов, как данные переписи по ликвидации полиомиелита, были проведены посещения по дому для сбора 2 образцов мокроты с интервалом в 40 минут. О результатах сообщили дома у человека или по телефону. Уровень выявления случаев был удвоен благодаря усилиям по увеличению количества диагнозов для женщин и пожилого населения. 76

Эфиопия имеет хорошо организованную программу распространения медицинских услуг. В ходе исследования HEW получали базовые медицинские пакеты, которые доставлялись им на дому каждые 14 дней.Основная цель упражнения заключалась в улучшении результатов лечения и выявления случаев туберкулеза. Медицинские работники были обучены выявлению случаев заболевания, сбору мокроты и приготовлению мазков, которые затем сдавали в местные лаборатории. Как только результаты подтвердят наличие туберкулезной инфекции, куратор начнет лечение на дому, и будут проверены домашние контактные лица. По сравнению с предыдущим годом выявление случаев ТБ увеличилось как минимум в 2 раза, что наглядно демонстрирует улучшения в выявлении случаев ТБ при использовании активного подхода к выявлению случаев. 77,78 Эндрю Кертис (Государственный университет Кента, США) также поддержал этот подход, он обсудил использование пространственных видеозаписей с видеокамеры и географических повествований для отслеживания активных контактов бездомных и потребителей наркотиков, которые подвержены высокому риску заражения этим заболеванием в развитых странах.

Микроскопия мазка мокроты остается основой классических диагностических тестов, используемых в странах с низким и средним уровнем дохода с высоким бременем туберкулеза. 79 Этот метод прост в исполнении, дешев и быстр, но его использование ограничено из-за низкой чувствительности и специфичности, особенно в педиатрических случаях, у пациентов с ВИЧ и пациентов с низкой бактериальной нагрузкой в ​​мокроте. 80 Для получения результатов с помощью методов жидких и твердых культур может потребоваться до 3 недель, после чего отслеживание пациентов может стать затруднительным, что приведет к тому, что инфицированные ТБ люди не получат лечения, а распространение болезни в своих общинах и домохозяйствах еще больше усугубит ситуацию.

В попытке разработать неинвазивную диагностическую стратегию туберкулеза с использованием образцов дыхания, Thu-Hoa Tran-Thi (Centre National de la Recherche Scientifique, Франция) обсудил потенциал летучих метаболитов M.tuberculosis в качестве биомаркеров болезни. 81,82 Никотиновая кислота (NA), метилфенилацетат (MPA), метил-п-анизат (p-MA), метилникотинат (MN) и о-фениланизол — это 5 летучих соединений, которые были идентифицированы из культур M. tuberculosis выращено in vitro . 82 NA может быть обнаружена в дыхании больных активной формой туберкулеза, хотя присутствует в небольших количествах. Также было обнаружено, что он является многообещающим индикатором штаммов M. tuberculosis , устойчивых к пиразинамиду.Доктор Тран-Тхи и группа исследовали метод обнаружения НА в сложных растворах с различными метаболитами, а также в биологических средах. Были разработаны люминесцентные методы обнаружения NA с использованием тербия III (Tb 3+ ) в качестве зонда благодаря его способности люминесцировать при передаче энергии от NA к иону Tb 3+ . 83 Потенциальное вмешательство других метаболитов, таких как MPA, p-MA и MN, которые имеют такие же длины волн возбуждения, что и NA в образцах, было идентифицировано как проблема.Конденсат выдыхаемого воздуха был признан лучшим образцом, поскольку он меньше мешает по сравнению с образцами слюны и мочи. Стоимость этого диагностического процесса оценивается ниже, чем одобренный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) молекулярный диагностический тест GeneXpert® MTB / RIF, что делает его разработку приоритетной для последующего использования в развивающихся странах.

Биомаркеры крови также можно использовать в диагностических тестах для выявления туберкулеза в эндемичных районах. В целом множество антител, специфичных к различным антигенным эпитопам, обнаруженным в M.tuberculosis у больных туберкулезом, методы выявления на основе профиля отдельных антител, скорее всего, не сработают. Имран Хан (Калифорнийский университет, США) изучил возможность использования мультиплексной серологической панели для диагностики туберкулеза. 84 В этом тесте используется панель из 28 микрогранул M. tuberculosis , покрытых антигеном, что позволяет универсально идентифицировать профили антител у пациентов с помощью одного теста. Используя тот же метод, доктор Хан исследовал 10 цитокинов / хемокинов / факторов роста в плазме и 8 антител против 8 M.tuberculosis биомаркеров антигенов, которые повышены у больных туберкулезом. Интересно, что они обнаружили, что уровни профиля антител среди больных туберкулезом зависят от пола и связаны с успехом лечения. 85 Иммунобиомаркеры при туберкулезе важны для понимания реакции хозяина на патоген, и эта область может быть дополнительно изучена для разработки диагностики и лечения туберкулеза.

Геномика, протеомика и транскриптомика — это подходы, которые широко использовались для характеристики M.Туберкулез . Недавно метаболомика, новый подход, была дополнена революцией «омиков», чтобы обеспечить более полное понимание сложных внутренних систем патогена. 86,87 Metabolomics исследует все внутри- и внеклеточные метаболиты (низкомолекулярные промежуточные соединения и продукты) в биологическом образце с использованием высокоспециализированных аналитических методов для создания метаболического профиля и измерения любых динамических реакций на стимулы или генетические модификации. 88-90 Du Toit Loots (Северо-Западный университет, Южная Америка) интересуется характеристикой M.tuberculosis с использованием метаболомики и определения его характерных метаболитных сигнатур. Этот подход позволяет идентифицировать различные виды микобактерий с использованием конкретных маркеров метаболитов, хотя известно, что у этих видов есть незначительные генетические вариации, что свидетельствует о чувствительности этого подхода. 86 Профессор Лутс выразил оптимизм по поводу возможности использования маркеров метаболитов для построения диагностических моделей, основанных на систематических подходах в исследованиях метаболомики. 91-93 Это также может помочь в обнаружении связи между туберкулезом и его симптомами; например, повышение уровня адреналина может прогнозировать потерю веса и бессонницу у пациентов.В будущем этот подход может также использоваться для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза и прогноза. 94

Тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) — это молекулярные диагностические подходы, которые были разработаны для повышения чувствительности и специфичности при диагностике ТБ и, что наиболее важно, для выявления инфекций МЛУ-ТБ. GeneXpert® MTB / RIF Ultra был представлен на Саммите по борьбе с туберкулезом в этом году, подчеркнув значительные улучшения по сравнению с его более ранней версией. Элиза Тальяни (Научный институт IRCCS Сан-Раффаэле, Италия) продвигала новый инструмент молекулярной диагностики и приветствовала его как трансформацию усилий по выявлению / ликвидации ТБ.В последнем формате используются картриджи большего размера и дополнительные зонды, выявляющие 4 новые мутации rpoB , IS6110 и IS1081 из M. tuberculosis , что позволяет обнаруживать 30 различных устойчивых к рифампицину мутаций M. tuberculosis rpoB . С помощью этих достижений они надеются повысить чувствительность анализа, близкого к жидкой культуре. 95

Эрик Р. Хаупт (Университет Вирджинии, США) рассказал о карте массива TaqMan (TAC). Это генотипический метод обнаружения мутации патогена, который обеспечивает 2 уровня точного обнаружения мутаций с помощью зондов, специфичных для последовательности, и анализов плавления с высоким разрешением (HRM).Он может обнаруживать мутации в генах, указывающих на устойчивость, таких как rpoB, inhA, embB, gyrA и многие другие. 96 Метод прост в применении, воспроизводим, обладает хорошей чувствительностью и специфичностью. Он может улучшить выявление МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ, а следовательно, повысить уместность и эффективность лечения ТБ.

Многие коммерчески доступные форматы NAAT недоступны в центрах с ограниченными ресурсами из-за высоких затрат, связанных с приборами и расходными материалами.PURE-TB-LAMP, тест TB NAAT, утверждает, что он простой, быстрый, надежный, чувствительный (по сравнению с микроскопией мазка) и доступный (по сравнению с другими платформами NAAT). Yasuyoshi Mori (Eiken Chemical Co., Ltd., Япония) рассказал об этом наборе для скрининговых тестов, в котором используется петлевая изотермическая амплификация (LAMP), которая устраняет необходимость в дорогостоящих термоциклерах или системах обнаружения. 97 Набор состоит из набора для экстракции ДНК Loopamp ™ PURE и набора для обнаружения MTBC Loompamp ™. Три основных технических аспекта теста: (a) амплификация ДНК с помощью LAMP, (b) сверхбыстрая экстракция (PURE) ДНК, которая может удалить ингибиторы теста без значительной потери генетического материала, и (c) простое визуальное обнаружение результат с использованием флуоресценции в ультрафиолетовом свете. 98,99 Станок Loopamp ™ LF-160 не требует обслуживания или калибровки, что делает весь процесс простым и легким в освоении; отказавшись от необходимости в высококвалифицированном персонале. Чувствительность TB LAMP в 100 раз выше, чем при микроскопии мазка мокроты. 100 В настоящее время скрининговый тест одобрен для использования в Японии, Китае, Южной Корее и Таиланде. Анализы его клинических характеристик были представлены в ВОЗ для утверждения использования.

Туберкулез средостения — это форма внелегочного туберкулеза, которая часто встречается у детей, ВИЧ-инфицированных пациентов и взрослых иммигрантов в развитых странах.Число зарегистрированных случаев внелегочного туберкулеза в Великобритании за последнее десятилетие несколько увеличилось, и эта тенденция вызывает беспокойство. 101 Диагностика туберкулезного лимфаденита средостения является сложной задачей из-за его неспецифической клинической картины, нормальных результатов рентгенологического исследования грудной клетки и низкопродуктивного посева мокроты. 102,103 Эти расплывчатые проявления необходимо дифференцировать с другими подобными заболеваниями, такими как лимфома, карцинома и саркоидоз. 102 Онн Мин Кон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) подчеркнул, что нельзя упускать из виду туберкулез средостения, особенно когда у пациентов с подозрением на изолированный лимфаденит средостения проводится нормальный рентген грудной клетки.Последующее сканирование грудной клетки с помощью ПЭТ / КТ является обязательным для подтверждения положительной лимфаденопатии. 104 Взятие пробы ткани лимфатических узлов средостения является обязательным для определения этиологии заболевания, ранее в основном выполнялось с использованием таких методов, как медиастиноскопия шейки матки. Однако этот инвазивный метод связан со значительной заболеваемостью и смертностью, поэтому эндоскопическая трансбронхиальная игольчатая аспирация под контролем УЗИ (EBUS-TBNA), обычно используемая при диагностике рака легких, рекомендуется в качестве минимально инвазивной альтернативы для диагностики туберкулеза средостения. 105-107 Профессор Кон сообщил, что этот широко используемый метод микробиологической диагностики в сочетании с GeneXpert® MTB / RIF может повысить чувствительность и специфичность диагностики туберкулеза средостения, ускорить оценку подозреваемых случаев и обеспечить быстрое обнаружение устойчивых M. tuberculosis штаммы. 108

M. bovis является членом комплекса MTB и не зависит от хозяина. Он может заразить альпак, лам, собак и кошек, а затем передать их владельцам животных.Великобритания не смогла сдержать болезнь, несмотря на ряд радикальных мер, принимаемых для контроля над популяциями естественных резервуаров. Для диагностики инфекции M. bovis требуется три месяца, и это стоит 140 долларов за образец. Дифференциация между M. bovis и M. tuberculosis необходима, поскольку первый по своей природе устойчив к пиразинамиду.

Традиционные подходы к созданию тестов серологического ответа используют либо непатогенные штаммы БЦЖ, либо убитые нагреванием / химически инактивированные патогены.Эти суровые условия повреждают важные конформационные эпитопы клеточной поверхности, которые не представлены или не поддерживаются во время обнаружения. Новый подход, опробованный Линдой Стюарт (Университет Белфаста, Великобритания), заключался в использовании гамма-облученных патогенных штаммов для разработки специфических связывающих веществ M. bovis . 109 Использовали цельноклеточные или экстрагированные этанолом поверхностные антигены и получали как поликлональные, так и моноклональные антитела с использованием технологии фагового дисплея. Результатом этого был набор связывающих веществ, которые были охарактеризованы с помощью ELISA и иммунофлуоресцентного окрашивания.Основная цель их усилий заключалась в разработке диагностического теста, в котором использовались бы связующие вещества для выявления заболеваний, которые могли бы различать инфекции M. bovis и M. tuberculosis , в отличие от коммерчески доступных наборов, имеющихся на рынке в настоящее время.

Густаво Морейра (Технический университет Брауншвейга, Германия) обсудил использование фагового дисплея для идентификации биомаркеров и генерации человеческих антител для диагностики и терапии. Фаговый дисплей антител включает процесс in vitro , который не затрагивает иммунную систему.Процесс начинается со вставки генов антител в геном фага, который затем выражается в виде слитого белка, отображаемого на внешней поверхности фага. Следующий этап называется пэннингом, когда антиген опрашивается созданной библиотекой антител. Идентификация положительно связывающихся антител выполняется с помощью ELISA, иммуноблоттинга или проточной цитометрии. 110

M. tuberculosis секретирует белок, называемый антигеном 85 (Ag85). Были отобраны гены антител из наивной библиотеки и клонированы в дрожжевые системы отображения.Эту комбинацию фагового и дрожжевого дисплеев использовали для получения антител против Ag85. Клоны были проверены на самое высокое связывание антигена, выявив 7 пар антител, которые могут обнаруживать Ag85 при наномолярных концентрациях, однако ни один из клонов не был строго специфичным для одной из субъединиц антигена 85 комплекса. 111 В другом исследовании использовались 5 человеческих антител против Ag85B из исходных библиотек, где 3 из них специфически связывались с белками 85B, как было проверено с помощью ELISA. 112

Мониторинг реакции хозяина на лечение ТБ может определить эффективность лечения и спрогнозировать вероятность рецидива.Текущий метод подтверждения успеха лечения — это конверсия бактериологической культуры через 2 месяца от начала терапии. Бактериальная транскриптомика предлагает новые возможности для изучения элиминации патогена у пациента. Dimitrios Evangelopoulos обсудил молекулярные методы обнаружения снижения бактериальной нагрузки во время лечения как биомаркера прогрессирования инфекции. Метод обнаружения микобактериальной РНК был разработан с использованием искусственного матрикса, напоминающего образцы мокроты, и применен к клиническому случаю у 12-летнего пациента. 113 В этом случае методы окрашивания выявили присутствие кислотоустойчивых бацилл, однако анализы жидких культур не смогли обнаружить никаких живых бацилл. При использовании анализа молекулярной бактериальной нагрузки (MBL) у пациента была выявлена ​​высокая бактериальная нагрузка, и схема лечения была изменена с включением моксифлоксацина. После года лечения ни MBL, ни окрашивание не выявили никаких бацилл, и пациент был подтвержден как излечившийся.

Пилотное исследование на мышах показало, что этот анализ также можно использовать с тканями животных.Анализы MBL и колониеобразующих единиц (КОЕ) в тканях мышей, подвергавшихся разному лечению, показали, что оба анализа согласуются друг с другом, причем первый последовательно обнаруживает большее количество клеток, вероятно, в результате обнаружения некультивируемой клеточной популяции. 113 Таким образом, MBL-анализы могут служить быстрым и чувствительным инструментом диагностики и мониторинга лечения, предлагать понимание эффективности лекарств и могут использоваться при открытии новых лекарств.

Открытие лекарств: преодоление препятствий

Поиск новых терапевтических целей

С момента знаменательного объявления полной последовательности генома M.tuberculosis , была целенаправленная работа по выявлению важных генов и визуализации их белковых продуктов, что позволило начать проекты по созданию целевых лекарств. Том Бланделл (Кембриджский университет, Великобритания) заинтересован в изучении биологического космоса, переходящего от генома к протеому. Традиционные методы влажных лабораторных исследований для понимания протеома патогена должны быть подкреплены подходами системной биологии. С этой целью группа профессора Бланделла работала над Шопеном, который наследует информацию об известных структурах примерно 400 белков и использует ее для прогнозирования моделей для остальных 3500 белковых структур. 114 На основании информации из общедоступных баз данных; взаимодействия, лиганды и олигомерные состояния многих белков могут быть расшифрованы. Затем эту информацию можно использовать для структурно-ориентированных и фрагментарных подходов к открытию лекарств. Обоснованием этой стратегии является использование небольших молекул с беспорядочной аффинностью связывания для исследования субструктур, присутствующих с белками-мишенями, с использованием стандартных биофизических анализов связывания лигандов. Затем удары оптимизируются для получения молекулы, которая связывается с целевым белком в наномолярных концентрациях.Используя этот подход, они успешно разработали ингибиторы против EthR, репрессора транскрипции для белка, активирующего этионамид. 115 Поскольку развитие мутаций является основным препятствием для индустрии разработки противотуберкулезных препаратов, профессор Бланделл также обсудил использование технологий секвенирования второго поколения для разработки основанного на знаниях подхода к пониманию эволюционной динамики. Влияние однонуклеотидных полиморфизмов на стабильность белка, сродство белок-белок / нуклеиновая кислота / лиганд теперь может быть установлено с помощью mCSM, другого полезного инструмента веб-сервиса, разработанного группой. 116

Выявление мишеней для лекарств, которые можно использовать, является важным шагом на пути к рациональному дизайну лекарств. Клеточная стенка микобактерий уникальна для грамположительных и грамотрицательных организмов и является хорошим источником для мишеней противомикобактериальных препаратов, как это обсуждали Санджиб Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) и Дирк Шнаппингер (Вейл Корнелл). Медицинский колледж, США). Он содержит комплекс миколиновой кислоты, арабиногалактана и пептидогликана, образующий ядро ​​клеточной стенки — характерная особенность, которая на протяжении многих лет привлекала внимание нескольких исследователей.

Разрушение миколовой кислоты M. tuberculosis оказалось отличной стратегией для нацеливания на патоген, о чем свидетельствует успех таких лекарств, как изониазид, этамбутол и пиразинамид, все из которых нацелены на синтез миколиновой кислоты. Однако рост устойчивости штаммов M. tuberculosis к этим препаратам усилил потребность в новых мишенях. Биотин является важным кофактором для всех ацил-КоА-карбоксилаз (АССаз), которые играют роль в обеспечении строительных блоков для синтеза компонента жирных кислот в M.tuberculosis клеточная оболочка. Клетки млекопитающих приобретают биотин из внешней среды и, таким образом, лишены этих ферментов, что подтверждает этот путь для разработки по сути селективных противотуберкулезных препаратов. 117 Кроме того, мутанты в пути синтеза биотина могут вызывать только ослабленные формы инфекций у мышей, что позволяет предположить, что патоген не может получить экзогенный биотин. 118 Проф Шнаппингер и его группа обнаружили, что мутация одного из ферментов, BioA (биотинлигаза) в M.tuberculosis сделал его неспособным выжить in vitro, и у мышей, что указывает на то, что синтез биотина de novo имеет решающее значение для выживания и устойчивости патогена. 119 BioA подвержен ингибированию, что подтверждается его ингибированием с использованием антибиотика амикленомицина. 120,121 Однако этот антибиотик слишком полярен и непригоден для использования в рамках длительной схемы лечения туберкулеза. Целенаправленный подход, предпринятый группой профессора Шнаппингера, позволил идентифицировать мощный бисубстратный ингибитор биотиновых протеинлигаз (называемый Bio-AMS) из M.tuberculosis , который действует путем взаимодействия как в карманах связывания биотина, так и АТФ. 122 Этот конкурентный ингибитор оказался очень селективным и сильным против штаммов туберкулеза, что свидетельствует о том, что генетические подходы, способствующие открытию противотуберкулезных препаратов, по-прежнему заслуживают внимания.

Д-р Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) был пионером в исследованиях метаболизма пептидогликана (PG) в M. tuberculosis на протяжении более десяти лет. 123 АТФ-зависимые гены лигазы Mur участвуют в синтезе предшественников PG.Эти гены ограничены бактериями, и было обнаружено, что они необходимы для микобактерий с помощью гибридизации сайта транспозона (TraSH). Структура murE была разрешена до 3Å и показывает доступный активный участок кармана, который можно использовать для создания лекарств. 124,125 Ферментативное ингибирование MurE из M. tuberculosis наблюдали с экстрактами колумбийских растений и химически синтезированными соединениями хинолона, тем самым демонстрируя, что лигазы могут служить мишенями для лекарств. 126-129 Кроме того, поскольку клеточное деление и биогенез клеточной стенки строго контролируются кооперативными процессами, неудивительно, что гены лигазы мур сгруппированы в опероне клеточной стенки ( dcw ), что дополнительно указывает на то, что нацеливание на этот путь будет иметь эффект «нокдауна» на совместно регулируемые пути.

Дивисома микобактерий представляет собой многофакторный комплекс, который собирается в средней клетке и вызывает расщепление бактерий, в результате чего образуются 2 дочерние клетки.Нарушение процесса деления клеток может серьезно повлиять на инфекционность патогена. С этой целью Тим А. Кросс (Университет штата Флорида, США) исследовал двух рекрутов дивизома, CrgA и ChiZ, о которых мало что известно. Структура микобактериального CrgA была смоделирована с и без белка деления FtsQ. Используя твердотельный ЯМР, они обнаружили, что CrgA состоит из 2 трансмембранных спиралей с очень точными осями вращения. Ожидается, что экспонированные остатки глицина в структуре будут участвовать в связывании с белками в дивисоме. 130 N — конец CrgA по своей природе неупорядочен, однако Dr Cross предполагает, что на липидном интерфейсе он, вероятно, будет принимать конформацию β-листа.

Вопреки ожиданиям, рациональная разработка лекарств не позволила определить количество потенциальных кандидатов в ведущие лекарственные препараты, которые были получены с помощью методов цельноклеточного фенотипического скрининга, таких как тот, который обсуждал д-р Бхакта. SPOTi — это метод, основанный на твердой культуре, при котором оптимизированное количество бактерий наносится на агар, содержащий серию разведений молекул ингибитора. 131-133 Этот метод адаптирован к формату 96-луночного микропланшета, тем самым увеличивая производительность.

Однако, как только обнаруживается мощный ингибитор роста микобактерий, важно идентифицировать эндогенную мишень молекулы. Существует несколько доступных технологий для идентификации целей, таких как подходы, основанные на геноме, аффинности и знаниях. Cristiano V. Bizarro (PUCRS, Бразилия) рассказал о импульсном протеолизе и преципитации для идентификации мишени (PePTID). 134 Это энергетический метод, при котором белковые экстракты инкубируются с лигандом или без него с последующим применением короткого протеолитического импульса и осаждения трихлоруксусной кислотой. Масс-спектрометрия используется для анализа результатов, и в качестве доказательства концепции они применили методологию для идентификации АТФ-связывающих белков с использованием негидролизуемого АТФγ в M. smegmatis .

Перспективные молекулы и натуральные продукты

Даниэле Кастаньоло (Королевский колледж Лондона, Великобритания), Ярослав Ро (Карлов университет в Праге, Чешская Республика) и Ill Y.Ли (Корейский научно-исследовательский институт химических технологий, Южная Корея) рассказал о многообещающих потенциальных противотуберкулезных препаратах, находящихся на разных этапах разработки в результате их исследовательских усилий.

Доктор Кастаньоло упомянул, что использование молекул, похожих на те, которые не прошли клинические испытания, и их оптимизация для улучшения их характеристик может быть выигрышной стратегией. Он отметил, что две мощные антимикобактериальные молекулы, BM212 и SQ109, имеют схожее топологическое распределение химических свойств.Однако у них были ограничения в отношении фармакокинетических параметров, растворимости, профиля цитотоксичности и эффективности против штаммов M. tuberculosis MDR . Стратегия группы заключалась в гибридизации этих двух препаратов для получения новых производных для достижения улучшенной противотуберкулезной активности или, возможно, снижения цитотоксичности. Было синтезировано два поколения соединений, и, что интересно, первое поколение соединений оказалось мощными ингибиторами эффлюксной помпы с множеством лекарственных препаратов, а это означает, что эти молекулы могут усилить действие стандартной химиотерапии. 135

Доктор Ли исследовал такие производные, как фениловый эфир и карбонатные производные нитроимидазола, поскольку в молекуле есть пространство для размещения реактивных групп, которые могут улучшить ее антимикобактериальный профиль. 136,137

Доктор Ро исследовал 5-замещенные 2 — [(3,5-динитробензил) сульфанил] -1,3,4-оксадиазолы и 1,3,4-тиадиазолы на предмет их превосходной антимикобактериальной активности как в отношении чувствительных, так и лекарственно-устойчивые формы M. tuberculosis со значениями МПК от 0.03 мкМ. Соединения проявляли селективную антимикобактериальную активность без активности против грамположительных, грамотрицательных и грибков. Перекрестной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда не наблюдалось. Исследования взаимосвязи структурной активности продемонстрировали, что 3,5-динитрофенильный фрагмент играет решающую роль в обеспечении антимикобактериальной активности. 138-140 Любые изменения положения динитрогруппы приводили к потере или снижению противотуберкулезной активности в несколько раз. Тест AMES показал, что эти соединения, содержащие нитрогруппу, не обладают мутагенной активностью. 140 Они также проявили низкую клеточную токсичность in vitro на 3 линиях клеток млекопитающих. Соединения имеют структурное сходство с ингибиторами DprE1, такими как динитробензамиды или бензотиазинон. Однако эксперименты с радиоактивной меткой показали снижение включения урацила, что указывает на то, что бактериальные клетки страдают от дефекта синтеза ДНК при лечении. Дальнейшие исследования по оптимизации соединений для улучшения растворимости и замены атома серы продолжаются, поскольку его присутствие в молекуле делает ее очень восприимчивой к метаболической деградации.

Натуральные продукты играют важную роль в открытии новых лекарств и являются богатым источником противомикробных препаратов. По оценкам, одна треть населения мира полагается на традиционную медицину для удовлетворения своих медицинских потребностей. Скрининг натуральных продуктов высших растений представляет собой одно из направлений поиска новых свинцовых противотуберкулезных агентов. Мария дель Райо Камачо-Корона (Автономный университет Нуэво-Леон, Мексика) оценила антимикобактериальную активность 9 растений, используемых в традиционной мексиканской медицине.Они выбрали растения на основе обширного поиска в мексиканской этноботанической литературе. Некоторые из растений включали Citrus sinensis, Citrus aurantifolia, Foeniculum vulgare, Larrea tridentata, Musa acuminata и Olea europaea . 141 Экстракты из различных частей растений были приготовлены путем мацерации с использованием гексана, хлороформа, метанола и воды. Экстракты растений тестировали с использованием анализа alamar blue на микропланшетах и ​​тестировали против M. tuberculosis и его изолятов MDR.Гексановый экстракт кожуры плодов цитруса Citrus aurantiifolia фракционировали с помощью колоночной хроматографии, и основные соединения были выяснены с помощью ЯМР-спектроскопии и ГХ-МС. Было идентифицировано несколько соединений, таких как кумарины, линолевая, пальмитиновая и олеиновая кислоты, многие из которых были летучими и ингибировали рост патогена.

Антимикробные пептиды (АМФ) являются неотъемлемой частью врожденного иммунитета, который помогает в борьбе с различными патогенами. Обычно они действуют путем разрушения мембран бактериальных клеток.В водной среде АМП существуют в виде отдельных молекул. При контакте с мембранами они упорядочиваются и образуют поры в мембранах. Их действие быстрое и эффективное даже против штаммов с высокой лекарственной устойчивостью, и, следовательно, они могут использоваться в качестве дополнительного лечения. Некоторые из них в настоящее время проходят клиническую разработку для лечения нескольких бактериальных инфекций. Однако природные AMP не являются хорошими кандидатами в лекарства из-за их большого размера, что приводит к более высоким производственным затратам. Черпая вдохновение в природе для создания новых AMP, Jasmeet S.Khara (Королевский колледж Лондона, Великобритания) принял рациональный дизайн для производства пептидов с меньшей вероятностью индукции устойчивости и пептидов, которые демонстрируют синергизм со стандартными антибиотиками. 142 Существуют различные стратегии модификации AMP, такие как синтез пептидных конъюгатов, пептидомиметиков и получение гибридных пептидов. Они сосредоточились на дизайне de novo и пришли к первичной последовательности, содержащей 4 аминокислоты (xxyy) n, где «x» и «y» являются гидрофобными и катионными остатками соответственно с числом повторов «n».Было обнаружено, что последовательности, содержащие повторяющиеся остатки лейцина и лизина, такие как (LLKK) 2 в качестве основы с короткими амфипатическими α-спиралями, являются антимикобактериальными. При добавлении остатков метионина к α-спиральной части гидрофобность пептида увеличивалась, что делало его внедрение в клеточную мембрану более эффективным. Пептиды проявляли синергизм с противотуберкулезными препаратами первой линии и были эффективны против лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis .Механизм действия этих пептидов анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии и визуализации живых клеток обработанных микобактерий. В присутствии пептидов мембрана бактериальных клеток была более проницаемой для красителя.

Репозиционирование лекарств: многообещающая альтернативная стратегия открытия лекарств?

Переназначение стало привлекательной стратегией для открытия лекарств, которые могут быть непосредственно добавлены к арсеналу лекарств, используемых для лечения туберкулезных инфекций. Susanne Brighenti (Каролинский институт, Швеция) заинтересована в усилении врожденной системы защиты хозяина в качестве альтернативной стратегии лечения инфекционных заболеваний.Комбинация витамина D3 и 4-фенилбутирата (PBA) проявляет синергетический эффект на продукцию LL-37 в разных типах клеток. LL-37 представляет собой AMP, который вызывает аутофагию в макрофагах человека, инфицированных M. tuberculosis . 143,144 Повышенная выработка LL-37 может потенциально увеличить уничтожение как внеклеточных, так и внутриклеточных бактерий, как сообщалось ранее. Нет значительных клинических или микробиологических данных об эффектах лечения этими препаратами. Таким образом, на основе исследования шигеллеза, проведенного в Бангладеш, клинические исследования были разработаны для проведения в Эфиопии и Бангладеш. 145 Исходный уровень витамина D3 в сыворотке у населения Эфиопии оказался низким, и было рекомендовано принимать добавки. Рандомизированное двойное слепое клиническое испытание с использованием ежедневного приема витамина D и PBA в качестве дополнительного лечения к стандартной химиотерапии было проведено для изучения комбинированного воздействия на продукцию LL-37. Оба увеличивали продукцию LL-37 в макрофагах человека и зависимую от LL-37 аутофагию в инфицированных макрофагах. Они также наблюдали уменьшение клинических симптомов с улучшенным выздоровлением и быстрой конверсией посева мокроты при дополнительной терапии только с помощью vitD3 или в комбинации с PBA.Следовательно, vitD3 и PBA могут противодействовать подавлению активности LL-37 во время инфекции, что может иметь положительное влияние на снижение потребности в антибиотиках для лечения. 145-147

Д-р Бхакта и его исследовательская группа сообщили, что распространенные, отпускаемые без рецепта нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), ибупрофен и карпрофен обладают специфической противотуберкулезной активностью. 131 148 149 Было обнаружено, что они активны в отношении штаммов, устойчивых к лекарствам, и микобактерий стационарной фазы. Эндогенный механизм действия этих препаратов все еще обсуждается, однако транскриптомный анализ показывает, что препараты могут оказывать плейотропное действие на патоген.Кроме того, иммуномодулирующие эффекты НПВП и обеспечиваемая ими защита от воспаления и повреждения тканей являются главным аргументом в пользу включения этого класса лекарств в качестве вспомогательных терапий, направленных на хозяина, в дополнение к стандартному лечению против туберкулеза с целью улучшения результатов лечения.

M. tuberculosis обладают 2-регуляторной системой PhoPR, которая важна для восприятия кислой среды, обнаруженной в макрофагах, и реагирования на нее, а также для ее использования в своих интересах. Роберт Абрамович (Университет штата Мичиган, США) стремился найти соединение, которое ингибирует регуляторную систему, делающую патоген восприимчивым к иммунным ответам хозяина. Для выявления ингибиторов регулона использовали фенотипический скрининг целых клеток. Высокопроизводительный скрининг почти 220 000 библиотек соединений выявил, что этоксоламид ингибирует регулон, но не влияет на рост патогена. Этоксзоламид — ингибитор карбоангидразы, который используется для лечения глаукомы и язв двенадцатиперстной кишки.Транскрипционные исследования показывают, что этоксоламид подавляет 45 генов в M. tuberculosis . Известно, что эти гены контролируют синтез липидов, углеродный метаболизм и вирулентность. В качестве основного вывода этого исследования они заявляют, что этоксзоламид не изменяет гомеостаз pH M. tuberculosis ‘, но подавляет его pH-зависимую адаптацию и вирулентность. 150

Джерри Дэвис (Ливерпульский университет, Великобритания) обнаружил, что проблема с разработкой нового лечения заключается в отсутствии комплексного подхода к фармакокинетическому и фармакодинамическому анализу клинических исходов, наряду с плохо спланированными исследованиями на животных, приводящими к неудачам в лечении. клинические испытания.Это захватывающее время для полевых клинических разработок лекарств от туберкулеза, поскольку несколько новых и перепрофилированных лекарств проходят испытания. Испытания фазы II B одного из немногих многообещающих кандидатов, фторхинолонов, гатифлоксацина и моксифлоксацина, показали, что препараты работают хорошо и ускоряют скорость конверсии посевов на ранних этапах клинической разработки, давая надежду на сокращение продолжительности терапии и снижение частоты рецидивов. Испытания фазы III, в которых моксифлоксацин был включен в схемы лечения первой линии как средство сокращения продолжительности лечения до 4 месяцев, закончились разочарованием.Доктор Дэвис предлагает концепцию бесшовного дизайна исследования с набором основных результатов. Это позволило бы оценить результаты в нескольких промежуточных точках, а руки, которые работают плохо, прекратить. Следовательно, ресурсы и пациентов можно направить в руки, которые хорошо работают в тщательно отобранных точках, чтобы минимизировать потери средств и времени. 151

Отчет с международного саммита Euroscicon по борьбе с туберкулезом 2016

РЕЗЮМЕ

Сказать, что туберкулез (ТБ) вернул себе прочную точку опоры в глобальном сценарии здоровья и благополучия человека, было бы преуменьшением.Наряду с ВИЧ / СПИДом в качестве основной причины смертности от одного инфекционного заболевания влияние туберкулеза простирается далеко в социально-экономический контекст во всем мире. По мере того, как глобальные усилия, возглавляемые экспертами и политическими органами, объединяются для смягчения прогнозируемого результата роста устойчивости к противомикробным препаратам, академическое сообщество студентов, практиков и исследователей мобилизовалось для разработки интегрированных междисциплинарных программ, чтобы претворить в жизнь планы первых. Выполнение этого важнейшего требования для беспрепятственного распространения научных открытий было реализовано на Саммите по борьбе с туберкулезом в 2016 году в Лондоне, Соединенное Королевство.В этом отчете критически обсуждаются недавние достижения в диагностике и лечении, а также освещаются основные препятствия в борьбе с этим заболеванием, которые обсуждались в ходе трехдневного международного мероприятия. Конференции и симпозиумы, подобные этим, являются питательной средой для успешного местного и глобального сотрудничества, и поэтому их необходимо поддерживать для расширения понимания и распространения фундаментальных научных исследований.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антибиотиков, открытие лекарств, лекарственная устойчивость, тестирование лекарственной чувствительности, туберкулез

Введение

Для болезни, которую следует в значительной степени контролировать, туберкулез (ТБ) по-прежнему требует более 1.5 миллионов жизней ежегодно, из них 140 000 детей. 1 Среди множества факторов, способствующих успеху заболевания, можно выделить стойкую природу возбудителя Mycobacterium tuberculosis и растущую лекарственную устойчивость, приобретенную им в результате десятилетий лечения с использованием фиксированного режима приема лекарств. Длительные диагностические процедуры, неправильные диагнозы с последующим неправильным назначением лечения позволяют устойчивым штаммам распространяться внутри и за пределами сообществ.Это еще более усложняется, поскольку туберкулез в основном ассоциируется со странами с ограниченными ресурсами, которые имеют высокую плотность населения, где программы отслеживания контактов скомпрометированы из-за отсутствия инфраструктуры. 2 Однако безрадостная обстановка вызвала потребность в инновационных, быстрых и точных диагностических тестах, основанных на молекулярных методах, таких как GeneXpert® MTB / RIF, которые широко используются во всем мире. 3 Эти технологии требуют дальнейшего развития, чтобы соответствовать потребностям времени в бедных районах с низкой инфраструктурной поддержкой.Для эффективного контроля над заболеванием успехи в диагностике должны отражаться появлением эффективных терапевтических средств для лечения инфекции.

Открытие противомикробных препаратов часто рассматривается как «предприятие с высоким риском и низкой отдачей». И этот сектор игнорировался фармацевтическими компаниями и одновременно игнорировался политикой общественного здравоохранения. Это привело к критической нехватке новых лекарственных препаратов в клинических испытаниях. Поскольку в настоящее время ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) обнаружен в 105 странах, FDA США предоставило ускоренные варианты разработки противотуберкулезных препаратов. 1 Примерно через полвека отсутствия новых лекарств для лечения пациенты с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наконец, имеют возможность, хотя и в соответствии со строгими правилами, получать для лечения бедаквилин или деламанид. 4,5

Государственные расходы на лечение ТБ в большинстве случаев колеблются в пределах 100-500 долларов США, увеличиваясь до 10 000 долларов США в случае пациентов с МЛУ ТБ. 1 Прогнозируется, что рост устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) обойдется мировой экономике от ≤2,1 трлн. До более ≤100 трлн. В 2050 году, в зависимости от предпринятых вмешательств и их эффективности. 6 Это бремя было бы прямым результатом прогнозируемой ежегодной потери 10 миллионов жизней в наиболее продуктивные годы, если бы УПП распространялся бесконтрольно. На туберкулез приходится большая часть бремени, вызванного УПП. Кроме того, воздействие туберкулеза на животноводство имеет серьезные последствия, поскольку отсутствуют вакцины или практические, экономически эффективные средства лечения инфицированных животных. В некоторых частях Уэльса в Соединенном Королевстве сообщается о стремительном росте количества забитого крупного рогатого скота из-за туберкулеза крупного рогатого скота. 7 Эти выбраковки создали непреднамеренную нагрузку на животноводческую отрасль и местные органы власти.

В сегодняшнем глобальном мире и экономике объединение усилий, начиная со студента, сидящего на скамейке, должно пройти до цепочки поставок, которая в конечном итоге приводит к получению готового диагностического или терапевтического продукта, используемого в пункте оказания медицинской помощи или у постели пациента. Ученым необходимо понимать основные реалии и трудности, с которыми сталкиваются медицинские работники, чтобы предлагать эффективные решения и стратегии.Точно так же врачей необходимо информировать о последних достижениях в области фундаментальных научных исследований, чтобы быстрее создавать механизмы обратной связи, которые могут выявить области, в которых существует острая необходимость в развитии. Поэтому очень важно установить каналы связи между этими разнородными людьми, объединенными своими усилиями по борьбе с туберкулезом.

TB Summit 2016, третье мероприятие подобного рода, организованное Euroscicon, было достойно проведено в Северном Гринвиче, Лондон (Великобритания), поскольку это один из районов Лондона с самой высокой заболеваемостью туберкулезом. 8-10 В трехдневном мероприятии приняли участие представители университетов и государственных учреждений со всего мира. Информативная устная презентация и стендовые сессии были разделены на категории для систематического обсуждения различных аспектов туберкулеза, что более подробно обсуждается в следующих разделах отчета.

Туберкулез: заболевание, возбудитель и хозяин

Изучение распространения туберкулеза

Туберкулез в его наиболее распространенной форме представляет собой воздушно-капельное заболевание, которое поражает ткани легких и находится в макрофагах и других фагоцитарных иммунных клетках гостья.Иммунные ответы хозяина служат для изоляции организма в отделах, известных как гранулема. 11 Эти гранулемы в дальнейшем созревают с образованием некротических поражений, которые, наконец, разрушаются механическим сдвигом и выбрасываются в воздух в результате кашля или разговора инфицированного человека. 12 Хотя воздушно-капельный путь передачи широко распространен, необходимо провести адекватное расследование различных стадий заболевания, а именно: изгнание бактерий, передача через воздух, вдыхание и инфицирование нового хозяина.

Кашель считается важным фактором передачи туберкулеза, поскольку он является распространенным симптомом туберкулеза легких. Поскольку M. tuberculosis заключен в полости легких в толстые биопленки, требуется большое усилие, чтобы выбросить бациллы в дыхательные пути и наружу. При кашле выделяется больше капель, чем при других маневрах, таких как разговор или пение, поскольку в первом акте задействована более высокая сила и, таким образом, считается, что это основной фактор, участвующий в механизме передачи. 13,14 Несколько исследований, изучающих характер кашля и передачу инфекции в домашних условиях, показали, что пациенты кашляют чаще днем, чем ночью, и что частота кашля является важным показателем передачи. 15,16 Как отмечает Ричард Тернер (Фонд NHS Foundation Trust, Великобритания), кашель в контексте заразности туберкулеза не изучался. Причина кашля у больного туберкулезом; его необходимость в передаче туберкулеза, корреляция с инфекционными / неинфекционными штаммами патогена и характеристики оптимальных капель от кашля для передачи заболевания еще предстоит полностью понять. Такие факторы, как анатомия дыхательных путей, количество, состав и вязкость мокроты, были упущены из виду, и необходимо разработать методики их исследования.

Изучение моделей передачи туберкулеза может помочь разработать эффективные стратегии вмешательства для борьбы с болезнью. Исчерпывающие исследования по отслеживанию передачи должны быть способны обнаруживать или исключать передачу между случаями, отслеживать последовательное приобретение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) вдоль цепочки передачи и дифференцировать первичный и приобретенный фенотипы устойчивости с учетом разнообразия хозяев. Однако инфекции ТБ печально известны своей неоднородностью в пределах одного и того же хозяина, поскольку длительный период инфицирования позволяет микроэволюции бацилл в течение одного цикла заражения. 17 С другой стороны, патоген имеет низкую скорость репликации и склонность к низкому генетическому разнообразию. Таким образом, бациллы могут либо не демонстрировать генетического разнообразия, либо иметь несколько SNP между контактами, что чрезвычайно затрудняет отслеживание передачи, используя только их генную последовательность. Кэролайн Колин (Имперский колледж Лондона, Великобритания) предлагает объединить датированные филогенетические деревья со статистическим моделированием, чтобы выявить вероятность дерева передачи с использованием моделирования цепи Маркова Монте-Карло / методов байесовского вывода. 18 Однако использование статистических методов для вывода о передаче туберкулезных микобактерий требует вычислительно-интенсивных методов вывода, которые страдают от ограничений доступных данных и предположений, сделанных для построения моделей, как указано в Ярно Линтусаари (Университет Аалто, Финляндия) . 19 Сложность процесса затрудняет получение надежных выводов на основе статистических моделей динамики передачи.

Альберт Ниенхаус (Университетский медицинский центр, Германия), Джеймс Седдон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) и Роберт Уилкинсон (Кейптаунский университет, Южная Америка) обсудили препятствия на пути контроля передачи среди различных групп лица высокого риска — медицинские работники, дети и пациенты с ВИЧ.

Говоря о профессиональном приобретении болезней, профессор Ниенхаус заявил, что туберкулез является одним из наиболее инфекционных заболеваний, поражающих медицинских работников (МР) в Германии. 20 Ситуация хуже в таких странах, как Португалия и Франция, где уровень заболеваемости определенно выше — 33% и 19% по сравнению с 10% в Германии. 21,22

Медицинские работники, особенно врачи и медсестры, подвергаются более высокому риску заражения активной и латентной инфекцией ТБ (ЛТИ) из-за продолжительных и частых контактов с инфицированными пациентами.Напротив, в этой группе уровень передачи контактов контактам ниже, чем в других группах инфицированных людей в результате частых проверок состояния здоровья. 23 После тщательного изучения данных скрининга 32 практикующих врачей профессор Ниенхаус рекомендовал ежегодный скрининг медицинских работников из группы высокого риска из-за контакта с высокоинфекционными пациентами. Однако в руководствах по скринингу, выпущенных системами общественного здравоохранения разных стран, предлагается разнообразная комбинация рентгеновских лучей, туберкулиновой кожной пробы (ТКП) и тестов высвобождения гамма-интерферона (IGRA) без единого мнения о наилучшей стратегии. 24,25 Он предположил, что в обстоятельствах, когда IGRA положительный, а рентгеновский отрицательный, LTBI может быть подтвержден и сопровождаться профилактическими мерами, если считается, что риск отказа от лечения выше, чем риск, связанный с его назначением. Обнадеживает, что выявление ЛТИ у медработников растет с годами по мере совершенствования диагностических технологий, и ожидается, что исследования динамики риска и вознаграждения лечения позволят разработать единое глобальное решение.

Еще одна группа с высоким риском заражения этим заболеванием, главным образом из-за их связи с инфицированными взрослыми, — это дети. Несмотря на то, что у детей зарегистрирован один миллион случаев туберкулеза, очень мало делается для понимания патогенеза и доступных для них вариантов лечения. Д-р Седдон работает над улучшением нашего понимания вариантов лечения и профилактики МЛУ-ТБ у детей. 26 ТБ у детей и младенцев трудно диагностировать, так как затруднен сбор мокроты.Еще больше усложняет ситуацию то, что заболевание проявляется в нескольких формах, включая инфекцию внутри- или внегрудных лимфатических узлов. 27 Следовательно, лечение необходимо подбирать в соответствии с потребностями и состоянием здоровья ребенка. Хотя исследования показывают, что почти все дети, которым поставлен диагноз, завершают курс лечения и имеют очень хорошие результаты, схемы лечения МЛУ-ТБ у детей требуют пересмотра, поскольку фармакокинетика и токсичность лекарств у детей значительно отличаются от таковых у взрослых. 28,29 Схема лечения лекарственно-чувствительного туберкулеза у детей представляет собой стандартную 6-месячную комбинированную терапию, при которой в течение первых 2 месяцев назначают рифампицин, изониазид и пиразинамид, а затем 4 месяца — рифампицин и изониазид. 30 Детям, страдающим ВИЧ и туберкулезом, рекомендуется дополнительный прием этамбутола в первые 2 месяца. Будущие испытания для оценки стратегий профилактики туберкулеза включают TB-CHAMP для оценки левофлоксацина у детей до 5 лет и ACTG A5300 для оценки левофлоксацина и изониазида у взрослых и детей, а также ряд других. 26,31 По мере того, как новые и перепрофилированные лекарственные препараты входят в терапевтические схемы, оценка их фармакокинетических свойств у детей остается важной.

Профессор Уилкинсон и его команда изучают связь между туберкулезом и ВИЧ в Хайелитше, Южная Африка. Хайелитша — бедный городок, в котором распространенность туберкулеза является одной из самых высоких в мире. Сообщается, что распространенность дородовой ВИЧ-инфекции составляет 25% от общей численности населения, при этом почти 40% имеют риск развития активного туберкулеза. 32 Кроме того, 76% случаев туберкулеза также являются ВИЧ-инфицированными. 32 Команда провела рандомизированное контролируемое испытание только антиретровирусной терапии (АРТ) и профилактической терапии изониазидом (ПЛИ) в сочетании с АРТ (АРТ) для профилактики ВИЧ-ассоциированного ТБ. Результаты показали, что изониазид, добавленный к противовирусной терапии, снижает риск туберкулеза на 35%, как это наблюдалось после года терапии IPT. 33 Он также подсчитал, что люди, инфицированные ВИЧ, имеют примерно в 30 раз больше риска заражения активным туберкулезом из-за иммуносупрессии, а в условиях очень высокой заболеваемости повторное инфицирование встречается чаще, чем эндогенная реактивация болезни. 34

Mycobacterium tuberculosis: более пристальный взгляд

Род Mycobacterium претерпел несколько событий видообразования и генетического распада, что привело к появлению множества непатогенных и патогенных видов с различной специфичностью к хозяину. В отличие от других бактерий, виды микобактерий не участвуют в горизонтальном переносе генов, поэтому эволюция происходит постепенно, за счет небольших генетических изменений, регулируемых естественным отбором или связанных с эволюцией человека и его палеомиграцией.Ход этих генетических дрейфов привел к тому, что M. tuberculosis превратились в облигатный патоген со специфичностью к хозяину, ограничиваемой в первую очередь людьми. 35 Frédéric Veyrier (INRS-Institut Armand-Frappier, Канада) использовал технологии секвенирования генов для выявления факторов, которые делают M. tuberculosis специфичным для человека. Были опробованы два подхода: (а) «бесцельный» метод, который включал секвенирование следующего поколения (NGS) и инструмент исследования микобактериальных гомологов (mycoHIT), и (б) «сфокусированный» подход, который ограничивался интересующими локусами.Их главный интерес заключался в исследовании генетических мутаций, которые отбираются в процессе эволюции, чтобы стать облигатным патогеном. 35

Секвенирование всего генома может помочь различить быстро и медленно растущие микобактерии. Эти исследования показали, что M. kansasii может быть потенциальным кандидатом для моделирования образа предков M. tuberculosis , представляющего собой вид окружающей среды, который может вызывать туберкулезное заболевание, которое не может передаваться. 36 Генетический анализ выявил взрыв токсин-антитоксиновых модулей в M.tuberculosis после видообразования, в основном за счет дупликации генов. Еще одна специфическая адаптация — анаэробное дыхание. 37,38 Генетические события предков могут объяснить последовательную эволюцию патогена, и текущая функциональная характеристика этих событий может быть реконструирована в M. kansasii или M. marinum .

Переходя от подсказок в генетическом коде к системе передачи сообщений, Эрик Галбурт (Школа медицины Вашингтонского университета, США) обсудил кинетику и энергетику инициации транскрипции у микобактерий.Хотя это фундаментальный биологический процесс, который является общим для бактерий и сохраняется в них; Скорости транскрипции сильно различаются между E. coli и видами микобактерий из-за различий в стабильности промежуточных комплексов, образующихся в этом процессе. Следовательно, важно изучать центральные процессы в самом патогене, а не наследовать информацию от других модельных организмов. Основные факторы инициации транскрипции CarD (Rv3583c) и RbpA (Rv2050) играют важную роль в биологии M.Туберкулез . 39-42 Инициирование требует образования холофермента РНК-полимеразы (РНКП) со связанными сигма-факторами. Серия кинетических шагов приводит к образованию замкнутого комплекса, ведущего к открытому комплексу с пузырем транскрипции. Факторы инициации расположены рядом с верхним краем пузыря транскрипции. 43,44 Такие методы, как флуоресцентное мечение, были использованы для изучения открытого комплекса с использованием M. bovis RNAP, который, как известно, образует открытые комплексы, которые являются более нестабильными по сравнению с E.coli RNAP. Было обнаружено, что факторы инициации действуют независимо и кооперативно, регулируя транскрипцию, и что только в присутствии обоих факторов кинетика транскрипции у микобактерий, по-видимому, подобна той, которая наблюдается у E. coli . 45,46 Поскольку известно, что оба фактора играют важную роль в патогенезе, глобальных уровнях экспрессии рРНК / генов и устойчивости к стрессу и антибиотикам, они могут служить хорошими мишенями для разработки лекарств.

Основная проблема в разработке эффективных лекарств и схем лечения против M.tuberculosis — это гетерогенность инфицированной популяции бацилл, которая включает активно реплицирующиеся и спящие клетки, известные как персистеры. Клетки-персистеры находятся в состоянии покоя, обладают высокой толерантностью к антибиотикам и другим внешним воздействиям и при благоприятных условиях могут вернуться в состояние активного деления. 47 Обнаружение этих клеток практически невозможно, поскольку обычные микробиологические методы культивирования не могут их идентифицировать. Эти клетки могут быть сгенерированы in vitro, , при длительной стационарной фазе культивирования или постепенном подкислении культуральной среды.Затем они могут быть возвращены к их активно воспроизводящейся физиологии путем воздействия факторов, способствующих реанимации (Rpfs), которые также известны как Rpf-зависимые клетки. 48

Rpfs представляют собой секретируемые или связанные с клеточной стенкой ферменты, продуцируемые активно делящимися микобактериями. Они структурно и функционально подобны лизоцимам и необходимы для оживления спящих клеток. 49 В M. tuberculosis имеется 5 Rpf, и было обнаружено, что они важны для персистенции и реактивации инфекции у мышей.RpfA, B и E секретируются и обнаруживаются в фильтратах культур, тогда как RpfC связывается с клетками. 50 RpfD активируется во время инфекции. После оживления Rpf-зависимые клетки теряют эту характерную зависимость во время пассажей in vitro и пассажей.

Rpf-зависимые микобактерии очень важны в клиническом аспекте. 48 Эти клетки очень распространены в мокроте и образцах внелегочного туберкулеза, их относительные пропорции колеблются от 0 до 99,99% от общего количества M.туберкулез населения. Джайшри Гархиан (Университет Джавахарлала Неру, Индия) сообщил, что костный мозг является нишей для персистеров, поскольку мезенхимальные стволовые клетки выживают в течение длительного периода времени и находятся в среде с подавленным иммунитетом. 51,52 Кроме того, у стволовых клеток есть клетки активного выхода лекарства, обеспечивающие вторую стену защиты для патогена. Их работа показывает, что M. tuberculosis захватывают мезенхимальные стволовые клетки, перепрограммируют их с помощью фактора, индуцируемого гипоксией (Hif-1), и воздействуя на этот путь, могут усилить стандартные схемы лечения.

Rpf-зависимые клетки по своей природе более устойчивы к нескольким лекарствам, таким как рифампицин, изониазид и стрептомицин. 53 Поскольку избавиться от Rpf-зависимых микобактерий труднее, они оказываются более богатыми у пролеченных больных туберкулезом. Поскольку персистеры часто являются причиной неудач лечения и рецидивов после лечения, важно, чтобы оценка схем лечения ТБ учитывала элиминацию / индукцию этой группы клеток. 54 Янминь Ху (Лондонский университет Св. Георгия, Великобритания) считает, что невидимые персистеры представляют собой многообещающую терапевтическую мишень, и более короткие схемы химиотерапии, такие как испытанная с фторхинолонами, могут быть успешными только в том случае, если они эффективны в уничтожении этого подмножества патогенная популяция.В условиях in vitro ее группа заметила, что для уничтожения стационарных культур M. tuberculosis требуются высокие дозы рифампицина. 47 Это происходит главным образом из-за Rpf-зависимых бацилл, которые обладают высокой толерантностью к препарату и, по-видимому, уменьшаются с увеличением концентрации рифампицина, но не могут быть полностью уничтожены. 47 Когда они инкубировали инфицированные ткани легких мышей (2 недели инфицирования) с культуральным фильтратом, содержащим Rpfs, клетки-персистеры могли оживать даже после введения мышам высоких доз рифампицина.Они использовали модель Корнелла для изучения эффективности и частоты рецидивов различных схем лечения лекарствами, при которых инфекции позволяли развиваться в течение 3 недель, а затем лечили комбинациями лекарств в течение 14 недель. В конце периода лечения мышам давали гидрокортизон для подавления иммунной системы для изучения частоты рецидивов. Как отмечалось в более ранней модели, наблюдалось дозозависимое уничтожение бактерий. Также было отмечено, что более высокие дозы рифампицина могут сократить время лечения, однако небольшая подгруппа Rpf-зависимых бацилл все еще сохраняется в тканях хозяина.

Галина Мукамолова (Университет Лестера, Великобритания) представила концепцию лекарственно-индуцированной Rpf-зависимости у M. tuberculosis . Было показано, что лечение рифампицином, изониазидом и этамбутолом вызывает Rpf-зависимость, тогда как в случае лечения стрептомицином и амикацином такого эффекта не наблюдалось. 53 Таким образом, очень важно, чтобы лекарства были проверены на их склонность вызывать Rpf-зависимость. С этой целью Мукамолова и его коллеги стремились разработать простой тест для определения способности лекарств вызывать Rpf-зависимость.Rpf-зависимые микобактерии могут образовываться во время инфицирования мышей. Однако эти модели трудно обрабатывать в условиях высокой производительности. Чтобы адаптировать это к условиям in vitro , группа Мукамоловой синтезировала новые доноры оксида азота, которые могли индуцировать персистирующий фенотип в клетках M. bovis . Таким образом, эти in vitro системы могут быть использованы для валидации новых лекарств и поиска биомаркеров, зависимых от Rpf.

Еще одна модель стойкости, использующая модули токсин-антитоксин (ТА), обнаруженные в M.tuberculosis , обсуждалась Шалин Корч (Университет Среднего Запада, США). Из 88 предполагаемых выявленных модулей ТА около 30 были назначены функции. 55 Обычно это опероны с двумя генами, один из которых кодирует токсичный белок, а другой — антитоксин, который связывается с токсином и ингибирует его. 56 Регуляция этих модулей контролируется в основном за счет авторепрессии транскрипции оперона антитоксином. Однако при воздействии стрессов, возникающих во время заражения, активируется определенная часть этих модулей.Учитывая, что у E. coli эти системы, как известно, участвуют в образовании персистеров, их роль в контроле скорости деления M. tuberculosis во время инфекции требует дальнейшего изучения. 57 Корч решил сосредоточиться на системе RelBE, которая ингибирует трансляцию посредством расщепления мРНК. 58,59 Путем создания штаммов, которые сверхэкспрессируют токсины с последующим спасением от антитоксина, они продемонстрировали фенотип персистенции, при котором наблюдали только 20% от общей трансляции. 60 Эта модель позволит провести дальнейшее исследование стадий персистентности, а именно входа, обслуживания и выхода.

Ответы хозяина на M. tuberculosis

Макрофаги являются стражем врожденной иммунной системы. После того, как M. tuberculosis попадает в дыхательные пути подходящего хозяина, он сталкивается с фагоцитарными клетками и преимущественно вторгается в альвеолярные макрофаги и моноциты. После заражения эти макрофаги высвобождают множество цитокинов, которые привлекают несколько иммунологически активных клеток, таких как Т-клетки, которые выделяют интерферон-γ (IFNγ), который в сочетании с фактором некроза опухоли-α (TNFα) активирует макрофаги для устранения патогена. 61 Марцин Влодарчик (Лодзинский университет, Польша) интересуется профилем цитокиновых ответов, управляемых микобактериальными антигенами, и экспрессией рецепторов передачи сигнала при ТБ. Для исследования были выбраны двести восемнадцать пациентов, вакцинированных БЦЖ и инфицированных ВИЧ / ТБ. Основная цель исследования заключалась в оценке продукции IFNγ, TNFα, интерлейкинов и экспрессии на клеточной поверхности рецепторов, таких как TLR2, LFA-1, CD14, а также растворимого аналога CD14 между пациентами и здоровыми добровольцами.Они сообщают, что наблюдают количественные, а не качественные изменения в уровнях экспрессии изучаемых цитокинов, когда сыворотка инфицированных людей заражается микобактериальными антигенами. Также было обнаружено, что у больных туберкулезом значительно более высокая частота встречаемости моноцитов с рецепторами CD14, TLR2 и LFA-1. 62

Другой член семейства Toll-подобных рецепторов, RP105 (CD180), исследуется группой Antje Blumenthal (Институт Диамантина Университета Квинсленда, Австралия).RP-105 в основном экспрессируется макрофагами и моноцитами. У него короткий цитоплазматический хвост, и было высказано предположение, что он не может передавать сигналы напрямую без партнера по передаче сигналов. CD180 Уровни экспрессии мРНК выше в цельной крови у вылеченных больных туберкулезом по сравнению с теми, у которых наблюдается рецидив. 63 Было также показано, что мыши с дефицитом RP105 более восприимчивы к туберкулезу, а макрофаги с дефицитом RP105 продуцируют значительно меньшее количество воспалительных цитокинов, чем их аналоги дикого типа. 64 Однако ни мРНК, ни экспрессия белков воспалительных цитокинов, таких как TNF, не были затронуты в макрофагах мутантов с дефицитом RP105. 64 Благодаря своей работе группа Blumenthal продемонстрировала, что активация макрофагов, опосредованная RP105, отличается от передачи сигналов классического Toll-подобного рецептора (TLR), где RP105 направляет трафик цитокинов. 65,66 Этот новый сигнальный путь врожденного иммунитета включает RP105, BTK и субъединицу p110δ фосфоинозитид-3-киназы.

Другое семейство малых белков, трансмембранных белков, индуцированных интерфероном (IFITM), и их роль в ограничении инфекции M. tuberculosis было представлено Шахином Ранджбаром (Гарвардская медицинская школа, США). 67 TLR2 и 4 и MyD88-зависимые сигнальные пути участвуют в индукции белков IFITM 1, 2 и 3. Их работа показала, что уровни экспрессии белков IFITM напрямую коррелируют со скоростью роста M. tuberculosis в THP. -1 ячейка.Было замечено, что IFITM3 совместно локализуется с микобактериальными клетками в альвеолярных эпителиальных клетках, а сверхэкспрессия белка усиливает закисление эндосом, тем самым ограничивая инфекцию. 67

Перейдя от рецепторов к сигнальным молекулам, Мария Регина Д’Империо Лима (Университет Сан-Паулу, Бразилия) рассказала о роли пуринов, особенно внеклеточного АТФ (eATP), в иммунном ответе на тяжелый туберкулез. . Гипервирулентные штаммы микобактерий проявляют разную степень патогенности.Тяжесть заболевания часто связана с подавлением выработки эффекторных цитокинов.

eATP и продукт его распада аденозин, как известно, действуют как хемотаксические сигналы, приводящие к усиленной миграции нейтрофилов и макрофагов к месту воспаления. 68,69 eATP, как известно, активирует несколько рецепторов, которые, в свою очередь, вызывают гибель клеток из-за некроза, образования ионных каналов или пироптоза. 70 Эти механизмы обеспечивают высвобождение бактерий из фагоцитарных клеток, и было замечено, что туберкулез, вызванный гипервирулентными микобактериями, ослабляется у мышей, у которых отсутствует рецептор P2X7, и наблюдается снижение распространения болезни. 71 Клетки дикого типа с активным P2X7 погибают от некроза, который способствует высвобождению гипервирулентных микобактерий. 71 Гистологические анализы также выявили меньшее повреждение, вызванное воспалением, у мышей с нокаутом, таким образом демонстрируя, что передача сигналов P2X7 вносит вклад в патологию в модели тяжелой инфекции. Группа также отметила, что специфические клетки CD4 в паренхиме легких мышей, инфицированных вирулентными штаммами микобактерий, подавлены.

Аннемари Х.Meijer (Лейденский университет, Нидерланды) использует однодневные эмбрионы рыбок данио, инфицированные M. marinum , близким родственником M. tuberculosis , для изучения механизмов защиты хозяина на ранних стадиях инфекции. Преимущество изучения этих организмов состоит в том, что они оптически прозрачны, а агрегаты клеток и их распространение можно легко проследить. Молодые эмбрионы не обладают адаптивным иммунитетом, а самые ранние иммунные клетки — это макрофаги и нейтрофилы. Через несколько минут после заражения бактерии фагоцитируются.Инфицированные клетки привлекают новые макрофаги, в результате чего образуются гранулематозные агрегаты. Гранулема защищает патоген от дальнейшего иммунологического вмешательства и тем самым дает ему большое преимущество. 72 Стабильная секреция патогеном раннего секреторного антигена-6 (ESAT-6) обеспечивает сохранение и рост гранулем. Это согласуется с открытием, что мутанты с дефицитом ESAT-6 могут поддерживать только небольшие гранулемы. Профессор Мейер и ее группа сосредотачиваются на сети хемокинов, которая облегчает миграцию макрофагов с образованием гранулемы.

У рыбок данио с мутированным рецептором CXCR3 случайная подвижность макрофагов снижена. 73 Этот дефект подвижности коррелирует с уменьшением количества и размера гранулемы, что приводит к уменьшению общего бремени инфекции. Ингибирование рецептора CXCR3 показало уменьшение образования гранулем, а предыдущие исследования показали, что мыши с дефицитом CXCR3 проявляют повышенную устойчивость к инфекции. 73 Следовательно, нацеливание на формирование гранулемы с помощью иммуномодулирующих препаратов может помочь разработать стратегии, ориентированные на хозяина, которые могут работать синергетически с химиотерапией и снижать риск возникновения новой резистентности.

Используя рыбок данио в качестве доклинической модели, они испробовали несколько методов, чтобы (а) ингибировать рост гранулемы (б) обратить ингибирование слияния фаголизосом и (в) стимулировать антимикобактериальную аутофагию и аутофагический отток. 74 Аутофагия — это система иммунологической защиты, и многочисленные исследования in vitro показывают, что ингибирование аутофагии способствует росту M. tuberculosis в тканях хозяина.

Модулятор аутофагии, связанный с повреждением ДНК 1 (DRAM1), активируется во время M.marinum , зависящая от пути распознавания патогенов TLF / MyD88. 75 При сверхэкспрессии драм1 у личинок рыб развиваются более низкие уровни инфекции и более мелкие гранулемы.

Ранняя диагностика: ключ к борьбе с туберкулезом?

Из 9,6 миллиона предполагаемых случаев во всем мире в 2014 году только 6 миллионов были зарегистрированы через национальные центры эпиднадзора. Считается, что большинство из 3 миллионов недиагностированных случаев происходит из регионов со слабым медицинским обслуживанием.В основном это происходит из-за неполной отчетности и неполной диагностики. Занижение отчетности происходит, когда диагностика и лечение проводятся в частном секторе, который не связан с национализированными схемами. Во-вторых, педиатрические службы часто плохо связаны с национальными противотуберкулезными службами, и у детей часто не диагностируется туберкулез, поскольку выявление туберкулеза в таких случаях особенно сложно. Плохой доступ к медицинскому обслуживанию в странах с низким уровнем дохода является основной причиной неполного диагноза, и многие пациенты теряются для последующего наблюдения.Большинство медицинских центров проводят пассивное выявление случаев, тогда как Луис Э. Куэвас (Ливерпульская школа тропической медицины, Великобритания) считает, что более активный подход, включающий аутрич-услуги, может улучшить ситуацию. Он сравнил 2 тематических исследования активного выявления случаев; один из них был проведен в Эфиопии, где действует активная программа расширения здравоохранения, а другой — в Нигерии, которая прекратила свою программу расширения здравоохранения несколько десятилетий назад. Исследование проводилось в трущобах вокруг Абуджи в Нигерии.С помощью вышедших на пенсию медицинских работников (HEW) и с использованием таких ресурсов, как данные переписи по ликвидации полиомиелита, были проведены посещения по дому для сбора 2 образцов мокроты с интервалом в 40 минут. О результатах сообщили дома у человека или по телефону. Уровень выявления случаев был удвоен благодаря усилиям по увеличению количества диагнозов для женщин и пожилого населения. 76

Эфиопия имеет хорошо организованную программу распространения медицинских услуг. В ходе исследования HEW получали базовые медицинские пакеты, которые доставлялись им на дому каждые 14 дней.Основная цель упражнения заключалась в улучшении результатов лечения и выявления случаев туберкулеза. Медицинские работники были обучены выявлению случаев заболевания, сбору мокроты и приготовлению мазков, которые затем сдавали в местные лаборатории. Как только результаты подтвердят наличие туберкулезной инфекции, куратор начнет лечение на дому, и будут проверены домашние контактные лица. По сравнению с предыдущим годом выявление случаев ТБ увеличилось как минимум в 2 раза, что наглядно демонстрирует улучшения в выявлении случаев ТБ при использовании активного подхода к выявлению случаев. 77,78 Эндрю Кертис (Государственный университет Кента, США) также поддержал этот подход, он обсудил использование пространственных видеозаписей с видеокамеры и географических повествований для отслеживания активных контактов бездомных и потребителей наркотиков, которые подвержены высокому риску заражения этим заболеванием в развитых странах.

Микроскопия мазка мокроты остается основой классических диагностических тестов, используемых в странах с низким и средним уровнем дохода с высоким бременем туберкулеза. 79 Этот метод прост в исполнении, дешев и быстр, но его использование ограничено из-за низкой чувствительности и специфичности, особенно в педиатрических случаях, у пациентов с ВИЧ и пациентов с низкой бактериальной нагрузкой в ​​мокроте. 80 Для получения результатов с помощью методов жидких и твердых культур может потребоваться до 3 недель, после чего отслеживание пациентов может стать затруднительным, что приведет к тому, что инфицированные ТБ люди не получат лечения, а распространение болезни в своих общинах и домохозяйствах еще больше усугубит ситуацию.

В попытке разработать неинвазивную диагностическую стратегию туберкулеза с использованием образцов дыхания, Thu-Hoa Tran-Thi (Centre National de la Recherche Scientifique, Франция) обсудил потенциал летучих метаболитов M.tuberculosis в качестве биомаркеров болезни. 81,82 Никотиновая кислота (NA), метилфенилацетат (MPA), метил-п-анизат (p-MA), метилникотинат (MN) и о-фениланизол — это 5 летучих соединений, которые были идентифицированы из культур M. tuberculosis выращено in vitro . 82 NA может быть обнаружена в дыхании больных активной формой туберкулеза, хотя присутствует в небольших количествах. Также было обнаружено, что он является многообещающим индикатором штаммов M. tuberculosis , устойчивых к пиразинамиду.Доктор Тран-Тхи и группа исследовали метод обнаружения НА в сложных растворах с различными метаболитами, а также в биологических средах. Были разработаны люминесцентные методы обнаружения NA с использованием тербия III (Tb 3+ ) в качестве зонда благодаря его способности люминесцировать при передаче энергии от NA к иону Tb 3+ . 83 Потенциальное вмешательство других метаболитов, таких как MPA, p-MA и MN, которые имеют такие же длины волн возбуждения, что и NA в образцах, было идентифицировано как проблема.Конденсат выдыхаемого воздуха был признан лучшим образцом, поскольку он меньше мешает по сравнению с образцами слюны и мочи. Стоимость этого диагностического процесса оценивается ниже, чем одобренный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) молекулярный диагностический тест GeneXpert® MTB / RIF, что делает его разработку приоритетной для последующего использования в развивающихся странах.

Биомаркеры крови также можно использовать в диагностических тестах для выявления туберкулеза в эндемичных районах. В целом множество антител, специфичных к различным антигенным эпитопам, обнаруженным в M.tuberculosis у больных туберкулезом, методы выявления на основе профиля отдельных антител, скорее всего, не сработают. Имран Хан (Калифорнийский университет, США) изучил возможность использования мультиплексной серологической панели для диагностики туберкулеза. 84 В этом тесте используется панель из 28 микрогранул M. tuberculosis , покрытых антигеном, что позволяет универсально идентифицировать профили антител у пациентов с помощью одного теста. Используя тот же метод, доктор Хан исследовал 10 цитокинов / хемокинов / факторов роста в плазме и 8 антител против 8 M.tuberculosis биомаркеров антигенов, которые повышены у больных туберкулезом. Интересно, что они обнаружили, что уровни профиля антител среди больных туберкулезом зависят от пола и связаны с успехом лечения. 85 Иммунобиомаркеры при туберкулезе важны для понимания реакции хозяина на патоген, и эта область может быть дополнительно изучена для разработки диагностики и лечения туберкулеза.

Геномика, протеомика и транскриптомика — это подходы, которые широко использовались для характеристики M.Туберкулез . Недавно метаболомика, новый подход, была дополнена революцией «омиков», чтобы обеспечить более полное понимание сложных внутренних систем патогена. 86,87 Metabolomics исследует все внутри- и внеклеточные метаболиты (низкомолекулярные промежуточные соединения и продукты) в биологическом образце с использованием высокоспециализированных аналитических методов для создания метаболического профиля и измерения любых динамических реакций на стимулы или генетические модификации. 88-90 Du Toit Loots (Северо-Западный университет, Южная Америка) интересуется характеристикой M.tuberculosis с использованием метаболомики и определения его характерных метаболитных сигнатур. Этот подход позволяет идентифицировать различные виды микобактерий с использованием конкретных маркеров метаболитов, хотя известно, что у этих видов есть незначительные генетические вариации, что свидетельствует о чувствительности этого подхода. 86 Профессор Лутс выразил оптимизм по поводу возможности использования маркеров метаболитов для построения диагностических моделей, основанных на систематических подходах в исследованиях метаболомики. 91-93 Это также может помочь в обнаружении связи между туберкулезом и его симптомами; например, повышение уровня адреналина может прогнозировать потерю веса и бессонницу у пациентов.В будущем этот подход может также использоваться для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза и прогноза. 94

Тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) — это молекулярные диагностические подходы, которые были разработаны для повышения чувствительности и специфичности при диагностике ТБ и, что наиболее важно, для выявления инфекций МЛУ-ТБ. GeneXpert® MTB / RIF Ultra был представлен на Саммите по борьбе с туберкулезом в этом году, подчеркнув значительные улучшения по сравнению с его более ранней версией. Элиза Тальяни (Научный институт IRCCS Сан-Раффаэле, Италия) продвигала новый инструмент молекулярной диагностики и приветствовала его как трансформацию усилий по выявлению / ликвидации ТБ.В последнем формате используются картриджи большего размера и дополнительные зонды, выявляющие 4 новые мутации rpoB , IS6110 и IS1081 из M. tuberculosis , что позволяет обнаруживать 30 различных устойчивых к рифампицину мутаций M. tuberculosis rpoB . С помощью этих достижений они надеются повысить чувствительность анализа, близкого к жидкой культуре. 95

Эрик Р. Хаупт (Университет Вирджинии, США) рассказал о карте массива TaqMan (TAC). Это генотипический метод обнаружения мутации патогена, который обеспечивает 2 уровня точного обнаружения мутаций с помощью зондов, специфичных для последовательности, и анализов плавления с высоким разрешением (HRM).Он может обнаруживать мутации в генах, указывающих на устойчивость, таких как rpoB, inhA, embB, gyrA и многие другие. 96 Метод прост в применении, воспроизводим, обладает хорошей чувствительностью и специфичностью. Он может улучшить выявление МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ, а следовательно, повысить уместность и эффективность лечения ТБ.

Многие коммерчески доступные форматы NAAT недоступны в центрах с ограниченными ресурсами из-за высоких затрат, связанных с приборами и расходными материалами.PURE-TB-LAMP, тест TB NAAT, утверждает, что он простой, быстрый, надежный, чувствительный (по сравнению с микроскопией мазка) и доступный (по сравнению с другими платформами NAAT). Yasuyoshi Mori (Eiken Chemical Co., Ltd., Япония) рассказал об этом наборе для скрининговых тестов, в котором используется петлевая изотермическая амплификация (LAMP), которая устраняет необходимость в дорогостоящих термоциклерах или системах обнаружения. 97 Набор состоит из набора для экстракции ДНК Loopamp ™ PURE и набора для обнаружения MTBC Loompamp ™. Три основных технических аспекта теста: (a) амплификация ДНК с помощью LAMP, (b) сверхбыстрая экстракция (PURE) ДНК, которая может удалить ингибиторы теста без значительной потери генетического материала, и (c) простое визуальное обнаружение результат с использованием флуоресценции в ультрафиолетовом свете. 98,99 Станок Loopamp ™ LF-160 не требует обслуживания или калибровки, что делает весь процесс простым и легким в освоении; отказавшись от необходимости в высококвалифицированном персонале. Чувствительность TB LAMP в 100 раз выше, чем при микроскопии мазка мокроты. 100 В настоящее время скрининговый тест одобрен для использования в Японии, Китае, Южной Корее и Таиланде. Анализы его клинических характеристик были представлены в ВОЗ для утверждения использования.

Туберкулез средостения — это форма внелегочного туберкулеза, которая часто встречается у детей, ВИЧ-инфицированных пациентов и взрослых иммигрантов в развитых странах.Число зарегистрированных случаев внелегочного туберкулеза в Великобритании за последнее десятилетие несколько увеличилось, и эта тенденция вызывает беспокойство. 101 Диагностика туберкулезного лимфаденита средостения является сложной задачей из-за его неспецифической клинической картины, нормальных результатов рентгенологического исследования грудной клетки и низкопродуктивного посева мокроты. 102,103 Эти расплывчатые проявления необходимо дифференцировать с другими подобными заболеваниями, такими как лимфома, карцинома и саркоидоз. 102 Онн Мин Кон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) подчеркнул, что нельзя упускать из виду туберкулез средостения, особенно когда у пациентов с подозрением на изолированный лимфаденит средостения проводится нормальный рентген грудной клетки.Последующее сканирование грудной клетки с помощью ПЭТ / КТ является обязательным для подтверждения положительной лимфаденопатии. 104 Взятие пробы ткани лимфатических узлов средостения является обязательным для определения этиологии заболевания, ранее в основном выполнялось с использованием таких методов, как медиастиноскопия шейки матки. Однако этот инвазивный метод связан со значительной заболеваемостью и смертностью, поэтому эндоскопическая трансбронхиальная игольчатая аспирация под контролем УЗИ (EBUS-TBNA), обычно используемая при диагностике рака легких, рекомендуется в качестве минимально инвазивной альтернативы для диагностики туберкулеза средостения. 105-107 Профессор Кон сообщил, что этот широко используемый метод микробиологической диагностики в сочетании с GeneXpert® MTB / RIF может повысить чувствительность и специфичность диагностики туберкулеза средостения, ускорить оценку подозреваемых случаев и обеспечить быстрое обнаружение устойчивых M. tuberculosis штаммы. 108

M. bovis является членом комплекса MTB и не зависит от хозяина. Он может заразить альпак, лам, собак и кошек, а затем передать их владельцам животных.Великобритания не смогла сдержать болезнь, несмотря на ряд радикальных мер, принимаемых для контроля над популяциями естественных резервуаров. Для диагностики инфекции M. bovis требуется три месяца, и это стоит 140 долларов за образец. Дифференциация между M. bovis и M. tuberculosis необходима, поскольку первый по своей природе устойчив к пиразинамиду.

Традиционные подходы к созданию тестов серологического ответа используют либо непатогенные штаммы БЦЖ, либо убитые нагреванием / химически инактивированные патогены.Эти суровые условия повреждают важные конформационные эпитопы клеточной поверхности, которые не представлены или не поддерживаются во время обнаружения. Новый подход, опробованный Линдой Стюарт (Университет Белфаста, Великобритания), заключался в использовании гамма-облученных патогенных штаммов для разработки специфических связывающих веществ M. bovis . 109 Использовали цельноклеточные или экстрагированные этанолом поверхностные антигены и получали как поликлональные, так и моноклональные антитела с использованием технологии фагового дисплея. Результатом этого был набор связывающих веществ, которые были охарактеризованы с помощью ELISA и иммунофлуоресцентного окрашивания.Основная цель их усилий заключалась в разработке диагностического теста, в котором использовались бы связующие вещества для выявления заболеваний, которые могли бы различать инфекции M. bovis и M. tuberculosis , в отличие от коммерчески доступных наборов, имеющихся на рынке в настоящее время.

Густаво Морейра (Технический университет Брауншвейга, Германия) обсудил использование фагового дисплея для идентификации биомаркеров и генерации человеческих антител для диагностики и терапии. Фаговый дисплей антител включает процесс in vitro , который не затрагивает иммунную систему.Процесс начинается со вставки генов антител в геном фага, который затем выражается в виде слитого белка, отображаемого на внешней поверхности фага. Следующий этап называется пэннингом, когда антиген опрашивается созданной библиотекой антител. Идентификация положительно связывающихся антител выполняется с помощью ELISA, иммуноблоттинга или проточной цитометрии. 110

M. tuberculosis секретирует белок, называемый антигеном 85 (Ag85). Были отобраны гены антител из наивной библиотеки и клонированы в дрожжевые системы отображения.Эту комбинацию фагового и дрожжевого дисплеев использовали для получения антител против Ag85. Клоны были проверены на самое высокое связывание антигена, выявив 7 пар антител, которые могут обнаруживать Ag85 при наномолярных концентрациях, однако ни один из клонов не был строго специфичным для одной из субъединиц антигена 85 комплекса. 111 В другом исследовании использовались 5 человеческих антител против Ag85B из исходных библиотек, где 3 из них специфически связывались с белками 85B, как было проверено с помощью ELISA. 112

Мониторинг реакции хозяина на лечение ТБ может определить эффективность лечения и спрогнозировать вероятность рецидива.Текущий метод подтверждения успеха лечения — это конверсия бактериологической культуры через 2 месяца от начала терапии. Бактериальная транскриптомика предлагает новые возможности для изучения элиминации патогена у пациента. Dimitrios Evangelopoulos обсудил молекулярные методы обнаружения снижения бактериальной нагрузки во время лечения как биомаркера прогрессирования инфекции. Метод обнаружения микобактериальной РНК был разработан с использованием искусственного матрикса, напоминающего образцы мокроты, и применен к клиническому случаю у 12-летнего пациента. 113 В этом случае методы окрашивания выявили присутствие кислотоустойчивых бацилл, однако анализы жидких культур не смогли обнаружить никаких живых бацилл. При использовании анализа молекулярной бактериальной нагрузки (MBL) у пациента была выявлена ​​высокая бактериальная нагрузка, и схема лечения была изменена с включением моксифлоксацина. После года лечения ни MBL, ни окрашивание не выявили никаких бацилл, и пациент был подтвержден как излечившийся.

Пилотное исследование на мышах показало, что этот анализ также можно использовать с тканями животных.Анализы MBL и колониеобразующих единиц (КОЕ) в тканях мышей, подвергавшихся разному лечению, показали, что оба анализа согласуются друг с другом, причем первый последовательно обнаруживает большее количество клеток, вероятно, в результате обнаружения некультивируемой клеточной популяции. 113 Таким образом, MBL-анализы могут служить быстрым и чувствительным инструментом диагностики и мониторинга лечения, предлагать понимание эффективности лекарств и могут использоваться при открытии новых лекарств.

Открытие лекарств: преодоление препятствий

Поиск новых терапевтических целей

С момента знаменательного объявления полной последовательности генома M.tuberculosis , была целенаправленная работа по выявлению важных генов и визуализации их белковых продуктов, что позволило начать проекты по созданию целевых лекарств. Том Бланделл (Кембриджский университет, Великобритания) заинтересован в изучении биологического космоса, переходящего от генома к протеому. Традиционные методы влажных лабораторных исследований для понимания протеома патогена должны быть подкреплены подходами системной биологии. С этой целью группа профессора Бланделла работала над Шопеном, который наследует информацию об известных структурах примерно 400 белков и использует ее для прогнозирования моделей для остальных 3500 белковых структур. 114 На основании информации из общедоступных баз данных; взаимодействия, лиганды и олигомерные состояния многих белков могут быть расшифрованы. Затем эту информацию можно использовать для структурно-ориентированных и фрагментарных подходов к открытию лекарств. Обоснованием этой стратегии является использование небольших молекул с беспорядочной аффинностью связывания для исследования субструктур, присутствующих с белками-мишенями, с использованием стандартных биофизических анализов связывания лигандов. Затем удары оптимизируются для получения молекулы, которая связывается с целевым белком в наномолярных концентрациях.Используя этот подход, они успешно разработали ингибиторы против EthR, репрессора транскрипции для белка, активирующего этионамид. 115 Поскольку развитие мутаций является основным препятствием для индустрии разработки противотуберкулезных препаратов, профессор Бланделл также обсудил использование технологий секвенирования второго поколения для разработки основанного на знаниях подхода к пониманию эволюционной динамики. Влияние однонуклеотидных полиморфизмов на стабильность белка, сродство белок-белок / нуклеиновая кислота / лиганд теперь может быть установлено с помощью mCSM, другого полезного инструмента веб-сервиса, разработанного группой. 116

Выявление мишеней для лекарств, которые можно использовать, является важным шагом на пути к рациональному дизайну лекарств. Клеточная стенка микобактерий уникальна для грамположительных и грамотрицательных организмов и является хорошим источником для мишеней противомикобактериальных препаратов, как это обсуждали Санджиб Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) и Дирк Шнаппингер (Вейл Корнелл). Медицинский колледж, США). Он содержит комплекс миколиновой кислоты, арабиногалактана и пептидогликана, образующий ядро ​​клеточной стенки — характерная особенность, которая на протяжении многих лет привлекала внимание нескольких исследователей.

Разрушение миколовой кислоты M. tuberculosis оказалось отличной стратегией для нацеливания на патоген, о чем свидетельствует успех таких лекарств, как изониазид, этамбутол и пиразинамид, все из которых нацелены на синтез миколиновой кислоты. Однако рост устойчивости штаммов M. tuberculosis к этим препаратам усилил потребность в новых мишенях. Биотин является важным кофактором для всех ацил-КоА-карбоксилаз (АССаз), которые играют роль в обеспечении строительных блоков для синтеза компонента жирных кислот в M.tuberculosis клеточная оболочка. Клетки млекопитающих приобретают биотин из внешней среды и, таким образом, лишены этих ферментов, что подтверждает этот путь для разработки по сути селективных противотуберкулезных препаратов. 117 Кроме того, мутанты в пути синтеза биотина могут вызывать только ослабленные формы инфекций у мышей, что позволяет предположить, что патоген не может получить экзогенный биотин. 118 Проф Шнаппингер и его группа обнаружили, что мутация одного из ферментов, BioA (биотинлигаза) в M.tuberculosis сделал его неспособным выжить in vitro, и у мышей, что указывает на то, что синтез биотина de novo имеет решающее значение для выживания и устойчивости патогена. 119 BioA подвержен ингибированию, что подтверждается его ингибированием с использованием антибиотика амикленомицина. 120,121 Однако этот антибиотик слишком полярен и непригоден для использования в рамках длительной схемы лечения туберкулеза. Целенаправленный подход, предпринятый группой профессора Шнаппингера, позволил идентифицировать мощный бисубстратный ингибитор биотиновых протеинлигаз (называемый Bio-AMS) из M.tuberculosis , который действует путем взаимодействия как в карманах связывания биотина, так и АТФ. 122 Этот конкурентный ингибитор оказался очень селективным и сильным против штаммов туберкулеза, что свидетельствует о том, что генетические подходы, способствующие открытию противотуберкулезных препаратов, по-прежнему заслуживают внимания.

Д-р Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) был пионером в исследованиях метаболизма пептидогликана (PG) в M. tuberculosis на протяжении более десяти лет. 123 АТФ-зависимые гены лигазы Mur участвуют в синтезе предшественников PG.Эти гены ограничены бактериями, и было обнаружено, что они необходимы для микобактерий с помощью гибридизации сайта транспозона (TraSH). Структура murE была разрешена до 3Å и показывает доступный активный участок кармана, который можно использовать для создания лекарств. 124,125 Ферментативное ингибирование MurE из M. tuberculosis наблюдали с экстрактами колумбийских растений и химически синтезированными соединениями хинолона, тем самым демонстрируя, что лигазы могут служить мишенями для лекарств. 126-129 Кроме того, поскольку клеточное деление и биогенез клеточной стенки строго контролируются кооперативными процессами, неудивительно, что гены лигазы мур сгруппированы в опероне клеточной стенки ( dcw ), что дополнительно указывает на то, что нацеливание на этот путь будет иметь эффект «нокдауна» на совместно регулируемые пути.

Дивисома микобактерий представляет собой многофакторный комплекс, который собирается в средней клетке и вызывает расщепление бактерий, в результате чего образуются 2 дочерние клетки.Нарушение процесса деления клеток может серьезно повлиять на инфекционность патогена. С этой целью Тим А. Кросс (Университет штата Флорида, США) исследовал двух рекрутов дивизома, CrgA и ChiZ, о которых мало что известно. Структура микобактериального CrgA была смоделирована с и без белка деления FtsQ. Используя твердотельный ЯМР, они обнаружили, что CrgA состоит из 2 трансмембранных спиралей с очень точными осями вращения. Ожидается, что экспонированные остатки глицина в структуре будут участвовать в связывании с белками в дивисоме. 130 N — конец CrgA по своей природе неупорядочен, однако Dr Cross предполагает, что на липидном интерфейсе он, вероятно, будет принимать конформацию β-листа.

Вопреки ожиданиям, рациональная разработка лекарств не позволила определить количество потенциальных кандидатов в ведущие лекарственные препараты, которые были получены с помощью методов цельноклеточного фенотипического скрининга, таких как тот, который обсуждал д-р Бхакта. SPOTi — это метод, основанный на твердой культуре, при котором оптимизированное количество бактерий наносится на агар, содержащий серию разведений молекул ингибитора. 131-133 Этот метод адаптирован к формату 96-луночного микропланшета, тем самым увеличивая производительность.

Однако, как только обнаруживается мощный ингибитор роста микобактерий, важно идентифицировать эндогенную мишень молекулы. Существует несколько доступных технологий для идентификации целей, таких как подходы, основанные на геноме, аффинности и знаниях. Cristiano V. Bizarro (PUCRS, Бразилия) рассказал о импульсном протеолизе и преципитации для идентификации мишени (PePTID). 134 Это энергетический метод, при котором белковые экстракты инкубируются с лигандом или без него с последующим применением короткого протеолитического импульса и осаждения трихлоруксусной кислотой. Масс-спектрометрия используется для анализа результатов, и в качестве доказательства концепции они применили методологию для идентификации АТФ-связывающих белков с использованием негидролизуемого АТФγ в M. smegmatis .

Перспективные молекулы и натуральные продукты

Даниэле Кастаньоло (Королевский колледж Лондона, Великобритания), Ярослав Ро (Карлов университет в Праге, Чешская Республика) и Ill Y.Ли (Корейский научно-исследовательский институт химических технологий, Южная Корея) рассказал о многообещающих потенциальных противотуберкулезных препаратах, находящихся на разных этапах разработки в результате их исследовательских усилий.

Доктор Кастаньоло упомянул, что использование молекул, похожих на те, которые не прошли клинические испытания, и их оптимизация для улучшения их характеристик может быть выигрышной стратегией. Он отметил, что две мощные антимикобактериальные молекулы, BM212 и SQ109, имеют схожее топологическое распределение химических свойств.Однако у них были ограничения в отношении фармакокинетических параметров, растворимости, профиля цитотоксичности и эффективности против штаммов M. tuberculosis MDR . Стратегия группы заключалась в гибридизации этих двух препаратов для получения новых производных для достижения улучшенной противотуберкулезной активности или, возможно, снижения цитотоксичности. Было синтезировано два поколения соединений, и, что интересно, первое поколение соединений оказалось мощными ингибиторами эффлюксной помпы с множеством лекарственных препаратов, а это означает, что эти молекулы могут усилить действие стандартной химиотерапии. 135

Доктор Ли исследовал такие производные, как фениловый эфир и карбонатные производные нитроимидазола, поскольку в молекуле есть пространство для размещения реактивных групп, которые могут улучшить ее антимикобактериальный профиль. 136,137

Доктор Ро исследовал 5-замещенные 2 — [(3,5-динитробензил) сульфанил] -1,3,4-оксадиазолы и 1,3,4-тиадиазолы на предмет их превосходной антимикобактериальной активности как в отношении чувствительных, так и лекарственно-устойчивые формы M. tuberculosis со значениями МПК от 0.03 мкМ. Соединения проявляли селективную антимикобактериальную активность без активности против грамположительных, грамотрицательных и грибков. Перекрестной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда не наблюдалось. Исследования взаимосвязи структурной активности продемонстрировали, что 3,5-динитрофенильный фрагмент играет решающую роль в обеспечении антимикобактериальной активности. 138-140 Любые изменения положения динитрогруппы приводили к потере или снижению противотуберкулезной активности в несколько раз. Тест AMES показал, что эти соединения, содержащие нитрогруппу, не обладают мутагенной активностью. 140 Они также проявили низкую клеточную токсичность in vitro на 3 линиях клеток млекопитающих. Соединения имеют структурное сходство с ингибиторами DprE1, такими как динитробензамиды или бензотиазинон. Однако эксперименты с радиоактивной меткой показали снижение включения урацила, что указывает на то, что бактериальные клетки страдают от дефекта синтеза ДНК при лечении. Дальнейшие исследования по оптимизации соединений для улучшения растворимости и замены атома серы продолжаются, поскольку его присутствие в молекуле делает ее очень восприимчивой к метаболической деградации.

Натуральные продукты играют важную роль в открытии новых лекарств и являются богатым источником противомикробных препаратов. По оценкам, одна треть населения мира полагается на традиционную медицину для удовлетворения своих медицинских потребностей. Скрининг натуральных продуктов высших растений представляет собой одно из направлений поиска новых свинцовых противотуберкулезных агентов. Мария дель Райо Камачо-Корона (Автономный университет Нуэво-Леон, Мексика) оценила антимикобактериальную активность 9 растений, используемых в традиционной мексиканской медицине.Они выбрали растения на основе обширного поиска в мексиканской этноботанической литературе. Некоторые из растений включали Citrus sinensis, Citrus aurantifolia, Foeniculum vulgare, Larrea tridentata, Musa acuminata и Olea europaea . 141 Экстракты из различных частей растений были приготовлены путем мацерации с использованием гексана, хлороформа, метанола и воды. Экстракты растений тестировали с использованием анализа alamar blue на микропланшетах и ​​тестировали против M. tuberculosis и его изолятов MDR.Гексановый экстракт кожуры плодов цитруса Citrus aurantiifolia фракционировали с помощью колоночной хроматографии, и основные соединения были выяснены с помощью ЯМР-спектроскопии и ГХ-МС. Было идентифицировано несколько соединений, таких как кумарины, линолевая, пальмитиновая и олеиновая кислоты, многие из которых были летучими и ингибировали рост патогена.

Антимикробные пептиды (АМФ) являются неотъемлемой частью врожденного иммунитета, который помогает в борьбе с различными патогенами. Обычно они действуют путем разрушения мембран бактериальных клеток.В водной среде АМП существуют в виде отдельных молекул. При контакте с мембранами они упорядочиваются и образуют поры в мембранах. Их действие быстрое и эффективное даже против штаммов с высокой лекарственной устойчивостью, и, следовательно, они могут использоваться в качестве дополнительного лечения. Некоторые из них в настоящее время проходят клиническую разработку для лечения нескольких бактериальных инфекций. Однако природные AMP не являются хорошими кандидатами в лекарства из-за их большого размера, что приводит к более высоким производственным затратам. Черпая вдохновение в природе для создания новых AMP, Jasmeet S.Khara (Королевский колледж Лондона, Великобритания) принял рациональный дизайн для производства пептидов с меньшей вероятностью индукции устойчивости и пептидов, которые демонстрируют синергизм со стандартными антибиотиками. 142 Существуют различные стратегии модификации AMP, такие как синтез пептидных конъюгатов, пептидомиметиков и получение гибридных пептидов. Они сосредоточились на дизайне de novo и пришли к первичной последовательности, содержащей 4 аминокислоты (xxyy) n, где «x» и «y» являются гидрофобными и катионными остатками соответственно с числом повторов «n».Было обнаружено, что последовательности, содержащие повторяющиеся остатки лейцина и лизина, такие как (LLKK) 2 в качестве основы с короткими амфипатическими α-спиралями, являются антимикобактериальными. При добавлении остатков метионина к α-спиральной части гидрофобность пептида увеличивалась, что делало его внедрение в клеточную мембрану более эффективным. Пептиды проявляли синергизм с противотуберкулезными препаратами первой линии и были эффективны против лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis .Механизм действия этих пептидов анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии и визуализации живых клеток обработанных микобактерий. В присутствии пептидов мембрана бактериальных клеток была более проницаемой для красителя.

Репозиционирование лекарств: многообещающая альтернативная стратегия открытия лекарств?

Переназначение стало привлекательной стратегией для открытия лекарств, которые могут быть непосредственно добавлены к арсеналу лекарств, используемых для лечения туберкулезных инфекций. Susanne Brighenti (Каролинский институт, Швеция) заинтересована в усилении врожденной системы защиты хозяина в качестве альтернативной стратегии лечения инфекционных заболеваний.Комбинация витамина D3 и 4-фенилбутирата (PBA) проявляет синергетический эффект на продукцию LL-37 в разных типах клеток. LL-37 представляет собой AMP, который вызывает аутофагию в макрофагах человека, инфицированных M. tuberculosis . 143,144 Повышенная выработка LL-37 может потенциально увеличить уничтожение как внеклеточных, так и внутриклеточных бактерий, как сообщалось ранее. Нет значительных клинических или микробиологических данных об эффектах лечения этими препаратами. Таким образом, на основе исследования шигеллеза, проведенного в Бангладеш, клинические исследования были разработаны для проведения в Эфиопии и Бангладеш. 145 Исходный уровень витамина D3 в сыворотке у населения Эфиопии оказался низким, и было рекомендовано принимать добавки. Рандомизированное двойное слепое клиническое испытание с использованием ежедневного приема витамина D и PBA в качестве дополнительного лечения к стандартной химиотерапии было проведено для изучения комбинированного воздействия на продукцию LL-37. Оба увеличивали продукцию LL-37 в макрофагах человека и зависимую от LL-37 аутофагию в инфицированных макрофагах. Они также наблюдали уменьшение клинических симптомов с улучшенным выздоровлением и быстрой конверсией посева мокроты при дополнительной терапии только с помощью vitD3 или в комбинации с PBA.Следовательно, vitD3 и PBA могут противодействовать подавлению активности LL-37 во время инфекции, что может иметь положительное влияние на снижение потребности в антибиотиках для лечения. 145-147

Д-р Бхакта и его исследовательская группа сообщили, что распространенные, отпускаемые без рецепта нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), ибупрофен и карпрофен обладают специфической противотуберкулезной активностью. 131 148 149 Было обнаружено, что они активны в отношении штаммов, устойчивых к лекарствам, и микобактерий стационарной фазы. Эндогенный механизм действия этих препаратов все еще обсуждается, однако транскриптомный анализ показывает, что препараты могут оказывать плейотропное действие на патоген.Кроме того, иммуномодулирующие эффекты НПВП и обеспечиваемая ими защита от воспаления и повреждения тканей являются главным аргументом в пользу включения этого класса лекарств в качестве вспомогательных терапий, направленных на хозяина, в дополнение к стандартному лечению против туберкулеза с целью улучшения результатов лечения.

M. tuberculosis обладают 2-регуляторной системой PhoPR, которая важна для восприятия кислой среды, обнаруженной в макрофагах, и реагирования на нее, а также для ее использования в своих интересах. Роберт Абрамович (Университет штата Мичиган, США) стремился найти соединение, которое ингибирует регуляторную систему, делающую патоген восприимчивым к иммунным ответам хозяина. Для выявления ингибиторов регулона использовали фенотипический скрининг целых клеток. Высокопроизводительный скрининг почти 220 000 библиотек соединений выявил, что этоксоламид ингибирует регулон, но не влияет на рост патогена. Этоксзоламид — ингибитор карбоангидразы, который используется для лечения глаукомы и язв двенадцатиперстной кишки.Транскрипционные исследования показывают, что этоксоламид подавляет 45 генов в M. tuberculosis . Известно, что эти гены контролируют синтез липидов, углеродный метаболизм и вирулентность. В качестве основного вывода этого исследования они заявляют, что этоксзоламид не изменяет гомеостаз pH M. tuberculosis ‘, но подавляет его pH-зависимую адаптацию и вирулентность. 150

Джерри Дэвис (Ливерпульский университет, Великобритания) обнаружил, что проблема с разработкой нового лечения заключается в отсутствии комплексного подхода к фармакокинетическому и фармакодинамическому анализу клинических исходов, наряду с плохо спланированными исследованиями на животных, приводящими к неудачам в лечении. клинические испытания.Это захватывающее время для полевых клинических разработок лекарств от туберкулеза, поскольку несколько новых и перепрофилированных лекарств проходят испытания. Испытания фазы II B одного из немногих многообещающих кандидатов, фторхинолонов, гатифлоксацина и моксифлоксацина, показали, что препараты работают хорошо и ускоряют скорость конверсии посевов на ранних этапах клинической разработки, давая надежду на сокращение продолжительности терапии и снижение частоты рецидивов. Испытания фазы III, в которых моксифлоксацин был включен в схемы лечения первой линии как средство сокращения продолжительности лечения до 4 месяцев, закончились разочарованием.Доктор Дэвис предлагает концепцию бесшовного дизайна исследования с набором основных результатов. Это позволило бы оценить результаты в нескольких промежуточных точках, а руки, которые работают плохо, прекратить. Следовательно, ресурсы и пациентов можно направить в руки, которые хорошо работают в тщательно отобранных точках, чтобы минимизировать потери средств и времени. 151

Отчет с международного саммита Euroscicon по борьбе с туберкулезом 2016

РЕЗЮМЕ

Сказать, что туберкулез (ТБ) вернул себе прочную точку опоры в глобальном сценарии здоровья и благополучия человека, было бы преуменьшением.Наряду с ВИЧ / СПИДом в качестве основной причины смертности от одного инфекционного заболевания влияние туберкулеза простирается далеко в социально-экономический контекст во всем мире. По мере того, как глобальные усилия, возглавляемые экспертами и политическими органами, объединяются для смягчения прогнозируемого результата роста устойчивости к противомикробным препаратам, академическое сообщество студентов, практиков и исследователей мобилизовалось для разработки интегрированных междисциплинарных программ, чтобы претворить в жизнь планы первых. Выполнение этого важнейшего требования для беспрепятственного распространения научных открытий было реализовано на Саммите по борьбе с туберкулезом в 2016 году в Лондоне, Соединенное Королевство.В этом отчете критически обсуждаются недавние достижения в диагностике и лечении, а также освещаются основные препятствия в борьбе с этим заболеванием, которые обсуждались в ходе трехдневного международного мероприятия. Конференции и симпозиумы, подобные этим, являются питательной средой для успешного местного и глобального сотрудничества, и поэтому их необходимо поддерживать для расширения понимания и распространения фундаментальных научных исследований.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антибиотиков, открытие лекарств, лекарственная устойчивость, тестирование лекарственной чувствительности, туберкулез

Введение

Для болезни, которую следует в значительной степени контролировать, туберкулез (ТБ) по-прежнему требует более 1.5 миллионов жизней ежегодно, из них 140 000 детей. 1 Среди множества факторов, способствующих успеху заболевания, можно выделить стойкую природу возбудителя Mycobacterium tuberculosis и растущую лекарственную устойчивость, приобретенную им в результате десятилетий лечения с использованием фиксированного режима приема лекарств. Длительные диагностические процедуры, неправильные диагнозы с последующим неправильным назначением лечения позволяют устойчивым штаммам распространяться внутри и за пределами сообществ.Это еще более усложняется, поскольку туберкулез в основном ассоциируется со странами с ограниченными ресурсами, которые имеют высокую плотность населения, где программы отслеживания контактов скомпрометированы из-за отсутствия инфраструктуры. 2 Однако безрадостная обстановка вызвала потребность в инновационных, быстрых и точных диагностических тестах, основанных на молекулярных методах, таких как GeneXpert® MTB / RIF, которые широко используются во всем мире. 3 Эти технологии требуют дальнейшего развития, чтобы соответствовать потребностям времени в бедных районах с низкой инфраструктурной поддержкой.Для эффективного контроля над заболеванием успехи в диагностике должны отражаться появлением эффективных терапевтических средств для лечения инфекции.

Открытие противомикробных препаратов часто рассматривается как «предприятие с высоким риском и низкой отдачей». И этот сектор игнорировался фармацевтическими компаниями и одновременно игнорировался политикой общественного здравоохранения. Это привело к критической нехватке новых лекарственных препаратов в клинических испытаниях. Поскольку в настоящее время ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) обнаружен в 105 странах, FDA США предоставило ускоренные варианты разработки противотуберкулезных препаратов. 1 Примерно через полвека отсутствия новых лекарств для лечения пациенты с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наконец, имеют возможность, хотя и в соответствии со строгими правилами, получать для лечения бедаквилин или деламанид. 4,5

Государственные расходы на лечение ТБ в большинстве случаев колеблются в пределах 100-500 долларов США, увеличиваясь до 10 000 долларов США в случае пациентов с МЛУ ТБ. 1 Прогнозируется, что рост устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) обойдется мировой экономике от ≤2,1 трлн. До более ≤100 трлн. В 2050 году, в зависимости от предпринятых вмешательств и их эффективности. 6 Это бремя было бы прямым результатом прогнозируемой ежегодной потери 10 миллионов жизней в наиболее продуктивные годы, если бы УПП распространялся бесконтрольно. На туберкулез приходится большая часть бремени, вызванного УПП. Кроме того, воздействие туберкулеза на животноводство имеет серьезные последствия, поскольку отсутствуют вакцины или практические, экономически эффективные средства лечения инфицированных животных. В некоторых частях Уэльса в Соединенном Королевстве сообщается о стремительном росте количества забитого крупного рогатого скота из-за туберкулеза крупного рогатого скота. 7 Эти выбраковки создали непреднамеренную нагрузку на животноводческую отрасль и местные органы власти.

В сегодняшнем глобальном мире и экономике объединение усилий, начиная со студента, сидящего на скамейке, должно пройти до цепочки поставок, которая в конечном итоге приводит к получению готового диагностического или терапевтического продукта, используемого в пункте оказания медицинской помощи или у постели пациента. Ученым необходимо понимать основные реалии и трудности, с которыми сталкиваются медицинские работники, чтобы предлагать эффективные решения и стратегии.Точно так же врачей необходимо информировать о последних достижениях в области фундаментальных научных исследований, чтобы быстрее создавать механизмы обратной связи, которые могут выявить области, в которых существует острая необходимость в развитии. Поэтому очень важно установить каналы связи между этими разнородными людьми, объединенными своими усилиями по борьбе с туберкулезом.

TB Summit 2016, третье мероприятие подобного рода, организованное Euroscicon, было достойно проведено в Северном Гринвиче, Лондон (Великобритания), поскольку это один из районов Лондона с самой высокой заболеваемостью туберкулезом. 8-10 В трехдневном мероприятии приняли участие представители университетов и государственных учреждений со всего мира. Информативная устная презентация и стендовые сессии были разделены на категории для систематического обсуждения различных аспектов туберкулеза, что более подробно обсуждается в следующих разделах отчета.

Туберкулез: заболевание, возбудитель и хозяин

Изучение распространения туберкулеза

Туберкулез в его наиболее распространенной форме представляет собой воздушно-капельное заболевание, которое поражает ткани легких и находится в макрофагах и других фагоцитарных иммунных клетках гостья.Иммунные ответы хозяина служат для изоляции организма в отделах, известных как гранулема. 11 Эти гранулемы в дальнейшем созревают с образованием некротических поражений, которые, наконец, разрушаются механическим сдвигом и выбрасываются в воздух в результате кашля или разговора инфицированного человека. 12 Хотя воздушно-капельный путь передачи широко распространен, необходимо провести адекватное расследование различных стадий заболевания, а именно: изгнание бактерий, передача через воздух, вдыхание и инфицирование нового хозяина.

Кашель считается важным фактором передачи туберкулеза, поскольку он является распространенным симптомом туберкулеза легких. Поскольку M. tuberculosis заключен в полости легких в толстые биопленки, требуется большое усилие, чтобы выбросить бациллы в дыхательные пути и наружу. При кашле выделяется больше капель, чем при других маневрах, таких как разговор или пение, поскольку в первом акте задействована более высокая сила и, таким образом, считается, что это основной фактор, участвующий в механизме передачи. 13,14 Несколько исследований, изучающих характер кашля и передачу инфекции в домашних условиях, показали, что пациенты кашляют чаще днем, чем ночью, и что частота кашля является важным показателем передачи. 15,16 Как отмечает Ричард Тернер (Фонд NHS Foundation Trust, Великобритания), кашель в контексте заразности туберкулеза не изучался. Причина кашля у больного туберкулезом; его необходимость в передаче туберкулеза, корреляция с инфекционными / неинфекционными штаммами патогена и характеристики оптимальных капель от кашля для передачи заболевания еще предстоит полностью понять. Такие факторы, как анатомия дыхательных путей, количество, состав и вязкость мокроты, были упущены из виду, и необходимо разработать методики их исследования.

Изучение моделей передачи туберкулеза может помочь разработать эффективные стратегии вмешательства для борьбы с болезнью. Исчерпывающие исследования по отслеживанию передачи должны быть способны обнаруживать или исключать передачу между случаями, отслеживать последовательное приобретение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) вдоль цепочки передачи и дифференцировать первичный и приобретенный фенотипы устойчивости с учетом разнообразия хозяев. Однако инфекции ТБ печально известны своей неоднородностью в пределах одного и того же хозяина, поскольку длительный период инфицирования позволяет микроэволюции бацилл в течение одного цикла заражения. 17 С другой стороны, патоген имеет низкую скорость репликации и склонность к низкому генетическому разнообразию. Таким образом, бациллы могут либо не демонстрировать генетического разнообразия, либо иметь несколько SNP между контактами, что чрезвычайно затрудняет отслеживание передачи, используя только их генную последовательность. Кэролайн Колин (Имперский колледж Лондона, Великобритания) предлагает объединить датированные филогенетические деревья со статистическим моделированием, чтобы выявить вероятность дерева передачи с использованием моделирования цепи Маркова Монте-Карло / методов байесовского вывода. 18 Однако использование статистических методов для вывода о передаче туберкулезных микобактерий требует вычислительно-интенсивных методов вывода, которые страдают от ограничений доступных данных и предположений, сделанных для построения моделей, как указано в Ярно Линтусаари (Университет Аалто, Финляндия) . 19 Сложность процесса затрудняет получение надежных выводов на основе статистических моделей динамики передачи.

Альберт Ниенхаус (Университетский медицинский центр, Германия), Джеймс Седдон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) и Роберт Уилкинсон (Кейптаунский университет, Южная Америка) обсудили препятствия на пути контроля передачи среди различных групп лица высокого риска — медицинские работники, дети и пациенты с ВИЧ.

Говоря о профессиональном приобретении болезней, профессор Ниенхаус заявил, что туберкулез является одним из наиболее инфекционных заболеваний, поражающих медицинских работников (МР) в Германии. 20 Ситуация хуже в таких странах, как Португалия и Франция, где уровень заболеваемости определенно выше — 33% и 19% по сравнению с 10% в Германии. 21,22

Медицинские работники, особенно врачи и медсестры, подвергаются более высокому риску заражения активной и латентной инфекцией ТБ (ЛТИ) из-за продолжительных и частых контактов с инфицированными пациентами.Напротив, в этой группе уровень передачи контактов контактам ниже, чем в других группах инфицированных людей в результате частых проверок состояния здоровья. 23 После тщательного изучения данных скрининга 32 практикующих врачей профессор Ниенхаус рекомендовал ежегодный скрининг медицинских работников из группы высокого риска из-за контакта с высокоинфекционными пациентами. Однако в руководствах по скринингу, выпущенных системами общественного здравоохранения разных стран, предлагается разнообразная комбинация рентгеновских лучей, туберкулиновой кожной пробы (ТКП) и тестов высвобождения гамма-интерферона (IGRA) без единого мнения о наилучшей стратегии. 24,25 Он предположил, что в обстоятельствах, когда IGRA положительный, а рентгеновский отрицательный, LTBI может быть подтвержден и сопровождаться профилактическими мерами, если считается, что риск отказа от лечения выше, чем риск, связанный с его назначением. Обнадеживает, что выявление ЛТИ у медработников растет с годами по мере совершенствования диагностических технологий, и ожидается, что исследования динамики риска и вознаграждения лечения позволят разработать единое глобальное решение.

Еще одна группа с высоким риском заражения этим заболеванием, главным образом из-за их связи с инфицированными взрослыми, — это дети. Несмотря на то, что у детей зарегистрирован один миллион случаев туберкулеза, очень мало делается для понимания патогенеза и доступных для них вариантов лечения. Д-р Седдон работает над улучшением нашего понимания вариантов лечения и профилактики МЛУ-ТБ у детей. 26 ТБ у детей и младенцев трудно диагностировать, так как затруднен сбор мокроты.Еще больше усложняет ситуацию то, что заболевание проявляется в нескольких формах, включая инфекцию внутри- или внегрудных лимфатических узлов. 27 Следовательно, лечение необходимо подбирать в соответствии с потребностями и состоянием здоровья ребенка. Хотя исследования показывают, что почти все дети, которым поставлен диагноз, завершают курс лечения и имеют очень хорошие результаты, схемы лечения МЛУ-ТБ у детей требуют пересмотра, поскольку фармакокинетика и токсичность лекарств у детей значительно отличаются от таковых у взрослых. 28,29 Схема лечения лекарственно-чувствительного туберкулеза у детей представляет собой стандартную 6-месячную комбинированную терапию, при которой в течение первых 2 месяцев назначают рифампицин, изониазид и пиразинамид, а затем 4 месяца — рифампицин и изониазид. 30 Детям, страдающим ВИЧ и туберкулезом, рекомендуется дополнительный прием этамбутола в первые 2 месяца. Будущие испытания для оценки стратегий профилактики туберкулеза включают TB-CHAMP для оценки левофлоксацина у детей до 5 лет и ACTG A5300 для оценки левофлоксацина и изониазида у взрослых и детей, а также ряд других. 26,31 По мере того, как новые и перепрофилированные лекарственные препараты входят в терапевтические схемы, оценка их фармакокинетических свойств у детей остается важной.

Профессор Уилкинсон и его команда изучают связь между туберкулезом и ВИЧ в Хайелитше, Южная Африка. Хайелитша — бедный городок, в котором распространенность туберкулеза является одной из самых высоких в мире. Сообщается, что распространенность дородовой ВИЧ-инфекции составляет 25% от общей численности населения, при этом почти 40% имеют риск развития активного туберкулеза. 32 Кроме того, 76% случаев туберкулеза также являются ВИЧ-инфицированными. 32 Команда провела рандомизированное контролируемое испытание только антиретровирусной терапии (АРТ) и профилактической терапии изониазидом (ПЛИ) в сочетании с АРТ (АРТ) для профилактики ВИЧ-ассоциированного ТБ. Результаты показали, что изониазид, добавленный к противовирусной терапии, снижает риск туберкулеза на 35%, как это наблюдалось после года терапии IPT. 33 Он также подсчитал, что люди, инфицированные ВИЧ, имеют примерно в 30 раз больше риска заражения активным туберкулезом из-за иммуносупрессии, а в условиях очень высокой заболеваемости повторное инфицирование встречается чаще, чем эндогенная реактивация болезни. 34

Mycobacterium tuberculosis: более пристальный взгляд

Род Mycobacterium претерпел несколько событий видообразования и генетического распада, что привело к появлению множества непатогенных и патогенных видов с различной специфичностью к хозяину. В отличие от других бактерий, виды микобактерий не участвуют в горизонтальном переносе генов, поэтому эволюция происходит постепенно, за счет небольших генетических изменений, регулируемых естественным отбором или связанных с эволюцией человека и его палеомиграцией.Ход этих генетических дрейфов привел к тому, что M. tuberculosis превратились в облигатный патоген со специфичностью к хозяину, ограничиваемой в первую очередь людьми. 35 Frédéric Veyrier (INRS-Institut Armand-Frappier, Канада) использовал технологии секвенирования генов для выявления факторов, которые делают M. tuberculosis специфичным для человека. Были опробованы два подхода: (а) «бесцельный» метод, который включал секвенирование следующего поколения (NGS) и инструмент исследования микобактериальных гомологов (mycoHIT), и (б) «сфокусированный» подход, который ограничивался интересующими локусами.Их главный интерес заключался в исследовании генетических мутаций, которые отбираются в процессе эволюции, чтобы стать облигатным патогеном. 35

Секвенирование всего генома может помочь различить быстро и медленно растущие микобактерии. Эти исследования показали, что M. kansasii может быть потенциальным кандидатом для моделирования образа предков M. tuberculosis , представляющего собой вид окружающей среды, который может вызывать туберкулезное заболевание, которое не может передаваться. 36 Генетический анализ выявил взрыв токсин-антитоксиновых модулей в M.tuberculosis после видообразования, в основном за счет дупликации генов. Еще одна специфическая адаптация — анаэробное дыхание. 37,38 Генетические события предков могут объяснить последовательную эволюцию патогена, и текущая функциональная характеристика этих событий может быть реконструирована в M. kansasii или M. marinum .

Переходя от подсказок в генетическом коде к системе передачи сообщений, Эрик Галбурт (Школа медицины Вашингтонского университета, США) обсудил кинетику и энергетику инициации транскрипции у микобактерий.Хотя это фундаментальный биологический процесс, который является общим для бактерий и сохраняется в них; Скорости транскрипции сильно различаются между E. coli и видами микобактерий из-за различий в стабильности промежуточных комплексов, образующихся в этом процессе. Следовательно, важно изучать центральные процессы в самом патогене, а не наследовать информацию от других модельных организмов. Основные факторы инициации транскрипции CarD (Rv3583c) и RbpA (Rv2050) играют важную роль в биологии M.Туберкулез . 39-42 Инициирование требует образования холофермента РНК-полимеразы (РНКП) со связанными сигма-факторами. Серия кинетических шагов приводит к образованию замкнутого комплекса, ведущего к открытому комплексу с пузырем транскрипции. Факторы инициации расположены рядом с верхним краем пузыря транскрипции. 43,44 Такие методы, как флуоресцентное мечение, были использованы для изучения открытого комплекса с использованием M. bovis RNAP, который, как известно, образует открытые комплексы, которые являются более нестабильными по сравнению с E.coli RNAP. Было обнаружено, что факторы инициации действуют независимо и кооперативно, регулируя транскрипцию, и что только в присутствии обоих факторов кинетика транскрипции у микобактерий, по-видимому, подобна той, которая наблюдается у E. coli . 45,46 Поскольку известно, что оба фактора играют важную роль в патогенезе, глобальных уровнях экспрессии рРНК / генов и устойчивости к стрессу и антибиотикам, они могут служить хорошими мишенями для разработки лекарств.

Основная проблема в разработке эффективных лекарств и схем лечения против M.tuberculosis — это гетерогенность инфицированной популяции бацилл, которая включает активно реплицирующиеся и спящие клетки, известные как персистеры. Клетки-персистеры находятся в состоянии покоя, обладают высокой толерантностью к антибиотикам и другим внешним воздействиям и при благоприятных условиях могут вернуться в состояние активного деления. 47 Обнаружение этих клеток практически невозможно, поскольку обычные микробиологические методы культивирования не могут их идентифицировать. Эти клетки могут быть сгенерированы in vitro, , при длительной стационарной фазе культивирования или постепенном подкислении культуральной среды.Затем они могут быть возвращены к их активно воспроизводящейся физиологии путем воздействия факторов, способствующих реанимации (Rpfs), которые также известны как Rpf-зависимые клетки. 48

Rpfs представляют собой секретируемые или связанные с клеточной стенкой ферменты, продуцируемые активно делящимися микобактериями. Они структурно и функционально подобны лизоцимам и необходимы для оживления спящих клеток. 49 В M. tuberculosis имеется 5 Rpf, и было обнаружено, что они важны для персистенции и реактивации инфекции у мышей.RpfA, B и E секретируются и обнаруживаются в фильтратах культур, тогда как RpfC связывается с клетками. 50 RpfD активируется во время инфекции. После оживления Rpf-зависимые клетки теряют эту характерную зависимость во время пассажей in vitro и пассажей.

Rpf-зависимые микобактерии очень важны в клиническом аспекте. 48 Эти клетки очень распространены в мокроте и образцах внелегочного туберкулеза, их относительные пропорции колеблются от 0 до 99,99% от общего количества M.туберкулез населения. Джайшри Гархиан (Университет Джавахарлала Неру, Индия) сообщил, что костный мозг является нишей для персистеров, поскольку мезенхимальные стволовые клетки выживают в течение длительного периода времени и находятся в среде с подавленным иммунитетом. 51,52 Кроме того, у стволовых клеток есть клетки активного выхода лекарства, обеспечивающие вторую стену защиты для патогена. Их работа показывает, что M. tuberculosis захватывают мезенхимальные стволовые клетки, перепрограммируют их с помощью фактора, индуцируемого гипоксией (Hif-1), и воздействуя на этот путь, могут усилить стандартные схемы лечения.

Rpf-зависимые клетки по своей природе более устойчивы к нескольким лекарствам, таким как рифампицин, изониазид и стрептомицин. 53 Поскольку избавиться от Rpf-зависимых микобактерий труднее, они оказываются более богатыми у пролеченных больных туберкулезом. Поскольку персистеры часто являются причиной неудач лечения и рецидивов после лечения, важно, чтобы оценка схем лечения ТБ учитывала элиминацию / индукцию этой группы клеток. 54 Янминь Ху (Лондонский университет Св. Георгия, Великобритания) считает, что невидимые персистеры представляют собой многообещающую терапевтическую мишень, и более короткие схемы химиотерапии, такие как испытанная с фторхинолонами, могут быть успешными только в том случае, если они эффективны в уничтожении этого подмножества патогенная популяция.В условиях in vitro ее группа заметила, что для уничтожения стационарных культур M. tuberculosis требуются высокие дозы рифампицина. 47 Это происходит главным образом из-за Rpf-зависимых бацилл, которые обладают высокой толерантностью к препарату и, по-видимому, уменьшаются с увеличением концентрации рифампицина, но не могут быть полностью уничтожены. 47 Когда они инкубировали инфицированные ткани легких мышей (2 недели инфицирования) с культуральным фильтратом, содержащим Rpfs, клетки-персистеры могли оживать даже после введения мышам высоких доз рифампицина.Они использовали модель Корнелла для изучения эффективности и частоты рецидивов различных схем лечения лекарствами, при которых инфекции позволяли развиваться в течение 3 недель, а затем лечили комбинациями лекарств в течение 14 недель. В конце периода лечения мышам давали гидрокортизон для подавления иммунной системы для изучения частоты рецидивов. Как отмечалось в более ранней модели, наблюдалось дозозависимое уничтожение бактерий. Также было отмечено, что более высокие дозы рифампицина могут сократить время лечения, однако небольшая подгруппа Rpf-зависимых бацилл все еще сохраняется в тканях хозяина.

Галина Мукамолова (Университет Лестера, Великобритания) представила концепцию лекарственно-индуцированной Rpf-зависимости у M. tuberculosis . Было показано, что лечение рифампицином, изониазидом и этамбутолом вызывает Rpf-зависимость, тогда как в случае лечения стрептомицином и амикацином такого эффекта не наблюдалось. 53 Таким образом, очень важно, чтобы лекарства были проверены на их склонность вызывать Rpf-зависимость. С этой целью Мукамолова и его коллеги стремились разработать простой тест для определения способности лекарств вызывать Rpf-зависимость.Rpf-зависимые микобактерии могут образовываться во время инфицирования мышей. Однако эти модели трудно обрабатывать в условиях высокой производительности. Чтобы адаптировать это к условиям in vitro , группа Мукамоловой синтезировала новые доноры оксида азота, которые могли индуцировать персистирующий фенотип в клетках M. bovis . Таким образом, эти in vitro системы могут быть использованы для валидации новых лекарств и поиска биомаркеров, зависимых от Rpf.

Еще одна модель стойкости, использующая модули токсин-антитоксин (ТА), обнаруженные в M.tuberculosis , обсуждалась Шалин Корч (Университет Среднего Запада, США). Из 88 предполагаемых выявленных модулей ТА около 30 были назначены функции. 55 Обычно это опероны с двумя генами, один из которых кодирует токсичный белок, а другой — антитоксин, который связывается с токсином и ингибирует его. 56 Регуляция этих модулей контролируется в основном за счет авторепрессии транскрипции оперона антитоксином. Однако при воздействии стрессов, возникающих во время заражения, активируется определенная часть этих модулей.Учитывая, что у E. coli эти системы, как известно, участвуют в образовании персистеров, их роль в контроле скорости деления M. tuberculosis во время инфекции требует дальнейшего изучения. 57 Корч решил сосредоточиться на системе RelBE, которая ингибирует трансляцию посредством расщепления мРНК. 58,59 Путем создания штаммов, которые сверхэкспрессируют токсины с последующим спасением от антитоксина, они продемонстрировали фенотип персистенции, при котором наблюдали только 20% от общей трансляции. 60 Эта модель позволит провести дальнейшее исследование стадий персистентности, а именно входа, обслуживания и выхода.

Ответы хозяина на M. tuberculosis

Макрофаги являются стражем врожденной иммунной системы. После того, как M. tuberculosis попадает в дыхательные пути подходящего хозяина, он сталкивается с фагоцитарными клетками и преимущественно вторгается в альвеолярные макрофаги и моноциты. После заражения эти макрофаги высвобождают множество цитокинов, которые привлекают несколько иммунологически активных клеток, таких как Т-клетки, которые выделяют интерферон-γ (IFNγ), который в сочетании с фактором некроза опухоли-α (TNFα) активирует макрофаги для устранения патогена. 61 Марцин Влодарчик (Лодзинский университет, Польша) интересуется профилем цитокиновых ответов, управляемых микобактериальными антигенами, и экспрессией рецепторов передачи сигнала при ТБ. Для исследования были выбраны двести восемнадцать пациентов, вакцинированных БЦЖ и инфицированных ВИЧ / ТБ. Основная цель исследования заключалась в оценке продукции IFNγ, TNFα, интерлейкинов и экспрессии на клеточной поверхности рецепторов, таких как TLR2, LFA-1, CD14, а также растворимого аналога CD14 между пациентами и здоровыми добровольцами.Они сообщают, что наблюдают количественные, а не качественные изменения в уровнях экспрессии изучаемых цитокинов, когда сыворотка инфицированных людей заражается микобактериальными антигенами. Также было обнаружено, что у больных туберкулезом значительно более высокая частота встречаемости моноцитов с рецепторами CD14, TLR2 и LFA-1. 62

Другой член семейства Toll-подобных рецепторов, RP105 (CD180), исследуется группой Antje Blumenthal (Институт Диамантина Университета Квинсленда, Австралия).RP-105 в основном экспрессируется макрофагами и моноцитами. У него короткий цитоплазматический хвост, и было высказано предположение, что он не может передавать сигналы напрямую без партнера по передаче сигналов. CD180 Уровни экспрессии мРНК выше в цельной крови у вылеченных больных туберкулезом по сравнению с теми, у которых наблюдается рецидив. 63 Было также показано, что мыши с дефицитом RP105 более восприимчивы к туберкулезу, а макрофаги с дефицитом RP105 продуцируют значительно меньшее количество воспалительных цитокинов, чем их аналоги дикого типа. 64 Однако ни мРНК, ни экспрессия белков воспалительных цитокинов, таких как TNF, не были затронуты в макрофагах мутантов с дефицитом RP105. 64 Благодаря своей работе группа Blumenthal продемонстрировала, что активация макрофагов, опосредованная RP105, отличается от передачи сигналов классического Toll-подобного рецептора (TLR), где RP105 направляет трафик цитокинов. 65,66 Этот новый сигнальный путь врожденного иммунитета включает RP105, BTK и субъединицу p110δ фосфоинозитид-3-киназы.

Другое семейство малых белков, трансмембранных белков, индуцированных интерфероном (IFITM), и их роль в ограничении инфекции M. tuberculosis было представлено Шахином Ранджбаром (Гарвардская медицинская школа, США). 67 TLR2 и 4 и MyD88-зависимые сигнальные пути участвуют в индукции белков IFITM 1, 2 и 3. Их работа показала, что уровни экспрессии белков IFITM напрямую коррелируют со скоростью роста M. tuberculosis в THP. -1 ячейка.Было замечено, что IFITM3 совместно локализуется с микобактериальными клетками в альвеолярных эпителиальных клетках, а сверхэкспрессия белка усиливает закисление эндосом, тем самым ограничивая инфекцию. 67

Перейдя от рецепторов к сигнальным молекулам, Мария Регина Д’Империо Лима (Университет Сан-Паулу, Бразилия) рассказала о роли пуринов, особенно внеклеточного АТФ (eATP), в иммунном ответе на тяжелый туберкулез. . Гипервирулентные штаммы микобактерий проявляют разную степень патогенности.Тяжесть заболевания часто связана с подавлением выработки эффекторных цитокинов.

eATP и продукт его распада аденозин, как известно, действуют как хемотаксические сигналы, приводящие к усиленной миграции нейтрофилов и макрофагов к месту воспаления. 68,69 eATP, как известно, активирует несколько рецепторов, которые, в свою очередь, вызывают гибель клеток из-за некроза, образования ионных каналов или пироптоза. 70 Эти механизмы обеспечивают высвобождение бактерий из фагоцитарных клеток, и было замечено, что туберкулез, вызванный гипервирулентными микобактериями, ослабляется у мышей, у которых отсутствует рецептор P2X7, и наблюдается снижение распространения болезни. 71 Клетки дикого типа с активным P2X7 погибают от некроза, который способствует высвобождению гипервирулентных микобактерий. 71 Гистологические анализы также выявили меньшее повреждение, вызванное воспалением, у мышей с нокаутом, таким образом демонстрируя, что передача сигналов P2X7 вносит вклад в патологию в модели тяжелой инфекции. Группа также отметила, что специфические клетки CD4 в паренхиме легких мышей, инфицированных вирулентными штаммами микобактерий, подавлены.

Аннемари Х.Meijer (Лейденский университет, Нидерланды) использует однодневные эмбрионы рыбок данио, инфицированные M. marinum , близким родственником M. tuberculosis , для изучения механизмов защиты хозяина на ранних стадиях инфекции. Преимущество изучения этих организмов состоит в том, что они оптически прозрачны, а агрегаты клеток и их распространение можно легко проследить. Молодые эмбрионы не обладают адаптивным иммунитетом, а самые ранние иммунные клетки — это макрофаги и нейтрофилы. Через несколько минут после заражения бактерии фагоцитируются.Инфицированные клетки привлекают новые макрофаги, в результате чего образуются гранулематозные агрегаты. Гранулема защищает патоген от дальнейшего иммунологического вмешательства и тем самым дает ему большое преимущество. 72 Стабильная секреция патогеном раннего секреторного антигена-6 (ESAT-6) обеспечивает сохранение и рост гранулем. Это согласуется с открытием, что мутанты с дефицитом ESAT-6 могут поддерживать только небольшие гранулемы. Профессор Мейер и ее группа сосредотачиваются на сети хемокинов, которая облегчает миграцию макрофагов с образованием гранулемы.

У рыбок данио с мутированным рецептором CXCR3 случайная подвижность макрофагов снижена. 73 Этот дефект подвижности коррелирует с уменьшением количества и размера гранулемы, что приводит к уменьшению общего бремени инфекции. Ингибирование рецептора CXCR3 показало уменьшение образования гранулем, а предыдущие исследования показали, что мыши с дефицитом CXCR3 проявляют повышенную устойчивость к инфекции. 73 Следовательно, нацеливание на формирование гранулемы с помощью иммуномодулирующих препаратов может помочь разработать стратегии, ориентированные на хозяина, которые могут работать синергетически с химиотерапией и снижать риск возникновения новой резистентности.

Используя рыбок данио в качестве доклинической модели, они испробовали несколько методов, чтобы (а) ингибировать рост гранулемы (б) обратить ингибирование слияния фаголизосом и (в) стимулировать антимикобактериальную аутофагию и аутофагический отток. 74 Аутофагия — это система иммунологической защиты, и многочисленные исследования in vitro показывают, что ингибирование аутофагии способствует росту M. tuberculosis в тканях хозяина.

Модулятор аутофагии, связанный с повреждением ДНК 1 (DRAM1), активируется во время M.marinum , зависящая от пути распознавания патогенов TLF / MyD88. 75 При сверхэкспрессии драм1 у личинок рыб развиваются более низкие уровни инфекции и более мелкие гранулемы.

Ранняя диагностика: ключ к борьбе с туберкулезом?

Из 9,6 миллиона предполагаемых случаев во всем мире в 2014 году только 6 миллионов были зарегистрированы через национальные центры эпиднадзора. Считается, что большинство из 3 миллионов недиагностированных случаев происходит из регионов со слабым медицинским обслуживанием.В основном это происходит из-за неполной отчетности и неполной диагностики. Занижение отчетности происходит, когда диагностика и лечение проводятся в частном секторе, который не связан с национализированными схемами. Во-вторых, педиатрические службы часто плохо связаны с национальными противотуберкулезными службами, и у детей часто не диагностируется туберкулез, поскольку выявление туберкулеза в таких случаях особенно сложно. Плохой доступ к медицинскому обслуживанию в странах с низким уровнем дохода является основной причиной неполного диагноза, и многие пациенты теряются для последующего наблюдения.Большинство медицинских центров проводят пассивное выявление случаев, тогда как Луис Э. Куэвас (Ливерпульская школа тропической медицины, Великобритания) считает, что более активный подход, включающий аутрич-услуги, может улучшить ситуацию. Он сравнил 2 тематических исследования активного выявления случаев; один из них был проведен в Эфиопии, где действует активная программа расширения здравоохранения, а другой — в Нигерии, которая прекратила свою программу расширения здравоохранения несколько десятилетий назад. Исследование проводилось в трущобах вокруг Абуджи в Нигерии.С помощью вышедших на пенсию медицинских работников (HEW) и с использованием таких ресурсов, как данные переписи по ликвидации полиомиелита, были проведены посещения по дому для сбора 2 образцов мокроты с интервалом в 40 минут. О результатах сообщили дома у человека или по телефону. Уровень выявления случаев был удвоен благодаря усилиям по увеличению количества диагнозов для женщин и пожилого населения. 76

Эфиопия имеет хорошо организованную программу распространения медицинских услуг. В ходе исследования HEW получали базовые медицинские пакеты, которые доставлялись им на дому каждые 14 дней.Основная цель упражнения заключалась в улучшении результатов лечения и выявления случаев туберкулеза. Медицинские работники были обучены выявлению случаев заболевания, сбору мокроты и приготовлению мазков, которые затем сдавали в местные лаборатории. Как только результаты подтвердят наличие туберкулезной инфекции, куратор начнет лечение на дому, и будут проверены домашние контактные лица. По сравнению с предыдущим годом выявление случаев ТБ увеличилось как минимум в 2 раза, что наглядно демонстрирует улучшения в выявлении случаев ТБ при использовании активного подхода к выявлению случаев. 77,78 Эндрю Кертис (Государственный университет Кента, США) также поддержал этот подход, он обсудил использование пространственных видеозаписей с видеокамеры и географических повествований для отслеживания активных контактов бездомных и потребителей наркотиков, которые подвержены высокому риску заражения этим заболеванием в развитых странах.

Микроскопия мазка мокроты остается основой классических диагностических тестов, используемых в странах с низким и средним уровнем дохода с высоким бременем туберкулеза. 79 Этот метод прост в исполнении, дешев и быстр, но его использование ограничено из-за низкой чувствительности и специфичности, особенно в педиатрических случаях, у пациентов с ВИЧ и пациентов с низкой бактериальной нагрузкой в ​​мокроте. 80 Для получения результатов с помощью методов жидких и твердых культур может потребоваться до 3 недель, после чего отслеживание пациентов может стать затруднительным, что приведет к тому, что инфицированные ТБ люди не получат лечения, а распространение болезни в своих общинах и домохозяйствах еще больше усугубит ситуацию.

В попытке разработать неинвазивную диагностическую стратегию туберкулеза с использованием образцов дыхания, Thu-Hoa Tran-Thi (Centre National de la Recherche Scientifique, Франция) обсудил потенциал летучих метаболитов M.tuberculosis в качестве биомаркеров болезни. 81,82 Никотиновая кислота (NA), метилфенилацетат (MPA), метил-п-анизат (p-MA), метилникотинат (MN) и о-фениланизол — это 5 летучих соединений, которые были идентифицированы из культур M. tuberculosis выращено in vitro . 82 NA может быть обнаружена в дыхании больных активной формой туберкулеза, хотя присутствует в небольших количествах. Также было обнаружено, что он является многообещающим индикатором штаммов M. tuberculosis , устойчивых к пиразинамиду.Доктор Тран-Тхи и группа исследовали метод обнаружения НА в сложных растворах с различными метаболитами, а также в биологических средах. Были разработаны люминесцентные методы обнаружения NA с использованием тербия III (Tb 3+ ) в качестве зонда благодаря его способности люминесцировать при передаче энергии от NA к иону Tb 3+ . 83 Потенциальное вмешательство других метаболитов, таких как MPA, p-MA и MN, которые имеют такие же длины волн возбуждения, что и NA в образцах, было идентифицировано как проблема.Конденсат выдыхаемого воздуха был признан лучшим образцом, поскольку он меньше мешает по сравнению с образцами слюны и мочи. Стоимость этого диагностического процесса оценивается ниже, чем одобренный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) молекулярный диагностический тест GeneXpert® MTB / RIF, что делает его разработку приоритетной для последующего использования в развивающихся странах.

Биомаркеры крови также можно использовать в диагностических тестах для выявления туберкулеза в эндемичных районах. В целом множество антител, специфичных к различным антигенным эпитопам, обнаруженным в M.tuberculosis у больных туберкулезом, методы выявления на основе профиля отдельных антител, скорее всего, не сработают. Имран Хан (Калифорнийский университет, США) изучил возможность использования мультиплексной серологической панели для диагностики туберкулеза. 84 В этом тесте используется панель из 28 микрогранул M. tuberculosis , покрытых антигеном, что позволяет универсально идентифицировать профили антител у пациентов с помощью одного теста. Используя тот же метод, доктор Хан исследовал 10 цитокинов / хемокинов / факторов роста в плазме и 8 антител против 8 M.tuberculosis биомаркеров антигенов, которые повышены у больных туберкулезом. Интересно, что они обнаружили, что уровни профиля антител среди больных туберкулезом зависят от пола и связаны с успехом лечения. 85 Иммунобиомаркеры при туберкулезе важны для понимания реакции хозяина на патоген, и эта область может быть дополнительно изучена для разработки диагностики и лечения туберкулеза.

Геномика, протеомика и транскриптомика — это подходы, которые широко использовались для характеристики M.Туберкулез . Недавно метаболомика, новый подход, была дополнена революцией «омиков», чтобы обеспечить более полное понимание сложных внутренних систем патогена. 86,87 Metabolomics исследует все внутри- и внеклеточные метаболиты (низкомолекулярные промежуточные соединения и продукты) в биологическом образце с использованием высокоспециализированных аналитических методов для создания метаболического профиля и измерения любых динамических реакций на стимулы или генетические модификации. 88-90 Du Toit Loots (Северо-Западный университет, Южная Америка) интересуется характеристикой M.tuberculosis с использованием метаболомики и определения его характерных метаболитных сигнатур. Этот подход позволяет идентифицировать различные виды микобактерий с использованием конкретных маркеров метаболитов, хотя известно, что у этих видов есть незначительные генетические вариации, что свидетельствует о чувствительности этого подхода. 86 Профессор Лутс выразил оптимизм по поводу возможности использования маркеров метаболитов для построения диагностических моделей, основанных на систематических подходах в исследованиях метаболомики. 91-93 Это также может помочь в обнаружении связи между туберкулезом и его симптомами; например, повышение уровня адреналина может прогнозировать потерю веса и бессонницу у пациентов.В будущем этот подход может также использоваться для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза и прогноза. 94

Тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) — это молекулярные диагностические подходы, которые были разработаны для повышения чувствительности и специфичности при диагностике ТБ и, что наиболее важно, для выявления инфекций МЛУ-ТБ. GeneXpert® MTB / RIF Ultra был представлен на Саммите по борьбе с туберкулезом в этом году, подчеркнув значительные улучшения по сравнению с его более ранней версией. Элиза Тальяни (Научный институт IRCCS Сан-Раффаэле, Италия) продвигала новый инструмент молекулярной диагностики и приветствовала его как трансформацию усилий по выявлению / ликвидации ТБ.В последнем формате используются картриджи большего размера и дополнительные зонды, выявляющие 4 новые мутации rpoB , IS6110 и IS1081 из M. tuberculosis , что позволяет обнаруживать 30 различных устойчивых к рифампицину мутаций M. tuberculosis rpoB . С помощью этих достижений они надеются повысить чувствительность анализа, близкого к жидкой культуре. 95

Эрик Р. Хаупт (Университет Вирджинии, США) рассказал о карте массива TaqMan (TAC). Это генотипический метод обнаружения мутации патогена, который обеспечивает 2 уровня точного обнаружения мутаций с помощью зондов, специфичных для последовательности, и анализов плавления с высоким разрешением (HRM).Он может обнаруживать мутации в генах, указывающих на устойчивость, таких как rpoB, inhA, embB, gyrA и многие другие. 96 Метод прост в применении, воспроизводим, обладает хорошей чувствительностью и специфичностью. Он может улучшить выявление МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ, а следовательно, повысить уместность и эффективность лечения ТБ.

Многие коммерчески доступные форматы NAAT недоступны в центрах с ограниченными ресурсами из-за высоких затрат, связанных с приборами и расходными материалами.PURE-TB-LAMP, тест TB NAAT, утверждает, что он простой, быстрый, надежный, чувствительный (по сравнению с микроскопией мазка) и доступный (по сравнению с другими платформами NAAT). Yasuyoshi Mori (Eiken Chemical Co., Ltd., Япония) рассказал об этом наборе для скрининговых тестов, в котором используется петлевая изотермическая амплификация (LAMP), которая устраняет необходимость в дорогостоящих термоциклерах или системах обнаружения. 97 Набор состоит из набора для экстракции ДНК Loopamp ™ PURE и набора для обнаружения MTBC Loompamp ™. Три основных технических аспекта теста: (a) амплификация ДНК с помощью LAMP, (b) сверхбыстрая экстракция (PURE) ДНК, которая может удалить ингибиторы теста без значительной потери генетического материала, и (c) простое визуальное обнаружение результат с использованием флуоресценции в ультрафиолетовом свете. 98,99 Станок Loopamp ™ LF-160 не требует обслуживания или калибровки, что делает весь процесс простым и легким в освоении; отказавшись от необходимости в высококвалифицированном персонале. Чувствительность TB LAMP в 100 раз выше, чем при микроскопии мазка мокроты. 100 В настоящее время скрининговый тест одобрен для использования в Японии, Китае, Южной Корее и Таиланде. Анализы его клинических характеристик были представлены в ВОЗ для утверждения использования.

Туберкулез средостения — это форма внелегочного туберкулеза, которая часто встречается у детей, ВИЧ-инфицированных пациентов и взрослых иммигрантов в развитых странах.Число зарегистрированных случаев внелегочного туберкулеза в Великобритании за последнее десятилетие несколько увеличилось, и эта тенденция вызывает беспокойство. 101 Диагностика туберкулезного лимфаденита средостения является сложной задачей из-за его неспецифической клинической картины, нормальных результатов рентгенологического исследования грудной клетки и низкопродуктивного посева мокроты. 102,103 Эти расплывчатые проявления необходимо дифференцировать с другими подобными заболеваниями, такими как лимфома, карцинома и саркоидоз. 102 Онн Мин Кон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) подчеркнул, что нельзя упускать из виду туберкулез средостения, особенно когда у пациентов с подозрением на изолированный лимфаденит средостения проводится нормальный рентген грудной клетки.Последующее сканирование грудной клетки с помощью ПЭТ / КТ является обязательным для подтверждения положительной лимфаденопатии. 104 Взятие пробы ткани лимфатических узлов средостения является обязательным для определения этиологии заболевания, ранее в основном выполнялось с использованием таких методов, как медиастиноскопия шейки матки. Однако этот инвазивный метод связан со значительной заболеваемостью и смертностью, поэтому эндоскопическая трансбронхиальная игольчатая аспирация под контролем УЗИ (EBUS-TBNA), обычно используемая при диагностике рака легких, рекомендуется в качестве минимально инвазивной альтернативы для диагностики туберкулеза средостения. 105-107 Профессор Кон сообщил, что этот широко используемый метод микробиологической диагностики в сочетании с GeneXpert® MTB / RIF может повысить чувствительность и специфичность диагностики туберкулеза средостения, ускорить оценку подозреваемых случаев и обеспечить быстрое обнаружение устойчивых M. tuberculosis штаммы. 108

M. bovis является членом комплекса MTB и не зависит от хозяина. Он может заразить альпак, лам, собак и кошек, а затем передать их владельцам животных.Великобритания не смогла сдержать болезнь, несмотря на ряд радикальных мер, принимаемых для контроля над популяциями естественных резервуаров. Для диагностики инфекции M. bovis требуется три месяца, и это стоит 140 долларов за образец. Дифференциация между M. bovis и M. tuberculosis необходима, поскольку первый по своей природе устойчив к пиразинамиду.

Традиционные подходы к созданию тестов серологического ответа используют либо непатогенные штаммы БЦЖ, либо убитые нагреванием / химически инактивированные патогены.Эти суровые условия повреждают важные конформационные эпитопы клеточной поверхности, которые не представлены или не поддерживаются во время обнаружения. Новый подход, опробованный Линдой Стюарт (Университет Белфаста, Великобритания), заключался в использовании гамма-облученных патогенных штаммов для разработки специфических связывающих веществ M. bovis . 109 Использовали цельноклеточные или экстрагированные этанолом поверхностные антигены и получали как поликлональные, так и моноклональные антитела с использованием технологии фагового дисплея. Результатом этого был набор связывающих веществ, которые были охарактеризованы с помощью ELISA и иммунофлуоресцентного окрашивания.Основная цель их усилий заключалась в разработке диагностического теста, в котором использовались бы связующие вещества для выявления заболеваний, которые могли бы различать инфекции M. bovis и M. tuberculosis , в отличие от коммерчески доступных наборов, имеющихся на рынке в настоящее время.

Густаво Морейра (Технический университет Брауншвейга, Германия) обсудил использование фагового дисплея для идентификации биомаркеров и генерации человеческих антител для диагностики и терапии. Фаговый дисплей антител включает процесс in vitro , который не затрагивает иммунную систему.Процесс начинается со вставки генов антител в геном фага, который затем выражается в виде слитого белка, отображаемого на внешней поверхности фага. Следующий этап называется пэннингом, когда антиген опрашивается созданной библиотекой антител. Идентификация положительно связывающихся антител выполняется с помощью ELISA, иммуноблоттинга или проточной цитометрии. 110

M. tuberculosis секретирует белок, называемый антигеном 85 (Ag85). Были отобраны гены антител из наивной библиотеки и клонированы в дрожжевые системы отображения.Эту комбинацию фагового и дрожжевого дисплеев использовали для получения антител против Ag85. Клоны были проверены на самое высокое связывание антигена, выявив 7 пар антител, которые могут обнаруживать Ag85 при наномолярных концентрациях, однако ни один из клонов не был строго специфичным для одной из субъединиц антигена 85 комплекса. 111 В другом исследовании использовались 5 человеческих антител против Ag85B из исходных библиотек, где 3 из них специфически связывались с белками 85B, как было проверено с помощью ELISA. 112

Мониторинг реакции хозяина на лечение ТБ может определить эффективность лечения и спрогнозировать вероятность рецидива.Текущий метод подтверждения успеха лечения — это конверсия бактериологической культуры через 2 месяца от начала терапии. Бактериальная транскриптомика предлагает новые возможности для изучения элиминации патогена у пациента. Dimitrios Evangelopoulos обсудил молекулярные методы обнаружения снижения бактериальной нагрузки во время лечения как биомаркера прогрессирования инфекции. Метод обнаружения микобактериальной РНК был разработан с использованием искусственного матрикса, напоминающего образцы мокроты, и применен к клиническому случаю у 12-летнего пациента. 113 В этом случае методы окрашивания выявили присутствие кислотоустойчивых бацилл, однако анализы жидких культур не смогли обнаружить никаких живых бацилл. При использовании анализа молекулярной бактериальной нагрузки (MBL) у пациента была выявлена ​​высокая бактериальная нагрузка, и схема лечения была изменена с включением моксифлоксацина. После года лечения ни MBL, ни окрашивание не выявили никаких бацилл, и пациент был подтвержден как излечившийся.

Пилотное исследование на мышах показало, что этот анализ также можно использовать с тканями животных.Анализы MBL и колониеобразующих единиц (КОЕ) в тканях мышей, подвергавшихся разному лечению, показали, что оба анализа согласуются друг с другом, причем первый последовательно обнаруживает большее количество клеток, вероятно, в результате обнаружения некультивируемой клеточной популяции. 113 Таким образом, MBL-анализы могут служить быстрым и чувствительным инструментом диагностики и мониторинга лечения, предлагать понимание эффективности лекарств и могут использоваться при открытии новых лекарств.

Открытие лекарств: преодоление препятствий

Поиск новых терапевтических целей

С момента знаменательного объявления полной последовательности генома M.tuberculosis , была целенаправленная работа по выявлению важных генов и визуализации их белковых продуктов, что позволило начать проекты по созданию целевых лекарств. Том Бланделл (Кембриджский университет, Великобритания) заинтересован в изучении биологического космоса, переходящего от генома к протеому. Традиционные методы влажных лабораторных исследований для понимания протеома патогена должны быть подкреплены подходами системной биологии. С этой целью группа профессора Бланделла работала над Шопеном, который наследует информацию об известных структурах примерно 400 белков и использует ее для прогнозирования моделей для остальных 3500 белковых структур. 114 На основании информации из общедоступных баз данных; взаимодействия, лиганды и олигомерные состояния многих белков могут быть расшифрованы. Затем эту информацию можно использовать для структурно-ориентированных и фрагментарных подходов к открытию лекарств. Обоснованием этой стратегии является использование небольших молекул с беспорядочной аффинностью связывания для исследования субструктур, присутствующих с белками-мишенями, с использованием стандартных биофизических анализов связывания лигандов. Затем удары оптимизируются для получения молекулы, которая связывается с целевым белком в наномолярных концентрациях.Используя этот подход, они успешно разработали ингибиторы против EthR, репрессора транскрипции для белка, активирующего этионамид. 115 Поскольку развитие мутаций является основным препятствием для индустрии разработки противотуберкулезных препаратов, профессор Бланделл также обсудил использование технологий секвенирования второго поколения для разработки основанного на знаниях подхода к пониманию эволюционной динамики. Влияние однонуклеотидных полиморфизмов на стабильность белка, сродство белок-белок / нуклеиновая кислота / лиганд теперь может быть установлено с помощью mCSM, другого полезного инструмента веб-сервиса, разработанного группой. 116

Выявление мишеней для лекарств, которые можно использовать, является важным шагом на пути к рациональному дизайну лекарств. Клеточная стенка микобактерий уникальна для грамположительных и грамотрицательных организмов и является хорошим источником для мишеней противомикобактериальных препаратов, как это обсуждали Санджиб Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) и Дирк Шнаппингер (Вейл Корнелл). Медицинский колледж, США). Он содержит комплекс миколиновой кислоты, арабиногалактана и пептидогликана, образующий ядро ​​клеточной стенки — характерная особенность, которая на протяжении многих лет привлекала внимание нескольких исследователей.

Разрушение миколовой кислоты M. tuberculosis оказалось отличной стратегией для нацеливания на патоген, о чем свидетельствует успех таких лекарств, как изониазид, этамбутол и пиразинамид, все из которых нацелены на синтез миколиновой кислоты. Однако рост устойчивости штаммов M. tuberculosis к этим препаратам усилил потребность в новых мишенях. Биотин является важным кофактором для всех ацил-КоА-карбоксилаз (АССаз), которые играют роль в обеспечении строительных блоков для синтеза компонента жирных кислот в M.tuberculosis клеточная оболочка. Клетки млекопитающих приобретают биотин из внешней среды и, таким образом, лишены этих ферментов, что подтверждает этот путь для разработки по сути селективных противотуберкулезных препаратов. 117 Кроме того, мутанты в пути синтеза биотина могут вызывать только ослабленные формы инфекций у мышей, что позволяет предположить, что патоген не может получить экзогенный биотин. 118 Проф Шнаппингер и его группа обнаружили, что мутация одного из ферментов, BioA (биотинлигаза) в M.tuberculosis сделал его неспособным выжить in vitro, и у мышей, что указывает на то, что синтез биотина de novo имеет решающее значение для выживания и устойчивости патогена. 119 BioA подвержен ингибированию, что подтверждается его ингибированием с использованием антибиотика амикленомицина. 120,121 Однако этот антибиотик слишком полярен и непригоден для использования в рамках длительной схемы лечения туберкулеза. Целенаправленный подход, предпринятый группой профессора Шнаппингера, позволил идентифицировать мощный бисубстратный ингибитор биотиновых протеинлигаз (называемый Bio-AMS) из M.tuberculosis , который действует путем взаимодействия как в карманах связывания биотина, так и АТФ. 122 Этот конкурентный ингибитор оказался очень селективным и сильным против штаммов туберкулеза, что свидетельствует о том, что генетические подходы, способствующие открытию противотуберкулезных препаратов, по-прежнему заслуживают внимания.

Д-р Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) был пионером в исследованиях метаболизма пептидогликана (PG) в M. tuberculosis на протяжении более десяти лет. 123 АТФ-зависимые гены лигазы Mur участвуют в синтезе предшественников PG.Эти гены ограничены бактериями, и было обнаружено, что они необходимы для микобактерий с помощью гибридизации сайта транспозона (TraSH). Структура murE была разрешена до 3Å и показывает доступный активный участок кармана, который можно использовать для создания лекарств. 124,125 Ферментативное ингибирование MurE из M. tuberculosis наблюдали с экстрактами колумбийских растений и химически синтезированными соединениями хинолона, тем самым демонстрируя, что лигазы могут служить мишенями для лекарств. 126-129 Кроме того, поскольку клеточное деление и биогенез клеточной стенки строго контролируются кооперативными процессами, неудивительно, что гены лигазы мур сгруппированы в опероне клеточной стенки ( dcw ), что дополнительно указывает на то, что нацеливание на этот путь будет иметь эффект «нокдауна» на совместно регулируемые пути.

Дивисома микобактерий представляет собой многофакторный комплекс, который собирается в средней клетке и вызывает расщепление бактерий, в результате чего образуются 2 дочерние клетки.Нарушение процесса деления клеток может серьезно повлиять на инфекционность патогена. С этой целью Тим А. Кросс (Университет штата Флорида, США) исследовал двух рекрутов дивизома, CrgA и ChiZ, о которых мало что известно. Структура микобактериального CrgA была смоделирована с и без белка деления FtsQ. Используя твердотельный ЯМР, они обнаружили, что CrgA состоит из 2 трансмембранных спиралей с очень точными осями вращения. Ожидается, что экспонированные остатки глицина в структуре будут участвовать в связывании с белками в дивисоме. 130 N — конец CrgA по своей природе неупорядочен, однако Dr Cross предполагает, что на липидном интерфейсе он, вероятно, будет принимать конформацию β-листа.

Вопреки ожиданиям, рациональная разработка лекарств не позволила определить количество потенциальных кандидатов в ведущие лекарственные препараты, которые были получены с помощью методов цельноклеточного фенотипического скрининга, таких как тот, который обсуждал д-р Бхакта. SPOTi — это метод, основанный на твердой культуре, при котором оптимизированное количество бактерий наносится на агар, содержащий серию разведений молекул ингибитора. 131-133 Этот метод адаптирован к формату 96-луночного микропланшета, тем самым увеличивая производительность.

Однако, как только обнаруживается мощный ингибитор роста микобактерий, важно идентифицировать эндогенную мишень молекулы. Существует несколько доступных технологий для идентификации целей, таких как подходы, основанные на геноме, аффинности и знаниях. Cristiano V. Bizarro (PUCRS, Бразилия) рассказал о импульсном протеолизе и преципитации для идентификации мишени (PePTID). 134 Это энергетический метод, при котором белковые экстракты инкубируются с лигандом или без него с последующим применением короткого протеолитического импульса и осаждения трихлоруксусной кислотой. Масс-спектрометрия используется для анализа результатов, и в качестве доказательства концепции они применили методологию для идентификации АТФ-связывающих белков с использованием негидролизуемого АТФγ в M. smegmatis .

Перспективные молекулы и натуральные продукты

Даниэле Кастаньоло (Королевский колледж Лондона, Великобритания), Ярослав Ро (Карлов университет в Праге, Чешская Республика) и Ill Y.Ли (Корейский научно-исследовательский институт химических технологий, Южная Корея) рассказал о многообещающих потенциальных противотуберкулезных препаратах, находящихся на разных этапах разработки в результате их исследовательских усилий.

Доктор Кастаньоло упомянул, что использование молекул, похожих на те, которые не прошли клинические испытания, и их оптимизация для улучшения их характеристик может быть выигрышной стратегией. Он отметил, что две мощные антимикобактериальные молекулы, BM212 и SQ109, имеют схожее топологическое распределение химических свойств.Однако у них были ограничения в отношении фармакокинетических параметров, растворимости, профиля цитотоксичности и эффективности против штаммов M. tuberculosis MDR . Стратегия группы заключалась в гибридизации этих двух препаратов для получения новых производных для достижения улучшенной противотуберкулезной активности или, возможно, снижения цитотоксичности. Было синтезировано два поколения соединений, и, что интересно, первое поколение соединений оказалось мощными ингибиторами эффлюксной помпы с множеством лекарственных препаратов, а это означает, что эти молекулы могут усилить действие стандартной химиотерапии. 135

Доктор Ли исследовал такие производные, как фениловый эфир и карбонатные производные нитроимидазола, поскольку в молекуле есть пространство для размещения реактивных групп, которые могут улучшить ее антимикобактериальный профиль. 136,137

Доктор Ро исследовал 5-замещенные 2 — [(3,5-динитробензил) сульфанил] -1,3,4-оксадиазолы и 1,3,4-тиадиазолы на предмет их превосходной антимикобактериальной активности как в отношении чувствительных, так и лекарственно-устойчивые формы M. tuberculosis со значениями МПК от 0.03 мкМ. Соединения проявляли селективную антимикобактериальную активность без активности против грамположительных, грамотрицательных и грибков. Перекрестной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда не наблюдалось. Исследования взаимосвязи структурной активности продемонстрировали, что 3,5-динитрофенильный фрагмент играет решающую роль в обеспечении антимикобактериальной активности. 138-140 Любые изменения положения динитрогруппы приводили к потере или снижению противотуберкулезной активности в несколько раз. Тест AMES показал, что эти соединения, содержащие нитрогруппу, не обладают мутагенной активностью. 140 Они также проявили низкую клеточную токсичность in vitro на 3 линиях клеток млекопитающих. Соединения имеют структурное сходство с ингибиторами DprE1, такими как динитробензамиды или бензотиазинон. Однако эксперименты с радиоактивной меткой показали снижение включения урацила, что указывает на то, что бактериальные клетки страдают от дефекта синтеза ДНК при лечении. Дальнейшие исследования по оптимизации соединений для улучшения растворимости и замены атома серы продолжаются, поскольку его присутствие в молекуле делает ее очень восприимчивой к метаболической деградации.

Натуральные продукты играют важную роль в открытии новых лекарств и являются богатым источником противомикробных препаратов. По оценкам, одна треть населения мира полагается на традиционную медицину для удовлетворения своих медицинских потребностей. Скрининг натуральных продуктов высших растений представляет собой одно из направлений поиска новых свинцовых противотуберкулезных агентов. Мария дель Райо Камачо-Корона (Автономный университет Нуэво-Леон, Мексика) оценила антимикобактериальную активность 9 растений, используемых в традиционной мексиканской медицине.Они выбрали растения на основе обширного поиска в мексиканской этноботанической литературе. Некоторые из растений включали Citrus sinensis, Citrus aurantifolia, Foeniculum vulgare, Larrea tridentata, Musa acuminata и Olea europaea . 141 Экстракты из различных частей растений были приготовлены путем мацерации с использованием гексана, хлороформа, метанола и воды. Экстракты растений тестировали с использованием анализа alamar blue на микропланшетах и ​​тестировали против M. tuberculosis и его изолятов MDR.Гексановый экстракт кожуры плодов цитруса Citrus aurantiifolia фракционировали с помощью колоночной хроматографии, и основные соединения были выяснены с помощью ЯМР-спектроскопии и ГХ-МС. Было идентифицировано несколько соединений, таких как кумарины, линолевая, пальмитиновая и олеиновая кислоты, многие из которых были летучими и ингибировали рост патогена.

Антимикробные пептиды (АМФ) являются неотъемлемой частью врожденного иммунитета, который помогает в борьбе с различными патогенами. Обычно они действуют путем разрушения мембран бактериальных клеток.В водной среде АМП существуют в виде отдельных молекул. При контакте с мембранами они упорядочиваются и образуют поры в мембранах. Их действие быстрое и эффективное даже против штаммов с высокой лекарственной устойчивостью, и, следовательно, они могут использоваться в качестве дополнительного лечения. Некоторые из них в настоящее время проходят клиническую разработку для лечения нескольких бактериальных инфекций. Однако природные AMP не являются хорошими кандидатами в лекарства из-за их большого размера, что приводит к более высоким производственным затратам. Черпая вдохновение в природе для создания новых AMP, Jasmeet S.Khara (Королевский колледж Лондона, Великобритания) принял рациональный дизайн для производства пептидов с меньшей вероятностью индукции устойчивости и пептидов, которые демонстрируют синергизм со стандартными антибиотиками. 142 Существуют различные стратегии модификации AMP, такие как синтез пептидных конъюгатов, пептидомиметиков и получение гибридных пептидов. Они сосредоточились на дизайне de novo и пришли к первичной последовательности, содержащей 4 аминокислоты (xxyy) n, где «x» и «y» являются гидрофобными и катионными остатками соответственно с числом повторов «n».Было обнаружено, что последовательности, содержащие повторяющиеся остатки лейцина и лизина, такие как (LLKK) 2 в качестве основы с короткими амфипатическими α-спиралями, являются антимикобактериальными. При добавлении остатков метионина к α-спиральной части гидрофобность пептида увеличивалась, что делало его внедрение в клеточную мембрану более эффективным. Пептиды проявляли синергизм с противотуберкулезными препаратами первой линии и были эффективны против лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis .Механизм действия этих пептидов анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии и визуализации живых клеток обработанных микобактерий. В присутствии пептидов мембрана бактериальных клеток была более проницаемой для красителя.

Репозиционирование лекарств: многообещающая альтернативная стратегия открытия лекарств?

Переназначение стало привлекательной стратегией для открытия лекарств, которые могут быть непосредственно добавлены к арсеналу лекарств, используемых для лечения туберкулезных инфекций. Susanne Brighenti (Каролинский институт, Швеция) заинтересована в усилении врожденной системы защиты хозяина в качестве альтернативной стратегии лечения инфекционных заболеваний.Комбинация витамина D3 и 4-фенилбутирата (PBA) проявляет синергетический эффект на продукцию LL-37 в разных типах клеток. LL-37 представляет собой AMP, который вызывает аутофагию в макрофагах человека, инфицированных M. tuberculosis . 143,144 Повышенная выработка LL-37 может потенциально увеличить уничтожение как внеклеточных, так и внутриклеточных бактерий, как сообщалось ранее. Нет значительных клинических или микробиологических данных об эффектах лечения этими препаратами. Таким образом, на основе исследования шигеллеза, проведенного в Бангладеш, клинические исследования были разработаны для проведения в Эфиопии и Бангладеш. 145 Исходный уровень витамина D3 в сыворотке у населения Эфиопии оказался низким, и было рекомендовано принимать добавки. Рандомизированное двойное слепое клиническое испытание с использованием ежедневного приема витамина D и PBA в качестве дополнительного лечения к стандартной химиотерапии было проведено для изучения комбинированного воздействия на продукцию LL-37. Оба увеличивали продукцию LL-37 в макрофагах человека и зависимую от LL-37 аутофагию в инфицированных макрофагах. Они также наблюдали уменьшение клинических симптомов с улучшенным выздоровлением и быстрой конверсией посева мокроты при дополнительной терапии только с помощью vitD3 или в комбинации с PBA.Следовательно, vitD3 и PBA могут противодействовать подавлению активности LL-37 во время инфекции, что может иметь положительное влияние на снижение потребности в антибиотиках для лечения. 145-147

Д-р Бхакта и его исследовательская группа сообщили, что распространенные, отпускаемые без рецепта нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), ибупрофен и карпрофен обладают специфической противотуберкулезной активностью. 131 148 149 Было обнаружено, что они активны в отношении штаммов, устойчивых к лекарствам, и микобактерий стационарной фазы. Эндогенный механизм действия этих препаратов все еще обсуждается, однако транскриптомный анализ показывает, что препараты могут оказывать плейотропное действие на патоген.Кроме того, иммуномодулирующие эффекты НПВП и обеспечиваемая ими защита от воспаления и повреждения тканей являются главным аргументом в пользу включения этого класса лекарств в качестве вспомогательных терапий, направленных на хозяина, в дополнение к стандартному лечению против туберкулеза с целью улучшения результатов лечения.

M. tuberculosis обладают 2-регуляторной системой PhoPR, которая важна для восприятия кислой среды, обнаруженной в макрофагах, и реагирования на нее, а также для ее использования в своих интересах. Роберт Абрамович (Университет штата Мичиган, США) стремился найти соединение, которое ингибирует регуляторную систему, делающую патоген восприимчивым к иммунным ответам хозяина. Для выявления ингибиторов регулона использовали фенотипический скрининг целых клеток. Высокопроизводительный скрининг почти 220 000 библиотек соединений выявил, что этоксоламид ингибирует регулон, но не влияет на рост патогена. Этоксзоламид — ингибитор карбоангидразы, который используется для лечения глаукомы и язв двенадцатиперстной кишки.Транскрипционные исследования показывают, что этоксоламид подавляет 45 генов в M. tuberculosis . Известно, что эти гены контролируют синтез липидов, углеродный метаболизм и вирулентность. В качестве основного вывода этого исследования они заявляют, что этоксзоламид не изменяет гомеостаз pH M. tuberculosis ‘, но подавляет его pH-зависимую адаптацию и вирулентность. 150

Джерри Дэвис (Ливерпульский университет, Великобритания) обнаружил, что проблема с разработкой нового лечения заключается в отсутствии комплексного подхода к фармакокинетическому и фармакодинамическому анализу клинических исходов, наряду с плохо спланированными исследованиями на животных, приводящими к неудачам в лечении. клинические испытания.Это захватывающее время для полевых клинических разработок лекарств от туберкулеза, поскольку несколько новых и перепрофилированных лекарств проходят испытания. Испытания фазы II B одного из немногих многообещающих кандидатов, фторхинолонов, гатифлоксацина и моксифлоксацина, показали, что препараты работают хорошо и ускоряют скорость конверсии посевов на ранних этапах клинической разработки, давая надежду на сокращение продолжительности терапии и снижение частоты рецидивов. Испытания фазы III, в которых моксифлоксацин был включен в схемы лечения первой линии как средство сокращения продолжительности лечения до 4 месяцев, закончились разочарованием.Доктор Дэвис предлагает концепцию бесшовного дизайна исследования с набором основных результатов. Это позволило бы оценить результаты в нескольких промежуточных точках, а руки, которые работают плохо, прекратить. Следовательно, ресурсы и пациентов можно направить в руки, которые хорошо работают в тщательно отобранных точках, чтобы минимизировать потери средств и времени. 151

Отчет с международного саммита Euroscicon по борьбе с туберкулезом 2016

РЕЗЮМЕ

Сказать, что туберкулез (ТБ) вернул себе прочную точку опоры в глобальном сценарии здоровья и благополучия человека, было бы преуменьшением.Наряду с ВИЧ / СПИДом в качестве основной причины смертности от одного инфекционного заболевания влияние туберкулеза простирается далеко в социально-экономический контекст во всем мире. По мере того, как глобальные усилия, возглавляемые экспертами и политическими органами, объединяются для смягчения прогнозируемого результата роста устойчивости к противомикробным препаратам, академическое сообщество студентов, практиков и исследователей мобилизовалось для разработки интегрированных междисциплинарных программ, чтобы претворить в жизнь планы первых. Выполнение этого важнейшего требования для беспрепятственного распространения научных открытий было реализовано на Саммите по борьбе с туберкулезом в 2016 году в Лондоне, Соединенное Королевство.В этом отчете критически обсуждаются недавние достижения в диагностике и лечении, а также освещаются основные препятствия в борьбе с этим заболеванием, которые обсуждались в ходе трехдневного международного мероприятия. Конференции и симпозиумы, подобные этим, являются питательной средой для успешного местного и глобального сотрудничества, и поэтому их необходимо поддерживать для расширения понимания и распространения фундаментальных научных исследований.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антибиотиков, открытие лекарств, лекарственная устойчивость, тестирование лекарственной чувствительности, туберкулез

Введение

Для болезни, которую следует в значительной степени контролировать, туберкулез (ТБ) по-прежнему требует более 1.5 миллионов жизней ежегодно, из них 140 000 детей. 1 Среди множества факторов, способствующих успеху заболевания, можно выделить стойкую природу возбудителя Mycobacterium tuberculosis и растущую лекарственную устойчивость, приобретенную им в результате десятилетий лечения с использованием фиксированного режима приема лекарств. Длительные диагностические процедуры, неправильные диагнозы с последующим неправильным назначением лечения позволяют устойчивым штаммам распространяться внутри и за пределами сообществ.Это еще более усложняется, поскольку туберкулез в основном ассоциируется со странами с ограниченными ресурсами, которые имеют высокую плотность населения, где программы отслеживания контактов скомпрометированы из-за отсутствия инфраструктуры. 2 Однако безрадостная обстановка вызвала потребность в инновационных, быстрых и точных диагностических тестах, основанных на молекулярных методах, таких как GeneXpert® MTB / RIF, которые широко используются во всем мире. 3 Эти технологии требуют дальнейшего развития, чтобы соответствовать потребностям времени в бедных районах с низкой инфраструктурной поддержкой.Для эффективного контроля над заболеванием успехи в диагностике должны отражаться появлением эффективных терапевтических средств для лечения инфекции.

Открытие противомикробных препаратов часто рассматривается как «предприятие с высоким риском и низкой отдачей». И этот сектор игнорировался фармацевтическими компаниями и одновременно игнорировался политикой общественного здравоохранения. Это привело к критической нехватке новых лекарственных препаратов в клинических испытаниях. Поскольку в настоящее время ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) обнаружен в 105 странах, FDA США предоставило ускоренные варианты разработки противотуберкулезных препаратов. 1 Примерно через полвека отсутствия новых лекарств для лечения пациенты с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наконец, имеют возможность, хотя и в соответствии со строгими правилами, получать для лечения бедаквилин или деламанид. 4,5

Государственные расходы на лечение ТБ в большинстве случаев колеблются в пределах 100-500 долларов США, увеличиваясь до 10 000 долларов США в случае пациентов с МЛУ ТБ. 1 Прогнозируется, что рост устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) обойдется мировой экономике от ≤2,1 трлн. До более ≤100 трлн. В 2050 году, в зависимости от предпринятых вмешательств и их эффективности. 6 Это бремя было бы прямым результатом прогнозируемой ежегодной потери 10 миллионов жизней в наиболее продуктивные годы, если бы УПП распространялся бесконтрольно. На туберкулез приходится большая часть бремени, вызванного УПП. Кроме того, воздействие туберкулеза на животноводство имеет серьезные последствия, поскольку отсутствуют вакцины или практические, экономически эффективные средства лечения инфицированных животных. В некоторых частях Уэльса в Соединенном Королевстве сообщается о стремительном росте количества забитого крупного рогатого скота из-за туберкулеза крупного рогатого скота. 7 Эти выбраковки создали непреднамеренную нагрузку на животноводческую отрасль и местные органы власти.

В сегодняшнем глобальном мире и экономике объединение усилий, начиная со студента, сидящего на скамейке, должно пройти до цепочки поставок, которая в конечном итоге приводит к получению готового диагностического или терапевтического продукта, используемого в пункте оказания медицинской помощи или у постели пациента. Ученым необходимо понимать основные реалии и трудности, с которыми сталкиваются медицинские работники, чтобы предлагать эффективные решения и стратегии.Точно так же врачей необходимо информировать о последних достижениях в области фундаментальных научных исследований, чтобы быстрее создавать механизмы обратной связи, которые могут выявить области, в которых существует острая необходимость в развитии. Поэтому очень важно установить каналы связи между этими разнородными людьми, объединенными своими усилиями по борьбе с туберкулезом.

TB Summit 2016, третье мероприятие подобного рода, организованное Euroscicon, было достойно проведено в Северном Гринвиче, Лондон (Великобритания), поскольку это один из районов Лондона с самой высокой заболеваемостью туберкулезом. 8-10 В трехдневном мероприятии приняли участие представители университетов и государственных учреждений со всего мира. Информативная устная презентация и стендовые сессии были разделены на категории для систематического обсуждения различных аспектов туберкулеза, что более подробно обсуждается в следующих разделах отчета.

Туберкулез: заболевание, возбудитель и хозяин

Изучение распространения туберкулеза

Туберкулез в его наиболее распространенной форме представляет собой воздушно-капельное заболевание, которое поражает ткани легких и находится в макрофагах и других фагоцитарных иммунных клетках гостья.Иммунные ответы хозяина служат для изоляции организма в отделах, известных как гранулема. 11 Эти гранулемы в дальнейшем созревают с образованием некротических поражений, которые, наконец, разрушаются механическим сдвигом и выбрасываются в воздух в результате кашля или разговора инфицированного человека. 12 Хотя воздушно-капельный путь передачи широко распространен, необходимо провести адекватное расследование различных стадий заболевания, а именно: изгнание бактерий, передача через воздух, вдыхание и инфицирование нового хозяина.

Кашель считается важным фактором передачи туберкулеза, поскольку он является распространенным симптомом туберкулеза легких. Поскольку M. tuberculosis заключен в полости легких в толстые биопленки, требуется большое усилие, чтобы выбросить бациллы в дыхательные пути и наружу. При кашле выделяется больше капель, чем при других маневрах, таких как разговор или пение, поскольку в первом акте задействована более высокая сила и, таким образом, считается, что это основной фактор, участвующий в механизме передачи. 13,14 Несколько исследований, изучающих характер кашля и передачу инфекции в домашних условиях, показали, что пациенты кашляют чаще днем, чем ночью, и что частота кашля является важным показателем передачи. 15,16 Как отмечает Ричард Тернер (Фонд NHS Foundation Trust, Великобритания), кашель в контексте заразности туберкулеза не изучался. Причина кашля у больного туберкулезом; его необходимость в передаче туберкулеза, корреляция с инфекционными / неинфекционными штаммами патогена и характеристики оптимальных капель от кашля для передачи заболевания еще предстоит полностью понять. Такие факторы, как анатомия дыхательных путей, количество, состав и вязкость мокроты, были упущены из виду, и необходимо разработать методики их исследования.

Изучение моделей передачи туберкулеза может помочь разработать эффективные стратегии вмешательства для борьбы с болезнью. Исчерпывающие исследования по отслеживанию передачи должны быть способны обнаруживать или исключать передачу между случаями, отслеживать последовательное приобретение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) вдоль цепочки передачи и дифференцировать первичный и приобретенный фенотипы устойчивости с учетом разнообразия хозяев. Однако инфекции ТБ печально известны своей неоднородностью в пределах одного и того же хозяина, поскольку длительный период инфицирования позволяет микроэволюции бацилл в течение одного цикла заражения. 17 С другой стороны, патоген имеет низкую скорость репликации и склонность к низкому генетическому разнообразию. Таким образом, бациллы могут либо не демонстрировать генетического разнообразия, либо иметь несколько SNP между контактами, что чрезвычайно затрудняет отслеживание передачи, используя только их генную последовательность. Кэролайн Колин (Имперский колледж Лондона, Великобритания) предлагает объединить датированные филогенетические деревья со статистическим моделированием, чтобы выявить вероятность дерева передачи с использованием моделирования цепи Маркова Монте-Карло / методов байесовского вывода. 18 Однако использование статистических методов для вывода о передаче туберкулезных микобактерий требует вычислительно-интенсивных методов вывода, которые страдают от ограничений доступных данных и предположений, сделанных для построения моделей, как указано в Ярно Линтусаари (Университет Аалто, Финляндия) . 19 Сложность процесса затрудняет получение надежных выводов на основе статистических моделей динамики передачи.

Альберт Ниенхаус (Университетский медицинский центр, Германия), Джеймс Седдон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) и Роберт Уилкинсон (Кейптаунский университет, Южная Америка) обсудили препятствия на пути контроля передачи среди различных групп лица высокого риска — медицинские работники, дети и пациенты с ВИЧ.

Говоря о профессиональном приобретении болезней, профессор Ниенхаус заявил, что туберкулез является одним из наиболее инфекционных заболеваний, поражающих медицинских работников (МР) в Германии. 20 Ситуация хуже в таких странах, как Португалия и Франция, где уровень заболеваемости определенно выше — 33% и 19% по сравнению с 10% в Германии. 21,22

Медицинские работники, особенно врачи и медсестры, подвергаются более высокому риску заражения активной и латентной инфекцией ТБ (ЛТИ) из-за продолжительных и частых контактов с инфицированными пациентами.Напротив, в этой группе уровень передачи контактов контактам ниже, чем в других группах инфицированных людей в результате частых проверок состояния здоровья. 23 После тщательного изучения данных скрининга 32 практикующих врачей профессор Ниенхаус рекомендовал ежегодный скрининг медицинских работников из группы высокого риска из-за контакта с высокоинфекционными пациентами. Однако в руководствах по скринингу, выпущенных системами общественного здравоохранения разных стран, предлагается разнообразная комбинация рентгеновских лучей, туберкулиновой кожной пробы (ТКП) и тестов высвобождения гамма-интерферона (IGRA) без единого мнения о наилучшей стратегии. 24,25 Он предположил, что в обстоятельствах, когда IGRA положительный, а рентгеновский отрицательный, LTBI может быть подтвержден и сопровождаться профилактическими мерами, если считается, что риск отказа от лечения выше, чем риск, связанный с его назначением. Обнадеживает, что выявление ЛТИ у медработников растет с годами по мере совершенствования диагностических технологий, и ожидается, что исследования динамики риска и вознаграждения лечения позволят разработать единое глобальное решение.

Еще одна группа с высоким риском заражения этим заболеванием, главным образом из-за их связи с инфицированными взрослыми, — это дети. Несмотря на то, что у детей зарегистрирован один миллион случаев туберкулеза, очень мало делается для понимания патогенеза и доступных для них вариантов лечения. Д-р Седдон работает над улучшением нашего понимания вариантов лечения и профилактики МЛУ-ТБ у детей. 26 ТБ у детей и младенцев трудно диагностировать, так как затруднен сбор мокроты.Еще больше усложняет ситуацию то, что заболевание проявляется в нескольких формах, включая инфекцию внутри- или внегрудных лимфатических узлов. 27 Следовательно, лечение необходимо подбирать в соответствии с потребностями и состоянием здоровья ребенка. Хотя исследования показывают, что почти все дети, которым поставлен диагноз, завершают курс лечения и имеют очень хорошие результаты, схемы лечения МЛУ-ТБ у детей требуют пересмотра, поскольку фармакокинетика и токсичность лекарств у детей значительно отличаются от таковых у взрослых. 28,29 Схема лечения лекарственно-чувствительного туберкулеза у детей представляет собой стандартную 6-месячную комбинированную терапию, при которой в течение первых 2 месяцев назначают рифампицин, изониазид и пиразинамид, а затем 4 месяца — рифампицин и изониазид. 30 Детям, страдающим ВИЧ и туберкулезом, рекомендуется дополнительный прием этамбутола в первые 2 месяца. Будущие испытания для оценки стратегий профилактики туберкулеза включают TB-CHAMP для оценки левофлоксацина у детей до 5 лет и ACTG A5300 для оценки левофлоксацина и изониазида у взрослых и детей, а также ряд других. 26,31 По мере того, как новые и перепрофилированные лекарственные препараты входят в терапевтические схемы, оценка их фармакокинетических свойств у детей остается важной.

Профессор Уилкинсон и его команда изучают связь между туберкулезом и ВИЧ в Хайелитше, Южная Африка. Хайелитша — бедный городок, в котором распространенность туберкулеза является одной из самых высоких в мире. Сообщается, что распространенность дородовой ВИЧ-инфекции составляет 25% от общей численности населения, при этом почти 40% имеют риск развития активного туберкулеза. 32 Кроме того, 76% случаев туберкулеза также являются ВИЧ-инфицированными. 32 Команда провела рандомизированное контролируемое испытание только антиретровирусной терапии (АРТ) и профилактической терапии изониазидом (ПЛИ) в сочетании с АРТ (АРТ) для профилактики ВИЧ-ассоциированного ТБ. Результаты показали, что изониазид, добавленный к противовирусной терапии, снижает риск туберкулеза на 35%, как это наблюдалось после года терапии IPT. 33 Он также подсчитал, что люди, инфицированные ВИЧ, имеют примерно в 30 раз больше риска заражения активным туберкулезом из-за иммуносупрессии, а в условиях очень высокой заболеваемости повторное инфицирование встречается чаще, чем эндогенная реактивация болезни. 34

Mycobacterium tuberculosis: более пристальный взгляд

Род Mycobacterium претерпел несколько событий видообразования и генетического распада, что привело к появлению множества непатогенных и патогенных видов с различной специфичностью к хозяину. В отличие от других бактерий, виды микобактерий не участвуют в горизонтальном переносе генов, поэтому эволюция происходит постепенно, за счет небольших генетических изменений, регулируемых естественным отбором или связанных с эволюцией человека и его палеомиграцией.Ход этих генетических дрейфов привел к тому, что M. tuberculosis превратились в облигатный патоген со специфичностью к хозяину, ограничиваемой в первую очередь людьми. 35 Frédéric Veyrier (INRS-Institut Armand-Frappier, Канада) использовал технологии секвенирования генов для выявления факторов, которые делают M. tuberculosis специфичным для человека. Были опробованы два подхода: (а) «бесцельный» метод, который включал секвенирование следующего поколения (NGS) и инструмент исследования микобактериальных гомологов (mycoHIT), и (б) «сфокусированный» подход, который ограничивался интересующими локусами.Их главный интерес заключался в исследовании генетических мутаций, которые отбираются в процессе эволюции, чтобы стать облигатным патогеном. 35

Секвенирование всего генома может помочь различить быстро и медленно растущие микобактерии. Эти исследования показали, что M. kansasii может быть потенциальным кандидатом для моделирования образа предков M. tuberculosis , представляющего собой вид окружающей среды, который может вызывать туберкулезное заболевание, которое не может передаваться. 36 Генетический анализ выявил взрыв токсин-антитоксиновых модулей в M.tuberculosis после видообразования, в основном за счет дупликации генов. Еще одна специфическая адаптация — анаэробное дыхание. 37,38 Генетические события предков могут объяснить последовательную эволюцию патогена, и текущая функциональная характеристика этих событий может быть реконструирована в M. kansasii или M. marinum .

Переходя от подсказок в генетическом коде к системе передачи сообщений, Эрик Галбурт (Школа медицины Вашингтонского университета, США) обсудил кинетику и энергетику инициации транскрипции у микобактерий.Хотя это фундаментальный биологический процесс, который является общим для бактерий и сохраняется в них; Скорости транскрипции сильно различаются между E. coli и видами микобактерий из-за различий в стабильности промежуточных комплексов, образующихся в этом процессе. Следовательно, важно изучать центральные процессы в самом патогене, а не наследовать информацию от других модельных организмов. Основные факторы инициации транскрипции CarD (Rv3583c) и RbpA (Rv2050) играют важную роль в биологии M.Туберкулез . 39-42 Инициирование требует образования холофермента РНК-полимеразы (РНКП) со связанными сигма-факторами. Серия кинетических шагов приводит к образованию замкнутого комплекса, ведущего к открытому комплексу с пузырем транскрипции. Факторы инициации расположены рядом с верхним краем пузыря транскрипции. 43,44 Такие методы, как флуоресцентное мечение, были использованы для изучения открытого комплекса с использованием M. bovis RNAP, который, как известно, образует открытые комплексы, которые являются более нестабильными по сравнению с E.coli RNAP. Было обнаружено, что факторы инициации действуют независимо и кооперативно, регулируя транскрипцию, и что только в присутствии обоих факторов кинетика транскрипции у микобактерий, по-видимому, подобна той, которая наблюдается у E. coli . 45,46 Поскольку известно, что оба фактора играют важную роль в патогенезе, глобальных уровнях экспрессии рРНК / генов и устойчивости к стрессу и антибиотикам, они могут служить хорошими мишенями для разработки лекарств.

Основная проблема в разработке эффективных лекарств и схем лечения против M.tuberculosis — это гетерогенность инфицированной популяции бацилл, которая включает активно реплицирующиеся и спящие клетки, известные как персистеры. Клетки-персистеры находятся в состоянии покоя, обладают высокой толерантностью к антибиотикам и другим внешним воздействиям и при благоприятных условиях могут вернуться в состояние активного деления. 47 Обнаружение этих клеток практически невозможно, поскольку обычные микробиологические методы культивирования не могут их идентифицировать. Эти клетки могут быть сгенерированы in vitro, , при длительной стационарной фазе культивирования или постепенном подкислении культуральной среды.Затем они могут быть возвращены к их активно воспроизводящейся физиологии путем воздействия факторов, способствующих реанимации (Rpfs), которые также известны как Rpf-зависимые клетки. 48

Rpfs представляют собой секретируемые или связанные с клеточной стенкой ферменты, продуцируемые активно делящимися микобактериями. Они структурно и функционально подобны лизоцимам и необходимы для оживления спящих клеток. 49 В M. tuberculosis имеется 5 Rpf, и было обнаружено, что они важны для персистенции и реактивации инфекции у мышей.RpfA, B и E секретируются и обнаруживаются в фильтратах культур, тогда как RpfC связывается с клетками. 50 RpfD активируется во время инфекции. После оживления Rpf-зависимые клетки теряют эту характерную зависимость во время пассажей in vitro и пассажей.

Rpf-зависимые микобактерии очень важны в клиническом аспекте. 48 Эти клетки очень распространены в мокроте и образцах внелегочного туберкулеза, их относительные пропорции колеблются от 0 до 99,99% от общего количества M.туберкулез населения. Джайшри Гархиан (Университет Джавахарлала Неру, Индия) сообщил, что костный мозг является нишей для персистеров, поскольку мезенхимальные стволовые клетки выживают в течение длительного периода времени и находятся в среде с подавленным иммунитетом. 51,52 Кроме того, у стволовых клеток есть клетки активного выхода лекарства, обеспечивающие вторую стену защиты для патогена. Их работа показывает, что M. tuberculosis захватывают мезенхимальные стволовые клетки, перепрограммируют их с помощью фактора, индуцируемого гипоксией (Hif-1), и воздействуя на этот путь, могут усилить стандартные схемы лечения.

Rpf-зависимые клетки по своей природе более устойчивы к нескольким лекарствам, таким как рифампицин, изониазид и стрептомицин. 53 Поскольку избавиться от Rpf-зависимых микобактерий труднее, они оказываются более богатыми у пролеченных больных туберкулезом. Поскольку персистеры часто являются причиной неудач лечения и рецидивов после лечения, важно, чтобы оценка схем лечения ТБ учитывала элиминацию / индукцию этой группы клеток. 54 Янминь Ху (Лондонский университет Св. Георгия, Великобритания) считает, что невидимые персистеры представляют собой многообещающую терапевтическую мишень, и более короткие схемы химиотерапии, такие как испытанная с фторхинолонами, могут быть успешными только в том случае, если они эффективны в уничтожении этого подмножества патогенная популяция.В условиях in vitro ее группа заметила, что для уничтожения стационарных культур M. tuberculosis требуются высокие дозы рифампицина. 47 Это происходит главным образом из-за Rpf-зависимых бацилл, которые обладают высокой толерантностью к препарату и, по-видимому, уменьшаются с увеличением концентрации рифампицина, но не могут быть полностью уничтожены. 47 Когда они инкубировали инфицированные ткани легких мышей (2 недели инфицирования) с культуральным фильтратом, содержащим Rpfs, клетки-персистеры могли оживать даже после введения мышам высоких доз рифампицина.Они использовали модель Корнелла для изучения эффективности и частоты рецидивов различных схем лечения лекарствами, при которых инфекции позволяли развиваться в течение 3 недель, а затем лечили комбинациями лекарств в течение 14 недель. В конце периода лечения мышам давали гидрокортизон для подавления иммунной системы для изучения частоты рецидивов. Как отмечалось в более ранней модели, наблюдалось дозозависимое уничтожение бактерий. Также было отмечено, что более высокие дозы рифампицина могут сократить время лечения, однако небольшая подгруппа Rpf-зависимых бацилл все еще сохраняется в тканях хозяина.

Галина Мукамолова (Университет Лестера, Великобритания) представила концепцию лекарственно-индуцированной Rpf-зависимости у M. tuberculosis . Было показано, что лечение рифампицином, изониазидом и этамбутолом вызывает Rpf-зависимость, тогда как в случае лечения стрептомицином и амикацином такого эффекта не наблюдалось. 53 Таким образом, очень важно, чтобы лекарства были проверены на их склонность вызывать Rpf-зависимость. С этой целью Мукамолова и его коллеги стремились разработать простой тест для определения способности лекарств вызывать Rpf-зависимость.Rpf-зависимые микобактерии могут образовываться во время инфицирования мышей. Однако эти модели трудно обрабатывать в условиях высокой производительности. Чтобы адаптировать это к условиям in vitro , группа Мукамоловой синтезировала новые доноры оксида азота, которые могли индуцировать персистирующий фенотип в клетках M. bovis . Таким образом, эти in vitro системы могут быть использованы для валидации новых лекарств и поиска биомаркеров, зависимых от Rpf.

Еще одна модель стойкости, использующая модули токсин-антитоксин (ТА), обнаруженные в M.tuberculosis , обсуждалась Шалин Корч (Университет Среднего Запада, США). Из 88 предполагаемых выявленных модулей ТА около 30 были назначены функции. 55 Обычно это опероны с двумя генами, один из которых кодирует токсичный белок, а другой — антитоксин, который связывается с токсином и ингибирует его. 56 Регуляция этих модулей контролируется в основном за счет авторепрессии транскрипции оперона антитоксином. Однако при воздействии стрессов, возникающих во время заражения, активируется определенная часть этих модулей.Учитывая, что у E. coli эти системы, как известно, участвуют в образовании персистеров, их роль в контроле скорости деления M. tuberculosis во время инфекции требует дальнейшего изучения. 57 Корч решил сосредоточиться на системе RelBE, которая ингибирует трансляцию посредством расщепления мРНК. 58,59 Путем создания штаммов, которые сверхэкспрессируют токсины с последующим спасением от антитоксина, они продемонстрировали фенотип персистенции, при котором наблюдали только 20% от общей трансляции. 60 Эта модель позволит провести дальнейшее исследование стадий персистентности, а именно входа, обслуживания и выхода.

Ответы хозяина на M. tuberculosis

Макрофаги являются стражем врожденной иммунной системы. После того, как M. tuberculosis попадает в дыхательные пути подходящего хозяина, он сталкивается с фагоцитарными клетками и преимущественно вторгается в альвеолярные макрофаги и моноциты. После заражения эти макрофаги высвобождают множество цитокинов, которые привлекают несколько иммунологически активных клеток, таких как Т-клетки, которые выделяют интерферон-γ (IFNγ), который в сочетании с фактором некроза опухоли-α (TNFα) активирует макрофаги для устранения патогена. 61 Марцин Влодарчик (Лодзинский университет, Польша) интересуется профилем цитокиновых ответов, управляемых микобактериальными антигенами, и экспрессией рецепторов передачи сигнала при ТБ. Для исследования были выбраны двести восемнадцать пациентов, вакцинированных БЦЖ и инфицированных ВИЧ / ТБ. Основная цель исследования заключалась в оценке продукции IFNγ, TNFα, интерлейкинов и экспрессии на клеточной поверхности рецепторов, таких как TLR2, LFA-1, CD14, а также растворимого аналога CD14 между пациентами и здоровыми добровольцами.Они сообщают, что наблюдают количественные, а не качественные изменения в уровнях экспрессии изучаемых цитокинов, когда сыворотка инфицированных людей заражается микобактериальными антигенами. Также было обнаружено, что у больных туберкулезом значительно более высокая частота встречаемости моноцитов с рецепторами CD14, TLR2 и LFA-1. 62

Другой член семейства Toll-подобных рецепторов, RP105 (CD180), исследуется группой Antje Blumenthal (Институт Диамантина Университета Квинсленда, Австралия).RP-105 в основном экспрессируется макрофагами и моноцитами. У него короткий цитоплазматический хвост, и было высказано предположение, что он не может передавать сигналы напрямую без партнера по передаче сигналов. CD180 Уровни экспрессии мРНК выше в цельной крови у вылеченных больных туберкулезом по сравнению с теми, у которых наблюдается рецидив. 63 Было также показано, что мыши с дефицитом RP105 более восприимчивы к туберкулезу, а макрофаги с дефицитом RP105 продуцируют значительно меньшее количество воспалительных цитокинов, чем их аналоги дикого типа. 64 Однако ни мРНК, ни экспрессия белков воспалительных цитокинов, таких как TNF, не были затронуты в макрофагах мутантов с дефицитом RP105. 64 Благодаря своей работе группа Blumenthal продемонстрировала, что активация макрофагов, опосредованная RP105, отличается от передачи сигналов классического Toll-подобного рецептора (TLR), где RP105 направляет трафик цитокинов. 65,66 Этот новый сигнальный путь врожденного иммунитета включает RP105, BTK и субъединицу p110δ фосфоинозитид-3-киназы.

Другое семейство малых белков, трансмембранных белков, индуцированных интерфероном (IFITM), и их роль в ограничении инфекции M. tuberculosis было представлено Шахином Ранджбаром (Гарвардская медицинская школа, США). 67 TLR2 и 4 и MyD88-зависимые сигнальные пути участвуют в индукции белков IFITM 1, 2 и 3. Их работа показала, что уровни экспрессии белков IFITM напрямую коррелируют со скоростью роста M. tuberculosis в THP. -1 ячейка.Было замечено, что IFITM3 совместно локализуется с микобактериальными клетками в альвеолярных эпителиальных клетках, а сверхэкспрессия белка усиливает закисление эндосом, тем самым ограничивая инфекцию. 67

Перейдя от рецепторов к сигнальным молекулам, Мария Регина Д’Империо Лима (Университет Сан-Паулу, Бразилия) рассказала о роли пуринов, особенно внеклеточного АТФ (eATP), в иммунном ответе на тяжелый туберкулез. . Гипервирулентные штаммы микобактерий проявляют разную степень патогенности.Тяжесть заболевания часто связана с подавлением выработки эффекторных цитокинов.

eATP и продукт его распада аденозин, как известно, действуют как хемотаксические сигналы, приводящие к усиленной миграции нейтрофилов и макрофагов к месту воспаления. 68,69 eATP, как известно, активирует несколько рецепторов, которые, в свою очередь, вызывают гибель клеток из-за некроза, образования ионных каналов или пироптоза. 70 Эти механизмы обеспечивают высвобождение бактерий из фагоцитарных клеток, и было замечено, что туберкулез, вызванный гипервирулентными микобактериями, ослабляется у мышей, у которых отсутствует рецептор P2X7, и наблюдается снижение распространения болезни. 71 Клетки дикого типа с активным P2X7 погибают от некроза, который способствует высвобождению гипервирулентных микобактерий. 71 Гистологические анализы также выявили меньшее повреждение, вызванное воспалением, у мышей с нокаутом, таким образом демонстрируя, что передача сигналов P2X7 вносит вклад в патологию в модели тяжелой инфекции. Группа также отметила, что специфические клетки CD4 в паренхиме легких мышей, инфицированных вирулентными штаммами микобактерий, подавлены.

Аннемари Х.Meijer (Лейденский университет, Нидерланды) использует однодневные эмбрионы рыбок данио, инфицированные M. marinum , близким родственником M. tuberculosis , для изучения механизмов защиты хозяина на ранних стадиях инфекции. Преимущество изучения этих организмов состоит в том, что они оптически прозрачны, а агрегаты клеток и их распространение можно легко проследить. Молодые эмбрионы не обладают адаптивным иммунитетом, а самые ранние иммунные клетки — это макрофаги и нейтрофилы. Через несколько минут после заражения бактерии фагоцитируются.Инфицированные клетки привлекают новые макрофаги, в результате чего образуются гранулематозные агрегаты. Гранулема защищает патоген от дальнейшего иммунологического вмешательства и тем самым дает ему большое преимущество. 72 Стабильная секреция патогеном раннего секреторного антигена-6 (ESAT-6) обеспечивает сохранение и рост гранулем. Это согласуется с открытием, что мутанты с дефицитом ESAT-6 могут поддерживать только небольшие гранулемы. Профессор Мейер и ее группа сосредотачиваются на сети хемокинов, которая облегчает миграцию макрофагов с образованием гранулемы.

У рыбок данио с мутированным рецептором CXCR3 случайная подвижность макрофагов снижена. 73 Этот дефект подвижности коррелирует с уменьшением количества и размера гранулемы, что приводит к уменьшению общего бремени инфекции. Ингибирование рецептора CXCR3 показало уменьшение образования гранулем, а предыдущие исследования показали, что мыши с дефицитом CXCR3 проявляют повышенную устойчивость к инфекции. 73 Следовательно, нацеливание на формирование гранулемы с помощью иммуномодулирующих препаратов может помочь разработать стратегии, ориентированные на хозяина, которые могут работать синергетически с химиотерапией и снижать риск возникновения новой резистентности.

Используя рыбок данио в качестве доклинической модели, они испробовали несколько методов, чтобы (а) ингибировать рост гранулемы (б) обратить ингибирование слияния фаголизосом и (в) стимулировать антимикобактериальную аутофагию и аутофагический отток. 74 Аутофагия — это система иммунологической защиты, и многочисленные исследования in vitro показывают, что ингибирование аутофагии способствует росту M. tuberculosis в тканях хозяина.

Модулятор аутофагии, связанный с повреждением ДНК 1 (DRAM1), активируется во время M.marinum , зависящая от пути распознавания патогенов TLF / MyD88. 75 При сверхэкспрессии драм1 у личинок рыб развиваются более низкие уровни инфекции и более мелкие гранулемы.

Ранняя диагностика: ключ к борьбе с туберкулезом?

Из 9,6 миллиона предполагаемых случаев во всем мире в 2014 году только 6 миллионов были зарегистрированы через национальные центры эпиднадзора. Считается, что большинство из 3 миллионов недиагностированных случаев происходит из регионов со слабым медицинским обслуживанием.В основном это происходит из-за неполной отчетности и неполной диагностики. Занижение отчетности происходит, когда диагностика и лечение проводятся в частном секторе, который не связан с национализированными схемами. Во-вторых, педиатрические службы часто плохо связаны с национальными противотуберкулезными службами, и у детей часто не диагностируется туберкулез, поскольку выявление туберкулеза в таких случаях особенно сложно. Плохой доступ к медицинскому обслуживанию в странах с низким уровнем дохода является основной причиной неполного диагноза, и многие пациенты теряются для последующего наблюдения.Большинство медицинских центров проводят пассивное выявление случаев, тогда как Луис Э. Куэвас (Ливерпульская школа тропической медицины, Великобритания) считает, что более активный подход, включающий аутрич-услуги, может улучшить ситуацию. Он сравнил 2 тематических исследования активного выявления случаев; один из них был проведен в Эфиопии, где действует активная программа расширения здравоохранения, а другой — в Нигерии, которая прекратила свою программу расширения здравоохранения несколько десятилетий назад. Исследование проводилось в трущобах вокруг Абуджи в Нигерии.С помощью вышедших на пенсию медицинских работников (HEW) и с использованием таких ресурсов, как данные переписи по ликвидации полиомиелита, были проведены посещения по дому для сбора 2 образцов мокроты с интервалом в 40 минут. О результатах сообщили дома у человека или по телефону. Уровень выявления случаев был удвоен благодаря усилиям по увеличению количества диагнозов для женщин и пожилого населения. 76

Эфиопия имеет хорошо организованную программу распространения медицинских услуг. В ходе исследования HEW получали базовые медицинские пакеты, которые доставлялись им на дому каждые 14 дней.Основная цель упражнения заключалась в улучшении результатов лечения и выявления случаев туберкулеза. Медицинские работники были обучены выявлению случаев заболевания, сбору мокроты и приготовлению мазков, которые затем сдавали в местные лаборатории. Как только результаты подтвердят наличие туберкулезной инфекции, куратор начнет лечение на дому, и будут проверены домашние контактные лица. По сравнению с предыдущим годом выявление случаев ТБ увеличилось как минимум в 2 раза, что наглядно демонстрирует улучшения в выявлении случаев ТБ при использовании активного подхода к выявлению случаев. 77,78 Эндрю Кертис (Государственный университет Кента, США) также поддержал этот подход, он обсудил использование пространственных видеозаписей с видеокамеры и географических повествований для отслеживания активных контактов бездомных и потребителей наркотиков, которые подвержены высокому риску заражения этим заболеванием в развитых странах.

Микроскопия мазка мокроты остается основой классических диагностических тестов, используемых в странах с низким и средним уровнем дохода с высоким бременем туберкулеза. 79 Этот метод прост в исполнении, дешев и быстр, но его использование ограничено из-за низкой чувствительности и специфичности, особенно в педиатрических случаях, у пациентов с ВИЧ и пациентов с низкой бактериальной нагрузкой в ​​мокроте. 80 Для получения результатов с помощью методов жидких и твердых культур может потребоваться до 3 недель, после чего отслеживание пациентов может стать затруднительным, что приведет к тому, что инфицированные ТБ люди не получат лечения, а распространение болезни в своих общинах и домохозяйствах еще больше усугубит ситуацию.

В попытке разработать неинвазивную диагностическую стратегию туберкулеза с использованием образцов дыхания, Thu-Hoa Tran-Thi (Centre National de la Recherche Scientifique, Франция) обсудил потенциал летучих метаболитов M.tuberculosis в качестве биомаркеров болезни. 81,82 Никотиновая кислота (NA), метилфенилацетат (MPA), метил-п-анизат (p-MA), метилникотинат (MN) и о-фениланизол — это 5 летучих соединений, которые были идентифицированы из культур M. tuberculosis выращено in vitro . 82 NA может быть обнаружена в дыхании больных активной формой туберкулеза, хотя присутствует в небольших количествах. Также было обнаружено, что он является многообещающим индикатором штаммов M. tuberculosis , устойчивых к пиразинамиду.Доктор Тран-Тхи и группа исследовали метод обнаружения НА в сложных растворах с различными метаболитами, а также в биологических средах. Были разработаны люминесцентные методы обнаружения NA с использованием тербия III (Tb 3+ ) в качестве зонда благодаря его способности люминесцировать при передаче энергии от NA к иону Tb 3+ . 83 Потенциальное вмешательство других метаболитов, таких как MPA, p-MA и MN, которые имеют такие же длины волн возбуждения, что и NA в образцах, было идентифицировано как проблема.Конденсат выдыхаемого воздуха был признан лучшим образцом, поскольку он меньше мешает по сравнению с образцами слюны и мочи. Стоимость этого диагностического процесса оценивается ниже, чем одобренный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) молекулярный диагностический тест GeneXpert® MTB / RIF, что делает его разработку приоритетной для последующего использования в развивающихся странах.

Биомаркеры крови также можно использовать в диагностических тестах для выявления туберкулеза в эндемичных районах. В целом множество антител, специфичных к различным антигенным эпитопам, обнаруженным в M.tuberculosis у больных туберкулезом, методы выявления на основе профиля отдельных антител, скорее всего, не сработают. Имран Хан (Калифорнийский университет, США) изучил возможность использования мультиплексной серологической панели для диагностики туберкулеза. 84 В этом тесте используется панель из 28 микрогранул M. tuberculosis , покрытых антигеном, что позволяет универсально идентифицировать профили антител у пациентов с помощью одного теста. Используя тот же метод, доктор Хан исследовал 10 цитокинов / хемокинов / факторов роста в плазме и 8 антител против 8 M.tuberculosis биомаркеров антигенов, которые повышены у больных туберкулезом. Интересно, что они обнаружили, что уровни профиля антител среди больных туберкулезом зависят от пола и связаны с успехом лечения. 85 Иммунобиомаркеры при туберкулезе важны для понимания реакции хозяина на патоген, и эта область может быть дополнительно изучена для разработки диагностики и лечения туберкулеза.

Геномика, протеомика и транскриптомика — это подходы, которые широко использовались для характеристики M.Туберкулез . Недавно метаболомика, новый подход, была дополнена революцией «омиков», чтобы обеспечить более полное понимание сложных внутренних систем патогена. 86,87 Metabolomics исследует все внутри- и внеклеточные метаболиты (низкомолекулярные промежуточные соединения и продукты) в биологическом образце с использованием высокоспециализированных аналитических методов для создания метаболического профиля и измерения любых динамических реакций на стимулы или генетические модификации. 88-90 Du Toit Loots (Северо-Западный университет, Южная Америка) интересуется характеристикой M.tuberculosis с использованием метаболомики и определения его характерных метаболитных сигнатур. Этот подход позволяет идентифицировать различные виды микобактерий с использованием конкретных маркеров метаболитов, хотя известно, что у этих видов есть незначительные генетические вариации, что свидетельствует о чувствительности этого подхода. 86 Профессор Лутс выразил оптимизм по поводу возможности использования маркеров метаболитов для построения диагностических моделей, основанных на систематических подходах в исследованиях метаболомики. 91-93 Это также может помочь в обнаружении связи между туберкулезом и его симптомами; например, повышение уровня адреналина может прогнозировать потерю веса и бессонницу у пациентов.В будущем этот подход может также использоваться для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза и прогноза. 94

Тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) — это молекулярные диагностические подходы, которые были разработаны для повышения чувствительности и специфичности при диагностике ТБ и, что наиболее важно, для выявления инфекций МЛУ-ТБ. GeneXpert® MTB / RIF Ultra был представлен на Саммите по борьбе с туберкулезом в этом году, подчеркнув значительные улучшения по сравнению с его более ранней версией. Элиза Тальяни (Научный институт IRCCS Сан-Раффаэле, Италия) продвигала новый инструмент молекулярной диагностики и приветствовала его как трансформацию усилий по выявлению / ликвидации ТБ.В последнем формате используются картриджи большего размера и дополнительные зонды, выявляющие 4 новые мутации rpoB , IS6110 и IS1081 из M. tuberculosis , что позволяет обнаруживать 30 различных устойчивых к рифампицину мутаций M. tuberculosis rpoB . С помощью этих достижений они надеются повысить чувствительность анализа, близкого к жидкой культуре. 95

Эрик Р. Хаупт (Университет Вирджинии, США) рассказал о карте массива TaqMan (TAC). Это генотипический метод обнаружения мутации патогена, который обеспечивает 2 уровня точного обнаружения мутаций с помощью зондов, специфичных для последовательности, и анализов плавления с высоким разрешением (HRM).Он может обнаруживать мутации в генах, указывающих на устойчивость, таких как rpoB, inhA, embB, gyrA и многие другие. 96 Метод прост в применении, воспроизводим, обладает хорошей чувствительностью и специфичностью. Он может улучшить выявление МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ, а следовательно, повысить уместность и эффективность лечения ТБ.

Многие коммерчески доступные форматы NAAT недоступны в центрах с ограниченными ресурсами из-за высоких затрат, связанных с приборами и расходными материалами.PURE-TB-LAMP, тест TB NAAT, утверждает, что он простой, быстрый, надежный, чувствительный (по сравнению с микроскопией мазка) и доступный (по сравнению с другими платформами NAAT). Yasuyoshi Mori (Eiken Chemical Co., Ltd., Япония) рассказал об этом наборе для скрининговых тестов, в котором используется петлевая изотермическая амплификация (LAMP), которая устраняет необходимость в дорогостоящих термоциклерах или системах обнаружения. 97 Набор состоит из набора для экстракции ДНК Loopamp ™ PURE и набора для обнаружения MTBC Loompamp ™. Три основных технических аспекта теста: (a) амплификация ДНК с помощью LAMP, (b) сверхбыстрая экстракция (PURE) ДНК, которая может удалить ингибиторы теста без значительной потери генетического материала, и (c) простое визуальное обнаружение результат с использованием флуоресценции в ультрафиолетовом свете. 98,99 Станок Loopamp ™ LF-160 не требует обслуживания или калибровки, что делает весь процесс простым и легким в освоении; отказавшись от необходимости в высококвалифицированном персонале. Чувствительность TB LAMP в 100 раз выше, чем при микроскопии мазка мокроты. 100 В настоящее время скрининговый тест одобрен для использования в Японии, Китае, Южной Корее и Таиланде. Анализы его клинических характеристик были представлены в ВОЗ для утверждения использования.

Туберкулез средостения — это форма внелегочного туберкулеза, которая часто встречается у детей, ВИЧ-инфицированных пациентов и взрослых иммигрантов в развитых странах.Число зарегистрированных случаев внелегочного туберкулеза в Великобритании за последнее десятилетие несколько увеличилось, и эта тенденция вызывает беспокойство. 101 Диагностика туберкулезного лимфаденита средостения является сложной задачей из-за его неспецифической клинической картины, нормальных результатов рентгенологического исследования грудной клетки и низкопродуктивного посева мокроты. 102,103 Эти расплывчатые проявления необходимо дифференцировать с другими подобными заболеваниями, такими как лимфома, карцинома и саркоидоз. 102 Онн Мин Кон (Имперский колледж Лондона, Великобритания) подчеркнул, что нельзя упускать из виду туберкулез средостения, особенно когда у пациентов с подозрением на изолированный лимфаденит средостения проводится нормальный рентген грудной клетки.Последующее сканирование грудной клетки с помощью ПЭТ / КТ является обязательным для подтверждения положительной лимфаденопатии. 104 Взятие пробы ткани лимфатических узлов средостения является обязательным для определения этиологии заболевания, ранее в основном выполнялось с использованием таких методов, как медиастиноскопия шейки матки. Однако этот инвазивный метод связан со значительной заболеваемостью и смертностью, поэтому эндоскопическая трансбронхиальная игольчатая аспирация под контролем УЗИ (EBUS-TBNA), обычно используемая при диагностике рака легких, рекомендуется в качестве минимально инвазивной альтернативы для диагностики туберкулеза средостения. 105-107 Профессор Кон сообщил, что этот широко используемый метод микробиологической диагностики в сочетании с GeneXpert® MTB / RIF может повысить чувствительность и специфичность диагностики туберкулеза средостения, ускорить оценку подозреваемых случаев и обеспечить быстрое обнаружение устойчивых M. tuberculosis штаммы. 108

M. bovis является членом комплекса MTB и не зависит от хозяина. Он может заразить альпак, лам, собак и кошек, а затем передать их владельцам животных.Великобритания не смогла сдержать болезнь, несмотря на ряд радикальных мер, принимаемых для контроля над популяциями естественных резервуаров. Для диагностики инфекции M. bovis требуется три месяца, и это стоит 140 долларов за образец. Дифференциация между M. bovis и M. tuberculosis необходима, поскольку первый по своей природе устойчив к пиразинамиду.

Традиционные подходы к созданию тестов серологического ответа используют либо непатогенные штаммы БЦЖ, либо убитые нагреванием / химически инактивированные патогены.Эти суровые условия повреждают важные конформационные эпитопы клеточной поверхности, которые не представлены или не поддерживаются во время обнаружения. Новый подход, опробованный Линдой Стюарт (Университет Белфаста, Великобритания), заключался в использовании гамма-облученных патогенных штаммов для разработки специфических связывающих веществ M. bovis . 109 Использовали цельноклеточные или экстрагированные этанолом поверхностные антигены и получали как поликлональные, так и моноклональные антитела с использованием технологии фагового дисплея. Результатом этого был набор связывающих веществ, которые были охарактеризованы с помощью ELISA и иммунофлуоресцентного окрашивания.Основная цель их усилий заключалась в разработке диагностического теста, в котором использовались бы связующие вещества для выявления заболеваний, которые могли бы различать инфекции M. bovis и M. tuberculosis , в отличие от коммерчески доступных наборов, имеющихся на рынке в настоящее время.

Густаво Морейра (Технический университет Брауншвейга, Германия) обсудил использование фагового дисплея для идентификации биомаркеров и генерации человеческих антител для диагностики и терапии. Фаговый дисплей антител включает процесс in vitro , который не затрагивает иммунную систему.Процесс начинается со вставки генов антител в геном фага, который затем выражается в виде слитого белка, отображаемого на внешней поверхности фага. Следующий этап называется пэннингом, когда антиген опрашивается созданной библиотекой антител. Идентификация положительно связывающихся антител выполняется с помощью ELISA, иммуноблоттинга или проточной цитометрии. 110

M. tuberculosis секретирует белок, называемый антигеном 85 (Ag85). Были отобраны гены антител из наивной библиотеки и клонированы в дрожжевые системы отображения.Эту комбинацию фагового и дрожжевого дисплеев использовали для получения антител против Ag85. Клоны были проверены на самое высокое связывание антигена, выявив 7 пар антител, которые могут обнаруживать Ag85 при наномолярных концентрациях, однако ни один из клонов не был строго специфичным для одной из субъединиц антигена 85 комплекса. 111 В другом исследовании использовались 5 человеческих антител против Ag85B из исходных библиотек, где 3 из них специфически связывались с белками 85B, как было проверено с помощью ELISA. 112

Мониторинг реакции хозяина на лечение ТБ может определить эффективность лечения и спрогнозировать вероятность рецидива.Текущий метод подтверждения успеха лечения — это конверсия бактериологической культуры через 2 месяца от начала терапии. Бактериальная транскриптомика предлагает новые возможности для изучения элиминации патогена у пациента. Dimitrios Evangelopoulos обсудил молекулярные методы обнаружения снижения бактериальной нагрузки во время лечения как биомаркера прогрессирования инфекции. Метод обнаружения микобактериальной РНК был разработан с использованием искусственного матрикса, напоминающего образцы мокроты, и применен к клиническому случаю у 12-летнего пациента. 113 В этом случае методы окрашивания выявили присутствие кислотоустойчивых бацилл, однако анализы жидких культур не смогли обнаружить никаких живых бацилл. При использовании анализа молекулярной бактериальной нагрузки (MBL) у пациента была выявлена ​​высокая бактериальная нагрузка, и схема лечения была изменена с включением моксифлоксацина. После года лечения ни MBL, ни окрашивание не выявили никаких бацилл, и пациент был подтвержден как излечившийся.

Пилотное исследование на мышах показало, что этот анализ также можно использовать с тканями животных.Анализы MBL и колониеобразующих единиц (КОЕ) в тканях мышей, подвергавшихся разному лечению, показали, что оба анализа согласуются друг с другом, причем первый последовательно обнаруживает большее количество клеток, вероятно, в результате обнаружения некультивируемой клеточной популяции. 113 Таким образом, MBL-анализы могут служить быстрым и чувствительным инструментом диагностики и мониторинга лечения, предлагать понимание эффективности лекарств и могут использоваться при открытии новых лекарств.

Открытие лекарств: преодоление препятствий

Поиск новых терапевтических целей

С момента знаменательного объявления полной последовательности генома M.tuberculosis , была целенаправленная работа по выявлению важных генов и визуализации их белковых продуктов, что позволило начать проекты по созданию целевых лекарств. Том Бланделл (Кембриджский университет, Великобритания) заинтересован в изучении биологического космоса, переходящего от генома к протеому. Традиционные методы влажных лабораторных исследований для понимания протеома патогена должны быть подкреплены подходами системной биологии. С этой целью группа профессора Бланделла работала над Шопеном, который наследует информацию об известных структурах примерно 400 белков и использует ее для прогнозирования моделей для остальных 3500 белковых структур. 114 На основании информации из общедоступных баз данных; взаимодействия, лиганды и олигомерные состояния многих белков могут быть расшифрованы. Затем эту информацию можно использовать для структурно-ориентированных и фрагментарных подходов к открытию лекарств. Обоснованием этой стратегии является использование небольших молекул с беспорядочной аффинностью связывания для исследования субструктур, присутствующих с белками-мишенями, с использованием стандартных биофизических анализов связывания лигандов. Затем удары оптимизируются для получения молекулы, которая связывается с целевым белком в наномолярных концентрациях.Используя этот подход, они успешно разработали ингибиторы против EthR, репрессора транскрипции для белка, активирующего этионамид. 115 Поскольку развитие мутаций является основным препятствием для индустрии разработки противотуберкулезных препаратов, профессор Бланделл также обсудил использование технологий секвенирования второго поколения для разработки основанного на знаниях подхода к пониманию эволюционной динамики. Влияние однонуклеотидных полиморфизмов на стабильность белка, сродство белок-белок / нуклеиновая кислота / лиганд теперь может быть установлено с помощью mCSM, другого полезного инструмента веб-сервиса, разработанного группой. 116

Выявление мишеней для лекарств, которые можно использовать, является важным шагом на пути к рациональному дизайну лекарств. Клеточная стенка микобактерий уникальна для грамположительных и грамотрицательных организмов и является хорошим источником для мишеней противомикобактериальных препаратов, как это обсуждали Санджиб Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) и Дирк Шнаппингер (Вейл Корнелл). Медицинский колледж, США). Он содержит комплекс миколиновой кислоты, арабиногалактана и пептидогликана, образующий ядро ​​клеточной стенки — характерная особенность, которая на протяжении многих лет привлекала внимание нескольких исследователей.

Разрушение миколовой кислоты M. tuberculosis оказалось отличной стратегией для нацеливания на патоген, о чем свидетельствует успех таких лекарств, как изониазид, этамбутол и пиразинамид, все из которых нацелены на синтез миколиновой кислоты. Однако рост устойчивости штаммов M. tuberculosis к этим препаратам усилил потребность в новых мишенях. Биотин является важным кофактором для всех ацил-КоА-карбоксилаз (АССаз), которые играют роль в обеспечении строительных блоков для синтеза компонента жирных кислот в M.tuberculosis клеточная оболочка. Клетки млекопитающих приобретают биотин из внешней среды и, таким образом, лишены этих ферментов, что подтверждает этот путь для разработки по сути селективных противотуберкулезных препаратов. 117 Кроме того, мутанты в пути синтеза биотина могут вызывать только ослабленные формы инфекций у мышей, что позволяет предположить, что патоген не может получить экзогенный биотин. 118 Проф Шнаппингер и его группа обнаружили, что мутация одного из ферментов, BioA (биотинлигаза) в M.tuberculosis сделал его неспособным выжить in vitro, и у мышей, что указывает на то, что синтез биотина de novo имеет решающее значение для выживания и устойчивости патогена. 119 BioA подвержен ингибированию, что подтверждается его ингибированием с использованием антибиотика амикленомицина. 120,121 Однако этот антибиотик слишком полярен и непригоден для использования в рамках длительной схемы лечения туберкулеза. Целенаправленный подход, предпринятый группой профессора Шнаппингера, позволил идентифицировать мощный бисубстратный ингибитор биотиновых протеинлигаз (называемый Bio-AMS) из M.tuberculosis , который действует путем взаимодействия как в карманах связывания биотина, так и АТФ. 122 Этот конкурентный ингибитор оказался очень селективным и сильным против штаммов туберкулеза, что свидетельствует о том, что генетические подходы, способствующие открытию противотуберкулезных препаратов, по-прежнему заслуживают внимания.

Д-р Бхакта (Биркбек, Лондонский университет, Великобритания) был пионером в исследованиях метаболизма пептидогликана (PG) в M. tuberculosis на протяжении более десяти лет. 123 АТФ-зависимые гены лигазы Mur участвуют в синтезе предшественников PG.Эти гены ограничены бактериями, и было обнаружено, что они необходимы для микобактерий с помощью гибридизации сайта транспозона (TraSH). Структура murE была разрешена до 3Å и показывает доступный активный участок кармана, который можно использовать для создания лекарств. 124,125 Ферментативное ингибирование MurE из M. tuberculosis наблюдали с экстрактами колумбийских растений и химически синтезированными соединениями хинолона, тем самым демонстрируя, что лигазы могут служить мишенями для лекарств. 126-129 Кроме того, поскольку клеточное деление и биогенез клеточной стенки строго контролируются кооперативными процессами, неудивительно, что гены лигазы мур сгруппированы в опероне клеточной стенки ( dcw ), что дополнительно указывает на то, что нацеливание на этот путь будет иметь эффект «нокдауна» на совместно регулируемые пути.

Дивисома микобактерий представляет собой многофакторный комплекс, который собирается в средней клетке и вызывает расщепление бактерий, в результате чего образуются 2 дочерние клетки.Нарушение процесса деления клеток может серьезно повлиять на инфекционность патогена. С этой целью Тим А. Кросс (Университет штата Флорида, США) исследовал двух рекрутов дивизома, CrgA и ChiZ, о которых мало что известно. Структура микобактериального CrgA была смоделирована с и без белка деления FtsQ. Используя твердотельный ЯМР, они обнаружили, что CrgA состоит из 2 трансмембранных спиралей с очень точными осями вращения. Ожидается, что экспонированные остатки глицина в структуре будут участвовать в связывании с белками в дивисоме. 130 N — конец CrgA по своей природе неупорядочен, однако Dr Cross предполагает, что на липидном интерфейсе он, вероятно, будет принимать конформацию β-листа.

Вопреки ожиданиям, рациональная разработка лекарств не позволила определить количество потенциальных кандидатов в ведущие лекарственные препараты, которые были получены с помощью методов цельноклеточного фенотипического скрининга, таких как тот, который обсуждал д-р Бхакта. SPOTi — это метод, основанный на твердой культуре, при котором оптимизированное количество бактерий наносится на агар, содержащий серию разведений молекул ингибитора. 131-133 Этот метод адаптирован к формату 96-луночного микропланшета, тем самым увеличивая производительность.

Однако, как только обнаруживается мощный ингибитор роста микобактерий, важно идентифицировать эндогенную мишень молекулы. Существует несколько доступных технологий для идентификации целей, таких как подходы, основанные на геноме, аффинности и знаниях. Cristiano V. Bizarro (PUCRS, Бразилия) рассказал о импульсном протеолизе и преципитации для идентификации мишени (PePTID). 134 Это энергетический метод, при котором белковые экстракты инкубируются с лигандом или без него с последующим применением короткого протеолитического импульса и осаждения трихлоруксусной кислотой. Масс-спектрометрия используется для анализа результатов, и в качестве доказательства концепции они применили методологию для идентификации АТФ-связывающих белков с использованием негидролизуемого АТФγ в M. smegmatis .

Перспективные молекулы и натуральные продукты

Даниэле Кастаньоло (Королевский колледж Лондона, Великобритания), Ярослав Ро (Карлов университет в Праге, Чешская Республика) и Ill Y.Ли (Корейский научно-исследовательский институт химических технологий, Южная Корея) рассказал о многообещающих потенциальных противотуберкулезных препаратах, находящихся на разных этапах разработки в результате их исследовательских усилий.

Доктор Кастаньоло упомянул, что использование молекул, похожих на те, которые не прошли клинические испытания, и их оптимизация для улучшения их характеристик может быть выигрышной стратегией. Он отметил, что две мощные антимикобактериальные молекулы, BM212 и SQ109, имеют схожее топологическое распределение химических свойств.Однако у них были ограничения в отношении фармакокинетических параметров, растворимости, профиля цитотоксичности и эффективности против штаммов M. tuberculosis MDR . Стратегия группы заключалась в гибридизации этих двух препаратов для получения новых производных для достижения улучшенной противотуберкулезной активности или, возможно, снижения цитотоксичности. Было синтезировано два поколения соединений, и, что интересно, первое поколение соединений оказалось мощными ингибиторами эффлюксной помпы с множеством лекарственных препаратов, а это означает, что эти молекулы могут усилить действие стандартной химиотерапии. 135

Доктор Ли исследовал такие производные, как фениловый эфир и карбонатные производные нитроимидазола, поскольку в молекуле есть пространство для размещения реактивных групп, которые могут улучшить ее антимикобактериальный профиль. 136,137

Доктор Ро исследовал 5-замещенные 2 — [(3,5-динитробензил) сульфанил] -1,3,4-оксадиазолы и 1,3,4-тиадиазолы на предмет их превосходной антимикобактериальной активности как в отношении чувствительных, так и лекарственно-устойчивые формы M. tuberculosis со значениями МПК от 0.03 мкМ. Соединения проявляли селективную антимикобактериальную активность без активности против грамположительных, грамотрицательных и грибков. Перекрестной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда не наблюдалось. Исследования взаимосвязи структурной активности продемонстрировали, что 3,5-динитрофенильный фрагмент играет решающую роль в обеспечении антимикобактериальной активности. 138-140 Любые изменения положения динитрогруппы приводили к потере или снижению противотуберкулезной активности в несколько раз. Тест AMES показал, что эти соединения, содержащие нитрогруппу, не обладают мутагенной активностью. 140 Они также проявили низкую клеточную токсичность in vitro на 3 линиях клеток млекопитающих. Соединения имеют структурное сходство с ингибиторами DprE1, такими как динитробензамиды или бензотиазинон. Однако эксперименты с радиоактивной меткой показали снижение включения урацила, что указывает на то, что бактериальные клетки страдают от дефекта синтеза ДНК при лечении. Дальнейшие исследования по оптимизации соединений для улучшения растворимости и замены атома серы продолжаются, поскольку его присутствие в молекуле делает ее очень восприимчивой к метаболической деградации.

Натуральные продукты играют важную роль в открытии новых лекарств и являются богатым источником противомикробных препаратов. По оценкам, одна треть населения мира полагается на традиционную медицину для удовлетворения своих медицинских потребностей. Скрининг натуральных продуктов высших растений представляет собой одно из направлений поиска новых свинцовых противотуберкулезных агентов. Мария дель Райо Камачо-Корона (Автономный университет Нуэво-Леон, Мексика) оценила антимикобактериальную активность 9 растений, используемых в традиционной мексиканской медицине.Они выбрали растения на основе обширного поиска в мексиканской этноботанической литературе. Некоторые из растений включали Citrus sinensis, Citrus aurantifolia, Foeniculum vulgare, Larrea tridentata, Musa acuminata и Olea europaea . 141 Экстракты из различных частей растений были приготовлены путем мацерации с использованием гексана, хлороформа, метанола и воды. Экстракты растений тестировали с использованием анализа alamar blue на микропланшетах и ​​тестировали против M. tuberculosis и его изолятов MDR.Гексановый экстракт кожуры плодов цитруса Citrus aurantiifolia фракционировали с помощью колоночной хроматографии, и основные соединения были выяснены с помощью ЯМР-спектроскопии и ГХ-МС. Было идентифицировано несколько соединений, таких как кумарины, линолевая, пальмитиновая и олеиновая кислоты, многие из которых были летучими и ингибировали рост патогена.

Антимикробные пептиды (АМФ) являются неотъемлемой частью врожденного иммунитета, который помогает в борьбе с различными патогенами. Обычно они действуют путем разрушения мембран бактериальных клеток.В водной среде АМП существуют в виде отдельных молекул. При контакте с мембранами они упорядочиваются и образуют поры в мембранах. Их действие быстрое и эффективное даже против штаммов с высокой лекарственной устойчивостью, и, следовательно, они могут использоваться в качестве дополнительного лечения. Некоторые из них в настоящее время проходят клиническую разработку для лечения нескольких бактериальных инфекций. Однако природные AMP не являются хорошими кандидатами в лекарства из-за их большого размера, что приводит к более высоким производственным затратам. Черпая вдохновение в природе для создания новых AMP, Jasmeet S.Khara (Королевский колледж Лондона, Великобритания) принял рациональный дизайн для производства пептидов с меньшей вероятностью индукции устойчивости и пептидов, которые демонстрируют синергизм со стандартными антибиотиками. 142 Существуют различные стратегии модификации AMP, такие как синтез пептидных конъюгатов, пептидомиметиков и получение гибридных пептидов. Они сосредоточились на дизайне de novo и пришли к первичной последовательности, содержащей 4 аминокислоты (xxyy) n, где «x» и «y» являются гидрофобными и катионными остатками соответственно с числом повторов «n».Было обнаружено, что последовательности, содержащие повторяющиеся остатки лейцина и лизина, такие как (LLKK) 2 в качестве основы с короткими амфипатическими α-спиралями, являются антимикобактериальными. При добавлении остатков метионина к α-спиральной части гидрофобность пептида увеличивалась, что делало его внедрение в клеточную мембрану более эффективным. Пептиды проявляли синергизм с противотуберкулезными препаратами первой линии и были эффективны против лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis .Механизм действия этих пептидов анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии и визуализации живых клеток обработанных микобактерий. В присутствии пептидов мембрана бактериальных клеток была более проницаемой для красителя.

Репозиционирование лекарств: многообещающая альтернативная стратегия открытия лекарств?

Переназначение стало привлекательной стратегией для открытия лекарств, которые могут быть непосредственно добавлены к арсеналу лекарств, используемых для лечения туберкулезных инфекций. Susanne Brighenti (Каролинский институт, Швеция) заинтересована в усилении врожденной системы защиты хозяина в качестве альтернативной стратегии лечения инфекционных заболеваний.Комбинация витамина D3 и 4-фенилбутирата (PBA) проявляет синергетический эффект на продукцию LL-37 в разных типах клеток. LL-37 представляет собой AMP, который вызывает аутофагию в макрофагах человека, инфицированных M. tuberculosis . 143,144 Повышенная выработка LL-37 может потенциально увеличить уничтожение как внеклеточных, так и внутриклеточных бактерий, как сообщалось ранее. Нет значительных клинических или микробиологических данных об эффектах лечения этими препаратами. Таким образом, на основе исследования шигеллеза, проведенного в Бангладеш, клинические исследования были разработаны для проведения в Эфиопии и Бангладеш. 145 Исходный уровень витамина D3 в сыворотке у населения Эфиопии оказался низким, и было рекомендовано принимать добавки. Рандомизированное двойное слепое клиническое испытание с использованием ежедневного приема витамина D и PBA в качестве дополнительного лечения к стандартной химиотерапии было проведено для изучения комбинированного воздействия на продукцию LL-37. Оба увеличивали продукцию LL-37 в макрофагах человека и зависимую от LL-37 аутофагию в инфицированных макрофагах. Они также наблюдали уменьшение клинических симптомов с улучшенным выздоровлением и быстрой конверсией посева мокроты при дополнительной терапии только с помощью vitD3 или в комбинации с PBA.Следовательно, vitD3 и PBA могут противодействовать подавлению активности LL-37 во время инфекции, что может иметь положительное влияние на снижение потребности в антибиотиках для лечения. 145-147

Д-р Бхакта и его исследовательская группа сообщили, что распространенные, отпускаемые без рецепта нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), ибупрофен и карпрофен обладают специфической противотуберкулезной активностью. 131 148 149 Было обнаружено, что они активны в отношении штаммов, устойчивых к лекарствам, и микобактерий стационарной фазы. Эндогенный механизм действия этих препаратов все еще обсуждается, однако транскриптомный анализ показывает, что препараты могут оказывать плейотропное действие на патоген.Кроме того, иммуномодулирующие эффекты НПВП и обеспечиваемая ими защита от воспаления и повреждения тканей являются главным аргументом в пользу включения этого класса лекарств в качестве вспомогательных терапий, направленных на хозяина, в дополнение к стандартному лечению против туберкулеза с целью улучшения результатов лечения.

M. tuberculosis обладают 2-регуляторной системой PhoPR, которая важна для восприятия кислой среды, обнаруженной в макрофагах, и реагирования на нее, а также для ее использования в своих интересах. Роберт Абрамович (Университет штата Мичиган, США) стремился найти соединение, которое ингибирует регуляторную систему, делающую патоген восприимчивым к иммунным ответам хозяина. Для выявления ингибиторов регулона использовали фенотипический скрининг целых клеток. Высокопроизводительный скрининг почти 220 000 библиотек соединений выявил, что этоксоламид ингибирует регулон, но не влияет на рост патогена. Этоксзоламид — ингибитор карбоангидразы, который используется для лечения глаукомы и язв двенадцатиперстной кишки.Транскрипционные исследования показывают, что этоксоламид подавляет 45 генов в M. tuberculosis . Известно, что эти гены контролируют синтез липидов, углеродный метаболизм и вирулентность. В качестве основного вывода этого исследования они заявляют, что этоксзоламид не изменяет гомеостаз pH M. tuberculosis ‘, но подавляет его pH-зависимую адаптацию и вирулентность. 150

Джерри Дэвис (Ливерпульский университет, Великобритания) обнаружил, что проблема с разработкой нового лечения заключается в отсутствии комплексного подхода к фармакокинетическому и фармакодинамическому анализу клинических исходов, наряду с плохо спланированными исследованиями на животных, приводящими к неудачам в лечении. клинические испытания.Это захватывающее время для полевых клинических разработок лекарств от туберкулеза, поскольку несколько новых и перепрофилированных лекарств проходят испытания. Испытания фазы II B одного из немногих многообещающих кандидатов, фторхинолонов, гатифлоксацина и моксифлоксацина, показали, что препараты работают хорошо и ускоряют скорость конверсии посевов на ранних этапах клинической разработки, давая надежду на сокращение продолжительности терапии и снижение частоты рецидивов. Испытания фазы III, в которых моксифлоксацин был включен в схемы лечения первой линии как средство сокращения продолжительности лечения до 4 месяцев, закончились разочарованием.Доктор Дэвис предлагает концепцию бесшовного дизайна исследования с набором основных результатов. Это позволило бы оценить результаты в нескольких промежуточных точках, а руки, которые работают плохо, прекратить. Следовательно, ресурсы и пациентов можно направить в руки, которые хорошо работают в тщательно отобранных точках, чтобы минимизировать потери средств и времени. 151

Информационные бюллетени | Тестирование и диагностика | Информационные бюллетени — Диагностика туберкулеза | ТБ

(значок PDFpdf — 35 КБ)

Диагностика туберкулеза
Когда следует подозревать туберкулез (ТБ)?

ТБ — болезнь, вызываемая Mycobacterium tuberculosis .Заболевание туберкулезом следует подозревать у лиц, имеющих следующие симптомы:

  • Необъяснимая потеря веса
  • Потеря аппетита
  • Ночная одежда
  • Лихорадка
  • Усталость

Если ТБ поражает легкие (легочные), симптомы могут включать:

  • Кашель более 3 недель
  • Кровохарканье (кровохарканье)
  • Боль в груди

Если туберкулез поражает другие части тела (внелегочный), симптомы будут зависеть от пораженной области.

Как вы оцениваете людей с подозрением на туберкулез?

Полное медицинское обследование на туберкулез включает следующее:

1. История болезни

Клиницисты должны спросить об истории контакта пациента с туберкулезом, инфекцией или заболеванием. Также важно учитывать демографические факторы (например, страну происхождения, возраст, этническую или расовую группу, род занятий), которые могут повысить риск заражения пациента туберкулезом или лекарственно-устойчивым туберкулезом.Кроме того, врачи должны определить, есть ли у пациента заболевания, особенно ВИЧ-инфекция, которые увеличивают риск развития латентной инфекции ТБ в заболевание ТБ.

2. Физический осмотр

Медицинский осмотр может предоставить ценную информацию об общем состоянии пациента и других факторах, которые могут повлиять на лечение туберкулеза, таких как ВИЧ-инфекция или другие заболевания.

3. Тест на туберкулез

Туберкулиновая кожная проба Манту (ТКП) или анализ крови на ТБ могут использоваться для определения M.tuberculosis инфекция. Для подтверждения заболевания туберкулезом требуются дополнительные тесты. Кожная туберкулиновая проба Манту проводится путем введения небольшого количества жидкости, называемой туберкулином, в кожу в нижней части руки. Тест считывается в течение 48-72 часов обученным медицинским работником, который ищет реакцию (уплотнение) на руке.

Анализ крови на ТБ измеряет реакцию иммунной системы пациента на M. tuberculosis .

4. Рентгенограмма грудной клетки

Для выявления аномалий грудной клетки используется задне-передняя рентгенограмма грудной клетки.Поражения могут появиться в любом месте легких и могут отличаться по размеру, форме, плотности и кавитации. Эти отклонения могут указывать на туберкулез, но не могут использоваться для окончательной диагностики туберкулеза. Однако рентгенограмма грудной клетки может использоваться, чтобы исключить возможность легочного туберкулеза у человека, у которого была положительная реакция на ТКП или анализ крови на туберкулез и не было симптомов заболевания.

5. Диагностическая микробиология

Наличие кислотоустойчивых бацилл (КУБ) в мазке мокроты или другом образце часто указывает на туберкулез.Кислотно-быстрая микроскопия — это просто и быстро, но она не подтверждает диагноз ТБ, потому что некоторые кислотоустойчивые бациллы не являются M. tuberculosis . Поэтому для подтверждения диагноза на всех исходных образцах делается посев . (Однако положительный посев не всегда необходим для начала или продолжения лечения туберкулеза.) Положительный посев на M. tuberculosis подтверждает диагноз туберкулеза. Посевы должны проводиться на всех образцах, независимо от результатов мазка на КУБ.Лаборатории должны сообщать о положительных результатах мазков и посевов в течение 24 часов по телефону или факсу поставщику первичной медико-санитарной помощи, а также в государственную или местную программу борьбы с туберкулезом, как требуется по закону.

6. Устойчивость к лекарствам

Для всех пациентов исходный изолят M. tuberculosis должен быть протестирован на лекарственную устойчивость. Крайне важно как можно раньше выявить лекарственную устойчивость, чтобы обеспечить эффективное лечение. Паттерны лекарственной чувствительности следует повторить для пациентов, которые не реагируют должным образом на лечение или у которых есть положительные результаты посева, несмотря на 3 месяца терапии.Результаты лабораторных исследований на чувствительность следует незамедлительно сообщать поставщику первичной медико-санитарной помощи и в государственную или местную программу борьбы с туберкулезом.

Дополнительная информация

(PDF) Ранняя диагностика туберкулеза: глобальная потребность

12 Бюллетень STAC Vol. XXII No. 1

Ранняя диагностика туберкулеза: глобальная потребность

Д-р Бадри Тапа, д-р В.С. Салхотра, доктор Каши Кант Джа

Центр борьбы с туберкулезом и ВИЧ / СПИДом СААРК, Тими, Бхактапур, Непал

Туберкулез (ТБ) — одна из

основных проблем здравоохранения в

развивающихся странах.Одна треть

населения мира инфицирована

Mycobacterium tuberculosis

(MTB) (возбудитель

ТБ). Всемирная организация здравоохранения

(ВОЗ) подсчитала, что в 2010 г. во всем мире

было 8,8 миллиона новых случаев ТБ

, а

смертей составили 1,1 миллиона среди

ВИЧ-отрицательных случаев ТБ и

дополнительно 0,35 миллионов смертей

среди ВИЧ-инфицированных —

положительных.С момента открытия

туберкулезных микобактерий более

веков назад, были достигнуты значительные успехи в области знаний

по туберкулезу, но

ранняя диагностика туберкулеза продвигается медленно, а

зависит от руководства.

выпусков. Ранняя диагностика и быстрое начало лечения

остается ключевой стратегией

в борьбе с туберкулезом. Ранняя диагностика

и начало лечения

излечивает отдельных пациентов, а также

сдерживает передачу инфекции

другим людям.Выявление случаев заболевания TB

остается краеугольным камнем

Национальной программы борьбы с туберкулезом

среди различных

отдельных компонентов. Ранний

Инструмент для диагностики

, вероятно, внесет существенный вклад в прогресс в борьбе с

ТБ.

Есть два основных подхода

для диагностики туберкулеза. Прямой подход

включает обнаружение

туберкулезных микобактерий или их продуктов, а

непрямой подход включает

измерений иммунных

ответов людей, инфицированных

туберкулезом.Косвенный подход

(обнаружение антител) — это не

, больше рекомендованное ВОЗ для

диагностики ТБ. Среди прямых подходов

, микроскопия мазка

(наблюдение MTB под световым микроскопом

), посев (выращивание MTB

в лаборатории стандартными и

автоматизированными методами), молекулярные

тесты (ДНК-тесты) и серологические

тестов (обнаружение продуктов

MTB) обычно используются для диагностики

ТБ.Микроскопия мазка

была простым и дешевым ранним диагностическим инструментом

, доступным в настоящее время

для обнаружения туберкулезных бацилл в клинических образцах

в учреждениях первичной медицинской помощи

на протяжении десятилетий. Для этой техники достаточно базовой микроскопии

и обученного техника

.

Для развивающихся стран микроскопия мазка

в настоящее время является единственным рентабельным инструментом

для диагностики

и наблюдения за пациентами с

ТБ.Однако метод

трудоемок, требует значительных затрат на пациента

, недостаточно чувствителен

и вызывает неудобства

, связанные с необходимостью сдать

образцов мокроты в течение

двух дней. Микроскопия мазка

также пропускает некоторые случаи туберкулеза.

В связи с этими ограничениями, ВОЗ

рекомендовала флуоресцентный микроскоп

(FM) на всех уровнях системы здравоохранения

, особенно в условиях

с высоким уровнем распространенности ВИЧ и

в условиях высокой лабораторной нагрузки

.

FM ранее использовала ртутную лампу,

дорогая, требует

непрерывного электроснабжения, а

требует темного помещения для осмотра.

Было сложно реализовать

в условиях нехватки ресурсов. Таким образом, были разработаны недорогие сверхъяркие светоизлучающие

диодные (LED) лампы

. Светодиодные лампы заменили

ртутных ламп

, а обычные

FM были впоследствии заменены на

LED-FM.Светодиодный FM на

дешевле, имеет длительный срок службы, может работать от батареи

и не требует темной комнаты для осмотра

, следовательно, может быть удобно

в условиях ограниченных ресурсов.

Обычная микроскопия мазка

оптимизирована с использованием LED-FM, а

с использованием двух точечных мазков мокроты до

обеспечивает диагностику в тот же день. Этот подход

в настоящее время одобрен ВОЗ

и внедряется в

бедных ресурсами странах на этапе

.

Посев на твердую среду — золотой стандарт

для диагностики туберкулеза. Традиционные методы культивирования

(с использованием твердых питательных сред) занимают

от 6 до 8 недель для подтверждения инфекции MTB

, в то время как современные автоматизированные методы жидкого культивирования

обнаруживают

MTB уже за одну неделю.

Кроме того, эти методы

трудоемки, дороги и

сталкиваются с рядом проблем по своей технической

.Хотя культура

является золотым стандартом, однако этот

нельзя использовать в качестве инструмента ранней диагностики

для туберкулеза. Молекулярные тесты

(ПЦР, гибридизация и т. Д.) Позволяют провести

Раннюю диагностику внелегочного туберкулеза с помощью новой процедуры, сочетающей культуру в бульоне и ПЦР.

Туберкулез (ТБ) — одна из основных причин инфекций во всем мире. Все чаще сообщается о внелегочных формах, которые, согласно недавним исследованиям, составляют от 20 до 50% всех случаев туберкулеза (6, 8, 12).Внелегочный туберкулез (ВТБ) остается сложной диагностикой как для клиницистов, так и для микробиологов (7, 8). Признаки и симптомы чаще всего неспецифичны. Получение материала для посева часто требует инвазивных процедур, которые трудно повторить. Из-за малобациллярной природы внелегочных образцов и неравномерного распределения бацилл, которые имеют тенденцию к слипанию, чувствительность микроскопии мазков очень низкая. Случаи ЕТВ чаще оказываются отрицательными при посеве, чем случаи легочного ТБ, а если посев положительный, для роста на твердой среде может потребоваться до 8 недель.Более того, гистопатологические данные не всегда убедительны, особенно при туберкулезной лимфаденопатии (20). В результате этих диагностических трудностей начало соответствующей терапии часто откладывается у пациентов с ЭТБ, что приводит к увеличению заболеваемости и смертности, тогда как пациенты без ТБ могут получать ненужное предполагаемое лечение в течение нескольких недель (11). Полезность тестов амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) в условиях туберкулеза была тщательно оценена с предполагаемой целью позволить клиницисту поставить более быстрый и точный диагноз (2). , 3, 13, 14, 17).В отличие от легочного туберкулеза, нет четких рекомендаций по использованию NAAT при ETB. В трех недавних метаанализах, обобщающих результаты почти 140 исследований, были изучены текущие доказательства эффективности этих тестов для диагностики туберкулезного лимфаденита, плеврита и менингита (3, 13, 14). Согласно этим исследованиям, NAAT обладают высокой специфичностью и положительной прогностической ценностью, но низкой и переменной чувствительностью, а также отрицательной прогностической ценностью во всех формах ETB. В то время как положительный результат однозначно указывает на ТБ, отрицательный результат не исключает ТБ с уверенностью.Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что NAAT не могут заменить традиционные тесты, такие как микроскопия и посев, и что их следует интерпретировать в сочетании с этими тестами и клиническими данными (15, 17). В клинической практике результаты NAAT не имеют существенного значения для принятия решения при подозрении на ETB, а предполагаемое противотуберкулезное лечение редко прекращают до получения окончательных результатов посева (21). Поэтому необходима дальнейшая работа для разработки новых методов с повышенной чувствительностью при сохранении высокой специфичности.На ETB приходилось 35% случаев туберкулеза, зарегистрированных в нашей больнице в 2002 году, и этот показатель увеличился до 53% в 2005 году. В попытке сократить время, необходимое для диагностики ETB, мы разработали процедуру, состоящую из предварительного этапа культивирования в бульоне. с последующим обнаружением Mycobacterium tuberculosis с использованием анализа GenoType Mycobacteria Direct (GTMD) (Hain Lifescience, Нерен, Германия). Этот тест представляет собой коммерчески доступный генетический анализ, предназначенный для обнаружения комплекса M. tuberculosis и четырех атипичных видов Mycobacterium непосредственно из респираторных образцов (5, 19).В настоящем исследовании процедура, объединяющая культивирование в бульоне и тест GTMD, будет называться ПЦР с усилением культуры.

В первой части исследования моделирование жидкости или ткани, содержащей M. tuberculosis , in vitro, было использовано для определения оптимального времени культивирования в бульоне для обнаружения мельчайшего инокулята бацилл с помощью теста GTMD. Во второй части исследования процедура использовалась для обнаружения M. tuberculosis в недыхательных клинических образцах от пациентов с подозрением на ETB, и результаты сравнивались с результатами традиционных микробиологических методов, гистопатологическими данными и терапевтическим ответом.

(Часть этого исследования была представлена ​​на 46-й Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии в 2006 г. [Сан-Франциско, Калифорния].)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Оценка процедуры ПЦР с культивированием и приготовленной in vitro

M. tuberculosis суспензия. (i) Приготовление суспензий M. tuberculosis .

В экспериментах использовался клинический изолят M. tuberculosis , идентифицированный в нашей лаборатории.Колонии, культивированные на скосе Левенштейна-Йенсена, диспергировали в стерильной воде для получения суспензии, содержащей приблизительно 5 × 10 7 КОЕ / мл. Эту суспензию подвергали 10-кратным серийным разведениям в стерильной воде (до 10 -8 ). Пятьсот микролитров каждой из девяти суспензий (включая исходную суспензию) смешивали с 500 мкл измельченных лимфатических узлов, которые, как ранее было показано, не содержат бактерий. Таким образом, 18 суспензий, содержащих 10-кратно переменные числа М.tuberculosis были получены бактерии с тканью лимфатических узлов или без них, и каждая из этих суспензий была впоследствии подвергнута (i) микроскопическому исследованию, (ii) количественному культивированию на наклонах Левенштейна-Йенсена, (iii) культуре бульона в бутылях BacT / Alert MP ( bioMérieux, Дарем, Северная Каролина) и (iv) ПЦР-анализ с усилением культуры.

(ii) Микроскопическое исследование.

Мазки готовили из 100 мкл суспензии, окрашивали аурамин-флуорохромом и исследовали на наличие флуоресцентных бацилл.

(iii) Культивирование на твердой среде.

Четыреста микролитров каждой суспензии инокулировали на два скошенных участка Левенштейна-Йенсена (200 мкл / наклон). Скосы инкубировали при 37 ° C и еженедельно проверяли на рост до положительного результата или в течение 12 недель. Для определения размеров посевного материала подсчитывали количество колоний на наклонных поверхностях, показавших неконфлюэнтный рост, и рассчитывали количество КОЕ / мл для каждой суспензии.

(iv) Культивирование в бульоне и анализ ПЦР.

Семь флаконов BacT / Alert MP инокулировали каждой из 18 суспензий (500 мкл / флакон).Все флаконы инкубировали в приборе BacT / Alert (bioMérieux, Лион, Франция) при 37 ° C без встряхивания. Для каждой суспензии одну из семи бутылок оставляли в приборе до получения положительного результата или на 8 недель, чтобы определить время до положительного результата в культуре в бульоне. Шесть других бутылей были извлечены из прибора для анализа ПЦР в разное время перед положительным обнаружением. С этой целью из этих шести бутылок удаляли аликвоту 5 мл в дни 0 (перед инкубацией), 2, 4, 6, 8 и 15, соответственно, и бутылки повторно загружали в прибор BacT / Alert до тех пор, пока они не были отмечены как положительный или на 8 недель.

Аликвоты по 5 мл центрифугировали и осадок ресуспендировали в 1 мл стерильной воды. Пятьсот микролитров использовали для ПЦР-анализа с использованием теста GTMD в соответствии с рекомендациями производителя (5). Оставшиеся 500 мкл замораживали при -20 ° C до использования для повторного тестирования, когда результат первой ПЦР был отрицательным.

Оценка процедуры ПЦР с культивированием на клинических внелегочных образцах.

Обработка и анализ образцов проводились следующим образом. Неспираторные образцы от пациентов с подозрением на ЭТБ и без противотуберкулезной терапии, которые были отправлены в нашу лабораторию с января 2006 г. по декабрь 2007 г., были проанализированы с помощью процедуры ПЦР с повышенным посевом.С января 2006 г. по май 2006 г. все образцы были подвергнуты двум ПЦР-анализам после 8-дневного культивирования в бульоне и 15-дневного культивирования в бульоне, соответственно. С июня 2006 г. по декабрь 2007 г. индекс клинической подозрительности на ТБ оценивался и классифицировался как средний или сильный лечащим врачом. Образцы от пациентов с сильным подозрением были впоследствии обработаны для проведения двух ПЦР-анализа, после 8-дневного и 15-дневного культивирования в бульоне, соответственно, тогда как образцы от пациентов с умеренным подозрением были подвергнуты единственному анализу ПЦР. после 15-дневного культивирования.

После получения образцы перед обработкой хранили при + 4 ° C. Образцы тканей нарезали и гомогенизировали со стерильной водой в ступке в стерильных условиях, и 100 мкл этих гомогенизированных тканей или жидких образцов инокулировали на две чашки с кровяным агаром (bioMérieux), которые инкубировали в течение ночи при 37 ° C в аэробных и анаэробных условиях. Последующее обеззараживание ацетилцистеином N проводили только в том случае, если на кровяном агаре наблюдали рост бактерий или грибков.Затем образцы центрифугировали при 3300 × g в течение 20 минут (за исключением спинномозговой жидкости и костного мозга), и осадок ресуспендировали в 1 или 1,5 мл стерильной воды в зависимости от того, был ли запланирован один анализ ПЦР или два анализа ПЦР. Порцию 100 мкл использовали для приготовления мазка для окрашивания аурамин-родамином и микроскопического исследования на наличие флуоресцентных бацилл. Еще одну порцию в 400 мкл использовали для посева на два скошенных участка Левенштейна-Йенсена (200 мкл на уклон), которые инкубировали при 37 ° C и еженедельно проверяли на рост в течение 12 недель.Оставшиеся 500 мкл или 1 мл засевали в одну или две бутыли BacT / Alert MP (500 мкл на бутыль), которые инкубировали при 37 ° C без встряхивания и отслеживали рост в течение 8 недель. Аликвоту 2,5 мл удаляли из каждого флакона после 8 дней и 15 дней инкубации, соответственно, или только после 15 дней, когда был засеян единственный флакон. Затем флаконы повторно загружали и оставляли в приборе до положительного определения или на общий период 8 недель. Однако культуры, которые уже были определены прибором как положительные до 8 или 15 дней, не подвергались анализу ПЦР.Удаленную аликвоту объемом 2,5 мл центрифугировали и ресуспендировали в 500 мкл стерильной воды. Суспензию 500 мкл использовали для ПЦР с тестом GTMD в соответствии с рекомендациями производителя, как описано ранее.

Диагностика туберкулеза и анализ результатов.

Критериями положительного диагноза ТБ были следующие: задокументированный ТБ с положительным посевом и / или положительным гистологическим исследованием или вероятный ТБ на основании клинических данных и улучшение после пробной противотуберкулезной терапии.Чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность и отрицательная прогностическая ценность нашего метода были рассчитаны только в сравнении с результатами культивирования и отдельно по сравнению с комбинацией посева, гистологии и реакции на предполагаемое лечение в качестве эталонного стандарта.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперименты in vitro с

суспензиями M. tuberculosis . Размеры посевного материала каждой суспензии оценивали путем культивирования на твердой среде. Штатная подвеска и подвески с 10 −1 до 10 −7 выросли на М.tuberculosis на наклонах Левенштейна-Йенсена с размером посевного материала от 5 × 10 7 КОЕ / мл до 5 КОЕ / мл (таблица 1). Микроскопическое исследование дало положительный результат только для инокулята ≥5 × 10 3 КОЕ / мл. Все суспензии, которые были положительными на наклонах Левенштейна-Йенсена, были обнаружены как положительные с помощью автоматизированного прибора BacT / Alert. Время появления положительных результатов в бульонных культурах составляло от 3 до 32 дней в зависимости от размера инокулята. Время достижения положительности данной суспензии существенно не отличалось для бутылей, которые были извлечены в разное время для анализа ПЦР, и для бутылок, оставленных в приборе.Для суспензии 10 -8 культура на наклонных планках Левенштейна-Йенсена оставалась отрицательной через 12 недель, а культура в бульоне не определялась как положительная с помощью прибора BacT / Alert через 8 недель. Следовательно, эта суспензия 10 -8 считалась свободной от M. tuberculosis . Тест GTMD был положительным в день 0 (до инкубации) только для суспензий с положительным мазком (таблица 1). Для суспензий с отрицательным мазком и положительной культурой тест обнаружил M. tuberculosis после периода инкубации от 2 до 15 дней, когда размер посевного материала уменьшился с 5 × 10 2 КОЕ / мл до 5 КОЕ / мл. (Таблица 1). M. tuberculosis был обнаружен в суспензии с наименьшим посевным материалом, который дал единственную колонию на скосе Левенштейна-Йенсена только после 15-дневного культивирования в бульоне. ПЦР на 8 день дала положительный результат для суспензии 10 -6 , что дало 10 колоний на скосе Левенштейна-Йенсена, тогда как ПЦР на 2, 4 или 6 день не выявила M. tuberculosis в этой суспензии. Для данного размера посевного материала результаты мазка, посева и ПЦР были аналогичными для суспензий, приготовленных с тканью лимфатического узла или без нее (данные не показаны).

Эти эксперименты in vitro показали, что ПЦР на 8 день работает лучше, чем ПЦР на 2, 4 или 6 день, для обнаружения M. tuberculosis в суспензиях малобациллярных бактерий. Однако для получения положительного результата ПЦР для суспензии с наименьшим размером посевного материала требовалось 15-дневное время инкубации. В результате мы впоследствии применили тест GTMD к бульонным культурам наших клинических образцов на 8-й и 15-й день.

Оценка процедуры с клиническими образцами.

С января 2006 г. по май 2006 г. эффективность процедуры, состоящей из двух ПЦР-анализов на 8-й и 15-й день, оценивалась на 24 образцах от 22 пациентов с подозрением на ETB.Эти образцы включали 16 образцов биопсии ткани (семь биопсий лимфатических узлов, шесть биопсий костей, две биопсии пищеварительной системы и один образец биопсии кожи) и семь образцов органических жидкостей или гноя (три из плевральной жидкости, один из асцитической жидкости, один из спинномозговой жидкости). , а также один образец мочи и один образец абсцесса головного мозга). Из этих 24 образцов все были отрицательными по мазку, а семь (29%), взятых от пяти пациентов, дали положительный результат посева на M. tuberculosis на скосах Левенштейна-Йенсена и в жидкой среде (Таблица 2).Среднее время роста на наклонах Левенштейна-Йенсена составляло 34 дня (диапазон от 26 до 45 дней), а среднее время до обнаружения в бутылках BacT / Alert составляло 25 дней (диапазон от 15 до 44 дней). Все образцы с отрицательным посевом были отрицательными по результатам ПЦР. Из семи образцов, положительных по культуре, шесть были положительными на ПЦР на 8-й день и все были положительными на ПЦР на 15-й день (Таблица 2). Таким образом, общая частота образцов с положительным результатом ПЦР на 8-й день составила 6/24 (25%). Учитывая стоимость и выполнимость теста, ПЦР-анализ впоследствии был применен к 8-дневным культурам только для образцов от пациентов, у которых было сильное подозрение на туберкулез.Таким образом, с июня 2006 г. по декабрь 2007 г. был изучен еще 201 образец, в том числе 19 образцов от 19 пациентов, у которых было сильное клиническое подозрение на ЕТБ. Всего с января 2006 г. по декабрь 2007 г. было исследовано 225 недыхательных образцов от 189 пациентов. Образцы включали 141 образец биопсии ткани, 73 образца жидкости и 11 гнойных экссудатов (таблица 3). Микроскопическое исследование во всех случаях было отрицательным. Из 225 образцов 24 (10,7%) выросли M. tuberculosis на уклонах Левенштейна-Йенсена и 31 (13.8%) от 27 больных выросло M. tuberculosis в бульонных культурах. Показатели положительных культур в бульоне в зависимости от типа образцов приведены в таблице 3. Ни один из образцов не был положительным на культивирование нетуберкулезных микобактерий. Среднее время роста на наклонах Левенштейна-Йенсена составляло 35 дней (диапазон от 21 до 60 дней), а среднее время до обнаружения прибором BacT / Alert составляло 23 дня (диапазон от 10 до 45 дней). В целом M. tuberculosis было обнаружено тестом GTMD либо на 15-й, либо на 8-й день в 31 образце с положительным посевом (таблица 4).ПЦР-анализы были отрицательными в 194 образцах с отрицательным посевом. Таким образом, по сравнению с результатами посева чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность и отрицательная прогностическая ценность процедуры были 100%. Отрицательный внутренний контроль амплификации теста GTMD, указывающий на присутствие ингибиторов, наблюдался в 9 (4%) из 225 образцов, включая шесть образцов тканей (три образца кости, один образец лимфатического узла, один образец околоушной железы и один образец биопсии кишечника). образец) и три образца жидкости (два образца асцитической жидкости и один образец костного мозга).Помимо 27 пациентов с подтвержденным посевом ТБ, у четырех пациентов был диагностирован ТБ, несмотря на отрицательные результаты посева (Таблица 5). ETB был задокументирован положительным гистологическим исследованием, показывающим типичную гранулему с казеозом и некрозом у трех пациентов. Примечательно, что у двух из этих трех пациентов образец, отправленный на гистопатологическое исследование, отличался от образца, отправленного в микробиологическую лабораторию (позвонок D9 по сравнению с позвонком D8 у одного пациента и образец биопсии брюшины по сравнению с образцом асцитической жидкости у другого пациента) .Еще один пациент с отрицательной культурой считался больным менингеальным туберкулезом на основании клинических факторов и хорошего ответа на противотуберкулезное лечение. Таким образом, используя комбинацию посева, гистопатологических данных и ответа на лечение в качестве эталонного стандарта, 31 (16,4%) из 189 включенных пациентов были диагностированы как имеющие ETB, а 35 (15,6%) из 225 исследованных образцов были собраны из этим пациентам (таблица 4). Четыре пациента, которым был поставлен диагноз ETB, несмотря на отрицательный результат посева, дали отрицательный результат ПЦР.При использовании положительного диагноза ТБ в качестве золотого стандарта чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность и отрицательная прогностическая ценность процедуры составили 88,6%, 100%, 100% и 97,9% соответственно. подозрение на ETB было диагностировано как туберкулез в соответствии с вышеупомянутыми критериями. ПЦР дала положительный результат на 8-й день только у 10 (52,6%) из 19 пациентов (таблица 6). ПЦР была отрицательной на 8-й день и положительной на 15-й день еще у пяти пациентов. У четырех оставшихся пациентов результаты ПЦР были отрицательными как на 8, так и на 15 дни (таблица 5).Посев во флаконах с BacT / Alert MP оказался положительным у 15 (78,9%) из 19 пациентов. Среднее время обнаружения в культуре бульона для 10 образцов с положительной ПЦР на 8 день составило 15,7 дня (диапазон от 10 до 20 дней). Восемь из этих 10 образцов были образцами тканей с положительным гистологическим исследованием, а два — жидкостями, гистология которых не была доступна (Таблица 6).

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранняя диагностика ETB является сложной задачей из-за малобациллярной природы этих инфекций, что приводит к очень редко положительным результатам микроскопии мазка и длительному инкубационному периоду, необходимому для роста.Эту долгую задержку без положительного или отрицательного микробиологического диагноза можно сократить с помощью NAAT. Однако эти методы имеют относительно низкую чувствительность и отрицательную прогностическую ценность при применении непосредственно к внелегочным образцам (15). Таким образом, для диагностики ETB необходима разработка процедур, направленных на повышение чувствительности NAAT. С этой целью мы разработали новую процедуру, сочетающую анализ GTMD с этапом предварительного культивирования, чтобы амплифицировать количество целевой нуклеиновой кислоты и разбавить ингибиторы амплификации.

В первой части исследования мы оценили нашу процедуру с 10-кратно разведенными суспензиями M. tuberculosis , имитирующими малобациллярные клинические образцы. Суспензии тестировали в присутствии и в отсутствие наземного лимфатического узла, чтобы изучить потенциальное влияние ингибиторов ПЦР. Эти эксперименты показали, что предварительная 8-дневная культура в бульоне позволила ПЦР детектировать M. tuberculosis в суспензиях с бактериальной нагрузкой ≥50 КОЕ / мл, тогда как 15-дневная культура в бульоне требовалась для обнаружения самой низкой нагрузки бактерий и бактерий. для точного прогнозирования окончательных результатов культивирования.Последний результат был подтвержден на серии из 24 клинических образцов, которые систематически подвергались ПЦР с культивированием на 8 и 15 день. Это предварительное исследование клинических образцов показало, что ПЦР с культивированием на 8 день не была положительной у всех пациентов с позитивная культура. В результате ПЦР с культивированием впоследствии оценивалась путем систематического выполнения теста на 15-й день для всех пациентов с подозрением на ETB, тогда как ПЦР проводилась на 8-й день только для подгруппы пациентов, у которых было сильное клиническое подозрение на ETB.

Уровень ингибирования ПЦР в нашем исследовании составил 4%, что ниже, чем показатели, обычно сообщаемые для внелегочных образцов (1, 9). Это открытие можно объяснить разбавлением ингибиторов ПЦР в результате посева образцов во флаконы BacT / Alert MP. Из 31 образца с положительной культурой все были малобациллярными, о чем свидетельствует отрицательность микроскопии мазка и время, необходимое для получения положительной культуры, а именно до 60 дней на твердой среде и до 45 дней в бутылях с BacT / Alert MP.Более того, семь образцов с положительной культурой в бульоне остались отрицательными на твердой среде после 12-недельной инкубации. По сравнению с результатами культивирования в бульоне чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность и отрицательная прогностическая ценность ПЦР с повышенным посевом были 100%. Таким образом, отрицательный результат ПЦР на 15 день был эффективным для исключения присутствия M. tuberculosis в образце, протестированном за несколько недель до получения результатов культивирования. Наши результаты показывают, что ПЦР с повышенным посевом может обеспечить ранний микробиологический результат, который можно использовать в сочетании с другими диагностическими критериями для переоценки лечения, не дожидаясь окончательных результатов посева.Эта процедура может быть особенно важна для образцов жидкости, поскольку гистологические данные отсутствуют. Хорошо известно, что посев не может считаться золотым стандартом для оценки эффективности новой диагностической процедуры для ETB из-за недостаточной чувствительности (10, 18). ). Поэтому мы использовали комбинацию посева, гистологических данных и реакции на лечение в качестве эталона. Чувствительность и отрицательная прогностическая ценность нашей процедуры составили 88,6% и 97,9% соответственно.Четыре пациента, которым был поставлен диагноз ЭТБ на основании гистологических результатов ( n = 3) или улучшения после пробной противотуберкулезной терапии ( n = 1), дали отрицательный результат ПЦР на 15-й день. Расхождения между микробиологическими и гистологическими результатами. можно объяснить неравномерным распределением бацилл в аликвотах, выделенных для отдельных тестов. Более того, микробиологические и гистопатологические исследования не проводились на одном и том же типе образцов для двух из четырех пациентов.Напротив, культивирование и ПЦР выполнялись с одной и той же аликвотой, что объясняет идеальную корреляцию между этими двумя методами. Таким образом, результаты ПЦР всегда следует сравнивать с гистологическими данными, если таковые имеются, до принятия решения о начале или прекращении противотуберкулезной терапии. В нашей серии исследований, несмотря на отрицательные результаты посева, ПЦР и гистологического исследования, в конечном итоге считалось, что у одного пациента есть ETB на основании клинических подозрений. Анализы высвобождения гамма-интерферона, которые стали специфическим методом диагностики латентного ТБ, могут быть полезны для этих нескольких пациентов с подозрением на ЭТБ, у которых все стандартные диагностические критерии отрицательны (16).

Начиная с июня 2006 г., ПЦР проводилась на 8-й день только для 19 пациентов, у которых было сильное клиническое подозрение на ЕТБ. Положительный результат был получен только у 10 из этих 19 пациентов, которым был поставлен диагноз ЭТБ. Напротив, гистологические данные, которые обычно доступны в течение 8 дней, были положительными для 12 из 13 исследованных биоптатов. Эти данные указывают на то, что ПЦР на 8-й день недостаточно чувствительна и ее не следует проводить систематически. Тем не менее, это может быть полезно для образцов жидкости у пациентов с высоким индексом клинического подозрения, поскольку при отсутствии гистологических результатов положительный результат ПЦР может быть единственным аргументом для принятия решения о немедленном начале терапии.

Существуют очевидные ограничения на рутинное использование нашей процедуры при диагностике ETB. Из-за стоимости и осуществимости теста беднейшие страны с самым высоким уровнем заболеваемости туберкулезом не могут воспользоваться такими технологиями. Процедура довольно трудоемкая и трудоемкая и должна выполняться квалифицированными специалистами из-за риска получения ложноположительных результатов из-за заражения ампликонами. Скрининг пациентов с подозрением на ЭТБ специалистами может быть полезным, чтобы избежать проведения дорогостоящих ненужных процедур (4, 21).

В заключение, ПЦР с культивированием — это высокочувствительный и специфический метод обнаружения M. tuberculosis во внелегочных образцах. Отрицательный результат ПЦР на 15-й день достоверно предсказал окончательные результаты культивирования. Таким образом, результаты ПЦР могут использоваться вместе с гистологическими данными в качестве ключевого фактора для принятия решения о том, следует ли продолжать или прекратить предполагаемое противотуберкулезное лечение, тем самым способствуя снижению затрат и снижению потенциальной токсичности, связанной с длительной ненужной терапией.

ТАБЛИЦА 1.

ТАБЛИЦА 1. Сравнение результатов мазка, посева и усиленной культуры ПЦР с приготовленными in vitro суспензиями M. tuberculosis a (+ сливной) сливной) 93 219 —
Разведение Размер посевного материала (КОЕ / мл ) b Результат мазка Результат посева на скосе Левенштейна-Йенсена (количество колоний) Бульонная культура Результат ПЦР с усилением культуры в соответствии с периодом инкубации (дни) d :
Позитивность Время до обнаружения (дни) c

247
9320 9320 9320 9320 9320

27
9306 9320 9320 9320 8 15
Stock 5 × 10 7 + + (conflue nt) Да 3 + + NP NP NP NP
10 −1 5 × 10 6 сливной) Да 5 + + + NP NP NP
10 −2 5 × 10 5 932 932 + Да 8 + + + + НП НП
10 −3 5 × 10 4 32 Да 12 + + + + + NP
10 −4 5 × 10 3 930 930 930 930 930 930 930 930 930 932 20 + (сливной) Да 17 + + + + + +
10 −5 5 × 932 13 2 + (80) Есть 20 + + + + +
10 -6 50 — 50 — ) Да 26 + +
10 −7 5 20 20 20 20 20 20 32 +
10 — 8 0 19 —

a

+, положительный; -, отрицательный; НП, не выполнено.

b

Размер посевного материала рассчитывали по количеству колоний на наклонах Левенштейна-Йенсена.

c

Время до обнаружения флакона BacT / Alert MP, оставшегося в приборе.

d

ПЦР не проводилась после того, как флакон был определен прибором как положительный.

e

На мазке было видно только 10 бацилл.

ТАБЛИЦА 2.

ТАБЛИЦА 2. Результаты ПЦР с повышенным посевом для пяти пациентов с отрицательными мазками и положительными посевами образцов в период с января 2006 г. по май 2006 г. a 932 932 932 жидкость 9327 1 Шейный лимфатический узел 0
Пациент Образец Мазок результат Результат гистологического исследования Время роста по наклону Левенштейна-Йенсена (дни) Время обнаружения в бутылях BacT / Alert MP (дни) Результат ПЦР с усилением культуры
День 8 День 15
1 Спинномозговая жидкость NP 27 21 NP 45 28 + +
3 + b 25 15 + +
Шейный лимфатический узел 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 + +
4 Позвоночный диск + 26 21 + +
—3219 44 +
5 Позвоночный диск + 39 27 + +
470 9000 + 470 9000 9000, положительный -, отрицательный; НП, не выполнено.

b

Положительный результат гистологического исследования был определен как гранулема с казеозом и некрозом.

ТАБЛИЦА 3.

ТАБЛИЦА 3. Результаты культивирования в бульоне для 225 недыхательных образцов 932 (15,4)
Тип образца (номер) Количество (%) положительных культур со средой:
Lowenstein -Jensen slant Бульон
Образцы тканей (141) 17 (12) 22 (15.6)
Лимфатический узел (53) 9 (17) 14 (26,4)
Кость (37) 6 (16,2) 6 (16,2)
Кишечник ( ) 0 0
Церебральный (6) 0 0
Печень (4) 0 0
20 930 932 930 930 930 930 930 930 930 930 930 930 930 930 (11,1) 2 a (11.1)
Органические жидкости (73) 5 (6,8) 7 (9,6)
Костный мозг (16) 0 0
Цереброспинальная жидкость 2 (15,4)
Асцитическая жидкость (25) 1 (4) 3 (12)
Плевральная жидкость (9) 1 (11,1) 1 (11,1 )
Перитонеальная жидкость (7) 1 (14.3) 1 (14,3)
Суставная жидкость (2) 0 0
Моча (1) 0 0
113219 9329 гнойный экссудат 18.2) 2 (18.2)

a

Образец из брюшины и сосцевидного отростка.

ТАБЛИЦА 4.

ТАБЛИЦА 4. Сравнение результатов ПЦР с усилением культуры с результатами культивирования в бульоне и диагностика туберкулеза a
Результат ПЦР с усилением культуры No.образцов (всего)
Результат культивирования в бульоне: От типа пациента:
Положительный (3147) Положительный (3147) Положительный (3147) TB (35) Non-TB (190)
Положительный 31 0 31 0
Отрицательный 0 194 930 0 900 190

a

ТБ был определен как положительный посев и / или положительный гистологический анализ и / или хороший ответ на терапию.

ТАБЛИЦА 5.

ТАБЛИЦА 5. Результаты для четырех пациентов с отрицательными посевами и отрицательными ПЦР с усилением посева a 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 позвонок D9) 932 19 —
Пациент Тип образца Результат посева Результат ПЦР на: Диагностический критерий ТБ
День 8 День 15
1 Позвонок D819 —
2 Асцитическая жидкость Положительный гистологический анализ (перитонеальная биопсия)
3 1932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 932 —32 932 гистология (биопсия подвздошной кишки)
4 Спинномозговая жидкость Хороший ответ на противотуберкулезное лечение

ТАБЛИЦА 6.

ТАБЛИЦА 6. Результаты ПЦР с культивированием на 8 день для 19 пациентов, у которых было сильное клиническое подозрение на ЕТБ, подтвержденное посевом, гистологией и / или терапевтическим ответом 9327 9327 9327 9327 9327 9327 9327 9327
Результат ПЦР на 8 день Нет пациентов с:
Результат посева в бульоне Результат гистологического исследования
Отрицательный Не выполнялся
Положительный 10 0 8 0 2
Отрицательный 932 932 932 932 932 932 932 932 920 932 920 932 932 932 920 932 932 932 932 920 932

a

Положительный результат гистологии определялся как gr.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *