Пуникалагин: Антиоксидант, который замедляет старение — Zahav.ru Салат

Содержание

Антиоксидант, который замедляет старение — Zahav.ru Салат

Пуникалагин — антиоксидант, присутствующий только в гранате, замедляет процесс старения вдвое. 

Гранат считается одним из самых полезных фруктов на планете. Плоды содержат клетчатку, витамины, минеральные вещества и микроэлементы: кальций, магний, калий, марганец, натрий. В соке плодов присутствует большое количество полезных веществ — глюкоза, фруктоза, лимонная, яблочная, щавелевая кислоты, фитонциды, азотистые вещества, танин. В других частях дерева — корнях, коре и околоплоднике содержатся дубильные вещества. Гранатовый сок используется для профилактики и лечения целого ряда заболеваний — разных форм анемий, респираторных инфекций, воспалений верхних дыхательных путей. Он оказывает выраженное противовоспалительное действие, повышает сопротивляемость вирусным и простудным заболеваниям, способствует нормализации артериального давления. А отвар из коры граната успешно справляется с расстройством желудка. 

В 2014 году ученые обнаружили в гранате уникальное вещество — пуникалагин, которое крайне эффективно для профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний, болезни Альцгеймера и даже рака, пишет GreenPlanet.  

Также было доказано, что пуникалагин — антиоксидант, присутствующий только в гранате, обеспечивает коже защиту от воздействия токсинов и замедляет процесс старения почти вдвое. 

Недавно в самом сердце блошиного рынка в Яффо на улице Пинхас бен-Яир, 16, открылся концептуальный магазин натуральной израильской косметики Pomegranate, основанной на экстракте граната. Главный «бестселлер» продукции Pomegranate — натуральное масло из гранатовых зерен. Масло содержит большое количество витамина E и жирных кислот. По мнению экспертов, оно обладает регенерирующим и противовоспалительным свойствами, способствует заживлению поврежденной кожи, смягчает ее и замедляет старение. 

Посмотрите сюжет израильского интернет-канала Iland, в котором известная модель и телеведущая Мария Барлин Богуславски рассказывает, как бороться со старением.

12 полезных свойств граната — Лайфхакер

Каждый год 26 октября в Азербайджане отмечается праздник граната. Заканчивается его сбор, и страна с размахом отмечает это событие. Проводятся выставки и ярмарки, люди хвастают своим урожаем и дегустируют различные гранатовые вкусности: вино, сок, варенье и т. д.

Гранат — это плод гранатового дерева округлой формы и насыщенного красного цвета. В переводе с латинского слово granatus означает «семенной». Плод состоит из множества зёрен, отделённых друг от друга тонкой мембраной. В одном гранате их до 700 штук.

В природе более десятка сортов граната. Плоды отличаются по вкусу и цвету. Но все они полны витаминов и минералов. Из этой статьи вы узнаете 12 полезных свойств граната.

Гранат обеспечивает организм питательными веществами

В гранате содержится порядка 15 аминокислот, пять из которых незаменимые. Также гранат богат витаминами К, С, В9 и В6 и минералами (калий, медь, фосфор). При этом гранат — низкокалорийный фрукт. В 100 граммах всего 72 килокалории.

Следующая картинка познакомит вас с тем, сколько процентов от дневной нормы различных питательных веществ, витаминов и минералов содержится в 100 граммах граната.

Гранат укрепляет здоровье сердца

В гранате содержится пуникалагин (Punicalagin). Это вещество нейтрализует свободные радикалы и повышает антиоксидантный статус. Попадая в организм, оно благотворно влияет на сердце.

По данным медиков, пуникалагин и другие антиоксиданты, содержащиеся в гранате, укрепляют стенки сосудов и снижают уровень «плохого» холестерина (ЛПНП). Это препятствует образованию атеросклеротических бляшек. Так, в одном из исследований больным со стенозом сонной артерии в течение трёх лет предлагалось выпивать по 30 миллилитров гранатового сока в день. В результате было выявлено, что риск образования атеросклеротических бляшек у участников эксперимента снизился на 30%.

Гранат препятствует развитию артрозов

Артроз — самое распространённое заболевание суставов. По статистике, им страдает более 10% населения Земли. Артроз характеризуется воспалением и болезненностью движений.

Гранат богат витамином К, который играет значительную роль в обмене веществ в костях и соединительных тканях. В частности, участвует в усвоении кальция. А научные изыскания Медицинской школы Западного резервного университета Кейза показали: гранат замедляет деформацию хрящевых тканей, приводящих к остеоартрозу. Гранатовый сок богат фитонутриентами, которые снимают воспаления и уменьшают припухлости хрящевых тканей.

Гранат ухаживает за зубами

Сок граната способствует удалению зубного налёта. Кроме того, он обладает противомикробными и противовирусными свойствами и очищает полость рта от бактерий. Благодаря этому снижается риск возникновения болезней дёсен.

Гранат защищает от рака

В соке граната содержатся вещества, препятствующие синтезу эстрогена и блокирующие рост злокачественных новообразований, — эллаготанины. Согласно исследованию, опубликованному в журнале Американской ассоциации исследований рака, регулярное употребление граната в несколько раз снижает риск рака молочной железы.

Учёные изучают также влияние экстракта граната при раке простаты. Благодаря высокому содержанию анктиокислительных и антивоспалительных веществ гранатовый сок замедляет рост раковых клеток. Кроме того, существуют основания полагать, что он замедляет развитие лёгочных онкологий, что позволяет более эффективно бороться с заболеванием.

Гранат повышает иммунитет

В 100 граммах граната содержится 21% дневной нормы витамина С. Как говорилось ранее, он обладает сильными антибактериальными свойствами. Гранат активизирует иммунную систему организма, защищая его от вирусов.

Считается, что достаточно съедать четвертинку одного граната, чтобы укреплять иммунитет.

Гранат улучшает пищеварение

Пищевые волокна — это элементы, которые не усваиваются организмом, но обеспечивают удаление из кишечника всего переработанного. Они считаются «двигателем» здорового пищеварения. Пищевые волокна содержатся в злаках, а также некоторых фруктах, в том числе гранате. Вы получите 16% дневной нормы пищевых волокон, если съедите всего 100 грамм граната — пищеварение и стул стабилизируются.

Кроме того, гранатовый сок стимулирует аппетит и прекрасно утоляет жажду.

Гранат способствует заживлению шрамов

Масло зёрен граната улучшает регенерацию клеток эпидермиса, а также ускоряет заживление ран. Оно воздействует на фибробласты — клетки, отвечающие за коллаген и эластин, а также за синтез межклеточного вещества. Кроме того, экстракт граната хорошо восстанавливает кожу после солнечных ожогов.

Гранат повышает гемоглобин

Гемоглобин — это железосодержащий белок, обеспечивающий перенос кислорода в ткани организма. Нормальный уровень гемоглобина в крови у мужчин — 130−160 г/л, у женщин — 120−150 г/л. Если этот уровень ниже, человек ощущает тошноту, головокружение, слабость.

Гранат повышает уровень гемоглобина в крови. Гранатовый сок часто назначается при анемии, по полстакана три раза в день за полчаса до еды.

Гранат предотвращает выпадение волос

Одной из причин потери волос является железодефицитная анемия, то есть нарушение синтеза гемоглобина из-за дефицита железа. Со снижением уровня гемоглобина в крови клетки организма испытывают кислородное голодание. Первыми недостаток кислорода испытывают волосы и ногти.

Регулярное употребление в пищу граната не только нормализует гемоглобин, но и укрепляет волосяные луковицы. Это предотвращает выпадение волос и придаёт им здоровый блеск.

Гранат показан при сахарном диабете

В отличие от других, более сладких соков, гранатовый можно употреблять при диабете (в умеренных количествах). Он не вреден, а даже полезен. Так, гранатовый сок обладает мочегонным действием, что способствует уменьшению отёков, часто встречающихся у диабетиков на ранних стадиях болезни.

Кроме того, диабет нередко приводит к урологическим осложнениям. Для устранения неприятных ощущений при инфекциях мочевого пузыря применяется разбавленный гранатовый сок с мёдом.

Однако людям с нарушенным обменом веществ не следует пить покупной гранатовый сок, так как производители часто подслащивают его. Безопаснее и полезнее свежевыжатый сок, разбавленный водой, или просто зёрна.

Гранат сохраняет молодость

Согласно исследованию 2006 года, гранат препятствует развитию болезни Альцгеймера. Это происходит за счёт высокого содержания в составе граната антиоксидантов пуникалагинов. К аналогичному выводу позднее пришли и учёные Университета Хаддерсфилда (University of Huddersfield). Концентрированный гранатовый сок на 3,4% состоит из пуникалагина, который, в свою очередь, уменьшает выраженность воспалительных процессов в головном мозге и замедляет возрастные деменции.

Кроме того, экстракт граната нередко применяется в медицине как anti-age добавка. Он замедляет процесс старения кожи, уменьшает количество морщин и препятствует образованию возрастных пигментных пятен.

Как выбрать гранат

Думаем, многие из вас вдохновились полезными свойствами граната и готовы бежать за ним в магазин. Задержитесь ненадолго — мы расскажем вам, как выбрать хороший фрукт.

Гранат должен быть тяжёлым — тяжелее, чем выглядит. Увесистость плода говорит о его сочности. Кожура должна быть сухой, без пятен и вмятин. Хорошо, если через неё прощупываются зёрна.

Не стоит думать, что чем краснее гранат, тем он слаще. Цвет этого фрукта зависит от сорта, а не от степени зрелости. Лучше ориентироваться на хвостик (место, где был цветок) — там не должно быть ничего зелёного.

Как почистить гранат

Помните эту шутку?

— Будешь апельсин?
— Нет!
— А если почищу?
— Буду!

С гранатами так же. Многие не любят их только потому, что их трудно чистить. На самом деле, сложно, если не знаешь, как правильно это делать. Есть множество способов быстро почистить гранат. Один из них — в чашке с водой. Чистые руки и никаких брызг от ударов ложкой по плоду.

Гранат — вкусный и красивый фрукт. Из него готовят множество блюд (от салатов до десертов), а из гранатового сока делают различные соусы и напитки. И теперь вы знаете, что гранат — это ещё и полезно.

Фитотерапия против COVID-19. Ученые ищут спасения в растениях

https://ria.ru/20210106/fitoterapiya-1588055852.html

Фитотерапия против COVID-19. Ученые ищут спасения в растениях

Фитотерапия против COVID-19. Ученые ищут спасения в растениях — РИА Новости, 10.11.2021

Фитотерапия против COVID-19. Ученые ищут спасения в растениях

Сразу два исследования выявили противовирусный эффект экстракта кожуры граната. Клинические испытания проходят и другие растительные препараты. В Китае с самого РИА Новости, 10.11.2021

2021-01-06T08:00

2021-01-06T08:00

2021-11-10T21:22

наука

растения

здоровье

биология

коронавирус covid-19

химия

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e4/0c/07/1588031482_0:0:3067:1725_1920x0_80_0_0_d416e3917810fd44fdfb53f5e1b18512.jpg

МОСКВА, 6 янв — РИА Новости, Владислав Стрекопытов. Сразу два исследования выявили противовирусный эффект экстракта кожуры граната. Клинические испытания проходят и другие растительные препараты. В Китае с самого начала пандемии для лечения COVID-19 использовали традиционные средства на основе лекарственных трав. РИА Новости разбирается, помогут ли растения остановить эпидемию.Волшебная кожура гранатаПлоды граната рекомендуют при диабете второго типа, атеросклерозе, сердечно-сосудистых заболеваниях, воспалениях и раке, сок — при малокровии, а отвар кожуры и пленчатых перегородок, богатых дубильными веществами, — при ожогах и расстройстве желудка. Неудивительно, что ученые попробовали это растение и против разных инфекций. Опыты на культурах клеток показали, что экстракт кожуры граната достаточно эффективен. В частности, ученые из Ирана утверждают, что содержащиеся в нем фитобиотики из группы полифенолов — гидролизуемые танины, флавоноиды, антоцианы и другие — предотвращают проникновение в клетки вируса гриппа и блокируют транскрипцию его РНК.Исследователи из Баня-Лукского университета в Боснии и Герцеговине вместе с сербскими коллегами решили проверить, действуют ли полифенолы экстракта кожуры граната и против SARS-CoV-2. С помощью компьютерного моделирования ученые выяснили, что вещества из гранатовой кожуры взаимодействуют со всеми четырьмя белками, от которых зависит распространение патогена. Вирус проникает в клетку организма посредством S-белка — цепляется им за клеточный рецептор ACE2, а затем трансмембранная сериновая протеаза 2 (TMPRSS2) и фурин расщепляют его. Главную роль в этом, по мнению авторов работы, играют полифенолы — самая большая группа биологически активных соединений в растительном мире. Они защищают растения от бактерий, вирусов и грибов. Ранее уже продемонстрировали их потенциал против вирусов гриппа, Эпштейна-Барра, простого герпеса и инфекций дыхательных путей.Итальянские специалисты на культуре клеток установили, что соединения экстракта кожуры граната — пуникалагин и теафлавин — подавляют активность основной протеазы SARS-CoV-2 — 3CLpro, которая необходима вирусу для репликации и выживания в организме. На основе этих двух полифенолов и предлагают создать лекарство для лечения COVID-19.Лиственница, зеленый чай, черника и помидорыУченые давно изучают антиоксидантные свойства биофлавоноида дигидрокверцетина, содержащегося в экстракте лиственницы сибирской. Он препятствует разрушению клеточных мембран свободными радикалами, развитию воспаления и, по китайским данным, помогает против коронавируса.Медицинская школа Восточной Вирджинии включила дигидрокверцитин и его менее активную модификацию — кверцитин — в протокол лечения больных COVID-19. Это вещество прошло клинические испытания в Саудовской Аравии и рекомендовано местным министерством здравоохранения для профилактики и терапии коронавирусной инфекции.Кверцитин содержится в луке, красном винограде, меде, цитрусовых и многих других овощах и фруктах. Особенно им богаты зеленый чай и черника. Он способен повышать внутреклеточную концентрацию цинка — микрокомпонента, который подавляет репликацию РНК вируса, считают ученые.Для лечения COVID-19 предлагают нарингенин — полифенол, содержащийся в цитрусовых и помидорах. Итальянские исследователи из университетов Рима и Милана на культуре клеток показали, что нарингенин подавляет основную протеазу вируса 3CLpro и снижает активность рецепторов ACE2, а также ослабляет воспалительные реакции при инфекции. Как ингибиторы репликации SARS-CoV-2 проявили себя куркумин из корня куркумы, катехины, в больших количествах обнаруженные в зеленом и белом чае, черном шоколаде, многих фруктах и ягодах, кемпферол, содержащийся в плодах шиповника, тмине, укропе, лакрице, фасоли и чае.А ученые из Алжира предположили, что все флавонолы — одна из групп полифенолов — активны против SARS-CoV-2. Эти молекулы нацеливаются на основные вирусные белки — S-белок, 3CLpro и PLpro, РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) и клеточный рецептор ACE2. Проанализировав различные исследования, специалисты сделали вывод, что флавонолы астрагалин, кемпферол и кверцетин связывают два основных фермента вируса 3CLpro и PLpro даже сильнее, чем антивирусный лекарственный препарат ремдесивир, одобренный для экстренного лечения COVID‑19 в полусотне стран. А флавонолы физетин, кверцетин, изорамнетин и кемпферол ингибируют S-белок сильнее, чем гидроксихлорохин. Кверцетин и кемпферол также подавляют полимеразу RdRp, необходимую вирусу для репликации РНК. Лекарственные травыВ Китае фитотерапию применяли во время вспышек коронавирусов SARS и MERS, птичьего гриппа N7N9. Так, используя клеточный анализ, ученые проверили около 200 китайских травяных экстрактов на эффективность против возбудителя SARS — SARS-CoV — и описали действие различных травяных смесей в зависимости от стадии заболевания. Эти наработки пригодились сейчас. Китайская ассоциация международного обмена и продвижения медицины и здравоохранения (CPAM) включила часть этих природных препаратов в рекомендации по лечению и профилактике COVID-19. Чаще всего в этих смесях фигурируют астрагал монгольский, солодка, сапожниковия растопыренная (зонтичное растение, известное также как ледебуриелла), атрактилодес, жимолость японская и форзиция пониклая. Эти травы широко применяются в традиционной китайской медицине для лечения гриппа и других вирусных заболеваний.В Саудовской Аравии сейчас проходят совместные с Университетом Аризоны (США) клинические исследования эффективности против SARS-CoV-2 омега-3 жирных кислот с добавлением масла чернушки посевной, семян аниса, хинного дерева, солодки, костуса индийского. Полынь изучают в Мексике, натуральный мед — в Пакистане и Египте, прополис — в Бразилии.Специалисты Великобритании, Ирландии, Бразилии, Венесуэлы и Польши оценили 39 лекарственных средств на травах и обнаружили среди них пять, помогающих при COVID-19: алтей аптечный, мирра, лакрица, плющ обыкновенный и бузина черная. Предположили, что содержащиеся в этих растениях фенольные кислоты и флавоноиды блокируют рецепторы ACE2 и вирусные белки. Однако ученые отмечают, что эта фитотерапия не лечит и не предотвращает инфекцию, а лишь улучшает состояние пациентов.

https://ria.ru/20201204/melatonin-1587633499.html

https://ria.ru/20201201/koronavirus-1587118633.html

https://ria.ru/20201127/pitanie-1586606828.html

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2021

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og. xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e4/0c/07/1588031482_72:0:2801:2047_1920x0_80_0_0_fbaa9be8d1980352ff16b204072b5c9b.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

растения, здоровье, биология, коронавирус covid-19, химия

МОСКВА, 6 янв — РИА Новости, Владислав Стрекопытов. Сразу два исследования выявили противовирусный эффект экстракта кожуры граната. Клинические испытания проходят и другие растительные препараты. В Китае с самого начала пандемии для лечения COVID-19 использовали традиционные средства на основе лекарственных трав. РИА Новости разбирается, помогут ли растения остановить эпидемию.

Волшебная кожура граната

Плоды граната рекомендуют при диабете второго типа, атеросклерозе, сердечно-сосудистых заболеваниях, воспалениях и раке, сок — при малокровии, а отвар кожуры и пленчатых перегородок, богатых дубильными веществами, — при ожогах и расстройстве желудка. Неудивительно, что ученые попробовали это растение и против разных инфекций.

Опыты на культурах клеток показали, что экстракт кожуры граната достаточно эффективен. В частности, ученые из Ирана утверждают, что содержащиеся в нем фитобиотики из группы полифенолов — гидролизуемые танины, флавоноиды, антоцианы и другие — предотвращают проникновение в клетки вируса гриппа и блокируют транскрипцию его РНК.Исследователи из Баня-Лукского университета в Боснии и Герцеговине вместе с сербскими коллегами решили проверить, действуют ли полифенолы экстракта кожуры граната и против SARS-CoV-2. С помощью компьютерного моделирования ученые выяснили, что вещества из гранатовой кожуры взаимодействуют со всеми четырьмя белками, от которых зависит распространение патогена.

Вирус проникает в клетку организма посредством S-белка — цепляется им за клеточный рецептор ACE2, а затем трансмембранная сериновая протеаза 2 (TMPRSS2) и фурин расщепляют его.

Главную роль в этом, по мнению авторов работы, играют полифенолы — самая большая группа биологически активных соединений в растительном мире. Они защищают растения от бактерий, вирусов и грибов. Ранее уже продемонстрировали их потенциал против вирусов гриппа, Эпштейна-Барра, простого герпеса и инфекций дыхательных путей.Итальянские специалисты на культуре клеток установили, что соединения экстракта кожуры граната — пуникалагин и теафлавин — подавляют активность основной протеазы SARS-CoV-2 — 3CLpro, которая необходима вирусу для репликации и выживания в организме. На основе этих двух полифенолов и предлагают создать лекарство для лечения COVID-19. 4 декабря 2020, 11:27НаукаУченые назвали вещество, эффективное против COVID-19

Лиственница, зеленый чай, черника и помидоры

Ученые давно изучают антиоксидантные свойства биофлавоноида дигидрокверцетина, содержащегося в экстракте лиственницы сибирской. Он препятствует разрушению клеточных мембран свободными радикалами, развитию воспаления и, по китайским данным, помогает против коронавируса.Медицинская школа Восточной Вирджинии включила дигидрокверцитин и его менее активную модификацию — кверцитин — в протокол лечения больных COVID-19. Это вещество прошло клинические испытания в Саудовской Аравии и рекомендовано местным министерством здравоохранения для профилактики и терапии коронавирусной инфекции.

Кверцитин содержится в луке, красном винограде, меде, цитрусовых и многих других овощах и фруктах. Особенно им богаты зеленый чай и черника. Он способен повышать внутреклеточную концентрацию цинка — микрокомпонента, который подавляет репликацию РНК вируса, считают ученые.

Для лечения COVID-19 предлагают нарингенин — полифенол, содержащийся в цитрусовых и помидорах. Итальянские исследователи из университетов Рима и Милана на культуре клеток показали, что нарингенин подавляет основную протеазу вируса 3CLpro и снижает активность рецепторов ACE2, а также ослабляет воспалительные реакции при инфекции.Как ингибиторы репликации SARS-CoV-2 проявили себя куркумин из корня куркумы, катехины, в больших количествах обнаруженные в зеленом и белом чае, черном шоколаде, многих фруктах и ягодах, кемпферол, содержащийся в плодах шиповника, тмине, укропе, лакрице, фасоли и чае.А ученые из Алжира предположили, что все флавонолы — одна из групп полифенолов — активны против SARS-CoV-2. Эти молекулы нацеливаются на основные вирусные белки — S-белок, 3CLpro и PLpro, РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) и клеточный рецептор ACE2.

Проанализировав различные исследования, специалисты сделали вывод, что флавонолы астрагалин, кемпферол и кверцетин связывают два основных фермента вируса 3CLpro и PLpro даже сильнее, чем антивирусный лекарственный препарат ремдесивир, одобренный для экстренного лечения COVID‑19 в полусотне стран. А флавонолы физетин, кверцетин, изорамнетин и кемпферол ингибируют S-белок сильнее, чем гидроксихлорохин. Кверцетин и кемпферол также подавляют полимеразу RdRp, необходимую вирусу для репликации РНК.

1 декабря 2020, 12:00НаукаРаскрыт механизм проникновения коронавируса в мозг

Лекарственные травы

В Китае фитотерапию применяли во время вспышек коронавирусов SARS и MERS, птичьего гриппа N7N9. Так, используя клеточный анализ, ученые проверили около 200 китайских травяных экстрактов на эффективность против возбудителя SARS — SARS-CoV — и описали действие различных травяных смесей в зависимости от стадии заболевания. Эти наработки пригодились сейчас. Китайская ассоциация международного обмена и продвижения медицины и здравоохранения (CPAM) включила часть этих природных препаратов в рекомендации по лечению и профилактике COVID-19.

Чаще всего в этих смесях фигурируют астрагал монгольский, солодка, сапожниковия растопыренная (зонтичное растение, известное также как ледебуриелла), атрактилодес, жимолость японская и форзиция пониклая. Эти травы широко применяются в традиционной китайской медицине для лечения гриппа и других вирусных заболеваний.

В Саудовской Аравии сейчас проходят совместные с Университетом Аризоны (США) клинические исследования эффективности против SARS-CoV-2 омега-3 жирных кислот с добавлением масла чернушки посевной, семян аниса, хинного дерева, солодки, костуса индийского. Полынь изучают в Мексике, натуральный мед — в Пакистане и Египте, прополис — в Бразилии.Специалисты Великобритании, Ирландии, Бразилии, Венесуэлы и Польши оценили 39 лекарственных средств на травах и обнаружили среди них пять, помогающих при COVID-19: алтей аптечный, мирра, лакрица, плющ обыкновенный и бузина черная. Предположили, что содержащиеся в этих растениях фенольные кислоты и флавоноиды блокируют рецепторы ACE2 и вирусные белки. Однако ученые отмечают, что эта фитотерапия не лечит и не предотвращает инфекцию, а лишь улучшает состояние пациентов.27 ноября 2020, 13:40НаукаСоставлен список продуктов, ускоряющих выздоровление от COVID-19

Punicalagin Extract Punicalagin, Экстракт гранатовой шелухи (кожуры) Punicalagins Эллаговая кислота производителей и поставщиков — цена

Экстракт граната Пуникалагин, Экстракт гранатовой шелухи (цедры) Экстракт пуникалагина Эллаговая кислота

Китай Экстракт граната Punicalagin, Экстракт гранатовой оболочки (кожуры) Punicalagins Ellagic acid завод, Поставщик, Производитель в Китае.

Синонимы: экстракт кожуры граната

Номер CAS: 65995-63-3

Характеристики: коричневый мелкий порошок. Темно-фиолетовый мелкий порошок.

Чистота (анализ): экстракт граната пуникалагин 30%, 40%, 20% -98%

Формула структуры:

Пакет: 25 кг / волоконный барабан

Ключевые слова:

Экстракт граната Пуникалагин, Экстракт гранатовой шелухи (цедры) Экстракт пуникалагина Эллаговая кислота

Описание:

Гранат (Punica granatum L на латыни) принадлежит к семейству Punicaceae, которое включает в себя только 1 род и 2 вида. Это дерево родом из Ирана в Гималаях на севере Индии и выращивается с древних времен во всем средиземноморском регионе Азии, Африки и Европы.

Экстракт граната Punicalagin, Экстракт гранатовой шелухи (Pel) Экстракт Punicalagins Эллаговая кислота предлагает значительные преимущества для сердечно-сосудистой системы, предотвращая повреждение стенок артерий, поддерживая здоровый уровень кровяного давления, улучшая приток крови к сердцу и предотвращая или обращая вспять атеросклероз.

Экстракт граната Punicalagin, Экстракт гранатовой шелухи (Pel) Экстракт Punicalagins Эллаговая кислота может принести пользу людям с диабетом и тем, кто подвержен риску заболевания. Он помогает снизить уровень сахара в крови после еды и защищает сердечно-сосудистую систему от повреждения, вызванного диабетом.

Экстракт граната Punicalagin, Экстракт гранатовой оболочки (кожура) Punicalagins Эллаговая кислота также защищает здоровье кожи и печени.

Функции:

1. Экстракт граната Punicalagin, экстракт гранатовой корки (кожура) Punicalagins Эллаговая кислота может бороться со следующими перечисленными видами рака: рак прямой кишки и толстой кишки, рак пищевода, рак печени, рак легких, рак языка и кожи.

2. Экстракт граната Пуникалагин ограничивает распространение вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и многих видов микробов и вирусов.

3. Экстракт граната Punicalagin, экстракт гранатовой оболочки (кожура) Punicalagins Эллаговая кислота может быть антиоксидантом, коагулянтом, снижая кровяное давление и седативный эффект.

4. Этот продукт противостоит анти-оксигенации, замедлению старения и отбеливанию кожи.

5. Помогает лечить симптомы, вызванные повышенным уровнем сахара в крови, гипертонией.

6. Этот продукт противостоит атеросклерозу и опухоли.

Заявка:

1.Косметическое поле: экстракт граната Punicalagin, экстракт кожуры граната (Pel) Punicalagins Эллаговая кислота добавляется в различные продукты по уходу за кожей для ее противовоспалительного и антиоксидантного действия.

2. Товары для здоровья и фармацевтика: экстракт граната, пуникалягин, экстракт гранатовой оболочки (кожура), пуникалагин, эллаговая кислота, часто используемая в адъювантной терапии нефрита, гликуреза, болезней сердца, ожирения, гепатопатии и многого другого.

Активный ингредиент, экстрагированный из Punica granatum L., экстракт граната, пуникалягин, экстракт оболочки граната (кожура), пуникалягин, эллаговая кислота выполняет следующие функции:

Противораковое и антимутационное. Доказано, что он является эффективным антиканцерогеном при раке прямой кишки и ободочной кишки, раке пищевода, раке печени, раке легких, раке языка и кожи.

Экстракт граната 30%, 40%, 20% -98% ВЭЖХ Эллаговая кислота

В качестве функционального фактора, такого как антиоксидант, ингибирование вируса иммунодефицита человека, отбеливание кожи.

Являясь самым известным китайским поставщиком в Китае, Punicalagin экстракт граната Punicalagin, экстракт шелухи граната (кожура) Punicalagins порошок эллаговой кислоты хорошо упакован с новейшей и самой безопасной упаковкой.

Технологическая схема производства:

Отгрузка и доставка: Fengchen Group является одним из самых известных производителей граната Punicalagin, Pomegranate hull (Peel) Экстракт Punicalagins Ellagic acid Powder в Китае, наша доставка профессиональна и относительно быстра.

Использование и применение

1. Этот продукт способен повысить иммунитет человека.

2. Обладает противораковыми, антиоксидантными способностями.

3. Против морщин и замедление старения кожи.

4. Понизить артериальное давление.

5. Применяется в фармацевтике: экстракт граната, пуникалягин, экстракт гранатовой оболочки (кожура), пуникалягин. Эллаговая кислота обычно превращается в капсулу для предотвращения рака, снижения кровяного давления и сопротивления окислению.

6. Применяется в пищевой промышленности: экстракт граната пуникалягин, экстракт гранатовой шелухи (кожура), пуникалягин Эллаговая кислота обычно используется в качестве пищевых антиоксидантов.

7. Применяется в косметической области, в основном используется для отбеливания, рассеивания пятен, против морщин и замедления старения кожи.

Он уже находит применение в фармацевтических продуктах, продуктах здравоохранения, косметических продуктах и продуктах личной гигиены.

Fengchen Group является ведущим поставщиком и производителем порошка граната в Китае Punicalagin, экстракт гранатовой шелухи (кожура) Punicalagins Ellagic acid Powder. Мы специализируемся на оптовых и оптовых партиях, обеспечивая всем нашим клиентам право на изготовление и поставку порошка граната Punicalagin, кожуры шелухи (кожуры) Punicalagins, производителя и поставщика порошка эллаговой кислоты Punicalagin. Когда вы собираетесь купить или купить экстракт граната Punicalagin, экстракт гранатовой шелухи (Pel), экстракт Punicalagins Ellagic acid Powder из Китая, обращайтесь в Fengchen Group.

Сертификат анализа (COA, TDS) экстракта граната пуникалягина, экстракта гранатовой оболочки (кожуры) пуникалягина эллаговой кислоты:

Название продукта

Экстракт граната Пуникалагин 30%

Ботанический источник : Punica Granatum L.

Серия №

20190319

Используемые растворители

Вода и этанол

Тестируемый предмет

стандарт

Внешность

Коричневый мелкий порошок

Запах и вкус

Характеристика

Удостоверение личности

Должен соответствовать образцу RS

Вода (KF)

≤ 5,0%

Всего пепла

≤ 10,0%

Ситовый анализ

100% через 80 меш

Объемная плотность

40-60 г / 100 мл

Свинец (Pb)

≤ 3. 0ppm

Мышьяк (как)

≤ 2.0ppm

Кадмий (Cd)

≤ 1.0ppm

Меркурий (Hg)

≤ 0.1ppm

Тяжелый металл

≤ 10 промилле

Остаточные растворители

Исполните с EP7.0

Остаточные пестициды

Исполните с USP36

Не облученный

≤ 700

Общее количество пластин

≤ 1000 КОЕ / г

Дрожжи и плесень

≤ 100 КОЕ / г

E.Coli

отрицательный

сальмонелла

отрицательный

стафилококк

отрицательный

Assay (Пуникаглагин)

≥ 30,0% ВЭЖХ

Статус: не облучение; Non-GMO; Нет перевозчика.

Высочайшее качество, экстракт граната, пуникалягин, экстракт гранатовой шелухи (кожура), экстракт пуникалагина, эллаговая кислота.

Если вы ищете гранатовый экстракт пуникалагина, гранатовой шелухи (кожуры), экстракт пуникалагина эллаговой кислоты, добро пожаловать к нам. Мы являемся одним из ведущих и профессиональных китайских производителей и поставщиков в этой области. Конкурентоспособная цена и хорошее послепродажное обслуживание.

Hot Tags: гранатовый экстракт пуникалагина, гранатовая оболочка (кожура) экстракта пуникалагина эллаговой кислоты, производители, поставщики, цена

10 полезных свойств граната

06.11.2021

Считается, что при регулярном употреблении граната в пищу, можно снизить вероятность развития множества заболеваний.

Гранат – это кустарник или дерево высотой до 6 метров. Его плоды круглые, достаточно крупные и красные. Внутри граната зерна, разделенные белыми горьковатыми перепонками. В спелом гранате, готовом к употреблению, может содержаться более тысячи зерен. В природе встречается более десяти сортов данного плода, и все они полны витаминов и минералов.


10 полезных свойства граната

1. Кладезь питательных веществ

В гранате содержатся 15 аминокислот, но два из них являются самыми важными – это пуникалагины и пуниковая (или гранатовая) кислота. Пуникалагины – одни из мощнейших антиоксидантов, их эффективность в 3 раза превышает полезные свойства зеленого чая.

Гранат в изобилии содержит витамины К, С, В9 и В6, С и минералы (калий, медь, фосфор).
При этом этот полезный фрукт является низкокалорийным. В 100 гр не более 80 ккал.
Регулярное употребление граната в пищу обеспечивает организм жизненно важными витаминами группы В, а также макро- и микроэлементами, значительно поднимает иммунитет.



2. Поддерживает работу сердца

Только в гранате содержится антиоксидант, называемый – пуникалагин, попадая в организм который нейтрализует свободные радикалы и благотворно влияет на работу сердца.
Пуникалагин активно исследуется учеными медиками и уже доказано, что благодаря ему можно снизить «плохой» холестерин, укрепить стенки сосудов и снизить риск образования атеросклеротических бляшек не менее чем на 30%.



3. Препятствует развитию артроза

Артроз является дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов. Приводит к воспалению и болезненностью движений. В гранате большое содержание витамина К (филлохинона), который необходим для минерализации костной ткани и позволяет замедлить деформацию хрящевых тканей, приводящих к остеоартрозу.



4. Удаляет зубной налёт

Сок граната активно помогает удалить зубной налет и очистить полость рта от различных бактерий, так как обладает противомикробными и противовирусными свойствами.



5. Защищает от рака

Множество исследований доказало, что гранат подавляет распространение раковых клеток, способствуя их гибели, так как в плоде содержатся эллаготанины — вещества препятствующие синтезу эстрогена. Регулярное использование граната в пищу может значительно снизить риск развития рака молочных желез, легких, предстательной железы и других форм рака.



6. Улучшает работу пищеварительной системы

Гранат содержит пищевые волокна, столь необходимые для очистки кишечника.



7. Повышает уровень гемоглобина

Гемоглобин — это белок из красных кровяных телец, переносящий по организму железо. Гранат позволяет повысить уровень железа в крови. Гранатовый сок довольно часто назначают при анемии в небольших количествах.



8. Предотвращает выпадение волос

Железо — микроэлемент, дефицит которого часто приводит ко многим проблемам, в том числе и к выпадению волос. Если гемоглобин снижен, то клетки организма не дополучают кислород, из-за этого, в первую очередь, страдают волосы и ногти. Именно поэтому регулярное употребление граната помогает нормализовать гемоглобин, укрепить волосяные луковицы и придать волосам здоровый блеск.



9. Разрешен при сахарном диабете

В отличие от сладких соков и нектаров, которые не желательно использовать при сахарном диабете любого типа, гранатовый сок можно употреблять в небольших количествах. Он обладает мочегонным средством и способствует уменьшению отечности, столь распространенным признаком диабета.



10. Сохраняет молодость

Согласно исследованиям, гранат препятствует развитию болезни Альцгеймера (сенильная деменция). Как уже было сказано ранее, в гранате содержится антиоксидант — пуникалагин , который позволяет уменьшить воспалительные процессы, в том числе и в головном мозгу и замедлить старение.




Вред граната

Несмотря на всю пользу граната, у него есть и относительные противопоказания.

— Употребление неразбавленного гранатового сока грозит проблемами людям с гастритом, язвенными болезнями, так как концентрированный сок раздражает слизистую ЖКТ. По данной причине не рекомендуется давать его и маленьким детям. Зерна, в свою очередь, в небольшом количестве, вреда не наносят.

— После употребления сока необходимо всегда чистить зубы и полоскать ротовую полость, так как он может разъедать и окрашивать зубную эмаль.

— Гранат может крепить, поэтому советуем отказаться от его употребления людям, страдающим хроническими запорами.

— Не рекомендуем делать отвары из кожуры граната, так как помимо того, что в ней содержится множество антиоксидантов и витаминов группы B, C, PP, E, но также в состав входят и ядовитые алкалоиды, способные привести к сильнейшей интоксикации.



Будьте здоровы!

всё самое интересное о «короле фруктов»

Гранат – настоящий «король фруктов». И дело вовсе не в маленькой «короне» сверху, а в редком наборе микроэлементов, полезных для здоровья. Сезон гранатов по эту сторону Экватора длится полгода — с сентября по февраль, а это значит, что сейчас самое время добавлять гранаты в свой ежедневный рацион и получать от них максимум пользы!

Для иммунитета

Уникальный комплекс кислот, среди которых янтарная, борная, винная, фолиевая и щавелевая, укрепляет иммунитет и противостоит простудам. В одной порции граната содержится примерно 20% от суточной нормы витамина С, который не только помогает противостоять вирусам, но и ускоряет выздоровление, если вы все-таки приболели.

Для пищеварения

Дубильные вещества помогают в борьбе с расстройствами кишечника, фитонциды подавляют рост вредных бактерий, танин и пектины выводят из организма токсины. Кроме того, в гранатах содержится много пищевых волокон, которые способствуют очищению кишечника, а кисло-сладкий гранатовый сок стимулирует выработку ферментов, ускоряющих пищеварение.

Для крови

Благодаря высокому содержанию железа гранаты помогают в борьбе с железодефицитной анемией и повышают уровень гемоглобина. Свежевыжатый гранатовый сок улучшает состав крови и способствует её разжижению, что благоприятно сказывается на процессе кровообращения в целом и предотвращает некоторые болезни в частности (например, инсульт, инфаркт и стенокардию).

Для молодости

Гранат содержит редкие вещества: пуническую кислоту и пуникалагин. Это мощные антиоксиданты, которые эффективно защищают клетки от воздействия вредных факторов окружающей среды и весь организм от преждевременного старения. Гранатовый сок — это самый настоящий anti-age компонент вашего рациона. При его регулярном употреблении сокращается количество морщин и пигментных пятен, восстанавливается работа головного мозга, сокращается риск возникновения старческой деменции.

Для сердца и сосудов

Ежедневное употребление гранатового сока (порция 150 мл) снижает артериальное давление до показателей нормы, что благоприятно отражается на работе сердца и здоровье сосудов. Пуникалагин, про который мы уже упоминали, снижает уровень плохого холестерина, укрепляет стенки сосудов, предотвращает образование атеросклеротических бляшек и улучшает кровообращение в сердце.

Для суставов

Растительные соединения, обладающие противовоспалительным эффектом, уменьшают припухлости, снижают риск суставных воспалений, возникновения артрита и артроза. Витамин К в составе граната положительно влияет на обмен веществ в соединительных тканях и костях, предотвращая их деформацию.

Регулярное употребление гранатов и гранатового сока поможет вам избавиться от неприятных и болезненных ощущениях при различного рода движениях.

Для головы

Целебные свойства граната восстанавливают работу головного мозга и помогают предотвратить болезнь Альцгеймера. Гранаты улучшают память, причем как вербальную, так и зрительную. Положительное воздействие граната распространяется и на волосяные луковицы. Благодаря высокому содержанию железа они становятся сильнее, что предотвращает выпадение волос и преждевременное облысение.

%d0%bf%d1%83%d0%bd%d0%b8%d0%ba%d0%b0%d0%bb%d0%b0%d0%b3%d0%b8%d0%bd — со всех языков на все языки

Все языкиРусскийАнглийскийИспанский────────Айнский языкАканАлбанскийАлтайскийАрабскийАрагонскийАрмянскийАрумынскийАстурийскийАфрикаансБагобоБаскскийБашкирскийБелорусскийБолгарскийБурятскийВаллийскийВарайскийВенгерскийВепсскийВерхнелужицкийВьетнамскийГаитянскийГреческийГрузинскийГуараниГэльскийДатскийДолганскийДревнерусский языкИвритИдишИнгушскийИндонезийскийИнупиакИрландскийИсландскийИтальянскийЙорубаКазахскийКарачаевскийКаталанскийКвеньяКечуаКиргизскийКитайскийКлингонскийКомиКомиКорейскийКриКрымскотатарскийКумыкскийКурдскийКхмерскийЛатинскийЛатышскийЛингалаЛитовскийЛюксембургскийМайяМакедонскийМалайскийМаньчжурскийМаориМарийскийМикенскийМокшанскийМонгольскийНауатльНемецкийНидерландскийНогайскийНорвежскийОрокскийОсетинскийОсманскийПалиПапьяментоПенджабскийПерсидскийПольскийПортугальскийРумынский, МолдавскийСанскритСеверносаамскийСербскийСефардскийСилезскийСловацкийСловенскийСуахилиТагальскийТаджикскийТайскийТатарскийТвиТибетскийТофаларскийТувинскийТурецкийТуркменскийУдмуртскийУзбекскийУйгурскийУкраинскийУрдуУрумскийФарерскийФинскийФранцузскийХиндиХорватскийЦерковнославянский (Старославянский)ЧеркесскийЧерокиЧеченскийЧешскийЧувашскийШайенскогоШведскийШорскийШумерскийЭвенкийскийЭльзасскийЭрзянскийЭсперантоЭстонскийЮпийскийЯкутскийЯпонский

 

Все языкиРусскийАнглийскийИспанский────────АймараАйнский языкАлбанскийАлтайскийАрабскийАрмянскийАфрикаансБаскскийБашкирскийБелорусскийБолгарскийВенгерскийВепсскийВодскийВьетнамскийГаитянскийГалисийскийГреческийГрузинскийДатскийДревнерусский языкИвритИдишИжорскийИнгушскийИндонезийскийИрландскийИсландскийИтальянскийЙорубаКазахскийКарачаевскийКаталанскийКвеньяКечуаКитайскийКлингонскийКорейскийКрымскотатарскийКумыкскийКурдскийКхмерскийЛатинскийЛатышскийЛингалаЛитовскийЛожбанМайяМакедонскийМалайскийМальтийскийМаориМарийскийМокшанскийМонгольскийНемецкийНидерландскийНорвежскийОсетинскийПалиПапьяментоПенджабскийПерсидскийПольскийПортугальскийПуштуРумынский, МолдавскийСербскийСловацкийСловенскийСуахилиТагальскийТаджикскийТайскийТамильскийТатарскийТурецкийТуркменскийУдмуртскийУзбекскийУйгурскийУкраинскийУрдуУрумскийФарерскийФинскийФранцузскийХиндиХорватскийЦерковнославянский (Старославянский)ЧаморроЧерокиЧеченскийЧешскийЧувашскийШведскийШорскийЭвенкийскийЭльзасскийЭрзянскийЭсперантоЭстонскийЯкутскийЯпонский

Пуникалагин — обзор | ScienceDirect Topics

2.

2 Антиоксидантные свойства PJ

Натуральные антиоксиданты фруктов и овощей в рационе необходимы человеку для поддержания баланса между оксидантами и антиоксидантами в организме. Трудно определить их активность по отдельности. Вместо этого были разработаны методы антиоксидантной способности для измерения общего антиоксидантного статуса образцов. Методы антиоксидантной способности широко используются в научных исследованиях для сравнения и ранжирования анализируемых образцов.

Опубликованы многочисленные исследования, в которых сообщается об антиоксидантных свойствах PJ, полученных либо из арилов, либо отжатых из цельных фруктов в лаборатории или в промышленных масштабах. Метод, используемый в производстве сока, имеет решающее значение с точки зрения антиоксидантной способности, поскольку сообщалось о значительных различиях между арильным и цельным фруктовым соком. Хотя результаты, полученные на образцах арилового сока, могут отражать потребление антиоксидантов при употреблении свежих фруктов и домашнего сока, производство сока из цельных фруктов более целесообразно в промышленных масштабах вместе с дополнительной обработкой ферментами для осветления сока и удаления терпкость в результате чрезмерного количества полифенолов.

ПЖ в основном характеризуются высоким содержанием фенольных соединений, особенно гидролизуемых дубильных веществ (эллагитаннины и галлотаннины) и флавоноидов (антоцианов). Общее содержание фенолов в гранатовом соке составляет 2117 мг p -эквивалентов кумаровой кислоты 1 -1 . По сравнению с продуктами с высоким содержанием фенолов, такими как красное вино (2036) и зеленый чай (1029), это значение доказывает исключительный статус PJ (Gil et al., 2000). Общее содержание фенолов в ариловом соке, полученном из различных сортов граната, варьировалось от 2083 до 3436 мг катехинового эквивалента 1 900 11 – 1 900 12 (Çam et al., 2009) и 990–2260 мг эквивалентов пирогаллола l -1 (Борохов-Неори и др., 2009).

PJ особенно богат пуникалагином и эллаговой кислотой. Сообщается также, что пуникалин и галлаговая кислота являются основными гидролизуемыми танинами цельной пижамы. Известно, что все эти гидролизуемые танины ответственны за 92% антиоксидантной способности цельного варенья (Seeram et al. , 2005; Tzulker et al., 2007). На рис. 32.2 показаны пуникалагин и родственные пуникалагину компоненты граната.Утверждается, что пуникалагин обладает исключительной антиоксидантной активностью, которая, вероятно, обусловлена ​​его 16-й гидроксильной группой, присоединенной к молекуле (Gil et al., 2000).

Рисунок 32.2. Структура полифенолов и родственных пуникалагину компонентов: (а) пуникалагин, (б) пуникалин, (в) галловая кислота, (г) эллаговая кислота и (д) галловая кислота.

Антоцианы являются основными соединениями, придающими специфический цвет пижаме. Основными антоцианами ПС являются 3-глюкозиды и 3,5-диглюкозиды дельфинидина, цианидина и пеларгонидина.Сообщается, что общее содержание антоцианов варьируется от 81 до 369 мг эквивалентов цианидин-3-глюкозида 1 -1 . Эти большие различия между различными сортами граната приводят к значительным различиям в цвете фруктов и соков (Чам и др., 2009).

Благодаря предполагаемой положительной корреляции между потреблением антиоксидантов и профилактикой некоторых патологических процессов стали популярными измерения антиоксидантной способности фруктов, овощей и других растений. Свободные радикалы обладают большим потенциалом для запуска и прогрессирования ряда патологических состояний в организме человека.Фрукты и овощи в рационе содержат широкий спектр фитохимических веществ, обладающих антиоксидантным потенциалом, которые помогают системе антиоксидантной защиты организма бороться со свободными радикалами.

Тесты In vitro широко используются для оценки антиоксидантной способности растительных образцов, в том числе PJ, из-за их простоты и короткого времени работы. В литературе использовалось несколько различных методологий для определения антиоксидантной способности PJ. Согласно анализам 2,2′-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS), 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) и способности восстанавливать железо в плазме (FRAP), коммерческие PJ полученный из цельных плодов, обладал лучшей антиоксидантной активностью, чем сок, полученный из плодоножек.Как цельные плоды, так и соки граната обладали более высоким антиоксидантным потенциалом, чем настой зеленого чая и красное вино (Gil et al. , 2000).

Антиоксидантная способность соков принадлежит разным сортам граната из разных мест, о которых сообщалось в литературе. Значения EC 50 (количество образца, необходимое для снижения исходной концентрации DPPH на 50%) восьми PJ, культивируемых в Турции, находились в диапазоне 29–72 мл PJ g −1  DPPH (Çam et al., 2009). .В том же исследовании были также определены способность поглощать радикалы ABTS и антилипидная пероксидативная активность PJ, и было обнаружено, что эти значения хорошо коррелируют с общим содержанием фенолов в образцах. Одиннадцать различных сортов граната из Израиля сравнивали по их антиоксидантной активности, помимо других параметров качества (Борохов-Неори и др., 2009). Согласно результатам, полученным с помощью FRAP-анализа, ПС разных сортов проявляли антиоксидантную активность в диапазоне 1.25–3,16 г эквивалентов витамина С l −1 . Также сообщалось о высокой корреляции ( R 2 = 0,98) между антиоксидантной активностью и общим содержанием фенолов.

Помимо оценки антиоксидантного действия in vitro , важно раскрыть защитную роль ФЖ на биомолекулы живых организмов. Основная причина, побуждающая исследователей к исследованиям in vivo , заключается в различиях между поведением биологически активных соединений в живых организмах и в пробирке.Исследования как на людях, так и на животных ясно показали, что потребление PJ улучшает антиоксидантный статус и предотвращает окисление биомолекул на определенных уровнях. Наиболее важными биомолекулами, которые подвергаются в организме атакам свободных радикалов, являются липиды, белки и ДНК.

Мышам давали либо воду, либо PJ в качестве напитка в течение 4 недель и умерщвляли. Ткани их печени использовались для измерения молекул-индикаторов окислительного повреждения липидов, белков и ДНК для исследования антиоксидантного потенциала PJ.Затем было отмечено, что PJ значительно снижает окисление белков и ДНК (Faria et al., 2007).

В исследовании на людях группе людей давали указание ежедневно потреблять 250 мл яблочного сока или пищевого сока (Guo et al. , 2008). Через 4 недели были протестированы несколько параметров крови и мочи, и было обнаружено, что, хотя статистически значимого изменения антиоксидантной способности сыворотки при приеме яблочного сока не наблюдалось, потребление PJ явно увеличивало антиоксидантную способность сыворотки.Более того, у лиц, употреблявших ПИ, в крови было меньше карбонилов и индикаторов окисленной ДНК, чем у контрольной группы.

В другом исследовании на людях пациенты с инсулиннезависимым сахарным диабетом принимали 50 мл PJ ежедневно в течение 3 месяцев. Уровень перекисей липидов и тиобарбитуровой кислоты-реактивных веществ в крови испытуемых снизился на 56% и 28% по сравнению с исходными значениями. С другой стороны, сообщалось, что потребление PJ снижает уровень клеточных перекисей (на 71%) и повышает уровень глутатиона (на 141%) в макрофагах пациентов, происходящих из моноцитов.В том же исследовании показано, что при употреблении ПИ уровень сульфгидрильных групп сыворотки и активность параоксоназы 1 (PON1) повышались на 12% и 24% соответственно. Таким образом, из всей картины авторы делают вывод, что потребление ПС больными сахарным диабетом значительно снижает сывороточный окислительный стресс (Rosenblat et al., 2006).

Пуникалагин, активный компонент граната, ослабляет сердечные митохондриальные нарушения у крыс с ожирением посредством активации AMPK

  • Barness, L.А., Опиц, Дж. М. и Гилберт-Барнесс, Э. Ожирение: генетические, молекулярные и экологические аспекты. Am J Med Genet A 143A, 3016–3034, 10.1002/ajmg.a.32035 (2007).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Harmancey, R., Wilson, C.R. & Taegtmeyer, H. Адаптация и дезадаптация сердца при ожирении. Гипертония 52, 181–187, 10.1161/HYPERTENSIONAHA.108.110031 (2008).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лоу, М.С. и др. Зависимое от пола влияние диеты с высоким содержанием жира на сердечную функцию у мышей C57Bl/6J. Appl Physiol Nutr Metab 37, 214–224, 10.1139/h21-153 (2012).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Schram, K. & Sweeney, G. Последствия ремоделирования матрикса миокарда адипокинами при сердечной недостаточности, связанной с ожирением. Trends Cardiovasc Med 18, 199–205, 10.1016/j.tcm.2008.10.001 (2008).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Ламунье-Цептер, В.и другие. Белок, связывающий жирные кислоты адипоцитов, подавляет сокращение кардиомиоцитов: новая связь между ожирением и сердечными заболеваниями. Циркуляр Рез. 105, 326–334, 10.1161/CIRCRESAHA.109.200501 (2009).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Martinez-Martinez, E. et al. Лептин вызывает сердечный фиброз через галектин-3, mTOR и окислительный стресс: потенциальная роль в ожирении. Дж. Гипертенс 32, 1104–1114; обсуждение 1114, 10. 1097/HJH.0000000000000149 (2014).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Ндисанг, Дж. Ф., Ванначчи, А. и Растоги, С. Окислительный стресс и воспаление при ожирении, диабете, гипертонии и связанных с ними кардиометаболических осложнениях. Oxid Med Cell Longev 2014, 506948, 10.1155/2014/506948 (2014).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ниманн, Б.и другие. Ожирение вызывает признаки преждевременного старения сердца у молодых пациентов: роль митохондрий. J Am Coll Cardiol 57, 577–585, 10.1016/j.jacc.2010.09.040 (2011).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Muthulakshmi, S. & Saravanan, R. Защитные эффекты азелаиновой кислоты против окислительного стресса, вызванного диетой с высоким содержанием жиров, в печени, почках и сердце мышей C57BL/6J. Mol Cell Biochem 377, 23–33, 10. 1007/s11010-013-1566-1 (2013).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Флакон, Г. и др. Влияние диеты с высоким содержанием жиров на энергетический обмен и выработку АФК в печени крыс. J Hepatol 54, 348–356, 10.1016/j.jhep.2010.06.044 (2011).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Zong, H. et al. Киназа AMP необходима для митохондриального биогенеза в скелетных мышцах в ответ на хроническую депривацию энергии.Proc Natl Acad Sci USA 99, 15983–15987, 10.1073/pnas.252625599 (2002).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед Google ученый

  • Bergeron, R. et al. Хроническая активация киназы AMP приводит к активации NRF-1 и митохондриальному биогенезу. Am J Physiol Endocrinol Metab 281, E1340–1346 (2001).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Линдхольм, К. Р. и др. Диета с высоким содержанием жиров снижает активность AMPK во многих тканях при отсутствии гипергликемии или системного воспаления у крыс. J Physiol Biochem 69, 165–175, 10.1007/s13105-012-0199-2 (2013).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Шао, Д. и др. Редокс-зависимый механизм регуляции активации AMPK тиоредоксином 1 во время энергетического голодания. Cell Metab 19, 232–245, 10.1016/j.cmet.2013.12.013 (2014).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Turdi, S. et al. Дефицит АМФ-активируемой протеинкиназы усугубляет гипертрофию сердца и сократительную дисфункцию, вызванную диетой с высоким содержанием жиров. J Mol Cell Cardiol 50, 712–722, 10.1016/j.yjmcc.2010.12.007 (2011).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Онкен, Б. и Дрисколл, М.Метформин вызывает состояние, подобное диетическим ограничениям, и реакцию на окислительный стресс, увеличивая продолжительность жизни C. elegans через AMPK, LKB1 и SKN-1. PloS One 5, e8758, 10.1371/journal.pone.0008758 (2010).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Liu, X.M. et al. Активация AMPK стимулирует экспрессию гена гемоксигеназы-1 и выживаемость эндотелиальных клеток человека. Am J Physiol Heart Circ Physiol 300, H84–93, 10.1152/ajpheart.00749.2010 (2011).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Мо, К. и др. Перекрестные помехи между сигнальными путями Nrf2 и AMPK важны для противовоспалительного эффекта берберина у стимулированных LPS макрофагов и мышей, подвергшихся шоку от эндотоксина. Antioxid Redox Signal 20, 574–588, 10.1089/ars.2012.5116 (2014).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Цао, К.и другие. Активация AMPK предотвращает когнитивные нарушения, вызванные пренатальным стрессом: модуляция митохондриального содержимого и окислительный стресс. Free Radic Biol Med 75C, 156–166, S0891-5849(14)00346-3 (2014).

    Артикул КАС Google ученый

  • Гил М.И., Томас-Барберан Ф.А., Гесс-Пирс Б., Холкрофт Д.М. и Кадер А.А. Антиоксидантная активность гранатового сока и ее связь с фенольным составом и обработкой.J Agric Food Chem 48, 4581–4589, jf000404a (2000).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Авирам, М. и др. Флавоноиды гранатового сока ингибируют окисление липопротеинов низкой плотности и сердечно-сосудистые заболевания: исследования на мышах с атеросклерозом и на людях. Drugs Exp Clin Res 28, 49–62 (2002).

    КАС пабмед Google ученый

  • Эсмаилзаде А., Тахбаз Ф., Гайени И., Алави-Маджд Х. и Азадбахт Л. Концентрированный гранатовый сок улучшает липидный профиль у больных диабетом с гиперлипидемией. J Med Food 7, 305–308, 10.1089/1096620041938623 (2004).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Huang, T.H. et al. Цветок граната улучшает метаболизм липидов в сердце на модели крыс с диабетом: роль снижения циркулирующих липидов. Br J Pharmacol 145, 767–774, 0706245 (2005).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Huang, T.H. et al. Экстракт цветков граната уменьшает сердечный фиброз у диабетических жирных крыс Zucker: модуляция путей сердечного эндотелина-1 и ядерного фактора-kappaB. J Cardiovasc Pharmacol 46, 856–862, 00005344-200512000-00021 (2005).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Сингх, М.и другие. Влияние растворителей на экстракцию основных фенольных соединений (пуникалагин, эллаговая и галловая кислоты) и их антиоксидантную активность в ариле граната. J Food Sci Technol 51, 2070–2077, 10.1007/s13197-014-1267-0 (2014).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Lin, C.C., Hsu, Y.F. & Lin, T.C. Влияние пуникалагина и пуникалина на индуцированное каррагинаном воспаление у крыс.Am J Chin Med 27, 371–376, 10.1142/S01×9

    22 (1999).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Аояги, Т. и др. Сердечный mTOR устраняет пагубные последствия вызванного диетой ожирения в сердце после ишемии-реперфузии. Am J Physiol Heart Circ Physiol 308, h2530–1539, 10.1152/ajpheart.00008.2015 (2015).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ядав Х.Н., Сингх, М. и Шарма, П.Л. Участие GSK-3beta в ослаблении кардиозащитного эффекта ишемического прекондиционирования в сердце крыс с диабетом. Mol Cell Biochem 343, 75–81, 10.1007/s11010-010-0500-z (2010).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Jager, S. , Handschin, C., St-Pierre, J. & Spiegelman, B.M. Действие AMP-активируемой протеинкиназы (AMPK) в скелетных мышцах посредством прямого фосфорилирования PGC-1alpha.Proc Natl Acad Sci USA 104, 12017–12022, 10.1073/pnas.0705070104 (2007).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед Google ученый

  • Вентурини, Д. и др. Оценка окислительного стресса у лиц с избыточным весом с метаболическим синдромом или без него. Ожирение (Серебряная весна) 20, 2361–2366, 10.1038/oby.2012.130 (2012).

    Артикул КАС Google ученый

  • Эккель, Р.Х., Барух, В. В. и Эршоу, А. Г. Отчет Национального института сердца, легких и крови и Рабочей группы Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек по патофизиологии сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ожирением. Тираж 105, 2923–2928 (2002).

    Артикул пабмед Google ученый

  • Wang, Z. , Li, L., Zhao, H., Peng, S. & Zuo, Z. Хроническая диета с высоким содержанием жиров вызывает гипертрофию сердца и фиброз у мышей.Метаболизм 64, 917–925, 10.1016/j.metabolic.2015.04.010 (2015).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Kuwabara, Y. et al. МикроРНК-451 усугубляет липотоксичность в сердечных миоцитах и ​​гипертрофию сердца, вызванную диетой с высоким содержанием жиров, у мышей за счет подавления пути LKB1/AMPK. Циркуляр Рез. 116, 279–288, 10.1161/CIRCRESAHA.116.304707 (2015).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Юань Ф.и другие. Умеренное введение этанола усиливает сократительную дисфункцию кардиомиоцитов и повреждение митохондрий при ожирении, вызванном диетой с высоким содержанием жиров. Toxicol Lett 233, 267–277, 10.1016/j.toxlet.2014.12.018 (2015).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Xia, Y. et al. Ингибирование пролилгидроксилазы 3 улучшает сердечную дисфункцию при диабетической кардиомиопатии. Mol Cell Endocrinol 403, 21–29, 10.1016/j.mce.2015.01.014 (2015).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Ндухирабанди Ф., Хуисамен Б., Стрейдом Х., Блэкхерст Д. и Лохнер А. Кратковременное потребление мелатонина защищает сердце крыс с ожирением независимо от изменения массы тела и висцерального ожирения. J Pineal Res 57, 317–332, 10.1111/jpi.12171 (2014).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Черда, Б., Церон, Дж. Дж., Томас-Барберан, Ф. А. и Эспин, Дж. К. Повторное пероральное введение высоких доз гранатового эллагитаннина пуникалагина крысам в течение 37 дней не токсично. J Agric Food Chem 51, 3493–3501, 10.1021/jf020842c (2003).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Цзоу, X. и др. Митохондриальная дисфункция при неалкогольной жировой болезни печени, связанной с ожирением: защитные эффекты граната с его активным компонентом пуникалагином.Антиоксидно-редокс-сигнал, 10.1089/ars.2013.5538 (2014).

  • Харди, Д. Г. Роль АМФ-активируемой протеинкиназы в метаболическом синдроме и сердечных заболеваниях. FEBS Lett 582, 81–89, 10.1016/j.febslet.2007.11.018 (2008).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Чжан, Б. Б., Чжоу, Г. и Ли, К. AMPK: новая мишень для лечения диабета и метаболического синдрома. Cell Metab 9, 407–416, 10.1016/j.cmet.2009.03.012 (2009).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Turdi, S. et al. Дефицит АМФ-активируемой протеинкиназы усугубляет вызванную старением сократительную дисфункцию миокарда. Камера старения 9, 592–606, 10.1111/j.1474-9726.2010.00586.x (2010).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кукидоме, Д. и другие. Активация АМФ-активируемой протеинкиназы снижает индуцированную гипергликемией продукцию митохондриальными активными формами кислорода и способствует митохондриальному биогенезу в эндотелиальных клетках пупочной вены человека. Диабет 55, 120–127 (2006).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Тедеско, Л. и др. Блокада каннабиноидных рецепторов 1 типа способствует митохондриальному биогенезу посредством экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота в белых адипоцитах.Диабет 57, 2028–2036 гг., 10.2337/db07-1623 (2008 г.).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Себастьян Д. и др. Митофузин 2 (Mfn2) связывает функцию митохондрий и эндоплазматического ретикулума с передачей сигналов инсулина и необходим для нормального гомеостаза глюкозы. Proc Natl Acad Sci USA 109, 5523–5528, 10.1073/pnas.1108220109 (2012).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед Google ученый

  • Джеймс, Д. И. и Мартину, Дж. К. Митохондриальная динамика и апоптоз: болезненное разделение. Dev Cell 15, 341–343, 10.1016/j.devcel.2008.08.011 (2008).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Sugioka, R., Shimizu, S. & Tsujimoto, Y. Fzo1, белок, участвующий в слиянии митохондрий, ингибирует апоптоз. J Biol Chem 279, 52726–52734, 10.1074/jbc.M4080 (2004).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Чавин, К.Д. и др. Ожирение индуцирует экспрессию разобщающего белка-2 в гепатоцитах и ​​способствует истощению запасов АТФ в печени. J Biol Chem 274, 5692–5700 (1999).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Кодама Х. и др. Ингибирующий лейкемию фактор, мощный гипертрофический цитокин сердца, активирует путь JAK/STAT в кардиомиоцитах крыс. Circ Res 81, 656–663 (1997).

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Границы | Метаболиты пуникалагина Эллаговая кислота и уролитин А оказывают различное укрепляющее и противовоспалительное действие на барьерную функцию кишечника, опосредованную плотными соединениями.

    Пуникалагин содержится в гранате ( Punica granatum ), малине ( Rubus idaeus ), клубнике ( Fragaria sp. ) или грецких орехах ( Juglans regia ). В частности, гранат уже тысячи лет применяется в традиционной медицине (Longtin, 2003) из-за его антидиарейного (Das et al., 1999; Zhao et al., 2018), антиоксидантного, против ожирения, антиканцерогенные и противовоспалительные свойства (рассмотрено в Saeed et al., (2018).Эллагитаннины не всасываются напрямую в кровоток (Seeram et al., 2004), а подвергаются гидролизу. В желудке и кишечнике гидролиз пуникалагина приводит к образованию эллаговой кислоты (ЭА), которая, в свою очередь, метаболизируется микробиотой кишечника до уролитина А и В (Cerdá et al., 2005; Espín et al., 2007). Несколько исследований показали, что эти метаболиты оказывают противовоспалительное действие на кишечник. В мышиной модели язвенного колита эллаговая кислота эффективно уменьшала воспаление кишечника за счет ингибирования циклооксигеназы-2 и индуцибельной синтазы оксида азота. Он препятствовал провоспалительной передаче сигналов через ядерный фактор «каппа-легкая цепь-энхансер» активированных В-клеток (NFκB) и преобразователи сигналов и активатор транскрипции 3 (STAT3) (Marín et al., 2013). Недавнее исследование клеточных культур показало, что эллаговая кислота ингибирует провоспалительные эффекты фактора некроза опухоли α (TNFα). Это включало потерю барьерной функции эпителия, усиление секреции интерлейкинов-6 и -8 и индукцию окислительного стресса путем препятствования индуцированной TNFα передаче сигналов через NF-κB, внеклеточные регулируемые сигналами киназы 1/2 (ERK1/2) и легкие цепи миозина. киназа (MLCK) (Iglesias et al., 2020). Уролитин А (UroA) может быть обнаружен в относительно больших количествах в толстой кишке. О его противовоспалительной активности сообщалось на модели колита у крыс (Larrosa et al., 2010) и на модели фибробластов толстой кишки (Giménez-Bastida et al., 2012).

    Воспаление кишечника вызывает дисфункцию кишечного барьера [(рассмотрено в Hering et al. , (2012)). Целостность кишечного барьера играет центральную роль для здоровья кишечника, предотвращая проникновение антигенов, аллергенов, бактериальных токсинов или других вредных агентов из просвета кишечника в слизистую оболочку и кровообращение.Эпителий кишечника состоит из одного ряда эпителиальных клеток, которые соединены плотными соединениями (TJs) в их самой апикальной точке. В зависимости от физиологического состояния эпителиальные ЩЖ регулируют парацеллюлярный пассивный пассаж воды и питательных веществ. Это достигается за счет специфического взаимодействия различных белков TJ, включая большое семейство клаудинов, TJ-ассоциированные белки MARVEL (Mineta et al., 2011), такие как трицеллулин, и соединительные молекулы адгезии (Raleigh et al., 2010). Эти трансмембранные белки связаны с внутриклеточными каркасными белками (например, белками zonula occludens, ZO-1-3) и образуют сеть из многочисленных горизонтально ориентированных нитей, окружающих эпителиальные клетки. Изменения в этом определенном составе могут привести к изменению барьерной функции. Провоспалительные цитокины, такие как, например, хорошо известно, что фактор некроза опухоли α (TNFα) вызывает дисфункцию барьера, индуцируя апоптоз эпителия и влияя на архитектуру TJ, включая экспрессию белка claudin и делокализацию (Hering and Schulzke, 2009).

    До сих пор мало что известно о влиянии пуникалагина, эллаговой кислоты или уролитина А на барьерную функцию кишечника. Цель настоящего исследования заключалась в выяснении их предполагаемых защитных и барьероукрепляющих свойств в отношении целостности эпителиального ЩЖ как такового или в состоянии воспаления. Поскольку их биодоступность различается в желудочно-кишечном тракте (Espín et al., 2013), мы предположили, что эти биологически активные соединения могут действовать на барьерную функцию в подвздошной или толстой кишке. Поэтому мы исследовали две разные линии клеток кишечника, клетки подвздошной кишки Caco-2 и клетки толстой кишки HT-29/B6.

    Материалы и методы

    Культура клеток и информация о дозировке

    Клетки Caco-2 представляют собой эпителиальные клетки, полученные из колоректальной аденокарциномы (ATCC® HTB-37™). Однако в определенных условиях культивирования клетки Caco-2 дифференцируются и поляризуются таким образом, что они функционально и морфологически напоминают фенотип энтероцитов дистального отдела подвздошной кишки. Они характеризуются поглотительной способностью и активными путями транспорта, обладают ферментативной активностью и апикальной щеточной каймой.При культивировании на подложках для фильтров клетки Caco-2 растут в виде поляризованных монослоев с эпителиальными TJs (Hidalgo et al., 1989).

    В настоящем исследовании клетки Caco-2 культивировали с использованием минимальной основной среды Eagle AqmediaTM, содержащей 15 % бычьей сыворотки и 1 % пенициллина/стрептомицина (все Sigma-Aldrich, Шнельдорф, Германия). В течение двух недель после посева на проницаемые фильтры Millicell PCF (эффективная площадь 0,6 см 2 ; поры 0,4 мкм, Millicell PCF, Millipore, Швальбах, Германия) они вырастали до слияния, а трансэпителиальное сопротивление (TER) обычно составляло от 280 до 450 Ом⋅см 2 . Пятнадцатидневные монослои подвергали заражению различными дозами пуникалагина (10, 25, 50, 150 и 250 мкМ; Sigma-Aldrich), гидрата эллаговой кислоты (50, 100, 150, 200 и 300 мкМ; Sigma-Aldrich) или уролитина А ( 25, 50, 100, 150 и 250 мкМ; Sigma-Aldrich). Вещества растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Чтобы избежать осмотических эффектов, монослои обычно подвергали воздействию с апикальной и базолатеральной стороны. Контрольные монослои обрабатывали равными количествами ДМСО. Три аспекта считаются оптимальными дозами.1) эффект TER, 2) воспроизводимость (демонстрируется SEM) и 3) количество диметилсульфоксида (ДМСО). Из-за токсичности ДМСО концентрации выше 1% ДМСО не рассматривались как оптимальные дозы.

    Ингибитор киназы легкой цепи миозина PIK (150 мкМ) предварительно инкубировали на монослоях Caco-2 за 2 часа до заражения EA. События фосфорилирования изучали в бессывороточных условиях.

    Клеточная линия карциномы толстой кишки HT-29/B6 является субклоном клеточной линии карциномы толстой кишки человека HT-29 (Kreusel et al. , 1991) и культивировали на проницаемых подложках для фильтров (эффективная площадь 0,6 см 2 ; поры 3,0 мкм, Millicell PCF, Millipore) с использованием среды RPMI (Sigma-Aldrich), содержащей 10% бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Монослои сливались в течение одной недели, давая TER не менее 350 Ом⋅см 2 , и были предварительно инкубированы с 10 мкМ пуникалагина, 150 мкМ эллаговой кислоты и 150 мкМ или 250 мкМ уролитина А с обеих сторон. Через два часа в базальное отделение добавляли 500 ЕД/мл TNFα (Pepro Tech, Гамбург, Германия).

    Изменения целостности барьера оценивали путем измерения трансэпителиального сопротивления (TER) с помощью пары электродов-палочек для еды при 37 C, как описано ранее (Heller et al., 2005).

    Измерения проницаемости

    Для измерения проницаемости монослои помещали в камеры Уссинга. Стандартное решение для купания содержится: 140 мм Na + , 123,8 мм CL , 5,4 мм K + , 1,2 мм Ca 2+ , 1,2 мм мг 2+ , 2,4 мм HPO 4 2- , 0. 6 мМ H 2 PO 4 , 21 мМ HCO 3 и 10 мМ D (+) -глюкозы. Измерения потока проводились в условиях фиксации напряжения с использованием 0,1 мМ флуоресцеина (332 Да, Sigma-Aldrich, Шнельдорф, Германия), который добавляли к апикальной стороне монослоя. Образцы брали с базолатеральной стороны в определенные моменты времени. Флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре (Infinite M200, Tecan, Меннедорф, Австрия) при 525 нм. Проницаемость флуоресцеина p (см⋅с -1 ) рассчитывали из отношения потока J (моль⋅ч -1 ⋅см -2 ) к концентрации Δc (моль/л): p = Дж/Δс.

    Для измерения проницаемости Na + и Cl контролировали напряжение и TER при снижении концентрации NaCl в одной полукамере. Это было сделано путем перехода на раствор, содержащий пониженную концентрацию NaCl и маннит для балансировки осмоляльности. Все остальные компоненты были эквивалентны стандартному раствору. Проницаемость NaCl определяли по потенциалам разбавления и уравнению Гольдмана-Ходжкина-Каца, как сообщалось ранее (Amasheh et al., 2002; Günzel et al., 2009; Ю и др., 2009).

    Вестерн-блот-анализ

    Для анализа экспрессии белки экстрагировали с использованием охлажденного льдом буфера для лизиса, включая 10 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5 % Triton X-100, 0,1 % SDS и полную смесь ингибиторов протеазы (Roche , Базель, Швейцария). Для исследований фосфорилирования буфер для лизиса содержал 20 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1 % Тритон Х-100, 2,5 мМ Na 2 H 2 P 2 O 7 , 1 мМ β-глицеролфосфат, 1 мМ Na 3 VO 4 , 1 мг мл -1 лейпептина, 1 мМ PMSF и полный ингибитор протеазы.Для анализа расщепления каспазы-3 проводили лизис клеток, как описано недавно (Hering et al., 2017).

    Белковые экстракты (15–40 мг) разделяли с помощью электрофореза в SDS-геле и наносили на мембрану из ПВДФ. Антитела, используемые для иммунодетекции: анти-клаудин-1 до -4, клаудин-7 и -15 (1:1000, Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), β-актин (1:5000, Sigma-Aldrich), анти-фосфо — легкая цепь миозина 2, антитело против легкой цепи 2 миозина (Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс, США) и антитело к каспазе 3 (1:1000; Cell Signaling Technology).Хемилюминесцентную визуализацию связанных антител проводили с конъюгированными с пероксидазой козьими антителами против кроличьего IgG или козьими антителами против мышиного IgG, хемилюминесцентным субстратом Lumi-LightPLUS (Roche) и системой обнаружения FX7 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany). Денситометрию проводили с помощью Image Studio Light (LI-COR Biosciences; NE, США) и значения нормализовали по β-актину, который служил внутренним контролем нагрузки.

    Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

    Монослои промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре. После пермеабилизации 0,5% монослоя Triton X-100 блокировали 5% козьей сывороткой и 1% бычьим сывороточным альбумином. Иммуноокрашивание проводили с первичными антителами к анти-ZO-1 (1:100), анти-клаудину-1, -4, -7 и -15 (все 1:100; Thermo Fisher Scientific) при 4°С в течение ночи. Контрастное окрашивание проводили с использованием Alexa Fluor 488 козьих антимышиных и Alexa Fluor 594 козьих антикроличьих IgG (1:1000; Thermo Fisher Scientific), как описано ранее (Luettig et al., 2016). Ядра окрашивали 4′,6-диамидин-2-фенилиндолом (DAPI) (1:5000).Интенсивность и локализацию клаудинов анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM 780, Zeiss, Йена, Германия).

    Электронная микроскопия замораживания трещин

    Электронно-микроскопический анализ замораживания трещин был проведен и количественно определен, как подробно описано в другом месте (Krug et al., 2009).

    Статистический анализ

    Статистический анализ выполнен с использованием критерия Стьюдента и поправки Бонферрони-Холма в случае множественного сравнения. Все данные выражены как среднее ± SEM. p <0,05 считали значительным (* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 или # p <0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001).

    Результаты

    Стабилизирующий эффект пуникалагина, уролитина А и эллаговой кислоты на барьерные свойства клеток кишечника Caco-2

    Пуникалагин незначительно увеличивал TER по сравнению с исходными значениями в монослоях Caco-2 в течение 24 часов (рис. 1A; p < 0.05, p <0,001 по сравнению с контролем). Это увеличение TER не могло быть увеличено в зависимости от дозы (рис. 1A; p <0,05 Puni 50 против 150 мкМ). Напротив, увеличение TER, вызванное уролитином А, было более выраженным (рис. 1В). Хотя 25 мкМ не были эффективными, дозы до 100 мкМ UroA значительно повышали TER по сравнению с контролем (рис. 1B; p <0,001 по сравнению с контролем). Дозы уролитина А, превышающие 100 мкМ, не вызывали дальнейшего усиления эффекта (рис. 1В). Эллаговая кислота вызывала сильнейшее увеличение TER в течение 24 ч.50 мкМ были столь же эффективны, как 200 мкМ EA по сравнению с контролем (рис. 1C; p <0,001 и p <0,05 по сравнению с контролем). Сравнение наиболее эффективной дозы каждого соединения в одном эксперименте показало, что эллаговая кислота (150 мкМ) вызывает самое сильное увеличение TER в монослоях Caco-2, за ней следуют уролитин А (250 мкМ) и пуникалагин (10 мкМ) (рис. 1D; p). < 0,001 по сравнению с контролем и p < 0,001 по сравнению с EA). Увеличение TER, вызванное 150 мкМ эллаговой кислоты, сопровождалось снижением проницаемости маркерной молекулы флуоресцеина 332 Да в монослоях Caco-2 (рис. 2А; p <0.001 по сравнению с контролем). Ни 250 мкМ уролитина А, ни 10 мкМ пуникалагина не снижали проницаемость флуоресцеина (рис. 2А). Измерения потенциалов разбавления натрия и хлорида показали, что эллаговая кислота ограничивала проницаемость натрия, но не проницаемость хлорида в монослоях Caco-2 (рис. 2B; p <0,001 по сравнению с контролем). Отношения проницаемости натрия и хлорида (P Na / P Cl ) были снижены в 3 раза с 28 ± 7 в контроле до 9 ± 1 в монослоях, обработанных эллаговой кислотой ( p < 0.05 по сравнению с контролем).

    РИСУНОК 1 . Влияние пуникалагина, эллаговой кислоты и уролитина А на трансэпителиальную резистентность (TER) в монослоях Caco-2. Изменения TER от исходных значений измеряли через 24 ч после заражения монослоев различными дозами (A) пуникалагина (Puni) ( p *<0,05, *** p < 0,001 по сравнению с контролем; # p <0,05 50 против 150 мкМ; n = 3–12) (B) уролитин A (UroA) (*** p < 0.001 по сравнению с контролем; n = 3–12) или (C) эллаговая кислота (EA) ( p *<0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 по сравнению с контролем; n = 6–15) (D) Сравнение наиболее эффективной дозы каждого соединения на TER через 24 часа после заражения (*** p <0,001 по сравнению с контролем; ### p <0,001 по сравнению с контролем , эллаговая кислота, n = 6–9).

    РИСУНОК 2 . Эллаговая кислота снижает проницаемость для флуоресцеина и натрия в монослоях Caco-2.Измерения проницаемости проводились в камерах Уссинга через 24 часа после заражения. Эллаговая кислота (ЭА) снижает проницаемость до маркерной молекулы флуоресцеина (А) 332 Да (*** p < 0,001 по сравнению с контролем; n = 7–9) и (Б) для ионов натрия ( *** p < 0,001 по сравнению с контролем, n = 8) по сравнению с необработанным контролем.

    Чтобы более подробно проанализировать барьерный эффект эллаговой кислоты, экспрессию белка TJ исследовали после 24 часов воздействия на монослои 150 мкМ эллаговой кислоты.Это снизило уровень белка клаудина-4, -7 и -15 (рис. 3А; p <0,0001 по сравнению с контролем), но не повлияло на клаудин-1, -2 или -3 и трицеллулин (рис. 3А). Клаудин-5 и -8 не экспрессировались в наших клетках Caco-2. Понижающая регуляция экспрессии клаудина-4, -7 и -15, полученная в результате вестерн-блоттинга, была подтверждена с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии иммуноокрашенных монослоев Caco-2. Интенсивность сигналов клаудина-4, клаудина-7 и клаудина-15 была снижена в монослоях, зараженных 150 мкМ эллаговой кислоты (фиг. 3B).В частности, клаудин-7 и -15 присутствовали только в одиночных клетках контрольных монослоев Caco-2. Обработка эллаговой кислотой уменьшала количество и частоту этих положительных по клаудину-7 или клаудину-15 клеток (рис. 3В). Эллаговая кислота не влияла на общую ультраструктуру TJ. Морфометрический анализ электронных микрофотографий переломов замораживания не выявил изменений в ультраструктуре TJ (рис. 3C). количество тяжей ЩЖ (3,4 ± 0,2 против 3,2 ± 0,1 в контроле), плотность (23 ± 3 против 22 ± 2 в контроле) и тип, глубина сетки (147 ± 17 против143 ± 9 в контроле), и количество разрывов цепей не отличалось от контроля в монослоях Caco-2, обработанных эллаговой кислотой.

    РИСУНОК 3 . Эллаговая кислота снижает экспрессию белков TJ белков клаудина-4, -7 и -15 в монослоях Caco-2 (A) Репрезентативные вестерн-блоты и денситометрия показывают снижение экспрессии клаудина-4, -7 и -15 в эллаговой кислоте (EA )-зараженные монослои ( p ***<0,001 по сравнению с контролем; n = 7–10) (B) Репрезентативные микрофотографии иммунофлуоресцентного окрашивания показывают клаудин-4, клаудин-7 и клаудин-15 в контроле и монослои с эллаговой кислотой (зеленые). ZO-1 служил маркером TJ (красный), ядра были окрашены DAPI (синий) ( n = 3 каждого) (C) Репрезентативные ЭМ-микрофотографии замораживания и разрушения контрольных монослоев и монослоев, зараженных эллаговой кислотой, не показывают различий в TJ ультраструктура.

    Передачу сигналов изучали путем оценки различных ингибиторов киназы. Хотя эллаговая кислота индуцировала фосфорилирование p38 и STAT3, специфическое ингибирование фосфорилирования этих киназ не могло препятствовать стимулированному эллаговой кислотой увеличению TER (данные не показаны).Напротив, ингибирование MLCK с помощью PIK предотвращало фосфорилирование легкой цепи 2 миозина (MLC2) и блокировало индуцированное эллаговой кислотой увеличение TER (рис. 4A; p <0,001 по сравнению с контролем). Параллельно с этим PIK препятствовал зависимому от эллаговой кислоты подавлению экспрессии клаудина-4, -7 и -15 (рис. 4B; p <0,05 PIK + эллаговая кислота по сравнению с одной эллаговой кислотой). В монослоях, совместно обработанных PIK + эллаговой кислотой, уровни белка не отличались от контроля (рис. 4B).

    РИСУНОК 4 .Эллаговая кислота усиливает барьерную функцию посредством передачи сигналов MLC2 в монослоях Caco-2 (A) Предварительная инкубация со специфическим ингибитором MLCK PIK препятствовала стимулированному эллаговой кислотой (EA) фосфорилированию MLC2 и увеличению TER в монослоях Caco-2 через 24 часа после заражения ( p ***<0,001 по сравнению с контролем; n = 9)., (B) Репрезентативные вестерн-блоты и количественный анализ показывают, что ингибирование PIK блокирует стимулируемую эллаговой кислотой понижающую регуляцию клаудина-4, -7 и -15 параллельно (* p < 0.05; *** p < 0,001 по сравнению с контролем; # p < 0,05 эллаговая кислота по сравнению с эллаговой кислотой + PIK; n = 6–9).

    Защитный эффект уролитина А на индуцированную TNFα потерю барьера в клетках HT-29/B6 Фигура 5А;

    p <0,001 по сравнению с контролем). Предварительная обработка 150 мкМ или 250 мкМ уролитина А частично обращала вспять это вызванное TNFα снижение ( p < 0.001 по сравнению с TNFα), в то время как обе дозы уролитина А были сравнительно эффективны (рис. 5А). Напротив, 10 мкМ пуникалагина или 150 мкМ эллаговой кислоты не ингибировали вызванное TNFα снижение TER (Фигура 5A). Хорошо известно, что TNFα повышает экспрессию клаудина-1 и -2 в клетках HT-29/B6. В рамках настоящего исследования предварительная инкубация со 150 мкМ уролитина А предотвращала активацию обоих клаудинов, стимулируемую TNFα. Вестерн-блоттинг показал увеличение экспрессии клаудина-1 примерно на 40% с помощью TNFα (рис. 5B; p <0.001 по сравнению с контролем), в то время как в монослоях, совместно обработанных уролитином А, экспрессия оставалась на уровне контроля (фиг. 5В). Уровень белка клаудина-2 повышался под действием TNFα примерно на 50% по сравнению с контрольными значениями (рис. 5B; p <0,01 по сравнению с контролем). Предварительное лечение уролитином А снизило экспрессию клаудина-2 до 67% по сравнению с контролем (рис. 5В; p <0,05 по сравнению с контролем). На экспрессию клаудина-4 не влияли TNFα или уролитин А (рис. 5В).

    РИСУНОК 5 . Уролитин А противодействует индуцированному TNFα снижению TER и изменениям экспрессии клаудина-1 и двух в монослоях HT-29/B6 (A) 150 и 250 мкМ уролитина A (UroA) частично предотвращали вызванное TNFα снижение TER при HT- 29/B6 монослои (*** p < 0.001 по сравнению с контролем; ### p < 0,001 TNFα по сравнению с уролитин А + TNFα; n = 6–12) (B) 150 мкМ уролитина А полностью препятствовали TNFα-индуцированной повышающей регуляции клаудина-1 и -2, как показали репрезентативные вестерн-блоты и денситометрия (* p < 0,05, * * p < 0,01, *** p < 0,001 по сравнению с контролем, ## p < 0,01, ### p < 0,001 TNFα + уролитин A n = 5–8) (C) , но 150 мкМ уролитина А не предотвращали расщепление каспаз-3, вызванное TNFα (** p < 0. 01 по сравнению с контролем; n = 5–6).

    Поскольку TNFα вызывает эпителиальный апоптоз в клетках HT-29/B6, влияние уролитина А на расщепление каспазы-3 исследовали с помощью Вестерн-блоттинга. Как и ожидалось, TNFα усиливал расщепление каспазы-3 по сравнению с необработанным контролем (рис. 5C; p <0,01 по сравнению с контролем). Уролитин А не снижал индуцированное TNFα расщепление каспазы-3, но, по-видимому, стимулировал его. Однако это не достигло статистической значимости (рис. 5C). Помимо регуляции экспрессии, TNFα вызывал перераспределение клаудина-1 из TJ в субапикальные компартменты по сравнению с необработанным контролем (фиг. 6A, B, обозначенные белыми стрелками на фиг. 6B).Репрезентативные микрофотографии иммунофлуоресцентного окрашивания показали повышенное слияние клаудина-1 с маркерным белком TJ ZO-1 в монослоях, которые были совместно заражены TNFα и уролитином A (указано белыми стрелками на рисунке 6C). В монослоях, зараженных уролитином А, интенсивность и локализация клаудина-1 не отличались от контроля (рис. 6D).

    РИСУНОК 6 . Влияние уролитина А на делокализацию клаудина-1, вызванную TNFα, в монослоях HT-29/B6. Локализация клаудина-1 изучалась с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в монослоях (A), , контрольных, (B), , TNFα, (C), , уролитин A (UroA) + TNFα и (D), , зараженных уролитином A.Слияние клаудина-1 (зеленый) с маркерным белком TJ ZO-1 (красный) оценивали с помощью визуализации z-stack, ядра окрашены DAPI (синий). TNFα вызывал делокализацию клаудина-1 (обозначено белыми стрелками в (B) ), в то время как параллельное лечение уролитином А усиливало слияние клаудина-1-ZO-1 (обозначено белыми стрелками в (C) ). Полосы указывают 5 мкм.

    Обсуждение

    Барьерная функция эпителия является ключевой характеристикой здоровья кишечника. В настоящем исследовании изучались молекулярные механизмы, лежащие в основе заявлений о пользе для здоровья биоактивного полифенола пуникалагина и его метаболитов эллаговой кислоты и уролитина А, влияющих на барьерную функцию эпителия in vitro . Наши данные показали, что особенно эллаговая кислота и уролитин А по-разному влияют на барьерную функцию в наших двух клеточных моделях. Эллаговая кислота сама по себе усиливала барьерную функцию, снижая экспрессию порообразующих клаудин-4, -7 и -15 посредством передачи сигналов MLC2 в клетках подвздошной кишки Caco-2. Уролитин А препятствовал провоспалительной дисрегуляции и/или перераспределению клаудина-2 и -1 в клетках толстой кишки HT-29/B6. Один только пуникалагин оказывал незначительное влияние или не влиял на барьерную функцию в двух клеточных моделях.

    Строение эпителиального ТК, особенно его состав порообразующих и герметизирующих белков ТК, имеет решающее значение для барьерной функции кишечника. Целостность барьера можно оценить путем измерения TER и парацеллюлярной проницаемости молекул или ионов разного размера. Оказалось, что особенно в клетках Caco-2 эллаговая кислота усиливает барьерную функцию эпителия сама по себе, что проявляется сильным увеличением TER, снижением проницаемости для флуоресцеина и натрия и подавлением экспрессии клаудина-4, -7 и -15.

    Ультраструктура плотного соединения не была изменена, как показала электронная микроскопия замораживания. Впоследствии барьерные эффекты связаны не с изменениями общего содержания белка, а с составом белка TJ. В частности, рациональным представляется подавление клаудинов, образующих каналы. Клаудин-15 преимущественно экспрессируется в тонком кишечнике (Inai et al., 2005; Fujita et al., 2006; Holmes et al., 2006) и образует парацеллюлярный катион (Colegio et al., 2002; Van Itallie et al. ., 2003; Саманта и др., 2018) и водоселективный канал (Rosenthal et al., 2020). Сверхэкспрессия claudin-15 в клетках Caco-2 вызывает снижение TER (Takehara et al., 2009). Физиологическая функция claudin-4 и -7 менее ясна, так как она непостоянна и, по-видимому, зависит от взаимодействия с другими белками TJ и различается в разных типах клеток и условиях (Günzel and Fromm, 2012). В двух исследованиях флавоноидов в клетках Caco-2 сообщалось, что кверцетин (Amasheh et al., 2008) или кемпферол (Suzuki et al. , 2011) усиливают барьерную функцию за счет повышения экспрессии клаудина-4.Напротив, в исследовании клеточной культуры клеток почек предполагалось, что клаудин-4 действует как хлоридный канал. Нокдаун клаудина-4 приводил здесь к снижению P Na / P Cl , что сопровождалось увеличением TER (Hou et al., 2010). В эпителиальной модели совместного культивирования клеток Caco и HT29-MTX снижение TER, вызванное окислительным стрессом, было связано с увеличением клаудина-7 (Bianchi et al., 2019). В клетках почек сверхэкспрессия клаудина-7 была связана со снижением P Cl и увеличением P Na (Alexandre et al., 2005). В совокупности кажется рациональным, что именно снижение клаудина-15 и клаудина-7 ответственно за снижение проницаемости натрия и увеличение TER в монослоях Caco-2, подвергшихся воздействию эллаговой кислоты.

    Эллаговая кислота усиливала фосфорилирование STAT3, p38 и MLC2 в клетках Caco-2. Однако только ингибирование фосфорилирования MLC2 с помощью MLCK-ингибитора PIK препятствовало стимулированному эллаговой кислотой увеличению TER, что указывает на центральную роль MLC2 в регуляции барьера, зависящей от эллаговой кислоты. Фосфорилирование MLC2 с помощью MLCK связано с сокращением актомиозина и регуляцией TJ (Turner et al., 1999; Zolotarevsky et al., 2002; Shen et al., 2006). Мы показали, что ингибирование фосфорилирования MLC2 препятствует индуцированному эллаговой кислотой увеличению TER и подавлению клаудина-4, -7 и -15. До сих пор роль немышечных КЛЦМ и MLC2 для барьерной функции преимущественно обсуждалась в отношении потери барьера, вызванной TNFα (Zolotarevsky et al., 2002; Wang et al., 2006; Ye and Ma, 2008).Iglesias et al. недавно показали, что эллаговая кислота ингибирует стимулированное TNFα фосфорилирование MLC2 (Iglesias et al., 2020). Напротив, наши данные показывают активацию MLCK/MLC2 в состоянии отсутствия воспаления и предполагают, что регуляция TJ, запускаемая MLC2, не обязательно связана с потерей барьера, поскольку она, по-видимому, зависит от конкретного типа затронутого белка TJ.

    В рамках настоящего исследования влияние пуникалагина, эллаговой кислоты и уролитина А на вызванную воспалением барьерную дисфункцию изучали на модели клеточной культуры HT-29/B6, которая является очень хорошо изученной моделью воспаления и более чувствительна к TNFα. чем клетки Caco-2.Известно, что TNFα повышает экспрессию запечатывающего клаудина-1 и каналообразующего клаудина-2, при этом клаудин-1 дополнительно перераспределяется из TJ в HT-29/B6. Сообщается, что вместе с усиленным эпителиальным апоптозом эти изменения TJ вносят критический вклад в вызванную TNFα потерю барьера (Gitter et al., 2000; Mankertz et al., 2009; Amasheh et al., 2010). В отличие от уролитина А, ни пуникалагин, ни эллаговая кислота не были эффективны для ингибирования индуцированного TNFα падения TER в HT-29/B6. Более того, уролитин А препятствовал положительной регуляции каудина-1 и -2 и, по-видимому, по крайней мере частично предотвращал перераспределение клаудина-1.Эти эффекты уролитина А очень похожи на эффекты, которые мы наблюдали в предыдущем исследовании острого компонента 6-шогаола, полученного из имбиря, который также препятствовал индуцированной TNFα повышающей регуляции клаудина-2 и разборке клаудина-1 (Luettig et al. ., 2016). Кроме того, TNFα усиливает эпителиальный апоптоз, способствуя проницаемости эпителия (Gitter et al. , 2000). Уролитин А не ингибировал апоптоз эпителия, вызванный TNFα, у HT-29/B6, но даже слегка его стимулировал. Это согласуется с другими исследованиями, которые показали, что эллагитаннины из метаболитов граната и уролитина ингибируют пролиферацию и вызывают апоптоз в клетках HT-29 (Kasimsetty et al., 2010).

    Эти очень разные эффекты пуникалагина, эллаговой кислоты и уролитина А на барьерную функцию кишечника в двух клеточных моделях кажутся рациональными, поскольку биодоступность этих соединений в кишечнике различается. Сообщалось, что пуникалагин гидролизуется уже во время прохождения через желудок, где он дает эллаговую кислоту. Сам пуникалагин, вероятно, не достигает кишечника в больших количествах, в то время как эллаговая кислота может преимущественно взаимодействовать с энтероцитами подвздошной кишки.Как сообщалось в клинических испытаниях, эллаговая кислота не обнаруживалась в больших количествах в слизистой оболочке толстой кишки (Nuñez-Sánchez et al., 2014). Напротив, в исследовании на животных был описан возрастающий градиент уролитинов от тощей кишки к дистальному отделу толстой кишки (Espín et al. , 2007). До сих пор только в очень немногих исследованиях рассматривался вопрос, сколько пуникалагина необходимо принимать внутрь для достижения эффективной концентрации эллаговой кислоты или уролитина А в кишечнике. В настоящем исследовании эффекты, по-видимому, зависели от оптимальной дозировки, которая была рассчитана для каждое соединение.Гонсалес-Сарриас и др. смоделированное пищеварение экстрактов граната в желудочно-кишечном тракте с выделением около 500 мкМ эллаговой кислоты, в то время как концентрации в плазме оставались низкими при 100 нМ (Nuñez-Sánchez et al., 2014). Впоследствии необходимы дополнительные исследования для выяснения дозировки, кишечной стороны преобразования и биодоступности этих компонентов in vivo .

    Заключение

    Наше исследование показало, что метаболиты пуникалагина эллаговая кислота и уролитин А оказывают защитное действие на барьерную функцию in vitro .Эти данные подтверждают гипотезу о том, что терапевтическое применение может действовать профилактически, укрепляя и защищая эпителиальный барьер в случае диареи или воспаления. Более того, характеристика этих соединений может представлять интерес для разработки мультимодальных функциональных пищевых продуктов в будущем.

    Заявление о доступности данных

    Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

    Вклад авторов

    NH, RR и JS задумали и разработали исследовательский проект; JL, NH, RR и BJ провели исследование; NH и RR проанализировали данные; NH провела статистический анализ; NH и RR написали статью; а JS и RR несли основную ответственность за окончательный контент.Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Это исследование было поддержано грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Schu 559/11.

    Сокращения

    DAPI, 4′,6-Диамидин-2-фенилиндол; EA, эллаговая кислота; ЭРК1/2; киназы, регулируемые внеклеточными сигналами 1/2; LSM, лазерная сканирующая микроскопия; MLC2, вторая легкая цепь миозина; MLCK, киназа легкой цепи миозина; NFκB, ядерный фактор «каппа-легкая цепь-энхансер» активированных В-клеток; Р, проницаемость; PCl, проницаемость для хлоридов; PNa, натриевая проницаемость; Пуни, пуникалагин; STAT3, преобразователи сигнала и активатор транскрипции 3; TER — трансэпителиальная резистентность; TJ, плотное соединение; TJs, плотные соединения; TNFα, фактор некроза опухоли α; УроА, уролитин А; ZO, белок zonula occludens.

    Ссылки

    Александр, доктор медицинских наук, Лу, К., и Чен, Ю. Х. (2005). Сверхэкспрессия клаудина-7 снижает парацеллюлярную проводимость Cl- и увеличивает парацеллюлярную проводимость Na+ в клетках LLC-PK1. Дж. Цел. Sci 118 (12), 2683–2693. doi:10.1242/jcs.02406

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Амаше М. , Фромм А., Круг С. М., Амаше С., Андрес С., Зейтц М. и др. (2010). Индуцированное TNF-альфа и антагонизированное берберином нарушение барьера плотных контактов посредством тирозинкиназы, передачи сигналов Akt и NFkappaB. Дж. Цел. Sci 123 (23), 4145–4155. doi:10.1242/jcs.070896

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Амаше М., Шлихтер С., Амаше С., Манкерц Дж., Цейц М., Фромм М. и др. (2008). Кверцетин усиливает барьерную функцию эпителия и увеличивает экспрессию клаудина-4 в клетках Caco-2. Дж. Нутр. 138 (6), 1067–1073. doi:10.1093/jn/138.6.1067

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Амашех С., Мейри Н., Гиттер А.H., Schöneberg, T., Mankertz, J., Schulzke, J.D., et al. (2002). Экспрессия клаудина-2 индуцирует катионселективные каналы в плотных контактах эпителиальных клеток. Дж. Цел. науч. 115 (24), 4969–4976. doi:10.1242/jcs.00165

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Бьянки М. Г., Чиу М., Таурино Г., Бригенти Ф., Дель Рио Д., Мена П. и др. (2019). Катехин и процианидин В2 модулируют экспрессию белков плотных контактов, но не защищают от вызванных воспалением изменений проницаемости монослоев кишечных клеток человека. Питательные вещества 11 (10), 2271. doi:10.3390/nu11102271

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Серда Б., Периаго П., Эспин Дж. К. и Томас-Барберан Ф. А. (2005). Идентификация уролитина а как метаболита, продуцируемого микрофлорой толстой кишки человека из эллаговой кислоты и родственных соединений. Дж. Агрик. Пищевая хим. 53 (14), 5571–5576. doi:10.1021/jf050384i

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Colegio, OR, Van Itallie, C.М., МакКри, Х.Дж., Ранер, К., и Андерсон, Дж.М. (2002). Клаудины создают заряд-селективные каналы в парацеллюлярном пути между эпителиальными клетками. утра. J. Physiol, Cel. Физиол. 283 (1), C142–C147. doi:10.1152/ajpcell. 00038.2002

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Дас А.К., Мандал С.К., Банерджи С.К., Синха С., Дас Дж., Саха Б.П. и др. (1999). Исследования противодиарейной активности экстракта семян граната граната у крыс. J. Ethnopharmacol 68 (1–3), 205–208.doi:10.1016/s0378-8741(99)00102-6

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Эспин, Дж. К., Гонсалес-Баррио, Р., Серда, Б., Лопес-Ботэ, К., Рей, А. И., и Томас-Барберан, Ф. А. (2007). Иберийская свинья как модель для прояснения неясных моментов биодоступности и метаболизма эллагитаннинов у человека. Дж. Агрик. Пищевая хим. 55 (25), 10476–10485. doi:10.1021/jf0723864

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Эспин, Дж.C., Larrosa, M., García-Conesa, MT, and Tomás-Barberan, F. (2013) Биологическое значение уролитинов, кишечных микробных метаболитов, полученных из эллаговой кислоты: доказательства на данный момент. Эвид. Дополнение на основе. альтернативная мед. 2013, 270418. doi:10.1155/2013/270418

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Фуджита Х., Тиба Х., Йокодзаки Х., Сакаи Н., Сугимото К., Вада Т. и др. (2006). Дифференциальная экспрессия и субклеточная локализация клаудина-7, -8, -12, -13 и -15 вдоль кишечника мыши. J. Histochem. Цитохим. 54 (8), 933–944. doi:10.1369/jhc.6A6944.2006

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Хименес-Бастида, Дж. А., Гонсалес-Сарриас, А., Ларроса, М., Томас-Барберан, Ф., Эспин, Дж. К., и Гарсия-Конеса, М. Т. (2012). Метаболиты эллагитаннина, глюкуронид уролитина А и его агликон уролитин А, уменьшают вызванное ФНО-альфа воспаление и связанные с ним молекулярные маркеры в эндотелиальных клетках аорты человека. Мол. Нутр. Еда Рез. 56 (5), 784–796. doi:10.1002/mnfr.201100677

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Гиттер А. Х., Бендфельдт К., Шульцке Дж. Д. и Фромм М. (2000). Утечки в эпителиальном барьере, вызванные спонтанным и индуцированным ФНО-альфа апоптозом одиночных клеток. Фасеб Дж. 14 (12), 1749–1753. doi:10.1096/fj.99-0898com

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Günzel, D., Stuiver, M., Kausalya, P.J., Haisch, L., Круг С.М., Розенталь Р. и соавт. (2009). Claudin-10 существует в шести изоформах альтернативного сплайсинга, которые обнаруживают различную локализацию и функцию. Дж. Цел. науч. 122 (10), 1507–1517. doi:10.1242/jcs.040113

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Хеллер Ф., Флориан П., Боярски К., Рихтер Дж., Крист М., Хилленбранд Б. и др. (2005). Интерлейкин-13 является ключевым эффекторным цитокином Th3 при язвенном колите, который влияет на плотные контакты эпителия, апоптоз и восстановление клеток. Гастроэнтерология 129 (2), 550–564. doi:10.1016/j.gastro.2005.05.002

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Геринг, Н. А., Фромм, М., и Шульцке, Дж. Д. (2012). Детерминанты барьерной функции толстой кишки при воспалительных заболеваниях кишечника и потенциальные терапевтические средства. Журнал физиол. 590 (5), 1035–1044. doi:10.1113/jphysiol.2011.224568

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Геринг, Н. А., Люттиг, Дж., Krug, S.M., Wiegand, S., Gross, G., van Tol, E.A., et al. (2017). Лактоферрин защищает от воспаления кишечника и вызванной бактериями дисфункции барьера in vitro . Энн. Н. Я. акад. науч. 1405 (1), 177–188. doi:10.1111/nyas.13405

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Идальго И. Дж., Рауб Т. Дж. и Борхардт Р. Т. (1989). Характеристика линии клеток карциномы толстой кишки человека (Caco-2) как модельной системы проницаемости эпителия кишечника. Гастроэнтерология 96 (3), 736–749. doi:10.1016/0016-5085(89)-4

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Холмс, Дж. Л., Ван Итали, К. М., Расмуссен, Дж. Э., и Андерсон, Дж. М. (2006). Профилирование Claudin у мышей во время постнатального развития кишечника и вдоль желудочно-кишечного тракта обнаруживает сложные паттерны экспрессии. Ген Экспр. Выкройки 6 (6), 581–588. doi:10.1016/j.modgep.2005.12.001

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Хоу, Дж., Ренигунта, А., Ян, Дж., и Вальдеггер, С. (2010). Клаудин-4 образует парацеллюлярный хлоридный канал в почках и нуждается в клаудине-8 для локализации плотных контактов. Проц. Натл. акад. науч. США 107 (42), 18010–18015. doi:10.1073/pnas.1009399107

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Иглесиас Д. Э., Кремонини Э., Фрага К. Г. и Отейза П. И. (2020) Эллаговая кислота защищает монослои клеток Caco-2 от пермеабилизации, вызванной воспалением. Свободный радикал. биол. Мед. 152, 776–786. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2020.01.022

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Инай Т. , Сенгоку А., Гуан X., Хиросе Э., Иида Х. и Шибата Ю. (2005) Гетерогенность в экспрессии и субклеточной локализации белков плотных контактов, клаудин- 10 и -15, исследованы с помощью ОТ-ПЦР и иммунофлуоресцентной микроскопии. Арх. гистол. Цитол. 68 (5), 349–360. doi:10.1679/aohc.68.349

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Касимсетти, С.Г., Бялонска Д., Редди М.К., Ма Г., Хан С.И. и Феррейра Д. (2010) Химиопрофилактическая активность эллагитаннинов и уролитинов граната при раке толстой кишки. Дж. Агрик. Пищевая хим. 58 (4), 2180–2187. doi:10.1021/jf

    2h

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Kreusel, K.M., Fromm, M., Schulzke, JD, and Hegel, U. (1991) Cl-секреция в эпителиальных монослоях слизеобразующих клеток толстой кишки человека (HT-29/B6). утра. Дж. Физиол. 261, C574–C582.doi:10.1152/ajpcell.1991.261.4.C574

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Круг С. М., Амашех С., Рихтер Дж. Ф., Милац С., Гюнцель Д., Вестфаль Дж. К. и др. (2009). Трицеллюлин образует барьер для макромолекул в трехклеточных плотных контактах, не влияя на ионную проницаемость. Мол. биол. Цел. 20 (16), 3713–3724. doi:10.1091/mbc.E09-01-0080

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Ларроса М., Гонсалес-Сарриас А., Yáñez-Gascón, M.J., Selma, M.V., Azorín-Ortuño, M., Toti, S., et al. (2010). Противовоспалительные свойства экстракта граната и его метаболита уролитина-А в модели колита у крыс и влияние воспаления толстой кишки на метаболизм фенолов. Дж. Нутр. Биохим. 21 (8), 717–725. doi:10.1016/j.jnutbio.2009.04.012

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Люттиг Дж., Розенталь Р., Ли И. М., Круг С. М. и Шульцке Дж. Д. (2016). Компонент имбиря 6-шогаол предотвращает индуцированную TNF-α потерю барьера за счет ингибирования передачи сигналов PI3K/Akt и NF-kB. Мол. Нутр. Еда Рез. 60 (12), 2576–2586. doi:10.1002/mnfr.201600274

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Манкерц Дж., Амаше М., Круг С. М., Фромм А., Амаше С., Хилленбранд Б. и др. (2009). TNF-альфа повышает экспрессию клаудина-2 в эпителиальных клетках HT-29/B6 посредством передачи сигналов фосфатидилинозитол-3-киназы. Цел. Tissue Res 336, 67. doi:10.1007/s00441-009-0751-8

    CrossRef Full Text | Google Scholar

    Марин, М., Мария Хинер, Р., Риос, Дж. Л., и Ресио, М. К. (2013). Кишечная противовоспалительная активность эллаговой кислоты в моделях острого и хронического декстрансульфата натрия колита у мышей. J. Ethnopharmacol 150 (3), 925–934. doi:10.1016/j.jep.2013.09.030

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Минета К., Ямамото Ю., Ямазаки Ю., Танака Х., Тада Ю., Сайто К. и др. (2011). Предсказанная экспансия мультигенного семейства клаудинов. ФЭБС Письмо. 585 (4), 606–612. doi:10.1016/j. febslet.2011.01.028

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Нуньес-Санчес, М. А., Гарсия-Вильяльба, Р., Монедеро-Сайс, Т., Гарсия-Талавера, Н. В., Гомес-Санчес, М. Б., Санчес-Альварес, К., и др. (2014). Целевое метаболическое профилирование полифенолов и уролитинов граната в плазме, моче и тканях толстой кишки у пациентов с колоректальным раком. Мол. Нутр. Еда Рез. 58 (6), 1199–1211. doi:10.1002/mnfr.201300931

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Роли, Д.R., Marchiando, A.M., Zhang, Y., Shen, L., Sasaki, H., Wang, Y., et al. (2010). Белки MARVEL, связанные с плотными контактами, marveld3, tricellulin и occludin имеют разные, но перекрывающиеся функции. Мол. биол. Цел. 21 (7), 1200–1213. doi:10.1091/mbc.E09-08-0734

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Розенталь Р., Гюнцель Д., Пионтек Дж., Круг С. М., Аяла-Торрес К., Хемпель К. и др. (2020) Claudin-15 образует водный канал через плотное соединение с функцией, отличной от claudin-2. Acta Physiol. 228 (1), e13334. doi:10.1111/apha.13334

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Саид М., Навид М., Биби Дж., Камбох А. А., Араин М. А., Шах К. А. и др. (2018). Многообещающие фармакологические эффекты и терапевтическое/медицинское применение punica granatum L. (граната) в качестве функционального продукта питания для людей и животных. Недавнее воспаление Пэт. Препарат от аллергии Дисков. 12 (1), 24–38. doi:10.2174/1872213X12666180221154713

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Саманта, П., Wang, Y., Fuladi, S., Zou, J., Li, Y., Shen, L., et al. (2018). Молекулярное определение организации клаудина-15 и избирательности каналов. J. Общая физиол. 150 (7), 949–968. doi:10.1085/jgp.201711868

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Сирам, Н. П., Ли, Р., и Хебер, Д. (2004) Биодоступность эллаговой кислоты в плазме человека после употребления эллагитаннинов из сока граната (Punica granatum L. ). клин. Чим. Acta 348 (1–2), 63–68.doi:10.1016/j.cccn.2004.04.029

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Шен Л., Блэк Э. Д., Витковски Э. Д., Ленсер В. И., Герьеро В., Шнеебергер Э. Э. и др. (2006). Фосфорилирование легкой цепи миозина регулирует барьерную функцию путем ремоделирования структуры плотных контактов. J. Cel Sci. 119 (10), 2095–2106. doi:10.1242/jcs.02915

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Судзуки Т., Танабэ С. и Хара Х. (2011). Кемпферол усиливает барьерную функцию кишечника за счет ассоциации с цитоскелетом и экспрессии белков плотных контактов в клетках Caco-2. Дж. Нутр. 141 (1), 87–94. doi:10.3945/jn.110.125633

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Такехара М., Нисимура Т., Мима С., Хосино Т. и Мидзусима Т. (2009). Влияние экспрессии клаудина на парацеллюлярную проницаемость, миграцию и инвазию клеток рака толстой кишки. биол. фарм. Бык. 32 (5), 825–831. doi:10.1248/bpb.32.825

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Тернер Дж. Р., Энгл Дж.М., Блэк, Э.Д., Джоял, Дж.Л., Сакс, Д.Б., и Мадара, Дж.Л. (1999). PKC-зависимая регуляция трансэпителиальной резистентности: роли MLC и киназы MLC. утра. Дж. Физиол. 277 (3), C554–C562. doi:10.1152/ajpcell.1999.277.3.C554

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Ван Итали, К.М., Фаннинг, А.С., и Андерсон, Дж.М. (2003). Изменение избирательности заряда в катион- или анион-селективных эпителиальных линиях за счет экспрессии различных клаудинов. утра. Дж. Физиол. Рен. Физиол 285 (6), Ф1078–Ф1084. doi:10.1152/ajprenal.00116.2003

    CrossRef Full Text | Google Scholar

    Ван Ф., Шварц Б. Т., Грэм В. В., Ван Ю., Су Л., Клейбург Д. Р. и др. (2006). Интерферон-гамма-индуцированная экспрессия TNFR2 необходима для TNF-зависимой дисфункции кишечного эпителиального барьера. Гастроэнтерология . 131 (4), 1153–1163. doi:10.1053/j.gastro.2006.08.022

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Е, Д.и Ма, Т.Ю. (2008). Клеточные и молекулярные механизмы, которые опосредуют базальную и индуцированную фактором некроза опухоли-альфа регуляцию активности гена киназы легкой цепи миозина. J.Cel Mol Med. 12 (4), 1331–1346. doi:10.1111/j.1582-4934.2008.00302.x

    CrossRef Full Text | Google Scholar

    Ю А. С., Ченг М. Х., Ангелов С., Гюнцель Д., Канзава С. А., Шнеебергер Э. Э. и др. (2009) Молекулярная основа селективности катионов в парацеллюлярных порах на основе клаудина-2: идентификация места электростатического взаимодействия. J. Общая физиол. 133, 111–127. doi:10.1085/jgp.200810154

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Чжао С. С., Ма Д. X., Чжу Ю., Чжао Дж. Х., Чжан Ю., Чен Дж. К. и др. (2018). Противодиарейный эффект фракций и биоактивных компонентов кожуры граната (Punica granatum L. ), ориентированных на биоактивность. Нейрогастроэнтерол Мотил. 30 (7), е13364. doi:10.1111/nmo.13364

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Золотаревский Ю., Hecht, G., Koutsouris, A., Gonzalez, D.E., Quan, C., Tom, J., et al. (2002). Проникающий через мембрану пептид, который ингибирует киназу MLC, восстанавливает барьерную функцию в in vitro моделях кишечных заболеваний. Гастроэнтерология 123 (1), 163–172. doi:10.1053/gast.2002.34235

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Пуникалагин снижает уровень глюкозы в сыворотке и повышает активность PON1 и противовоспалительные свойства ЛПВП у мышей Balb/c, получавших диету с высоким содержанием жиров включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и диабет.Традиционно польза полифенолов для здоровья связывалась с их антиоксидантной активностью, но многим исследованиям может помешать пероральный прием и незначительная биодоступность. Механизмы, с помощью которых полифенолы проявляют свое полезное действие, не оказывают прямого антиоксидантного действия, а, по-видимому, включают их взаимодействие с белками. Настоящее исследование направлено на расширение и подтверждение наших недавно опубликованных результатов in vitro, показывающих, что полифенолы могут снижать риск атеросклероза посредством взаимодействия с белками и липопротеинами, связанными с атеросклерозом.Биологические функции пуникалагина и кверцетина в отношении уровней глюкозы и липидов, активности параоксоназы 1 (PON1) и воспаления были исследованы in vivo.

    Мышей кормили диетой с высоким содержанием жиров (HFD) в течение 12 недель, а в течение последних 4 недель они получали подкожное лечение с помощью имплантированных мининасосов, которые ежедневно выпускали физиологические концентрации пуникалагина, кверцетина или аторвастатина (в качестве положительного контроля) в живот. сыворотка. HFD снижал активность PON1 в сыворотке, тогда как введение пуникалагина восстанавливало активность PON1 до уровня мышей, получавших нормальную диету.Кроме того, пуникалагин значительно снижал уровень глюкозы у мышей HFD и улучшал противовоспалительные свойства ЛПВП. В заключение, помимо антиоксидантной активности, механизмы, с помощью которых полифенолы проявляют свои полезные свойства, по-видимому, включают их взаимодействие с белками сыворотки, которые опосредуют функцию ЛПВП и липидно-глюкозное состояние в кровотоке.

    1. Введение

    Полифенолы — это многочисленные антиоксиданты в рационе человека, содержащиеся во фруктах, овощах, орехах и чае. Было предложено оказывать благотворное влияние на множество болезненных состояний, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и нейродегенеративные расстройства [1, 2]. Кверцетин, полифенол, содержащийся в основном в красном луке (Allium cepa) , и пуникалагин из граната (Punica granatum) , являются двумя известными антиоксидантами в рационе человека. Помимо антиоксидантных, химиопрофилактических и антибактериальных свойств кверцетин и пуникалагин известны своей гипогликемической и антиатерогенной активностью [1, 3–5].Было показано, что оба полифенола защищают клетки макрофагов от накопления липидов и образования пенистых клеток, а также снижают развитие атеросклероза [4, 6–9]. Кроме того, многочисленные исследования показали, что кверцетин и его гликозиды, а также антиоксидантный состав граната, особенно общее содержание фенолов и общее содержание антоцианов, эффективны в профилактике и лечении неинфекционных хронических заболеваний, таких как диабет, ожирение и гиперлипидемия. Они могут регулировать метаболизм глюкозы и липидов с помощью различных механизмов.Они снижают уровень глюкозы в крови, защищая β -клетки поджелудочной железы, улучшая чувствительность к инсулину или и то, и другое. Они также снижают уровень липидов, возможно, посредством регуляции катаболизма и/или анаболизма липидов [10, 11]. Предполагается, что механизм действия полифенолов обусловлен их антиоксидантной активностью, обусловленной их химической способностью отдавать электрон или хелатировать переходные металлы. Однако антиоксидантная активность не может быть единственным объяснением клеточных эффектов полифенолов in vivo, поскольку они плохо всасываются через кишечник в кровоток и активно метаболизируются в тонком кишечнике, печени и толстой кишке.Таким образом, концентрации полифенолов в крови едва ли достигают уровня, необходимого для эффективной антиоксидантной активности [12]. Недавние исследования показали, что клеточные эффекты полифенолов могут быть опосредованы их взаимодействием со специфическими белками. Полифенолы избирательно взаимодействуют с различными компонентами белков и внутриклеточными ферментами (например, гидролазами, оксидазами и киназами) [13–17], сывороточными ферментами, такими как альбумин или амилаза, рецепторами эстрогенов и различными факторами транскрипции [16, 18, 19].Точно так же было обнаружено, что полифенолы действуют как лиганды ядерных рецепторов, пролиферируют, активируют и модулируют энергию и гомеостаз [12].

    Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) являются важным переносчиком холестерина в организме. ЛПНП содержит одну большую белковую молекулу — аполипопротеин В-100, — которая распознается и связывается рецептором ЛПНП. Эпидемиологические данные показывают, что чем больше ЛПНП присутствует в крови, тем быстрее развивается атеросклероз [20]. Напротив, липопротеины высокой плотности (ЛПВП) играют важную роль в профилактике атеросклероза благодаря своим антиатерогенным свойствам, таким как обратный транспорт холестерина, антиоксидантная, противовоспалительная, антиапоптотическая и сосудорасширяющая активность, а также улучшение функции эндотелия [21, 22]. Большинство атеропротективных эффектов ЛПВП связано с ассоциированным с ним ферментом параоксоназой 1 (PON1; EC 3.1.8.1) [23, 24]. Мыши с дефицитом PON1 подвержены развитию атеросклероза, тогда как он ингибируется гиперэкспрессией человеческого PON1 у мышей [25]. Активность PON1 обратно коррелирует с толщиной интима-медиа сонных артерий [26], ослабляет поглощение окисленных ЛПНП макрофагами, ингибирует скорость биосинтеза холестерина макрофагами и стимулирует опосредованный ЛПВП отток холестерина из макрофагов [27–30].Эпидемиологические данные демонстрируют связь между низкой активностью PON1 и повышенным риском сердечно-сосудистых событий [26, 31]. Кроме того, отчеты об исследованиях с детьми и подростками из разных этнических групп показали более низкую активность PON1, связанную с диабетом 2 и 1 типа [32–37]. Диабет и атеросклероз — два заболевания, которые, как известно, возникают одновременно, при этом атеросклероз ускоряется диабетом и метаболическим синдромом [38]. Исследования in vitro дали важные сведения о механизме, с помощью которого гипергликемия может привести к атеросклерозу, но эти механизмы не всегда подтверждались in vivo. Таким образом, было проведено множество исследований, чтобы связать состояние высокого уровня глюкозы с ЛПВП, PON1 и атеросклерозом.

    В предыдущих исследованиях мы показали, что полифенолы, такие как кверцетин, связываются с аллостерическим сайтом на рекомбинантном PON1 и влияют на функцию и биологию фермента [17]. Полифенолы предотвращают окисление PON1 и защищают его от ингибирования гидропероксидом линолевой кислоты посредством специфического взаимодействия [16]. Точно так же пуникалагин связывается с аполипопротеином В-100 и индуцирует приток ЛПНП в макрофаги до уровня, который препятствует их трансформации в пенистые клетки.Такой эффект может обеспечить альтернативный механизм снижения концентрации холестерина в крови и замедления развития атеросклероза [39].

    Чтобы подтвердить наши недавние результаты in vitro, показывающие антиатерогенные эффекты пуникалагина и кверцетина при специфическом связывании с белком, расположенным на частицах ЛПВП или ЛПНП [39], мы стремились охарактеризовать эффекты этих полифенолов in vivo. В этом исследовании эффекты пуникалагина и кверцетина, вводимых подкожно (п/к) через осмотические мининасосы, изучались у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров (HFD).Имплантация мининасоса позволила нам контролировать уровни липидов и глюкозы в сыворотке мышей HFD в присутствии физиологических концентраций полифенолов и измерять свойства HDL и PON1 в конце эксперимента.

    2. Материалы и методы
    2.1. Материалы

    Пуникалагин, кверцетин, твин 80, метанол, хлороформ, аторвастатин, дигидрокумарин, диметилсульфоксид (ДМСО), 1-пальмитоил-2-арахидоноил- sn -глицеро-3-фосфорилхолин (PAPC) и дихлор-дигидро- диацетат флуоресцеина (DCFH-DA) приобретали у Sigma-Aldrich; 1-пальмитоил-2-(5,6-эпоксиизопростан Е2)- sn -глицеро-3-фосфохолин (PEIPC) получали от PAPC, а осмотические мининасосы ALZET приобретали у Biotest.

    2.2. Животные и диеты
    2.2.1. Животные

    Всего для этого исследования было взято 90 самцов мышей Balb/c, которым на момент начала эксперимента было 8 недель, из которых 68 животных дожили до умерщвления. Животные были приобретены в Harlan Laboratories, Израиль, и содержались группами по 5–6 особей в клетках размером 26,5 × 20 ×13,5 см в SPF-сертифицированном учреждении Института Шаретта Медицинского центра Хадасса-Еврейского университета. Еду и воду давали вволю. Мышей содержали при 12-часовом цикле свет-темнота (свет включался в 07:00).Этическое одобрение этого исследования было предоставлено Управлением биологических и биомедицинских моделей Еврейского университета в Иерусалиме, MD-16-14817-4.

    2.2.2. Дизайн исследования

    Целью данного исследования было изучение влияния полифенолов на метаболизм липидов, биологию липопротеинов и атеросклероз у мышей, получавших HFD.

    Измеряли исходную массу тела (МТ) и собирали образцы крови (~0,1 мл) для определения исходного уровня липидов в сыворотке после 12-часового голодания.Кровь брали из лицевой вены (под наркозом). Мышей разделили на 2 группы. Контрольная группа (не группа) (в начале протокола) получала обычную диету для грызунов в течение 8 недель, в то время как остальные группы (в начале протокола) получали HFD (60 кал. % жира, 20 кал.% белков и 20 кал.% углеводов; D12492, Research Diets Inc., США). Через 8 недель и еще 12 часов голодания животных взвешивали и собирали кровь для определения уровня липидов в сыворотке. Мышей кормили нормальным (вне группы) или HFD (в экспериментальных группах) еще в течение 4 недель.В течение этого времени лечебные группы (каждая) получали следующие виды лечения с помощью подкожно имплантированных осмотических мининасосов: (1) носитель (бидистиллированная вода (DDW) + 2% Tween 80), (2) пуникалагин при 140  мк г/100  мкм л, (3) кверцетин 42  мкм г/100  мкм л и (4) аторвастатин 15 мг/100  мкм л. Все соединения сначала растворяли в этаноле, который выпаривали в токе азота, а остаток перед использованием растворяли в DDW + 2% Tween 80 в соответствии с рекомендациями поставщика мининасоса ALZET.В каждый насос загружали 100  мкл л раствора (молекула в DDW + 2% Tween 80), из которого ежедневно в течение 28 дней высвобождалось 3,5  мкл мкл, что эквивалентно 2  мкл М. Помпы имплантировали под коктейль Домитор плюс кетамин, введенный внутрибрюшинно (в/б). Глубину анестезии контролировали с помощью щипкового рефлекса. Область имплантации выбривают, дезинфицируют 70% этанолом и протирают йодом с помощью тампона или тампона. Каждую минипомпу вводили подкожно в межлопаточное пространство.Затем кожу сшивали, и животному давали возможность выздороветь. За полчаса до операции мышам вводили 5 мг/кг анальгетика Римадил. Животных наблюдали и ежедневно контролировали на предмет дискомфорта, изъязвлений и неподвижности. Мышей, страдающих от этих недомоганий, немедленно усыпляли.

    В конце периода лечения и после 12-часового голодания мышей умерщвляли внутрибрюшинной инъекцией ветеринарного пентала и собирали внутрисердечную кровь для измерения соответствующих параметров крови в конце протокола.

    2.3. Образцы сыворотки

    Кровь, взятую во время умерщвления животных, собирали в конические пробирки Эппендорфа и оставляли на полчаса для свертывания. Затем образцы крови центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Сыворотку хранили при -70°С до анализа. Измеряли следующие показатели гиперлипидемии и атеросклероза: уровень липидов в сыворотке крови (ЛПВП, триглицериды и общий холестерин) и уровень глюкозы.

    2.3.1. Лактоназная активность PON1

    Образец мышиной сыворотки, разбавленный в 10 раз фосфатно-солевым буфером (PBS), помещали в 96-луночный УФ-микропланшет, содержащий 45  мкл мкл PBS и 50  мкл мкл Tris-HCl буфера pH 8 .4 с 1 мМ CaCl 2 (буфер активности) на лунку. Затем добавляли 100  мкл мкл дигидрокумарина, 2 мМ в буфере активности (приготовленном из исходного раствора 100 мМ дигидрокумарина в ДМСО). Скорость гидролиза дигидрокумарина измеряли при 270 нм каждые 25 с в течение 15 мин с помощью ридера SpectraMax M2. Из общей скорости гидролиза вычитали неферментативный гидролиз дигидрокумарина. Одна единица активности лактоназы равнялась гидролизу 1  мк моль дигидрокумарина в минуту.

    2.3.2. Измерения противовоспалительной активности с использованием бесклеточного анализа (CFA) с дихлорфлуоресцеином (DCF)

    ЛПВП выделяли из сыворотки мышей с помощью набора для очистки ЛПНП/ЛПОНП и ЛПВП (Cell Biolabs, каталожный номер STA-608) и подвергали диализу дважды, в течение 1 ч каждый раз и еще раз в течение ночи против PBS при 4°С. Для получения ПЭИПК окислением 1 мг ПАФХ в 100  мкл л хлороформа выпаривали в токе азота. Липидному остатку давали самоокислиться на воздухе в течение 24–48 часов.ПЭИПК растворяли в 400  мкл л ДМСО и идентифицировали методом ЖХ-МС [40]. DCFH-DA растворяли в метаноле для приготовления маточного раствора (2 мг/мл). Перед каждым экспериментом 50  мкл л исходного раствора добавляли к 200  мкл л 0,1 М NaOH и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Реакцию останавливали путем нейтрализации раствора 1,75 мл 0,1 М PBS, что приводило к превращению DCFH-DA в дигидродихлорфлуоресцеин (DCFH). При окислении DCFH превращается в DCF.ЛПВП (73  мк мкл) инкубировали в конечной концентрации 50  мк г с 2  мк мкл ПЭИПК (50  мк г/мл) в черном плоскодонном планшете для ИФА при 37°C в течение 60 мин. Затем в каждую лунку добавляли по 25  мкл мкл раствора DCFH (50  мкл г/мл), перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 3 ч. Интенсивность флуоресценции определяли с использованием планшетного ридера Tecan Infinite® 200 PRO с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны испускания 530 нм. Флуоресценцию в отсутствие ЛПВП нормализовали до 1.0. Значения  > 1,0 после добавления тестируемого ЛПВП указывали на провоспалительный ЛПВП; значения  < 1,0 указывают на наличие противовоспалительных ЛПВП.

    2.4. Статистический анализ

    Статистический анализ был проведен с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.01. Парный критерий Стьюдента использовали для сравнения средних значений двух групп со значимостью, определенной в (), () или ().

    3. Результаты

    Недавно мы показали, что пуникалагин специфически связывается с ЛПНП и индуцирует его приток в клетки макрофагов без образования пенистых клеток.Такой механизм может удалять избыток холестерина из этих клеток в печень, тем самым снижая уровень холестерина в кровотоке [39]. В этом исследовании in vivo изучались антиатерогенные и противовоспалительные свойства пуникалагина и его способность влиять на уровень липидов и глюкозы в сыворотке крови.

    3.1. МТ и клинические параметры в образцах крови

    Мыши МТ и образцы крови брали три раза в ходе эксперимента: в его начале, в середине и в конце. Окончательный BW в конце эксперимента сообщается на рисунке 1 (а).Значительные изменения массы тела наблюдались для всех групп мышей, получавших HFD (экспериментальные группы по сравнению с негруппой, ). Подкожно имплантированная помпа не влияла на массу тела мыши. Уровни глюкозы, триглицеридов, холестерина и ЛПВП (рис. 1) определяли из сыворотки, взятой при умерщвлении мышей. Четыре экспериментальные группы, получавшие HFD, были обработаны подкожно осмотическими мининасосами, загруженными следующим образом: DDW + 2% Tween 80 (носитель), пуникалагин (70  мк г/кг массы тела), кверцетин (140  мк г/кг массы тела). или аторвастатин (15 мг/кг массы тела).Значения уровня глюкозы, триглицеридов, холестерина и ЛПВП в сыворотке после введения лечения сравнивали с контрольной группой (мыши, получавшие нормальную диету), которую не лечили подкожно (не группа). Интересный вывод можно увидеть на рисунке 1(b); введение пуникалагина значительно снижало уровень глюкозы в сыворотке по сравнению с группой, получавшей носитель. Рисунок 1(d) показывает, что, хотя HFD приводил к повышению уровня триглицеридов (), лечение не влияло на уровни триглицеридов в сыворотке. Аторвастатин — известный препарат для снижения уровня холестерина, который ингибирует синтез холестерина в клетках [41].В этом исследовании он использовался в качестве положительного контроля, и, хотя его эффекты не были статистически значимыми, он снижал общий холестерин и ЛПВП в сыворотке (рис. 1(c) и 1(e) соответственно). На рис. 1(с) показана тенденция к повышению (незначительная) уровня общего холестерина при введении физиологического раствора, пуникалагина и кверцетина по сравнению с контролем (не в группе). Уровни ЛПВП повышались при введении HFD () между группой без группы и группой с носителем, рис. 1(e), но ни лечение пуникалагином, ни кверцетином не изменяло уровни ЛПВП (рис. 1(e)).

    3.2. Активность PON1

    Активность PON1 в сыворотке показана на рис. 2. Активность PON1 была снижена в сыворотке мышей, получавших HFD (носитель по сравнению с негруппой, ), и пуникалагин восстанавливал активность PON1 (до негрупповых уровней; приблизительно 8 единиц/мин по сравнению с 5 единиц/мин для группы транспортных средств, ).


    3.3. Противовоспалительные свойства ЛПВП

    Метод CFA выявляет дисфункциональные ЛПВП, показывая результаты, сравнимые с результатами клеточного анализа [20, 42].CFA основан на способности ЛПВП предотвращать окисление DCFH окисленными липидами, что приводит к превращению нефлуоресцентного DCFH в его флуоресцентную форму, DCF. DCFH окислялся под действием PEIPC, так как на этот окисленный фосфолипид приходится более 80% индуцированной ЛПНП хемотаксической активности моноцитов в сокультурах клеток стенки артерии человека (т. к образованию PEIPC) [43]. На фигуре 3 показано, что ЛПВП от мышей HFD, получавших носитель, был в два раза более провоспалительным, чем у мышей, получавших обычную диету.ЛПВП, выделенные из мышей, получавших пуникалагин, обладали значительным противовоспалительным эффектом (значение < 1) по сравнению с группой, получавшей носитель. Что касается кверцетина, его противовоспалительное значение составляло приблизительно 1,0, что не было значительным по сравнению с группой, получавшей носитель.


    4. Обсуждение

    Полифенолы интенсивно исследуются на предмет их антиатерогенных и гипогликемических свойств [4]. Что касается атеросклероза, было показано, что полифенолы уменьшают модификации ЛПНП в сыворотке, перекисное окисление липидов макрофагов, синтез холестерина, площадь атеросклеротического поражения и образование пенистых клеток [21, 44]. Что касается гипогликемии, имеются значительные данные, свидетельствующие о том, что диеты, богатые полифенолами, обладают способностью защищать от диабета [45, 46]. Хотя полезные для здоровья свойства как кверцетина, так и пуникалагина хорошо изучены, основные механизмы действия связаны с большой неопределенностью. В целом наблюдается тенденция объяснять антиатерогенные эффекты полифенолов их антиоксидантной активностью, хотя концентрации полифенолов в крови едва достигают уровня, необходимого для такой активности (10–100  мкМ М) [12].Недавние исследования показали, что клеточные эффекты полифенолов опосредованы их взаимодействием со специфическими внутриклеточными элементами или белками плазмы [19]. Исследования в нашей лаборатории показали, что связывание полифенола глабридина с PON1 предотвращает ингибирование фермента гидропероксидом линолевой кислоты [16]. Более того, пуникалагин, но не кверцетин или другие полифенолы, связывается с ЛПНП и индуцирует его приток в макрофаги без образования пенистых клеток. Это можно предположить как механизм, снижающий концентрацию холестерина в крови и замедляющий развитие атеросклероза [39].Настоящее исследование направлено на подтверждение этого последнего вывода и изучение биологических функций пуникалагина и кверцетина в отношении уровней глюкозы и липидов, активности PON1 и воспаления в сыворотке мышей с гиперлипидемией. Мышей кормили HFD в течение 12 недель, а в течение последних 4 недель они также получали лечение с помощью мининасоса, который выпускал физиологические концентрации каждой молекулы ежедневно в течение 28 дней. Важно было поддерживать суточные дозы полифенолов в сыворотке мышей на уровне не более 2  мк М, что близко к приблизительной концентрации полифенолов в сыворотке крови человека [47, 48] и ниже концентрации, при которой полифенолы было показано, что они действуют по классическому механизму антиоксидантной активности [12, 49, 50].В конце периода лечения мышей умерщвляли, а клинические параметры измеряли, определяли количественно и сравнивали (рис. 1). Поскольку полифенолы активно метаболизируются в тонком кишечнике, печени и толстой кишке [51, 52], их вводили в кровоток с помощью имплантированных подкожно осмотических мининасосов, что обеспечивало воздействие тестируемых молекул в предсказуемое время каждый день без повторяющихся графиков инъекций. Этот метод защищает мышей от чрезмерного стресса и обеспечивает стабильные и надежные результаты.Более того, альтернатива п/к лучше, чем альтернатива пищеварительной системы, поскольку полифенолы активно катаболизируются в тонком кишечнике, печени и толстой кишке [12], что затрудняет контроль их концентрации в сыворотке при приеме с пищей. Это первый случай, когда этот тип введения был использован для полифенолов, и это позволило нам точно определить их влияние на уровни глюкозы и липидов, а также на состояние воспаления и антиатерогенные уровни белка PON1 in vivo.

    Изучаемые полифенолы не оказывали существенного влияния на уровень ЛПВП, холестерина или триглицеридов.Этот вывод согласуется с тем фактом, что среди множества исследований in vitro и in vivo, связанных с пуникалагином и кверцетином, очень немногие показывают какое-либо влияние на уровни ЛПНП, ЛПВП, общего холестерина или триглицеридов в сыворотке. Большинство исследований подчеркивают дополнительные антиатерогенные параметры этих полифенолов, такие как их способность ослаблять накопление холестерина в макрофагах, уменьшать толщину сонных артерий, уменьшать количество пенистых клеток в очагах поражения и уменьшать модификации ЛПНП [5–7, 9, 17, 44, 53, 54].В последнее время исследования были сосредоточены на качестве ЛПВП в кровотоке, а не на его количестве. ЛПВП подразделяют на подклассы, различающиеся по плотности, размеру, содержанию и электрофоретической подвижности, а их гетерогенность влияет на их функцию [55]. Например, структурно-функциональный анализ показал, что атерозащитные функции ЛПВП в основном связаны с более мелкими, плотными и богатыми белками ЛПВП [22]. PON1 является наиболее важным ферментом, связанным с антиоксидантными и антиатерогенными ЛПВП, ответственными за многие преимущества ЛПВП; корреляции между PON1, HDL и атеросклерозом хорошо известны как in vivo, так и in vitro [26, 56].Эпидемиологические данные показывают, что низкая активность PON1 связана с повышенным риском сердечно-сосудистых событий и сердечно-сосудистых заболеваний [29, 34]. Здесь и кверцетин, и пуникалагин повышали активность PON1 (значительным был только эффект пуникалагина) (рис. 2).

    Польза пищевых полифенолов при диабете 2 типа заключается в защите β -клеток поджелудочной железы от токсичности глюкозы, противовоспалительных и антиоксидантных действиях, ингибировании α -амилаз или α -глюкозидаз и, таким образом, снижении усвоения крахмала. , и ингибирование образования конечных продуктов гликирования [45].Недавнее исследование показало, что добавки с кожурой граната приводят к повышению уровня инсулина [57]. Поэтому наш вывод о том, что введение пуникалагина мышам HFD значительно снижает уровень глюкозы в их сыворотке (рис. 1(b)), очень важен. Мы обнаружили корреляцию между активностью лактоназы PON1 в сыворотке и концентрацией глюкозы в сыворотке: последняя увеличивалась у мышей, получавших HFD, по сравнению с негруппой, тогда как активность лактоназы PON1 у них значительно снижалась. Интересно, что в группе, получавшей пуникалагин, наблюдалось снижение концентрации глюкозы в сыворотке крови, параллельное повышению активности лактоназы в сыворотке (оба статистически значимые), как и в группе, не принимавшей пуникалагин. Эти результаты демонстрируют корреляцию между активностью лактоназы PON1 и уровнем глюкозы в сыворотке, что требует дальнейшего изучения, особенно в свете недавних отчетов об исследованиях с участием различных этнических групп, которые показали снижение активности PON1, связанное с диабетом [32–37].

    Противовоспалительный потенциал пуникалагина и кверцетина хорошо изучен [58, 59]. Хотя в этом исследовании противовоспалительная активность кверцетина не была статистически значимой, он проявлял высокоэффективные противовоспалительные свойства.Известный противовоспалительный потенциал кверцетина проявляется в различных типах клеток как на животных, так и на человеческих моделях. Он также играет модулирующую, двухфазную и регулирующую роль в воспалении и иммунитете [1]. Пуникалагин, однако, показал значительный противовоспалительный эффект в отношении ЛПВП, выделенных из сыворотки мышей, которым вводили пуникалагин с помощью мининасоса. Кроме того, ЛПВП, выделенные от мышей, получавших аторвастатин, показали значительный противовоспалительный эффект, что и ожидалось [41].

    Настоящее исследование показывает, что, хотя уровень ЛПВП не снижался при введении пуникалагина, его биологическая активность (качество) улучшалась, что отражалось в его противовоспалительных свойствах и активности связанного с ним PON1.Подкожное введение пуникалагина мышам, получавшим HFD, одновременно снижало уровень глюкозы в кровотоке и увеличивало активность PON1.

    Мы предлагаем дополнительный механизм благотворного воздействия полифенолов на ЛПВП, помимо классически предполагаемой антиоксидантной активности. Поскольку гипогликемический, противовоспалительный и антиатерогенный эффекты были продемонстрированы при небольших физиологических концентрациях полифенолов, мы предполагаем, что вместо прямого антиоксидантного действия механизмы, с помощью которых полифенолы проявляют эти полезные свойства, включают их взаимодействие с клеточными сигнальными путями и клетками и клетками. белков сыворотки, которые опосредуют клеточную функцию.Поэтому необходимы дальнейшие исследования влияния полифенолов на химическую и биологическую активность ЛПВП и лежащие в их основе механизмы.

    Сокращения 9062
    LDL: LiDL LipoProtein
    High-FipoRotein
    PON1: PARAOOXONASE 1
    SC: Подкожный
    ДМСО: Диметилсульфоксид PALMITOYL-2-ARACHIDONOYL- SN -GLECERO-3-PHOSPHORYLCHOLINE
    DCFH-DA: Dichloro-Dihydro-флуореоресцеин диацетат
    PEIPC: 1-PALMITOYL-2- (5,6-EPOXYISOROSTANE E2) — SN -GLECERO-3-PHOSPHOCHOCHOLINE
    BW: Вес тела
    IP: INTRABLYITONEAL
    PBS: Фосфатно-солевой буфер
    DCF: Дихлорфлуоресцеин
    CFA: Cell91-free assay 6
    DCFH: Дигидродихлорфлуоресцеин
    HFD: Диета с высоким содержанием жиров.
    Доступность данных

    Данные, использованные для поддержки результатов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

    Благодарности

    Авторы выражают благодарность доктору Цури Лифшиц и профессору Бернарду Лереру за умелое управление и проведение экспериментов in vivo в лаборатории биологической психиатрии Медицинского центра Хадасса, Иерусалим

    , Израиль.

    Пуникалагин, соединение граната, вызывает апоптоз и аутофагию при остром лейкозе [PeerJ]

    Введение

    Лейкемия характеризуется повышенной продукцией гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, что приводит к нарушению гемопоэза (Davis, Viera & Mea, 2014). В 2020 году в США было зарегистрировано 60 530 новых случаев лейкемии и 23 100 случаев смерти (Siegel, Miller & Jemal, 2020). Лечение лейкемии включает химиотерапию, трансплантацию стволовых клеток и целенаправленное лечение заболевания (Greaves, 2016).Химиотерапия, предназначенная для уменьшения количества лейкемических клеток, имеет различные побочные эффекты, включая тошноту, выпадение волос и изменение аппетита (Ramirez et al. , 2009). Рецидив заболевания может быть связан с традиционной химиотерапией (Yilmaz et al., 2019). Поэтому особое внимание уделяется развитию альтернативной медицины с использованием натуральных соединений и трав для повышения терапевтической эффективности (Hwang et al., 2019; Saedi et al., 2014).

    Пуникалагин (рис. 1) является основным активным соединением, присутствующим в кожуре граната (Khwairakpam et al., 2018). Он проявляет антиоксидантную (Abid et al., 2017), антибактериальную (Xu et al., 2017), противовирусную (Lin et al., 2013) и противовоспалительную активность (BenSaad et al., 2017). Существует некоторая озабоченность по поводу биодоступности и концентрации пуникалагина, и было проведено исследования биодоступности in vivo (Espín et al., 2007). Эллаговая кислота является продуктом гидролиза пуникалагина, который метаболизируется микрофлорой кишечника вместе с оставшимся пуникалагином с образованием уролитинов.Затем метаболиты поглощаются клетками кишечника и циркулируют в кровотоке (Espín et al., 2007; Vora, Londhe & Pandita, 2015). Пероральное потребление пуникалагина крысами показало, что пуникалагин присутствует в плазме в концентрациях приблизительно 30 мкг/мл (Cerdá et al., 2003).

    Рисунок 1: Химическая структура пуникалагина.

    Сообщается, что пуникалагин обладает противоопухолевыми свойствами в отношении различных линий раковых клеток, включая рак толстой кишки (Larrosa, Tomás-Barberán & Espín, 2006), яичников (Tang et al., 2016), раковых клеток простаты (Adaramoye et al., 2017) и легких (Berköz & Krośniak, 2020) за счет ингибирования пролиферации и индукции остановки клеточного цикла и апоптоза. In vivo пуникалагин продемонстрировал антиангиогенный эффект за счет ингибирования роста кровеносных сосудов в хориоаллантоисной мембране цыплят (Adaramoye et al., 2017). Было показано, что пуникалагин обладает противолейкозной активностью, подавляя пролиферацию и стимулируя апоптоз лейкозных клеток HL-60 посредством активации каспазы-3 (Chen et al., 2009). Экстракты гранатового сока и кожуры содержат пуникалагин, который отвечает за индукцию апоптоза, остановку клеточного цикла S-фазы и ингибирование пролиферации клеток CCRF-CEM, MOLT-3, HL-60 и THP-1 (Dahlawi et al., 2013). ; Тамборлин и др., 2020).

    Индукция гибели клеток посредством апоптоза, аутофагии и некроза является ключевым фактором в терапии рака (Mishra et al., 2018). Было показано, что пуникалагин активирует внутренний путь апоптоза посредством подавления Bcl-XL и активации каспазы-9 и каспазы-3 в клетках толстой кишки Caco-2.Активация внешнего пути через активацию каспазы-8 и каспазы-3 в клетках предстательной железы PC-3 также может вызывать апоптоз (Adaramoye et al., 2017; Larrosa, Tomás-Barberan & Espín, 2006). Пуникалагин также был способен вызывать апоптозную гибель клеток за счет ингибирования сигнальных путей β-катенина и NF-κB в клетках HeLa и ME-180 соответственно (Tang et al., 2017; Zhang et al., 2020a). Предыдущие исследования показали, что пуникалагин также может вызывать аутофагию (Cheng et al., 2016; Ван и др., 2013). Активация конверсии LC3-II, экспрессии беклина-1 и деградации р62 с помощью пуникалагина может запускать аутофагию в клетках папиллярной карциномы щитовидной железы BCPAP (Cheng et al., 2016). Применение пуникалагина приводило к индукции апоптоза и аутофагии в клетках глиомы U87MG (Wang et al., 2013). Однако механизм пуникалагина, способствующего апоптотической и аутофагической гибели клеток в лейкемических клетках, неизвестен.

    Мы исследовали механизм индукции апоптоза и аутофагии пуникалагином в лейкозных клетках NB4 и MOLT-4.Мы продемонстрировали, что пуникалагин ингибирует пролиферацию клеток и вызывает гибель клеток посредством механизмов апоптоза и аутофагии. Лечение пуникалагином приводило к активации каспазы-3/-8/-9, изменению Bax и Bcl-2 и регуляции передачи сигналов mTOR/ULK1 для индукции апоптоза и аутофагии.

    Материалы и методы

    Культура лейкемических клеток

    NB4 (клеточная линия острого промиелоцитарного лейкоза) и MOLT-4 (клеточная линия острого лимфоцитарного лейкоза) были приобретены в Cell Lines Service (Eppelheim, Германия).Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 1% антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) и 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (Gibco Life Technologies, Уолтем, Массачусетс, США) при 37 °C с 5% CO 2 .

    Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)

    Образцы крови человека были собраны с этического одобрения Центрального институционального наблюдательного совета Университета Махидол (MU-CIRB) (разрешение № MU-CIRB 2019/310.2911), и от всех участников исследования было получено письменное информированное согласие.Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием Lymphoprep™ (Alere Technology AS, Осло, Норвегия). Образцы крови разводили фосфатно-солевым буфером (PBS) в соотношении 1:1, разбавленную кровь наслаивали на Lymphoprep, затем центрифугировали в течение 30 мин при 800 g. РВМС дважды промывали средой после сбора.

    Анализ жизнеспособности клеток с помощью анализа MTS

    лейкозных клеток (1×10 4 клеток/лунку) обрабатывали различными концентрациями пуникалагина (25, 50, 75 и 100 мкг/мл; Sigma-Aldrich, Шнельдорф, Германия).Пуникалагин растворяли в деионизированной воде. Мы инкубировали 20 мкл раствора для анализа пролиферации клеток Cell Titer 96 (Promega Corp., Мэдисон, Висконсин, США) в течение 24 и 48 часов, затем добавляли раствор в лунки и инкубировали образцы при 37 °C в течение 4 часов. Поглощение формазанового продукта измеряли при 490 нм с использованием спектрофотометра с программным обеспечением для анализа GEN5™ (BioTek Instruments, Inc., Винуски, штат Вирджиния, США). Жизнеспособность клеток оценивали с использованием необработанных клеток в качестве контроля, а затем для дальнейших экспериментов рассчитывали полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC 50 ).

    Лейкемические клетки (1×10 4 клеток/лунку) и РВМС (1×10 5 клеток/лунку) обрабатывали IC 50 концентрацией пуникалагина (60 и 55 мкг/мл в течение 24 и 48 ч, соответственно) и/или IC 50 даунорубицина (0,5 и 0,25 мкг/мл в течение 24 и 48 ч) (TOKU-E, Беллингем, Вашингтон, США) соответственно, чтобы определить синергетическое свойство пуникалагина и даунорубицина. Жизнеспособность клеток определяли с использованием анализа MTS. Для анализа синергетического эффекта пуникалагина и даунорубицина использовали комбинированный индекс (КИ) (Chou & Talalay, 1984).Синергизм, аддитивный эффект и антагонизм обозначаются ДИ < 1, ДИ = 1 и ДИ > 1 соответственно. CI рассчитывается с использованием следующего уравнения: Комбинированный индекс CI=D1Dχ1+D2Dχ2

    , где (D)1 и (D)2 представляют собой концентрации первого соединения и второго соединения, при которых достигается X% ингибирования в комбинации; (D х )1 и (D х )2 представляют собой концентрации первого соединения (отдельно) и второго соединения (отдельно), соответственно, которые дают одинаковый эффект.

    Анализ апоптоза клеток с помощью окрашивания аннексином V-FITC/PI

    Количество

    апоптотических клеток определяли с использованием набора для анализа аннексина V (BD Biosciences, Пало-Альто, Калифорния, США). Клетки (1×10 5 клеток/лунку) обрабатывали IC 50 концентрацией пуникалагина (55 мкг/мл) в течение 48 ч, а затем дважды промывали PBS. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере для связывания перед окрашиванием аннексином V/FITC и йодидом пропидия (PI) в течение 15 мин в темноте.Были собраны данные по 10 000 событий на образец, и апоптотические клетки были измерены с использованием проточного цитометра FACScantoII (BD Biosciences).

    Анализ индукции аутофагии окрашиванием анти-LC3/FITC антителами

    Набор Guava ® Autophagy LC3 Antibody Detection Kit (Luminex Corporation, Остин, Техас, США) использовали для определения пуникалагин-индуцированной аутофагии. Клетки обрабатывали 55 мкг/мл пуникалагина в течение 48 ч, а затем инкубировали с разведенным реагентом А для аутофагии, который является ингибитором лизосом.Клетки центрифугировали и ресуспендировали в реагенте для аутофагии В. Клетки окрашивали антителами против LC3, конъюгированными с FITC. Средняя интенсивность флуоресценции LC3-II может быть использована для количественного определения аутофагосом, и это было измерено с помощью проточной цитометрии.

    Определение экспрессии генов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR)

    Лейкемические клетки обрабатывали пуникалагином в концентрации IC 50 в течение 48 часов. Суммарную РНК экстрагировали реагентом Genezol™ (New England Biolab, Inc., Ипсвич, Массачусетс, США) в соответствии с рекомендациями производителя. кДНК первой цепи синтезировали путем обратной транскрипции 2 мкг матричной РНК с использованием набора для синтеза кДНК первой цепи RevertAid (Themo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Затем кДНК амплифицировали с помощью мастер-микса ПЦР в реальном времени Luna (New England Biolan Inc., Ипсвич, Массачусетс, США). Праймеры были разработаны на основе обзоров литературы, а их качество было определено по базе данных BLASTN (Chatupheeraphat et al., 2020; Deesrisak et al., 2021).Последовательности праймеров показаны в таблице 1. ПЦР в реальном времени проводили с использованием термоцикла Bio-Rad CX1000 (Bio-Rad, Inc., Геркулес, Калифорния, США). Экспрессию мРНК нормализовали до внутреннего контроля GAPDH. Экспрессию гена рассчитывали по методу 2 -ΔΔct (Livak & Schmittgen, 2001).

    Таблица 1:

    Последовательность праймеров, используемых в этом исследовании.

    Грунтовки Последовательность
    Каспаза-3 F: 5′-TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC-3′
    R: 5′-CAAGCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-3′
    Каспаза-8 F: 5′-GATCAAGCCCCACGATGAC-3′
    R: 5′-CCTGTCCATCAGTGCCATAG-3′
    Каспаза-9 F: 5′-CATTTCATGGTGGAGGTGAAG-3′
    R: 5′-GGGAACTGCAGGTGGCTG-3′
    Бакс F: 5′-CGAGGTCTTTTTCCGAGTG-3′
    R: 5′-GTGGGCGTCCCAAAGTAGG-3′
    Бкл-2 F: 5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3′
    R: 5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3′
    мТОР F: 5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3′
    R: 5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′
    УЛК1 F: 5-‘GGCAAGTTCGAGTTCTCCCG-3’
    R: 5′-CGACCTCCAAATCGTGCTTCT-3′
    ГАПДХ F: 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′
    R: 5′-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3′
    ДОИ: 10.7717/peerj.12303/стол-1

    Построение сетей белково-химических взаимодействий методом биоинформатического анализа

    Сеть взаимодействия между пуникалагином и его белками-мишенями была предсказана с использованием базы данных STITCH. Исходные данные для анализа состояли из пуникалагина, апоптотических белков (CASP3, CASP8, CASP9, BAX и BCL2) и аутофагических белков (MTOR и ULK1) для Homo sapiens со средней достоверностью (0,400).

    Статистический анализ

    Эксперименты проводились трижды.Данные были выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Результаты между двумя группами были проанализированы с использованием теста Стьюдента t , а сравнения более чем двух групп были выполнены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием SPSS (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Статистически значимой разницей считали p -значение <0,05.

    Результаты

    Влияние пуникалагина на пролиферацию лейкемических клеток

    лейкемических клетки (NB4 и MOLT-4) обрабатывали различными концентрациями пуникалагина (25, 50, 75 и 100 мкг/мл) в течение 24 и 48 часов для изучения влияния пуникалагина на жизнеспособность клеток.Их жизнеспособность проверяли с помощью анализа MTS. Пуникалагин значительно снижал жизнеспособность клеток NB4 и MOLT-4 дозозависимым образом (рис. 2А и 2В). Сравнительные результаты между клетками, обработанными пуникалагином, и контрольными клетками представлены в таблице 2. IC50 50 пуникалагина составила 57,1 и 53,5 мкг/мл в клетках NB4 через 24 и 48 ч обработки, а также 65,7 и 58,9 мкг/мл. в клетках MOLT-4 через 24 и 48 ч обработки соответственно. Значение IC 50 через 48 часов было выбрано для дальнейшего эксперимента, так как оно показало более высокий цитотоксический эффект по сравнению с 24 часами.Результаты показали, что пуникалагин ингибирует лейкозные клетки NB4 и MOLT-4.

    Рисунок 2: Пуникалагин подавляет жизнеспособность лейкозных клеток.
    (A) NB4 и (B) лейкемические клетки MOLT-4 обрабатывали различными концентрациями пуникалагина в течение 24 и 48 часов. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа MTS. * p  < 0,05 считалось статистически значимым отличием от контроля. Таблица 2:

    Сравнительная статистика жизнеспособности клеток, обработанных пуникалагином, и контрольных клеток.

    Группа % Жизнеспособность клеток NB4
    (среднее ± SEM)
    р -значение Группа % Жизнеспособность клеток MOLT-4
    (среднее ± S.ЕМ)
    р -значение
    Круглосуточно
    Управление 100,00 ± 0,00 Управление 100,00 ± 0,00
    Пуникалагин
    (мкг/мл)
    25 77.50 ± 1,26 0,2190 Пуникалагин
    (мкг/мл)
    25 86,42 ± 3,22 0,3743
    50 54,13 ± 2,39 0,0058 50 73.17 ± 8,22 0,0238
    75 31,02 ± 8,81 0,0003 75 40,83 ± 6,99 0,00007
    100 17.37 ± 2,21 0,00005 100 16,53 ± 0,56 0,000003
    48 ч
    Управление 100,00 ± 0,00 Управление 100.00 ± 0,00
    Пуникалагин
    (мкг/мл)
    25 79,06 ± 1,26 0,1234 Пуникалагин
    (мкг/мл)
    25 78,66 ± 1,92 0,0175
    50 48.07 ± 8,85 0,0004 50 61,56 ± 5,81 0,0002
    75 30,62 ± 7,91 0,00003 75 34,29 ± 5,65 0.0000019
    100 8,65 ± 2,78 0,000003 100 14,17 ± 1,68 0,0000002
    DOI: 10.7717/peerj.12303/таблица-2

    Влияние комбинации пуникалагина и даунорубицина на лейкемические клетки

    Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа MTS для определения эффекта пуникалагина в сочетании с химиотерапевтическим препаратом.Клетки NB4 и MOLT-4 сначала обрабатывали 0,25, 0,5, 0,75 и 1 мкг/мл химиотерапевтического препарата даунорубицин, а затем инкубировали в течение 24 и 48 часов. Даунорубицин снижал жизнеспособность клеток NB4 и MOLT-4 дозозависимым образом (рис. 3А и 3В). Сравнение жизнеспособности клеток лейкемических клеток, обработанных даунорубицином, и контрольных клеток представлено в таблице 3. Затем NB4 и MOLT-4 обрабатывали IC 50 пуникалагина, даунорубицина отдельно или комбинации обоих соединений в течение 24 и 48 часов. .Комбинация пуникалагина и даунорубицина значительно снижала жизнеспособность клеток по сравнению с лечением только пуникалагином или даунорубицином (рис. 4). Также оценивали влияние на РВМС. Эта комбинация значительно снижала жизнеспособность клеток РВМС, но имела меньший эффект, чем лейкозные клетки NB4 и MOLT-4. Сравнительный статистический анализ (значение p ) результатов комбинации был представлен в таблице 4, и для определения синергетического эффекта пуникалагина и даунорубицина использовали ДИ.Результаты показали, что CI клеток NB4 после 48 часов обработки и клеток MOLT-4 после 24 и 48 часов обработки составляли 0,80, 0,94 и 0,81 соответственно, что представляет собой синергетический эффект. Однако ДИ клеток NB4 через 24 ч обработки составил 1,02, что указывает на аддитивный эффект. Эти результаты позволяют предположить, что пуникалагин усиливает цитотоксичность даунорубицина в отношении NB4 и MOLT-4.

    Рисунок 3: Влияние даунорубицина на жизнеспособность клеток в лейкозных клеточных линиях.
    (A) NB4 и (B) лейкемические клетки MOLT-4 обрабатывали различными концентрациями даунорубицина в течение 24 и 48 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа MTS. * p  < 0,05 считалось статистически значимым отличием от контроля. Таблица 3:

    Статистический анализ жизнеспособности клеток между обработанными даунорубицином лейкозными клетками и контрольными клетками.

    Группа % Жизнеспособность клеток NB4
    (среднее ± S.ЕМ)
    р -значение Группа % Жизнеспособность клеток MOLT-4
    (среднее ± SEM)
    р -значение
    Круглосуточно
    Управление 100.00 ± 0,00 Управление 100,00 ± 0,00
    Даунорубицин (мкг/мл) 0,25 77,31 ± 5,55 0,0095 Даунорубицин (мкг/мл) 0.25 84,85 ± 1,35 0,021
    0,5 47,99 ± 5,58 0,0000121 0,5 53,14 ± 1,61 0,0000025
    0.75 33,27 ± 1,21 0,0000012 0,75 40,79 ± 4,74 0,0000003
    1,0 30,60 ± 0,93 0,0000008 1.0 32,40 ± 3,45 0,0000001
    48 ч
    Управление 100,00 ± 0,00 Управление 100,00 ± 0,00
    Даунорубицин (мкг/мл) 0.25 52,61 ± 6,92 0,0001 Даунорубицин (мкг/мл) 0,25 61,04 ± 3,57 0,0000876
    0,5 22,35 ± 6,57 0.0000012 0,5 22,37 ± 6,53 0,0000001
    0,75 15,94 ± 0,44 0,0000006 0,75 15,99 ± 1,53 0.0000001
    1,0 14,75 ± 0,06 0,0000005 1,0 14,27 ± 1,13 0,0000001
    DOI: 10.7717/peerj.12303/таблица-3
    Рисунок 4: Синергический эффект пуникалагина и даунорубицина.
    NB4, MOLT-4 и мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обрабатывали IC 50 пуникалагина с даунорубицином или без него в течение (A) 24 ч и (B) 48 ч. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа MTS. * p  < 0,05 расценивали как статистически значимое различие, существенно отличающееся от лечения только пуникалагином или даунорубицином.

    Пуникалагин индуцирует апоптоз в лейкемических клетках

    Для определения влияния пуникалагина на апоптоз лейкемических клеток клетки NB4 и MOLT-4 обрабатывали пуникалагином в концентрации IC 50 .Процент апоптотических клеток измеряли с помощью окрашивания аннексином V-FITC/PI через 48 ч инкубации. Пуникалагин значительно увеличивал общий процент апоптотических клеток в NB4 и MOLT-4 по сравнению с необработанными клетками, как показано на рис. 5A–5C ( p = 0,0003 и 0,0000001 соответственно). Результаты показывают, что пуникалагин индуцирует апоптоз в клетках NB4 и MOLT-4.

    Пуникалагин повышал уровень LC3-II для индукции аутофагии

    Лейкемические клетки

    NB4 и MOLT-4 обрабатывали IC 50 пуникалагина в течение 48 ч для оценки влияния пуникалагина на аутофагию.Для выявления аутофагической активности использовали внутриклеточное окрашивание аутофагосом. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) LC3-II, которая количественно определяет аутофагосомы, анализировали с помощью окрашивания антителом против LC3, конъюгированным с FITC. Результаты показали, что пуникалагин значительно увеличивал MFI LC3-II в NB4 и MOLT-4 по сравнению с контролем (рис. 6A–6C) ( p = 0,00002 и 0,00002 соответственно). Результаты позволяют предположить, что пуникалагин индуцировал аутофагию в клетках NB4 и MOLT-4.

    Таблица 4:

    Сравнительная статистика результата комбинации.

    Сотовый Группа 24 часа 48 ч
    % Жизнеспособность клеток
    (среднее значение ± S.ЕМ)
    р -значение % Жизнеспособность клеток
    (среднее ± SEM)
    р -значение
    НБ4 Комбинация и 29,66 ± 2,605 0.028 20,26 ± 0,358 0,044
    Пуникалагин (ИК 50 ) 56,01 ± 7,332 52,78 ± 7,044
    Комбинация и 29,66 ± 2,605 0.044 20,26 ± 0,358 0,011
    Даунорубицин (IC 50 ) 48,33 ± 5,885 52,69 ± 3,458
    МОЛТ-4 Комбинация и 30,67 ± 3.995 0,039 25,51 ± 2,786 0,008
    Пуникалагин (ИК 50 ) 54,28 ± 6,744 58,59 ± 6,038
    Комбинация и 30.67 ± 3,995 0,009 25,51 ± 2,786 0,002
    Даунорубицин (IC 50 ) 53,18 ± 2,488 54,30 ± 2,607
    РВМС Комбинация и 63.43 ± 2,149 0,002 67,53 ± 4,966 0,016
    Пуникалагин (ИК 50 ) 85,24 ± 2,306 90,25 ± 2,742
    Комбинация и 63.43 ± 2,149 0,032 67,53 ± 4,966 0,045
    Даунорубицин (IC 50 ) 83,59 ± 5,868 88,74 ± 5,476
    РВМС Комбинация и 63.43 ± 2,149 0,001 67,53 ± 4,966 0,001
    НБ4 29,66 ± 2,605 20,26 ± 0,358
    РВМС Комбинация и 63.43 ± 2,149 0,002 67,53 ± 4,966 0,002
    МОЛТ-4 30,67 ± 3,995 25,51 ± 2,786
    DOI: 10.7717/peerj.12303/таблица-4
    Рисунок 5: Влияние пуникалагина на ранние и поздние апоптотические клетки.
    Клетки NB4 и MOLT-4 обрабатывали IC 50 пуникалагина в течение 48 ч и процент апоптотических клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. Графики рассеяния клеток, окрашенных аннексином V-FITC/PI (A) NB4 и (B) MOLT-4, обрабатывали пуникалагином или без него. (C) Количественные результаты ранних и поздних апоптотических клеток. Данные были выражены как среднее ± SEM трех независимых экспериментов. * p  < 0,05 считалось статистически значимым отличием от контрольной группы.
    Рисунок 6: Пуникалагин способствует аутофагии за счет повышения уровня LC3-II.
    (A) Клетки NB4 и (B) MOLT-4 обрабатывали IC 50 пуникалагина в течение 48 ч и анализировали LC3-II MFI с использованием проточной цитометрии. (C) Количественный результат уровня LC3-II. * p  < 0,05 считалось статистически значимым отличием от контрольной группы.

    Пуникалагин регулирует экспрессию генов апоптоза и аутофагии в лейкозных клетках NB4 и MOLT-4

    Мы исследовали изменение экспрессии апоптотической мРНК, каспазы-3, каспазы-8, каспазы-9, Bax и Bcl-2, а также аутофагической экспрессии мРНК mTOR и ULK1, чтобы исследовать механизм, участвующий в индукции апоптоза и аутофагии под действием пуникалагина.Клетки NB4 и MOLT-4 обрабатывали IC 50 пуникалагина в течение 48 ч, что приводило к значительному увеличению экспрессии мРНК каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9 ( p  = 0,023, 0,00001 и 0,019 для NB4; p = 0,022, 0,026 и 0,01 для МОЛТ-4 соответственно). Эти результаты указывают на активацию каспазы, как показано на фиг. 7А. Семейство В-клеточной лимфомы 2 (Bcl-2) представляет собой регулятор апоптоза, состоящий как из проапоптотических генов, таких как Bax, так и из антиапоптотических генов, таких как Bcl-2.Результаты показали, что пуникалагин повышал экспрессию Bax ( p = 0,001 для NB4; p = 0,00009 для MOLT-4) и подавлял экспрессию Bcl-2 ( p = 0,023 и 0,036 для NB4 и MOLT-4). 4 соответственно), как показано на фиг. 7B. Более того, экспрессия мРНК mTOR была значительно снижена ( p = 0,002 и 0,002 для клеток NB4 и MOLT-4 соответственно), тогда как экспрессия мРНК ULK1 значительно увеличилась ( p = 0,036 для NB4; p = 0.045 для MOLT-4) в клетках, обработанных пуникалагином (рис. 7С).

    Рисунок 7: Влияние пуникалагина на экспрессию мРНК генов апоптоза и аутофагии.
    Лейкемические клетки обрабатывали IC 50 пуникалагина в течение 48 часов. Экспрессию мРНК генов (A) семейства каспаз, (B) семейства Bcl-2, а также (C) ULK1 и mTOR определяли с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией. * p  < 0,05 считалось статистически значимым отличием от контрольной группы.

    Прогноз белково-химических взаимодействий

    Белково-химические взаимодействия были получены из баз данных STITCH, и результаты показали взаимодействие между пуникалагином и родственными белками. Анализ показал, что пуникалагин связан с белками, которые играют роль в индукции апоптоза (CASP3, CASP8, CASP9, BAX, BCL2, BCL2L11 и APAF1) и передаче сигналов mTOR в регуляции аутофагии (MTOR, ULK1, RPTOR, RICTOR, RPS6KB1, MLST8, EIF4EBP1, FKBP1A и MAPKAP1) через циклооксигеназу-2 (PTGS2) и толл-подобный рецептор 4 (TLR4) (фиг.8). Мы определили, что каспаза-3/-8/-9, Bax, Bcl-2 и mTOR и ULK1 играют роль в сигнальных путях апоптоза и аутофагии при лечении пуникалагином.

    Рисунок 8: Построение белково-химического взаимодействия с использованием STITCH.
    Взаимодействия между белком и химическими веществами представлены зелеными линиями, а белок-белковые взаимодействия представлены серыми линиями. Более сильные ассоциации показаны более толстыми линиями. CASP3, каспаза-3; CASP8, каспаза-8; CASP9, каспаза-9; BAX, белок X, ассоциированный с BCL2; BCL2, В-клеточный ХЛЛ/лимфома; MTOR, механистическая мишень рапамицина; ULK1, unc-51-подобная киназа 1; PTGS2, простагландин-эндопероксидсинтаза 2 или циклооксигеназа 2; TLR4, толл-подобный рецептор 4; RPTOR, регуляторно ассоциированный белок MTOR; РИКТОР, РПТОР независимый компаньон МТОР; RPS6KB1, рибосомальная протеинкиназа S6; MLST8, белок, ассоциированный с MTOR; AKT1, v-akt гомолог вирусного онкогена тимомы мышей; EIF4EBP1, эукариотический фактор инициации трансляции 4E, связывающий белок 1; FKBP1A, FK506-связывающий белок 1А; MAPKAP1, белок 1, ассоциированный с митоген-активируемой протеинкиназой; APAF1, фактор активации апоптотической протеазы 1; BCL2L11, BCL2-подобный 11.

    Обсуждение

    Пуникалагин — основное полифенольное соединение, содержащееся в гранате. Сообщается, что он обладает рядом биологических свойств, включая антиоксидантные (Abid et al., 2017), противовоспалительные (BenSaad et al., 2017) и противораковые свойства (Adaramoye et al., 2017; Berköz & Krośniak, 2020; Larrosa, Tomás- Barberán & Espín, 2006; Tang et al., 2016). Мы изучили противолейкемические эффекты пуникалагина и механизм, лежащий в основе индукции апоптоза и аутофагии на лейкозных клетках NB4 и MOLT-4.Пуникалагин подавлял пролиферацию клеток NB4 и MOLT-4. Цитотоксический эффект пуникалагина проявлял незначительное увеличение на NB4 по сравнению с клетками MOLT-4. В этом исследовании также было обнаружено, что пуникалагин проявляет синергический эффект с даунорубицином. Комбинация улучшала цитотоксическое действие на лейкемические клетки при низкой цитотоксичности на здоровых РВМС. Также сообщалось, что пуникалагин оказывает слабое антипролиферативное действие на РВМС по сравнению с лейкемическими клетками HL-60 (Chen et al., 2009).Было показано, что натуральные продукты в сочетании с химиотерапевтическими препаратами уменьшают побочные эффекты и улучшают терапевтические эффекты химиотерапевтических препаратов при лечении рака (Zhang et al., 2020b). Было показано, что пуникалагин усиливает цитотоксичность даунорубицина, что позволяет предположить, что пуникалагин можно использовать в сочетании с обычными химиотерапевтическими препаратами. Механизм действия пуникалагина и даунорубицина до сих пор не ясен. Даунорубицин способен интеркалировать нити ДНК, ингибируя синтез ДНК и РНК и фермент топоизомеразу II, а также продуцировать активные формы кислорода (АФК), что приводит к повреждению ДНК и апоптозу (Al-Aamri et al., 2019). Возможно, механизм пуникалагина в индукции апоптоза может функционировать через каспазный путь и аутофагию через путь mTOR/ULK1. Результаты комбинированного лечения могут быть связаны со сходным каспазным путем. Необходимы дальнейшие исследования побочных эффектов комбинированного лечения пуникалагином и даунорубицином для определения его роли в ингибировании жизнеспособности клеток.

    Апоптоз или запрограммированная гибель клеток I типа характеризуется каспаз-зависимой протеолитической активацией, образованием пузырей на мембране и фрагментацией ДНК.Активация апоптоза уничтожает раковые клетки, и это терапевтический подход к разработке противораковых препаратов (Carneiro & El-Deiry, 2020). Активация каспазы-8 и каспазы-9 играет решающую роль во внешнем и внутреннем пути апоптоза соответственно. Активные каспаза-8 или каспаза-9 дополнительно активируют каспазу-3, что приводит к апоптозу (Mishra et al., 2018). Наши результаты показали, что пуникалагин увеличивал экспрессию мРНК каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9.Более того, белки семейства Bcl-2 являются митохондриальными регуляторами апоптоза, которые могут быть либо проапоптотическими белками, такими как Bax, либо антиапоптотическими белками, такими как Bcl-2 (Mishra et al., 2018). В этом исследовании было показано, что пуникалагин повышает экспрессию мРНК Bax и подавляет экспрессию мРНК Bcl-2. Таким образом, наши результаты показали, что пуникалагин индуцировал апоптоз посредством внутренних и внешних путей апоптоза путем активации каспазы-3/-8-9 и изменения Bax/Bcl-2 в клетках NB4 и MOLT-4.Пуникалагин-индуцированный апоптоз был продемонстрирован в клетках рака толстой кишки Caco-2, предстательной железы PC-3 и шейки матки HeLa (Adaramoye et al., 2017; Larrosa, Tomás-Barberán & Espín, 2006; Zhang et al., 2020a). Сообщалось об индукции апоптоза натуральными продуктами в лейкемических клеточных линиях (Bozok Cetintas et al., 2014; Debnath et al., 2019). Капсаицин является компонентом красного перца чили, который, как было показано, повышает экспрессию членов семейства генов каспаз, активирует активность каспазы-3 и подавляет экспрессию Bcl-2, вызывая апоптоз в клетках CCRF-CEM (Bozok Cetintas et al., 2014). Бромелайн, фермент ананаса, в сочетании с пероксидазой подавлял пролиферацию клеток K562 и стимулировал внутренний путь апоптоза посредством изменения митохондриальной мембраны и регуляции экспрессии белков, связанных с апоптозом, включая Bax, Bcl-2, каспазу- 3 и цитохром с (Debnath et al., 2019).

    Аутофагия играет важную роль в подавлении опухоли за счет устранения поврежденных органелл или белков, ингибирования выживания раковых клеток и индукции гибели клеток.Несколько белков, в том числе AMP-активируемая протеинкиназа (AMPK), мишень рапамицина млекопитающих (mTOR), Unc-51-подобная активирующая аутофагию киназа (ULK), белок, связанный с аутофагией (ATG) и беклин-1, участвуют в регуляция аутофагии (Yun & Lee, 2018). Предыдущие исследования показали, что пуникалагин проявляет противораковую активность через индукцию аутофагии, которая играет роль в гибели раковых клеток (Cheng et al., 2016; Wang et al., 2013). Активация mTOR ингибирует аутофагию, что приводит к стимуляции роста и прогрессирования рака.Так, для терапии рака были разработаны ингибиторы mTOR (Hua et al., 2019). Ингибирование mTOR способствует активации ULK1, которая необходима для индукции аутофагии (Kim et al., 2011). Ресвератрол, полифенольное соединение, содержащееся в ягодах и винограде, вызывает аутофагию, ингибируя mTOR и активируя активность ULK1 (Park et al., 2016). Результаты настоящего исследования показали, что пуникалагин индуцирует аутофагию за счет увеличения экспрессии LC3-II, а также подавления экспрессии mTOR и повышения экспрессии ULK1.Изменения в экспрессии генов могут коррелировать с уровнями белка. Однако экспрессия генов не доказывает существования белков. Было исследовано влияние лечения пуникалагином на экспрессию белка (Ganesan et al., 2020; Wang et al., 2013). Иммуноблот-анализ показал, что экспрессия белка Bcl-2 снижалась, в то время как экспрессия расщепленной каспазы-9 и расщепленной поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP) увеличивалась при лечении пуникалагином. Повышенная экспрессия LC3-II и фосфорилирование AMPK и p27 были связаны с индукцией аутофагии (Wang et al., 2013). Кроме того, с помощью анализа профиля протеома была изучена экспрессия 35 различных белков, связанных с апоптозом/аутофагией. Результаты показали, что измененная экспрессия белка теплового шока (HSP) 27, HSP 60, каталазы, рецептора фактора некроза опухоли 1/члена надсемейства рецептора фактора некроза опухоли 1A (TNFRI/TNFRSF1A), p53, Bax, Bcl-2, Smac /Diablo, HSP 70, p21 и p27 играют роль в активации или ингибировании апоптоза и/или аутофагии в клетках HCT 116, обработанных пуникалагином (Ganesan et al., 2020).

    Взаимодействие между пуникалагином и целевыми белками было построено с использованием биоинформатического инструмента STITCH для лучшего понимания молекулярного механизма апоптоза и аутофагии в ответ на пуникалагин. PTGS2 (циклооксигеназа-2; ЦОГ-2) и толл-подобный рецептор 4 (TLR4) были вовлечены в сеть взаимодействия родственных пуникалагину молекул. ЦОГ-2, провоспалительный фермент, необходимый для синтеза простагландинов, сверхэкспрессируется при воспалительных заболеваниях и раке.ЦОГ-2 увеличивает пролиферацию мутировавших клеток и модулирует запрограммированную гибель клеток, способствуя прогрессированию рака в нескольких моделях рака (Liu, Qu & Yan, 2015; Sobolewski et al., 2010). ЦОГ-2 способен предотвращать апоптоз за счет увеличения экспрессии выживших антиапоптотических белков Mcl-2 и Bcl-2 за счет снижения экспрессии каспазы-3 (Goradel et al., 2019). Подавление ЦОГ-2 связано с аутофагией, приводящей к гибели нейронов (Niranjan, Mishra & Thakur, 2018). В нескольких исследованиях сообщалось о природных соединениях для химиопрофилактики рака, которые потенциально могут подавлять экспрессию ЦОГ-2 (Cerella et al., 2010). Например, куркумин, флавоноид из Curcuma longa , ингибирует ЦОГ-2 и нижележащие гены, что приводит к индукции апоптоза посредством регуляции AMP-активируемой протеинкиназы (AMPK) в клетках рака молочной железы MCF-7 и HT-29. клетки рака толстой кишки (Mortezaee et al., 2019). Кроме того, пуникалагин ингибирует экспрессию белка ЦОГ-2 в клетках рака толстой кишки HT-29 и в мозге мышей (Adams et al., 2006; Kim et al., 2017). Трансмембранные рецепторы Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) играют ключевую роль в воспалительном иммунном ответе (Hao et al., 2018) и присутствовали в сети родственных пуникалагину белков. По сообщениям, экспрессия TLR4 увеличивалась в различных опухолевых клетках, в том числе в клетках, участвующих в развитии немелкоклеточного рака легкого (Wang et al., 2017), рака молочной железы (Yang et al., 2014) и гепатокарциномы (Gong et al., 2013). . STITCH — это полезный ресурс, который включает данные о метаболических путях, кристаллических структурах, экспериментах по связыванию и взаимосвязях лекарство-мишень (Kuhn et al., 2008). Он обеспечивает обобщенный анализ для обзора взаимодействия между химическим веществом и его мишенями и не является инструментом для конкретных типов клеток.Наши результаты показывают, что белковые взаимодействия между пуникалагином и его мишенями в клетках NB4 и MOLT-4 следует учитывать в будущих исследованиях.

    Выводы

    Наше исследование показало, что пуникалагин оказывает противолейкемическое действие, подавляя пролиферацию клеток и способствуя апоптотической и аутофагической гибели клеток, регулируя каспазу, Bax/Bcl-2 и сигнальный путь mTOR/ULK1. Результаты этого исследования могут помочь в создании дополнительных и альтернативных методов лечения в будущем.

    Дополнительная информация

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната вызывают апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 человека путем нацеливания на митохондрии

    1. Введение

    Гранат широко культивируется в Китае. Как пищевое и лекарственное растение двойного назначения, его плоды и кожура обладают антиоксидантным и противоопухолевым лечебным действием благодаря обильному содержанию полифенолов (Avriam et al., 2008; Йоханнингсмайер и Харрис, 2011 г.; Цулькер и др., 2007). В отрасли переработки граната ряд продуктов из граната, включая гранатовые соки, гранатовые напитки и масло из семян граната, были популярны на рынке благодаря своим питательным ингредиентам и оздоровительным свойствам. Однако большое количество кожуры граната, составляющее 20-30% веса плода граната, выбрасывается как отходы переработки граната, что приводит к растрате ресурсов (Ferrueloa et al., 2014). Между тем, многие исследования показали эффективность гранатового сока и экстрактов его кожуры в медицинских целях, противовоспалительные (Braga et al., 2005; Lansky & Newman, 2007) и противоопухолевые свойства (Aviram & Dornfeld, 2001; Syed , Афак и Мухтар, 2007). Ежедневное потребление гранатового сока потенциально лучше, чем яблочный сок, в улучшении антиоксидантной функции у пожилых людей. Кроме того, употребление гранатового сока больными диабетом может оказывать антиоксидантное действие на сыворотку и макрофаги без ухудшения показателей диабета (Guo et al., 2008; Розенблат, Хайек и Авирам, 2006 г.). Экстракты плодов граната приводили к значительному торможению роста опухоли, что сопровождалось значительным снижением уровня простат-специфического антигена в сыворотке (Malik et al., 2005). В частности, эллаговая кислота может быть основным полифенолом в гранатовом соке, который вызывает апоптоз клеток рака предстательной железы человека PC3 и ингибирование роста клеток in vitro (Malik, Afaq, Shahid, Akhtar, & Assiri, 2011).

    В настоящее время редко сообщается об исследовании противоракового действия полифенольных экстрактов кожуры граната и их основных активных компонентов (Song, Li, & Li, 2016).В качестве основных мономеров и полезных компонентов против различных заболеваний среди полифенолов кожуры граната сообщалось о пуникалагине (ПК) и эллаговой кислоте (ЭА). Ранее мы сообщали, что экстракты полифенолов из кожуры граната могут индуцировать апоптоз в клетках гепатомы человека, и предположили, что основная индуцирующая апоптоз функция может выполняться их основным компонентом, ФХ и ЭА (Song et al., 2016). Чтобы получить более подробную информацию о индуцирующем апоптоз эффекте ПК/ЭА на клетки линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, будут проведены дальнейшие исследования, чтобы выяснить различные эффекты ПК и ЭА и сравнить, какой из них более эффективен.Таким образом, эта статья была направлена ​​​​на изучение дифференциального противоракового действия основных компонентов ПК и ЭА на клетки линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 и их возможных механизмов действия.

    В настоящем исследовании изучалось влияние ПК и ЭА на клеточную морфологию HepG2, клеточный цикл, апоптоз, активные формы кислорода и митохондриальные трансгендеры соответственно. Кроме того, чтобы получить представление о механизмах действия, также обсуждались активность каспазы-3/9 и экспрессия белка, связанного с апоптозом, в HepG2.Это исследование не только обеспечивает основу для функционального механизма и будущего применения ПК и ЭА, но также способствует более эффективному использованию побочных продуктов граната.

    2. Материалы и методы

    2.1. Материалы и реагенты

    Плоды граната были приобретены на местных рынках в Линтонге (Шэньси, Китай). Стандарты пуникалагина и эллаговой кислоты были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Среда Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) была приобретена у Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США).Фетальную бычью сыворотку (FBS) приобретали у Tianhang Biological Technology Co. (Чжэцзян, Китай). ДМСО, МТТ, окрашивание Hoechst 33258, йодид пропидия (PI) и РНКаза-А были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Набор Annexin V-FITC (изотиоцианат флуоресцеина)/PI (йодид пропидия) и DCFH-DA были приобретены у Nanjing Jiancheng Biology Co. (Нанкин, Китай). Наборы для детекции каспазы-3 и каспазы-9 были приобретены у Beyotime Biotechnology Co. (Шанхай, Китай). 1-антитело было приобретено у Abcam Co.(Кембридж, Англия) и Cell Signaling Technology Co. (Шанхай, Китай). 2-антитело было приобретено у Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co. (Шэньчжэнь, Китай). Все остальные реагенты для культивирования клеток были приобретены у Sinopharm (Пекин, Китай).

    2.2. Экстракция и количественное определение ФХ и ЭА из кожуры граната

    Для экстракции ФХ и ЭА (их химические формулы указаны на рисунке 1) кожуру граната сначала удаляли вручную, сушили на солнце и измельчали ​​в порошок. Неочищенные экстракты ППС экстрагировали 60% (об./об.) раствором этанола ультразвуковым методом.Конкретные процедуры были следующими: соотношение материала и жидкости составляло 1:20, время экстракции 25 мин при мощности ультразвука 100 Вт. Экстракционный раствор центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. После этого супернатант собирали и концентрировали на роторном испарителе при 40°C, затем получали сырые экстракты с последующей лиофилизацией (степень вакуума, 5 мторр). Для очистки использовали метод адсорбции и десорбции смолы. 25 мг смол помещали в 250 мл раствора неочищенных экстрактов с концентрацией 1 мг/мл в конических колбах, затем помещали на орбитальный шейкер при 130 об/мин и 25°C на 10 ч.После адсорбции смолы с полифенолами кожуры граната дважды элюировали дистиллированной водой, затем к элюенту добавляли 70% (об/об) этанол для десорбции. Наконец, очищенные экстракты PPP, содержащие PC и EA, были получены после концентрирования и сушки вымораживанием.

    Для количественного анализа полифенолов кожуры граната использовали систему ВЭЖХ 1525 Waters (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США), оснащенную бинарным насосом и УФ-детектором (установленным на 280 нм). Количественное определение полифенолов анализировали на колонке Zorbax SB-C18 (4.6 мм × 250 мм, 5 мкм, Agilent, Америка) с использованием 1% ледяной уксусной кислоты (A) и метанола (B) в качестве подвижной фазы (0–70 мин, 5%–44% B; 70–80 мин, 44% –44% Б) при скорости потока 1 мл/мин.

    2.3. Культура клеток и группировка

    Клетки гепатомы человека (HepG2) были приобретены в центре экспериментальных животных Четвертого военного медицинского университета (Сиань, Китай), а нормальные клетки печени человека L-02 были приобретены в центре лабораторных животных Sun Университет Ятсена (Нанкин, Китай). Клетки содержали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 единиц/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) и культивировали при 37°C во влажном инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% CO 2 .

    Было проведено три серии экспериментов следующим образом: группа обработки испытуемым веществом с конечными концентрациями 50 и 100 мкМ ФХ и ЭА, группа обработки 5-Fu с конечной концентрацией 200 мкМ и контрольная группа. Тестируемые соединения растворяли в ДМСО и разбавляли бессывороточной культуральной средой. Конечная концентрация ДМСО не превышала 0,1%. Все эксперименты были повторены независимо трижды.

    2.4. Оценка клеточной пролиферации

    Ингибирующее действие PC и EA на пролиферацию HepG2 измеряли с помощью анализа МТТ.Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты (5 × 10 3 клеток/лунку). Через 24 ч клетки промывали свежей средой и обрабатывали разными концентрациями ФХ или ЭА в качестве серий опытов на разные сроки. После инкубации в течение 24 и 48 часов в каждую лунку добавляли по 10 мкл раствора МТТ (5 мг/мл), растворенного в PBS, и инкубировали еще 4 часа. Наконец, добавляли ДМСО (150 мкл на лунку) и растворяли образовавшиеся кристаллы формазана. Поглощение измеряли при 570 нм с использованием микропланшет-ридера (Multiskan Go, Thermo Electron Corporation, США).Жизнеспособность клеток рассчитывали по следующей формуле:

    A t , A c и A b обозначают оптическую плотность испытуемых веществ, контроля и контроля соответственно.

    2.5. Анализ окрашивания Hoechst 33258

    Клетки HepG2 культивировали в 6-луночных планшетах (4 × 10 5 клеток/лунку) в течение 24  часов, а затем обрабатывали различными концентрациями PC или EA в качестве серий экспериментов в течение 48  часов. Для промывки лунок добавляли PBS, затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом при 4°C.Через 15 мин клетки снова промывали PBS и окрашивали Hoechst 33258 в течение 10 мин. Наконец, морфологические изменения клеток наблюдали под инвертированным флуоресцентным микроскопом.

    2.6. Анализ клеточного цикла с помощью проточной цитометрии

    Распределение клеточного цикла определяли с помощью проточной цитометрии с использованием PI (Marel, Lizard, Izard, Latruffe, & Delmas, 2008). Клетки HepG2 (1 × 10 6 клеток/лунку) выращивали в течение 24 ч, а затем обрабатывали различными концентрациями ФХ или ЭА в качестве серий экспериментов в течение 48 ч.Как суспензионные клетки, так и прикрепленные к трипсину клетки собирали, затем суспендировали в холодном PBS и фиксировали 70% этанолом при -20°C в течение ночи. После удаления супернатанта к окрашенным клеткам добавляли 1 мл PBS, содержащего РНКазу (1,0 мг/мл) и 0,5 мл PI (50 мкг/мл), на 30 мин при комнатной температуре в темноте. Затем клеточный цикл анализировали с помощью проточной цитометрии (Millipore Corporation, Биллерика, Массачусетс, США).

    2.7. Измерение апоптоза с помощью проточной цитометрии

    Апоптоз количественно определяли с помощью анализа двойного окрашивания на аннексин V-FITC/PI с использованием набора для обнаружения аннексина V-FITC.Приблизительно 1 × 10 6 клеток/лунку в 6-луночных планшетах инкубировали в течение ночи, а затем обрабатывали различными концентрациями PC или EA в качестве серий экспериментов в течение 48  часов. После этого все клетки собирали и суспендировали в 400 мкл буфера для связывания. Затем 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл PI добавляли для окрашивания на 10 мин в темноте. Ранние апоптотические клетки и поздние апоптотические/некротические клетки (аннексин + /PI и аннексин + /PI + ) измеряли с помощью проточной цитометрии.

    2.8. Определение активности каспазы-3 и каспазы-9

    Анализ активности каспазы-3 и каспазы-9 проводили с помощью набора для анализа активности каспазы (Beyotime Biotechnology Co., Шанхай, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки в контрольной группе и в каждой лечебной группе собирали и лизировали в буфере для холодного лизиса. После 15 мин во льду белок получали из супернатанта центрифугированием и смешивали с буфером для детекции и каталитическим субстратом (AcDEVD-pNA и Ac-LEHD-pNA) в 96-луночном планшете.Смеси инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Активность каспаз, представленную поглощением, измеряли при 405 нм с помощью микропланшет-ридера (Multiskan Go, Thermo Electron Corporation, США).

    2.9. Анализ внутриклеточных активных форм кислорода в клетках HepG2

    Производство внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) оценивали с помощью зонда DCFH-DA. Вкратце, клетки HepG2 высевали с плотностью 1 × 10 6 клеток/мл в 6-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями PC или EA в течение 24 часов.Затем клетки собирали и подвергали воздействию 0,2 мл PBS, содержащего 10 мкМ DCFH-DA в конечной концентрации. После 30 мин инкубации при 37 °C с помощью проточного цитометра измеряли интенсивность флуоресценции, отражающую продукцию АФК.

    2.10. Экспрессия белка, связанного с апоптозом, обнаруженная вестерн-блоттингом

    Клетки контрольной группы и группы лечения собирали и лизировали реагентом для экстракции белка и ингибиторами протеиназы. Лизаты центрифугировали при 15 000 g в течение 30 минут, отбирали надосадочную жидкость и определяли концентрацию белка с помощью анализа Бредфорда (Li et al., 2013). После разделения с помощью 15% SDS-PAGE белки переносили на мембраны PVDF и использовали 5% обезжиренное сухое молоко для блокировки в течение 1  часа. Используя 1-антитело (1:1000–3000) для закрытия на ночь при 4°C. Затем 2-антитело (1:10000), Р53, Bax, Bcl-2, Cyt-c, каспаза-3/9, PARP и актин инкубируют в течение 1 ч в условиях 37°C. Используйте набор для окраски щелочной фосфатазой, а затем сделайте и сохраните фотографии. Опыт повторялся трижды.

    2.11. Статистический анализ

    Все результаты выражены как среднее ± ± стандартное отклонение как минимум трех независимых экспериментов.Достоверную разницу определяли с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения SPSS 19.0. P  < 0,05 считается значимым.

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната вызывают апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 путем нацеливания на митохондрии https://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857 ПК и ЕА.

    Рис. 1.Химические формулы ПК и ЭА.

    3. Результаты

    3.1. Анализ PC и EA в кожуре граната

    Соединения полифенолов в очищенных экстрактах кожуры граната были идентифицированы, и компоненты и количественная оценка показаны на рисунке 2. Было успешно выделено и идентифицировано семь основных полифенольных веществ. Среди этих соединений основным компонентом был ФХ с изомерной структурой (два пика, 15,22 и 22,49 мин) с общим содержанием 65,38 мг/100 мг.Далее следуют катехин, ЭА и галловая кислота с содержанием 12,66, 2,93 и 2,53 мг/100 мг соответственно. Результаты показали, что основными компонентами ППС были ФХ, катехин, ЭА и галловая кислота.

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната вызывают апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 человека путем нацеливания на митохондрии https://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857 экстракты полифенолов кожуры граната.t R /содержимое ПК и EA были выделены жирным шрифтом.

    Рис. 2. ВЭЖХ-анализ полифенольных экстрактов кожуры граната. t R /содержимое ПК и EA были выделены жирным шрифтом.

    3.2. Влияние ФХ и ЭА на антипролиферацию клеток HepG2

    Как показано в результатах метода МТТ на рисунке 3, ФХ и ЭА ингибировали выживаемость клеток HepG2 (клеток гепатомы) в зависимости от дозы и времени, но не оказывал значительного влияния на клетки L-02 (нормальные клетки печени) (рис. 3(В)).Степень ингибирования клеток HepG2, обработанных PC и EA при 25, 50 и 100 мкМ в течение 24 часов, составила 16,4%, 26,3% и 40,2% и 13,1%, 25,7% и 37,8% соответственно. При обработке ФХ в концентрациях 25, 50 и 100 мкМ в течение 48 ч ингибирующее действие значительно увеличивалось до 36,2%, 47,3% и 59,9% соответственно, что было выше, чем у ЭА (29,1%, 44,4%, 52,8%). ), (рис. 3(А)). По сравнению с контролем обработка ПК и ЭА оказала значительное влияние на выживаемость клеток HepG2 ( P  < 0.01). Через 48 часов обработки значения IC 50 достигли 94,70 мкМ для ЭА и 83,47 мкМ для ПК. Таким образом, результаты показали, что ингибирование пролиферации клеток HepG2, индуцированное PC, было более сильным, чем ингибирование, индуцированное EA. Это было похоже на другое исследование: клеточная линия лимфомы Раджи ингибировалась экстрактами Cuscuta (Aribi, Zerizer, Kabouche, Screpanti, & Palermo, 2016; Ghazanfari, Naseri, Shams, & Rahmati, 2013). экстракты могут ингибировать пролиферацию раковых клеток, не затрагивая нормальные клетки.

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната вызывают апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 путем нацеливания на митохондрии https://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857 PC и EA на антипролиферацию клеток HepG2 (A) и клеток L0-2 (B). * р  < 0,05, ** р < 0,01.

    Рисунок 3. Влияние ПК и ЭА на антипролиферацию клеток HepG2 (A) и клеток L0-2 (B).* р  < 0,05, ** р < 0,01.

    3.3. Влияние ПК и ЭА на морфологию клеток HepG2

    Морфологическое изменение было показателем, используемым для оценки апоптоза. Морфология клеток после окрашивания Hoechst 33258 показана на рисунке 4. По сравнению с контрольной группой клетки в лечебной группе были деформированы и глубоко окрашены. Точечная флуоресценция была увеличена и усилена. Видно, что произошло сморщивание ядра и появление маргинации хроматина.С увеличением концентрации тестируемого вещества деформация клеток и явления гиперхромии становились более выраженными.

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната вызывают апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 человека путем нацеливания на митохондрииhttps://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857

    ПК и ЭА на морфологию клеток HepG2. Увеличение, 400×.

    Рис. 4.Влияние ПК и ЭА на морфологию клеток HepG2. Увеличение, 400×.

    3.4. Эффекты PC и EA на остановку клеточного цикла

    Чтобы определить, было ли ингибирование роста клеток PC и EA вызвано остановкой клеточного цикла, мы исследовали фазы цикла клеток HepG2, которые обрабатывали PC и EA в течение 48 часов и окрашивали ПИ. Когда ПК действовал на клетки HepG2 в течение 48 часов при 50 и 100 мкМ, результаты гистограммы ДНК анализа клеточного цикла показали, что количество клеток в S-фазе увеличилось с 36.78% до 50,25% ( P  < 0,01) (рис. 5(А)) и сопровождалось снижением процентного содержания клеток в фазе G0/G1 с 51,58% до 43,79%. Тем не менее, после продолжения действия ЭА на клетки HepG2 в течение 48 ч в той же концентрации накопление клеточной популяции в фазе G0/G1 увеличилось с 60,53% до 68,61% ( P  < 0,01), а количество клеток в фазе G2/M уменьшалось одновременно (рис. 5(B)). Эти результаты показали, что как PC, так и EA могут ингибировать рост клеток HepG2, поскольку они могут останавливать клетки HepG2 в фазе S и фазе G0/G1 соответственно.

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната вызывают апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 человека путем нацеливания на митохондрииhttps://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857

    PC и EA при остановке клеточного цикла в клетках HepG2. (A) Репрезентативные гистограммы содержания ДНК в клетках, инкубированных с различными концентрациями PC или EA (0, 50 и 100  мкМ) в течение 48 часов, 5-Fu был установлен в качестве положительной контрольной группы; (B) Процент клеточных популяций в фазах G0/G1, S и G2/M.*
    р  < 0,05, ** р  < 0,01.

    Рисунок 5. Влияние ПК и ЭА на остановку клеточного цикла в клетках HepG2. (A) Репрезентативные гистограммы содержания ДНК в клетках, инкубированных с различными концентрациями PC или EA (0, 50 и 100  мкМ) в течение 48 часов, 5-Fu был установлен в качестве положительной контрольной группы; (B) Процент клеточных популяций в фазах G0/G1, S и G2/M. * р  < 0,05, ** р  < 0,01.

    3.5. Эффекты PC и EA на индукцию апоптоза

    Чтобы выяснить, была ли гибель клеток HepG2 вызвана апоптозом, вызванным PC и EA, мы выполнили апоптическую характеристику клеток, обработанных PC и EA в течение 48 часов.Результаты анализа двойного окрашивания аннексином V-FITC и PI и проточной цитометрии показаны на рисунке 6(A). В отличие от контрольной группы, когда клетки HepG2 обрабатывали ФХ и ЭА в концентрациях 50 и 100  мкМ, процент клеток с поздним апоптозом повышался до 23,30% и 35,05% для ФХ ( P  < 0,01) и 16,13% и 23,80%. % для EA ( P  < 0,01) соответственно (рис. 6(B)). Более того, PC и EA вызывали изменение скоростей раннего апоптоза, хотя это изменение было небольшим. Результаты показали, что как PC, так и EA индуцировали клеточный апоптоз дозозависимым образом, и эффект апоптоза, вызванного PC, был сильнее, чем у EA ( P  < 0.05).

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната индуцируют апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 человека путем нацеливания на митохондрииhttps://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857

    ПК и ЭА на индукцию апоптоза. (A) Клетки обрабатывали различными концентрациями PC и EA при 0 (контроль), 50 и 100 мкМ в течение 48 часов, 5-Fu был установлен в качестве группы положительного контроля; (B) Количественный анализ апоптотических клеток.**
    р  < 0,01.

    Рисунок 6. Влияние ПК и ЭА на индукцию апоптоза. (A) Клетки обрабатывали различными концентрациями PC и EA при 0 (контроль), 50 и 100 мкМ в течение 48 часов, 5-Fu был установлен в качестве группы положительного контроля; (B) Количественный анализ апоптотических клеток. ** р  < 0,01.

    3.6. Влияние PC и EA на активность каспазы-9 и каспазы-3 в клетках HepG2

    Семейство каспазных протеаз играет центральную роль в координации апоптотических ответов (Son et al., 2010). Чтобы исследовать путь апоптоза, мы исследовали активность каспазы-9 и каспазы-3. На рисунке 7 (A и B) показаны значительные изменения активности каспазы-9 и каспазы-3 в клетках, обработанных ПК и ЭА при 50 и 100 мкМ в течение 24 часов. По сравнению с контролем активность каспазы-9 в клетках экспериментальных групп повышалась в 1,3 раза ( P  < 0,01) и в 1,9 раза ( P  < 0,01) для ПК, а ЭА вызывала 1,1-кратное ( P  < 0,05) и в 1,5 раза ( P  < 0.01) увеличивается (рис. 7(А)). Точно так же повышалась активность внутриклеточной каспазы-3 (фиг. 7(B)). Активность повышалась с увеличением концентрации тестируемого вещества, и ФХ в тех же условиях действовал лучше, чем ЭА. Экспрессию белков каспазы-3 и каспазы-9 проводили вестерн-блоттингом. Как показано на Фигуре 8, белки каспазы-3 и каспазы-9 были значительно экспрессированы в группе, получавшей лекарственное средство, по сравнению с белками в контроле, что указывает на то, что апоптоз действительно происходил в клетках HepG2 в группах, получавших лекарственное средство.

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната индуцируют апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 человека путем нацеливания на митохондрииhttps://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857

    PC и EA на активность каспаз ((A) каспазы-3, (B) каспазы-9) и продукцию АФК (C) в клетках HepG2. *
    р  < 0,05, ** р  < 0,01.

    Рисунок 7. Влияние ФХ и ЭА на активность каспаз ((А) каспазы-3, (В) каспазы-9) и продукцию АФК (С) в клетках HepG2.* р  < 0,05, ** р  < 0,01.

    Пуникалагин и эллаговая кислота из кожуры граната индуцируют апоптоз и ингибируют пролиферацию клеток гепатомы HepG2 человека путем нацеливания на митохондрииhttps://doi.org/10.1080/09540105.2019.1642857

    белки, связанные с апоптозом, в ответ на обработку PC, EA и PPPs. (A) типичные полосы вестерн-блоттинга для p53, Bax, Bcl-2, Cyt-c и PARP; (Б) статистический анализ.*
    р  < 0,05, ** р  < 0,01.

    Рисунок 8. Эффекты белков, связанных с апоптозом, в ответ на лечение PC, EA и PPPs. (A) типичные полосы вестерн-блоттинга для p53, Bax, Bcl-2, Cyt-c и PARP; (Б) статистический анализ. * р  < 0,05, ** р  < 0,01.

    3.7. Продукция АФК клетками HepG2

    Согласно недавним исследованиям, увеличение АФК представляет собой один сигнал, предшествующий апоптозу раковых клеток; доказательства также доказали, что некоторые фитохимические вещества могут стимулировать раковые клетки производить больше АФК до их порога токсичности, а затем вызывать апоптоз (Trachootham, Alexandre, & Huang, 2009).Мы предположили, что ингибирование роста клеток ПК и ЭА частично связано с повышенным уровнем АФК в клетках. Поэтому мы обнаружили внутриклеточные АФК с помощью зонда DCF, чтобы подтвердить это подозрение. Результаты изменения уровня АФК в клетках HepG2 показаны на рис. 7(С). И ПК, и ЭА в разных концентрациях на клетках HepG2 сохранялись в течение 24 часов; все внутриклеточные АФК были значительно выше, в отличие от контрольных клеток. Кроме того, 50 и 100  мкМ ФХ и ЭА стимулировали производство H 2 O 2 на 20.на 40% и 44,17% и на 13,80% и 32,90% соответственно в зависимости от дозы. Приведенное выше исследование показало, что PC и EA индуцировали образование H 2 O 2 в клетках HepG2. Следовательно, уровень АФК был выше исходного, а действие ПК было более выраженным, чем у ЭА.

    3.8. Анализ экспрессии связанных с апоптозом белков

    Результаты вестерн-блоттинга представлены на рисунке 8. По сравнению с контрольной группой экспрессия связанного с апоптозом белка Р53 была значительно повышена в группах лечения ПК, ЭА и РРР.Экспрессия проапоптотического белка Вах увеличивалась с увеличением концентрации тестируемого вещества. В то же время экспрессия проапоптотического белка Cyt-c также была значительно повышена. Более того, фермент репарации ДНК PARP в экспериментальных группах был расщеплен на три фрагмента, но в контрольной группе PARP все еще оставался в одной полосе. Эта серия изменений в экспрессии белка, связанного с апоптозом, в клетках HepG2 предполагает, что PC и EA могут индуцировать апоптоз клеток HepG2, и его путь апоптоза может проходить через внутриклеточный митохондриальный путь.

    4. Обсуждение и заключение

    В естественном состоянии полифенолы кожуры граната в основном состоят из ФХ, на долю которого приходится 65,75% общего количества фенолов в кожуре граната (He et al., 2015; Li, Zhao, Yu и Ли, 2009). Исследования показали, что основной формой внутреннего метаболизма и абсорбции ПК является ЭА граната, гидролизат ПК (Castonguay et al., 1997; Larrosa, Tomas-Barberan, & Espin, 2006; Seeram et al., 2007). Следовательно, на рынке, как правило, есть две формы продуктов с полифенольным экстрактом из кожуры граната: один представляет собой натуральный экстракт полифенолов из кожуры граната, который в основном состоит из ПК, а другой представляет собой тип экстракта полифенолов из кожуры граната, в котором ПК гидролизуется. до EA (на долю которого приходится более 90%) в процессе экстракции.Однако пока неясно, являются ли биоактивными и PC, и EA, или какой из них более активен в клетках HepG2. Чтобы изучить этот вопрос, было проведено исследование с целью изучения in vitro антигепатомной активности PC и EA с использованием клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 в качестве модельной клетки.

    Хотя общепризнанно, что полифенолы кожуры граната являются основным мономером полифенолов, сообщений о его противоопухолевой активности немного. Предыдущее исследование продемонстрировало влияние ПК на клетки глиомы человека U87MG, и результаты показали, что ПК может вызывать клеточный апоптоз и аутофагию и, в конечном итоге, приводит к гибели клеток (Wang et al., 2013). Хотя были сообщения о противоопухолевом действии EA, других основных мономеров полифенолов кожуры граната, например, при раке предстательной железы и раке головного мозга (Kim et al., 2010; Malik et al., 2011). Однако имеется несколько сообщений о влиянии ПК и ЭА на индукцию апоптоза клеток гепатомы и их механизме. В настоящем исследовании мы отдельно изучили потенциальное влияние ПК и ЭА на жизнеспособность и морфологию клеток, распределение клеточного цикла, апоптоз, активность каспазы-3 и каспазы-9 и внутриклеточную генерацию АФК в клетках HepG2, и мы обнаружили, что оба PC и EA могут значительно ингибировать пролиферацию клеток HepG2 и индуцировать клеточный апоптоз.Более того, роли PC и EA могут быть связаны с участием в митохондриальном пути апоптоза. Сравнивая противоопухолевую активность ФХ и ЭА, мы обнаружили, что активность ФХ была сильнее, чем у ЭА. Это может быть связано с их различной молекулярной структурой. ЭА является продуктом гидролиза ПК и имеет меньшую молекулярную структуру (Ларроса и др., 2006). Возможно, у них разные рецепторы или мишени, которые требуют дальнейшего изучения. Что касается влияния PC и EA на клеточный цикл, наше исследование показало, что они оба оказывают тормозящее действие на клетки HepG2.PC в основном останавливал клеточный цикл в фазе S, а EA делал это в фазе G0/G1. В настоящее время существует теория о том, что фитохимический вклад осуществляется различными путями путем распознавания разных мишеней (Wagner, 2006). Регуляция клеточного цикла теоретически осуществляется через фазу удержания G1. Фаза G0 — это когда клетка временно выходит из цикла и прекращает деление (Alberts et al., 2013). Наше исследование пришло к соглашению с этим аргументом. Результаты показали, что EA значительно блокирует раковые клетки во время фазы G0/G1, указывая на то, что EA, вероятно, ингибирует пролиферацию клеток HepG2, удерживая клетки в фазе G1 и останавливая деление клеток в фазе G0. Этот ингибирующий эффект был идентифицирован с эффектом ацилированный антоцианин черники на мышиных опухолях h32 (Liu, Chen, Li, & Sun, 2016).Кроме того, ПК значительно блокировал раковые клетки во время S-фазы при синтезе ДНК, что позволяет предположить, что ПК, возможно, предотвращал синтез ДНК раковых клеток. Это согласуется с результатами определения FCM. Более того, ФХ может в некоторой степени деградировать и трансформироваться в ЭА, что свидетельствует о функциональном перекрытии ФХ и ЭА, хотя они вносят свой вклад в пути индивидуально во время клеточного цикла. Тем не менее, точный механизм PC и EA в цикле раковых клеток остается предметом дальнейших исследований.

    Существуют также некоторые углубленные исследования противоопухолевой активности EA в отношении различных раковых клеток, таких как рак мочевого пузыря человека T24 (Li et al., 2005), рак шейки матки человека CaSki (Narayanan, Geoffroy, Willingham, Re , & Nixon, 1999) и рак толстой кишки (Narayanan & Re, 2001). Что согласуется с этим результатом исследования, так это то, что EA может индуцировать апоптоз в этих клетках, останавливать клетки CaSki рака мочевого пузыря человека T24 и рака шейки матки человека в фазе G0 / G1 и приводить к изменениям уровней каспазы и ROS в клетках T24.Между тем, в этих исследованиях изучались гены, связанные с регуляцией апоптоза. В нашем исследовании ФХ и ЭА повышали уровень АФК и активность каспазы-3/9. При этом все PARP в лечебных группах были разделены на 3 полосы, тогда как в контрольной группе только 1 полоса. Это может означать, что фермент репарации ДНК PARP в группах обработки клеток HepG2 может расщепляться на фрагменты каспазой-3/9, поскольку PARP является субстратом каспазы-3/9. В нашем эксперименте мы обнаружили, что это увеличивает экспрессию каспазы-3/9, поэтому мы предполагаем, что фермент репарации ДНК PARP потерял активность после того, как был разрезан каспазой-3/9.Этот процесс еще больше ускоряет апоптоз раковых клеток. Другими словами, результаты экспрессии белка PARP предполагают, что PC и EA могут блокировать репарацию ДНК в раковой клетке и, следовательно, ускорять апоптоз клеток HepG2.

    Кроме того, экспрессия связанных с апоптозом белков, включая P53, Bax, Cyt-c, в клетках экспериментальной группы была значительно повышена по сравнению с контрольной группой. Изменения экспрессии генов показывают, что механизм апоптоза в клетках HepG2, индуцированный ПК и ЭА, может быть связан с их участием в митохондриальном пути апоптоза (Kwon et al., 2014; Ли, Шао, Фу, Хань и Гао, 2010 г .; ван Делфт и Хуанг, 2006).

    С комплексной точки зрения, мы можем сделать следующие выводы, вещества, которые были приняты в этой статье, PC и EA, а также его исходные экстракты PPPs, все они обладают хорошим ингибирующим и проапоптотическим действием на клетки гепатомы человека HepG2, это Кажется, ПК оказывает более сильное влияние на клетки HepG2, чем EA, PC и экстракты, богатые EA, PPP показывают лучший эффект, чем любой из них при однократном применении, это может быть связано с возможным синергетическим эффектом двух из них, механизмом апоптоза в Клетки HepG2, индуцированные PC, EA и PPP, возможно, связаны с их участием в митохондриальном пути апоптоза.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.

    Вся информация, размещенная на сайте, носит ознакомительный характер и не является руководством к действию. Перед применением любых лекарств и методов лечения необходимо обязательно проконсультироваться с врачом. Администрация ресурса osteohondroz24.ru не несет ответственность за использование материалов, размещенных на сайте. Копирование материалов разрешается только с указанием активной ссылки на сайт.