Расшифровка флюорографии коды: Цифровые коды описания результатов оценки флюорографии

SET7 / 9 сначала сообщалось о монометилировании h4K4 (h4K4me1) ( 13 ), но позже было показано, что он нацелен на K189me1 на TAF10, K372me1 на p53 и многие другие белки ( 14 ). Основываясь на подтвержденных субстратах и ​​структурных исследованиях, консенсусным мотивом SET7 / 9 является X [KR] [STA] -K-pXX, где p обозначает полярную аминокислоту. Как и G9a, профиль селективности субстрата K-OPL для SET7 / 9 согласовывался с описанным мотивом (фиг. 2B и фиг. S1, C и D). Набор P-1 серин K-OPL использовался чаще всего в этой позиции.В положении P + 2 хорошо использовали несколько наборов K-OPL с полярными аминокислотами, включая лизин, аргинин, гистидин, аспарагин, глутамин и серин. Посадочное место SET7 / 9 K-OPL предполагает, что h4K4 не является оптимальным субстратом. Оптимальным субстратом SET7 / 9, предсказанным с помощью скрининга K-OPL, был RRSKRRK, последовательность, которая отображается на K477 SCN5A (α-субъединица сердечного натриевого канала). SCN5A K477 метилировался быстрее, чем p53 K372 (рис. 2E). Как предсказано профилем селективности субстрата K-OPL, замена серина P-1 в RRSKRRK на глутаминовую кислоту привела к потере любого детектируемого метилирования.

SMYD2 монометилирует или диметилирует гистон h4 (h4K4me1 и h4K36me2) ( 15 , 16 ), p53 (K370me1) ( 17 ), RB (K860me1) ( 18 ) ( 18 ) ) ( 19 ) и множество других белков ( 20 ). Сообщалось, что SMYD2 предпочитает мотив XX [LFM] -K-SXX, и все наборы K-OPL, соответствующие этому описанному мотиву, были среди наиболее метилированных с помощью SMYD2 (фиг. 2C и фиг. S1, E и F). Несмотря на первоначальные сообщения о том, что SMYD2 метилирует h4K4 и h4K36, анализ K-OPL предполагает, что оба они будут плохими субстратами.Анализы метилтрансферазы in vitro с использованием рекомбинантных человеческих мононуклеосом подтвердили, что в отличие от G9a рекомбинантные человеческие нуклеосомы являются плохими субстратами SMYD2 по сравнению с пулом всех наборов K-OPL (рис. S2A).

Для валидации скрининга SMYD2 K-OPL была синтезирована серия пептидов на основе оптимального субстрата, WKLKSKR. Эта точная последовательность не встречается ни в одном человеческом белке. Однако замена триптофана P-3 на аргинин соответствует лизину 798 из PER2 (RKLKSKR), репрессору транскрипции и основному компоненту циркадных часов.Как предсказано профилем селективности субстрата K-OPL, пептид, соответствующий PER2 K798, был более эффективным субстратом, чем пептиды, соответствующие ранее описанным субстратам SMYD2 p53 K370 и MAPKAPK3 K355 (фиг. 2F). Замена аспарагиновой кислоты в положении P-1, глутаминовой кислоты в положении P + 1 или аспарагиновой кислоты в положении P-3 снижает скорость метилирования с помощью SMYD2, в то время как замена триптофана в положении P-3 увеличивает скорость метилирования (рис. 2F).

Для дальнейшей проверки конкретных пептидных субстратов KMT, выявленных с помощью K-OPL, мы провели сравнительные измерения скорости для лучших субстратов SMYD2, G9a и SET7 / 9 с каждым ферментом (рис.S2B). Эти результаты демонстрируют, что составы последовательностей, выявленные при скрининге K-OPL, обладают высокой ферментоспецифичностью.

Все три KMT, проверенные в этом исследовании, предпочитали основные остатки рядом с центральным лизином. Результирующие субстраты, предсказанные картой селективности K-OPL, часто содержали более одного остатка лизина, включая оптимальные субстраты, протестированные для SMYD2 (RKLKSKR), G9a (TARKRFK) и SET7 / 9 (RRSKRRK). Чтобы исключить возможность того, что множественные события метилирования отдельных пептидов способствовали увеличению использования субстрата, наблюдаемому в наших анализах, мы выполнили MS-анализ продуктов этих реакций метилирования.G9a метилирование TARKRFK приводит как к монометильным, так и к диметильным продуктам (рис. 3A). Тандемный MS (MS / MS) анализ обоих продуктов показал, что метилирован только центральный лизин этого субстрата (фиг. S3, A и B). Для SET7 / 9 и SMYD2 анализ MS обнаружил сдвиг массы, соответствующий добавлению одной метильной группы (рис. 3, B и C), а MS / MS подтвердил, что монометилирован только центральный лизин (рис. S3, C). и D).

Продукты реакций G9a ( A ), SET7 / 9 ( B ) и SMYD2 ( C ) с соответствующими пептидными субстратами анализировали с помощью МС. Масс-спектры показаны в отсутствие (вверху) или в присутствии (внизу) обработки ферментом, как указано.

В совокупности анализ K-OPL точно идентифицировал и расширил известные мотивы последовательности для G9a, SET7 / 9 и SMYD2. Кроме того, профили селективности субстрата K-OPL точно предсказывают, как изменения в последовательности субстрата отрицательно или положительно влияют на скорость его метилирования.Эти данные подтверждают использование K-OPL для профилирования селективности субстрата KMT и предоставляют первые карты аминокислотного предпочтения для G9a, SET7 / 9 и SMYD2 с высоким разрешением. Примечательно, что эти результаты предполагают, что наиболее изученные субстраты для этих трех ферментов не самые надежные.

Структурный и кинетический анализ взаимодействий SMYD2-субстрат

Мы сосредоточили дальнейшие усилия на SMYD2, отчасти потому, что его профиль показал, что его наиболее ценный субстрат, p53 K370, содержит несколько неоптимальных остатков.Кроме того, для SMYD2 в настоящее время разрабатываются низкомолекулярные ингибиторы для различных клинических показаний ( 21 ). Эти терапевтические усилия в первую очередь основаны на биологической связи, с помощью которой SMYD2 метилирует опухолевый супрессорный белок р53, что приводит к ингибированию функции р53 ( 17 ). Знание всех мишеней SMYD2 будет важно для понимания клинических результатов ингибирования SMYD2.

Чтобы определить молекулярную основу селективности субстрата SMYD2, мы сначала решили 2.Рентгеновская кристаллическая структура 7-Å SMYD2, связанного с S, -аденозилгомоцистеином (SAH) и пептидом с последовательностью GWKL-Nle-SKRG (рис. 4, A и B; рис. S4, A и B; и таблица S1). Этот пептид соответствует оптимальному производному K-OPL субстрату SMYD2 с центральным лизином, замещенным норлейцином (Nle), имитатором метил-лизина, который стабилизирует комплексы KMT-субстрат ( 22 ). Триптофан P-3 не был разрешен в структуре, что свидетельствует о конформационной гибкости в этом положении (рис.S4A). Неожиданно конформация пептида была почти идентична предыдущим структурам пептида SMYD2-SAH (фиг. 4B и фиг. S4B) ( 23 — 25 ), что дает мало информации о том, почему PER2 или WKLKSKR являются лучшими субстратами, чем p53.

( A ) Гибридное изображение поверхности ленты SMYD2 (белый), связанного с SAH и GWKLNleSKRG (Nle, норлейцин) (синие палочки). Коструктура была депонирована в банке данных белков (PDB) как PDB: 6MON.( B ) Наложение пептидных субстратов из структур SMYD2-GWKLNleSKRG (PDB: 6MON) и SMYD2-p53K370 (PDB: 3TG5). ( C ) Диаграмма рассеяния, сравнивающая взаимосвязь между скоростью метилирования, рассчитанной из фиг. 2F, и динамикой координации субстрата с помощью SMYD2. Среднеквадратичное смещение (RMSD) атомов Cα указанных пептидов рассчитывали на основе моделирования МД для всего атома за 500 нс. Показаны ориентации пептидов в нескольких временных точках в ходе МД-моделирования, обозначенные цветом с соответствующей цветовой шкалой (вверху слева). ( D ) Кинетический анализ метилирования SMYD2 производных субстратов p53, PER2 и PER2. Точки данных представляют собой среднее значение трех независимых измерений, а ошибка представлена ​​как ± SEM. PER2 и WKLKSKR соответствовали кинетической модели ингибирования субстратом. DKLKSKR и SHLKSKK соответствовали стандартной модели Михаэлиса-Ментен (MM). ( E ) Измерения IC ₅₀ (средняя ингибирующая концентрация) пептидных ингибиторов Nle SMYD2 с использованием PER2 в качестве субстрата. Точки данных представляют собой среднее значение трех независимых измерений, а ошибка представлена ​​как ± SEM.

Затем мы собрали серию 0,5 мкс траекторий молекулярной динамики (МД) (всего 3 мкс) SMYD2 в комплексе с различными субстратами (рис. 4C). В качестве исходной матрицы мы использовали структуру SMYD2, связанного с пептидом p53 (PDB: 3TG5), который разрешал остатки между положениями P − 2 и P + 3 относительно p53 K370. Неразрешенная аминокислота в положении P-3 была смоделирована, и моделирование полностью атомной МД этой структуры в комплексе с пептидами, используемыми для анализов KMT in vitro, позволило нам оценить динамику взаимодействий SMYD2-субстрат. Среднеквадратичное отклонение атомов Cα в основной цепи пептида на протяжении всего моделирования (фиг. 4C, ось x ) обеспечивало прокси для стабильности пептида или отклонения от скорости, поскольку моделирование начиналось в связанном состоянии. Интеграция этого показателя с измерениями скорости реакции KMT in vitro (рис. 2F) привела к гипотезе, что координация субстратов SMYD2 и каталитический оборот связаны с помощью квазивогнутой функции (рис. 4C). В этой модели слабо скоординированные пептиды (т.е. RKDKSKR) являются плохими субстратами, потому что взаимодействие фермент-субстрат слишком слабое, чтобы организовать субстрат для катализа.Тесно скоординированные пептиды (RKLKEKR) также являются плохими субстратами из-за их медленной скорости реакции, что приводит к неэффективному обмену субстратов. Оптимальные субстраты (KLKSKR и WKLKSKR) организованы таким образом, чтобы обеспечить как эффективный катализ, так и быстрый оборот.

Моделирование методом МД также выявило уникальные взаимодействия для субстратов SMYD2 PER2 и WKLKSKR. Пептид PER2 быстро перешел в альтернативную конформацию, чтобы установить стабилизирующие контакты в положении P-3. В этой конформации P-3 аргинин образовывал солевой мостик с D151 SMYD2 (рис.S4C). Триптофан P-3 пептида WKLKSKR осел в гидрофобном кармане (рис. S4D) рядом со спиралью, содержащей D151. Это тот же карман, который занимает AZ506, недавно обнаруженный низкомолекулярный ингибитор SMYD2 (рис. S4E) ( 26 ). В целом, моделирование MD выявило уникальные взаимодействия как для PER2, так и для WKLKSKR, которые, вероятно, вносят вклад в более высокие скорости метилирования, наблюдаемые для этих пептидов.

Затем мы выполнили кинетический анализ для дальнейшего изучения того, что делает PER2 и WKLKSKR лучше субстратов SMYD2, чем p53.SMYD2-метилирование p53 соответствует классической кинетике MM (Fig. 4D). Однако SMYD2-метилирование PER2 и WKLKSKR имело совершенно другой кинетический профиль, соответствующий субстратному ингибированию. Повышенные концентрации PER2 или WKLKSKR приводили к снижению скорости метилирования.

Поскольку моделирование методом МД выявило уникальные конформации Р-3 для не-ММ субстратов (рис. 4C и рис. S4, C и D), мы затем задались вопросом, вносят ли эти взаимодействия вклад в наблюдаемую кинетику ингибирования субстрата.В моделировании МД замена аспарагиновой кислоты в положении P-3 препятствовала взаимодействию пептида с SMYD2 таким же образом, как PER2 или WKLKSKR (фиг. 4C и фиг. S4, C и D), и за этим последовало метилирование SMYD2 DKLKSKR. классическая модель ММ (рис. 4D). Вместе эти наблюдения подтверждают, что аминокислотный состав в позиции P-3 модулирует конформацию субстратов SMYD2 и кинетику SMYD2.

K-OPL как инструмент для обнаружения каркасов для рациональной разработки ингибитора KMT

Замена целевого лизина субстрата на Nle ранее использовалась в качестве стратегии ингибирования KMT ( 22 ).В качестве доказательства концепции K-OPL-управляемого открытия ингибиторов KMT мы синтезировали Nle-содержащие пептиды на основе оптимального субстрата SMYD2 и обнаружили, что производное Nle WKLKSKR ингибирует SMYD2 метилирование PER2 (Fig. 4E). Производные RKDKSKR и RKLKEKR Nle были менее эффективны, как и предполагал анализ K-OPL. Однако, хотя RKLKEKR и RKDKSKR были одинаково плохими субстратами SMYD2 (Fig. 2F), RKLNleEKR был более эффективным конкурентным ингибитором, чем RKDNleSKR (Fig. 4E). Этот результат согласуется с моделированием МД, которое показало, что RKLKEKR образует более стабильный комплекс с SMYD2 (рис.4С). В целом, эти результаты предполагают, что оптимальные субстраты, идентифицированные с помощью скрининга K-OPL, могут служить каркасом для дальнейшей оптимизации в сторону более сильных ингибиторов.

Использование K-OPL для идентификации новых субстратов SMYD2

Для идентификации новых субстратов KMT мы разработали функцию оценки с наименьшим интервалом (LoB) на основе профилей селективности K-OPL для ранжирования 7-мерных последовательностей с лизином из аннотированных протеомов. Показатели LoB равны необработанному сигналу из самого низкого набора K-OPL, используемого для построения полной 7-мерной последовательности, e. г., рассмотрим PER2 K798 (RKLKSKR). Оценка для этой последовательности присваивается аргинином в позиции P-3, поскольку этот набор имеет самый низкий сигнал в этой последовательности (рис. S1, E и F). Оценка LoB была специально разработана для минимизации ложных срабатываний и не содержит позиционного взвешивания, общего для других функций оценки мотивов ( 27 , 28 ).

Список кандидатов из шести белков (PER2, PRDM11, CDC5L, GDAP1, ZPK и ATP6V1G3) из 50 лучших последовательностей с оценкой LoB (таблица S2) был выбран для проверки in vitro в качестве субстратов SMYD2.Все шесть белков были метилированы SMYD2 (фиг. 5A и фиг. S5A). ZPK и GDAP1 были плохими субстратами SMYD2 (рис. S5A). Доступные структурные данные для ZPK показали, что целевой лизин находится в структурированной спирали, которая, вероятно, запрещает метилирование с помощью SMYD2 (рис. S5B), но не было доступных структурных данных, чтобы объяснить, почему GDAP1 не является более надежным субстратом SMYD2. Чтобы определить, был ли метилирован лизин, предсказанный скринингом K-OPL, мы генерировали белковые субстраты с целевым лизином, замещенным на аргинин (с K на R).Все мутантные субстраты от K до R имели пониженное метилирование (фиг. 5A и фиг. S5A). Для CDC5L, ATP6V1G3 и PER2 мутация K в R не устраняет полностью метилирование, что позволяет предположить, что метилируются и дополнительные остатки. В соответствии с измерениями скорости для пептида MAPKAPK3 K355 (рис. 2F), метилирование полноразмерного рекомбинантного MAPKAPK3 было слабее, чем у большинства недавно идентифицированных субстратов SMYD2 (рис. 5A), что требовало гораздо более длительного воздействия для обнаружения метилирования этого белка ( инжир.S5A).

( A ) Репрезентативный анализ метилтрансферазы SMYD2 in vitro с известными и предсказанными белковыми субстратами. K к R относится к миссенс-мутации (лизин в аргинин), введенной в целевой лизин. Гель, окрашенный кумасси, показан вверху синим цветом, а флюорография ³ H показана внизу. ( B ) Репрезентативный анализ метилтрансферазы SMYD2 in vitro с мутантными формами субстратов PRDM11 и MAPKAPK3, которые, по прогнозам, уменьшают или повышают эффективность субстрата соответственно.WT, дикий тип. ( C ) Диаграмма рассеяния оценки LoB для мотивов метилирования SMYD2, которые созданы (синий), ослаблены (красный), усилены (зеленый) или неизменны (черный) в результате миссенс-мутаций, обнаруженных в данных первичного секвенирования рака человека.

В целом SMYD2 метилировал четыре из недавно идентифицированных субстратов (PER2, PRDM11, CDC5L и ATP6V1G3) по крайней мере так же эффективно, как известный субстрат p53. Эти результаты подтверждают использование профилей селективности K-OPL для идентификации новых субстратов KMT.

Анализ K-OPL предсказывает влияние миссенс-мутаций на использование субстрата.

Было показано, что миссенс-мутации изменяют сигнальные сети киназ, включая мутации, вызывающие аминокислотные замены в непосредственной близости от модифицированного остатка ( 29 ). Мы стремились определить, могут ли профили селективности K-OPL предсказать влияние миссенс-мутаций на субстрат KMT на уровне белка. Руководствуясь профилем K-OPL SMYD2, мы создали мутант PRDM11 (K89D), который, по прогнозам, сделает этот устойчивый субстрат SMYD2 дефицитным.В анализе KMT in vitro метилирование PRDM11 K89D было снижено по сравнению с PRDM11 дикого типа (фиг. 5B). Кроме того, мутации, предсказанные для усиления метилирования слабого субстрата SMYD2 MAPKAPK3 (D353R и T356S), улучшили метилирование этого белка (рис. 5B). Эти результаты показывают, что профили селективности, полученные на основе K-OPL, точно предсказывают, как изменения отдельной аминокислоты рядом с целевым лизином могут значительно влиять на эффективность субстрата KMT на уровне белка.

Затем мы обратили свое внимание на прогнозирование того, как зарегистрированные миссенс-мутации в наборах данных первичного секвенирования рака человека могут перестраивать сигнальные сети метилирования лизина из-за замен в мотивах субстрата SMYD2. Для этого мы каталогизировали и проанализировали К-центрические 7-мерные аминокислотные последовательности в масштабе протеома. Сравнение оценок LoB для мишеней SMYD2 в нормальном протеоме (UniProt) с онкопротеомом (COSMIC) ( 30 ) привело к идентификации четырех классов миссенс-мутаций, которые могут влиять на передачу сигналов метилирования лизина SMYD2. Четыре класса включают мутации, которые (i) ослабляют, (ii) усиливают, (iii) создают или (iv) не влияют на цель метилирования (фиг. 5C и таблица S3).Эти результаты демонстрируют полезность наборов данных K-OPL для определения приоритетности исследования миссенс-мутаций, связанных с раком, на основе их предсказанной функциональной связи с передачей сигналов метилирования лизина. Кроме того, эти исследования предполагают, что метилом лизина отдельной раковой клетки может быть изменен из-за миссенс-мутаций.

Анализ K-OPL выявляет пробелы в метиломе лизина

В недавнем исследовании использовали МС для идентификации 35 белков с сайтами монометилирования, которые последовательно уменьшались при потере активности SMYD2 ( 20 ). Удивительно, но эти 35 белков находятся далеко за пределами наших 50 лучших субстратов с оценкой LoB (таблица S2). По физическим свойствам подложки, идентифицированные с помощью MS, отличаются от подложек, получивших верхнюю оценку 50 по шкале LoB. Большинство из 50 лучших субстратов, предсказанных K-OPL, обогащены остатками лизина и аргинина, тогда как почти все из 35 лучших субстратов из Olsen et al . исследование ( 20 ) обеднены этими аминокислотами (фиг. 6A). Плотность лизина и аргинина положительно коррелирует с гидрофильностью и является показателем количества сайтов разрезания трипсина, что затрудняет обнаружение этих мотивов субстрата с помощью МС.Таким образом, либо белки, которые K-OPL идентифицирует как идеальные субстраты, никогда не метилируются в клетках, либо их невозможно обнаружить с помощью стандартных восходящих конвейеров MS.

( A ) Сравнение содержания аргинина и лизина между 50 верхними K-OPL-предсказанными субстратами SMYD2 (синий) и 35 субстратами, идентифицированными с помощью МС (красный) (Olsen et al . ). ( B ) Содержание лизина и аргинина во всем метиломе лизина согласно данным PhosphoSitePlus ( 8 ).

Чтобы проверить последнюю гипотезу, мы провели восходящий МС-анализ рекомбинантного PER2. Несмотря на достижение более 70% покрытия последовательностей рекомбинантного белка (рис. S6, A и B), мы не смогли обнаружить пептиды, соответствующие области, охватывающей недавно идентифицированный субстрат K798 для SMYD2. Это предполагает, что даже если бы PER2 или другие основные мотивы, предсказанные анализом K-OPL, были метилированы в клетках, они не были бы обнаружены с помощью MS.

Отметим, что в дополнение к SMYD2, SET7 / 9 и G9a также предпочитают субстраты, богатые лизином и аргинином (рис.2). Хотя это небольшая выборка активности KMT, анализ содержания лизина и аргинина в данных протеомики метилирования лизина человека, собранных в PhosphoSitePlus ( 8 ), выявил смещение, наблюдаемое в Olsen et al . исследование отражает аннотированный метилом лизина (фиг. 6B). Хотя хорошо известно, что последовательности, богатые лизином и аргинином, сложно обнаружить с помощью МС ( 31 ), анализ K-OPL показывает, что изученные здесь ферменты имеют сильную предвзятость для субстратов с точным составом последовательностей, которые не обнаруживаются с помощью МС. .Это ключевое открытие предполагает, что текущий перечень сайтов метилирования лизина, собранный из наборов протеомных данных MS, является неполным.

ОБСУЖДЕНИЕ

Наше исследование устанавливает K-OPL в качестве функциональной протеомной платформы для картирования селективности субстрата KMT путем количественного измерения аминокислотного предпочтения ± три положения от целевого лизина. Помимо идентификации новых субстратов, K-OPL можно использовать в качестве инструмента для открытия новых каркасов ингибиторов KMT. K-OPL анализ селективности к субстрату SMYD2 показал, что оптимальный субстрат не обнаруживается в протеоме человека (WKLKSKR) из-за триптофана в положении P-3. Производное оптимального субстрата Nle без дальнейшей модификации было умеренным ингибитором активности SMYD2. Моделирование методом МД показало, что триптофан оседает в гидрофобном кармане рядом с активным центром SMYD2, а недавно обнаруженный низкомолекулярный ингибитор SMYD2 содержит объемную ароматическую группу, которая также связывается в этом же кармане. Таким образом, платформа скрининга K-OPL идентифицировала взаимодействие SMYD2-субстрат, которое никогда не было бы обнаружено при анализе ранее идентифицированных субстратов SMYD2.Использование анализа K-OPL для создания каркасов для разработки ингибиторов — захватывающее будущее применение, особенно для KMTs без известных ингибиторов.

Кроме того, платформа K-OPL может применяться для понимания влияния миссенс-мутаций на передачу сигналов метилирования лизина. Наш анализ показал, что миссенс-мутации при раке человека могут оказывать существенное влияние на сигнальную сеть метилирования лизина для SMYD2. Миссенс-мутации, которые усиливают, ослабляют, создают или разрушают новые субстраты SMYD2, широко распространены в раковых клетках человека. Уже этот ограниченный анализ мотивирует будущую работу по картированию того, как метилом лизина изменяется в результате миссенс-мутаций. По мере того, как K-OPL профилирование дополнительных KMTs завершено, этот интегративный анализ станет все более полезным для формулирования гипотез о роли метилирования лизина в заболеваниях человека.

K-OPL профилирование SMYD2 позволило идентифицировать новые подложки. Идентификация субстратов KMT является серьезной проблемой, и ранее описанные подходы имеют ограничения, которые платформа K-OPL обходит.Например, качественные анализы толерантности использовались для определения воздействия отдельных аминокислот на известный субстрат KMT и успешно использовались для идентификации новых мишеней для G9a, SET7 / 9 и других KMT ( 12 , 32 ) . Платформа K-OPL не требует какого-либо известного субстрата, который может помочь идентифицировать субстраты сиротских KMTs, таких как члены загадочного семейства, содержащего PR домен. Мы отмечаем, что подход скрининга K-OPL не учитывает некоторые существенные вклады в селективность субстрата, которые могут присутствовать в клетке, такие как членство в комплексе, уровни экспрессии, тканевая специфичность и субклеточная локализация. Тщательное рассмотрение этих дополнительных вкладов в селективность субстрата может быть использовано для дальнейшего определения приоритетности субстратов-кандидатов.

В дополнение к тестам на толерантность, новые субстраты KMT были идентифицированы с использованием анализа MS в сочетании с генетическими или химико-генетическими подходами. Подходы на основе MS страдают двумя техническими ограничениями. Во-первых, реагенты пан-метил-лизинового сродства, необходимые для обогащения перед анализом MS, часто содержат систематическую ошибку, маскирующую некоторые из метиломов лизина ( 10 , 33 ).Подход K-OPL не требует стадии обогащения сродства. Во-вторых, основанные на MS протеомные конвейеры анализируют пептиды из клеточных лизатов, в первую очередь переваренных трипсином. Недавний анализ протеомных данных, депонированных в Global Proteome Machine Database (GPBdb), показал, что 96% всех данных были получены из образцов, расщепленных трипсином ( 31 ). Все три KMT, прошедшие скрининг в этом исследовании, предпочитают остатки аргинина и лизина, окружающие лизин субстрата. Триптическое расщепление мотивов оптимальной последовательности дает пептиды, которые не обнаруживаются с помощью MS.Наш анализ недавнего исследования SMYD2 ( 20 ) на основе MS демонстрирует, что идентифицированные субстраты дефицитны по лизину и аргинину. Кроме того, мы не смогли обнаружить PER2 K798 с помощью MS, несмотря на превосходный охват последовательностей, что свидетельствует о сложности обнаружения последовательностей, богатых лизином и аргинином, с помощью MS. Анализ K-OPL G9a, SET7 / 9 и SMYD2, представленный в этом исследовании, и анализ сообщенных негистоновых субстратов для других KMT (рис. S6C) позволяют предположить, что аннотированный метилом лизина человека, вероятно, неполный из-за основного состава последовательности наиболее предпочтительные мотивы метилирования для этих ферментов.Это исследование подчеркивает необходимость разработки новых основанных на MS методов для обнаружения метилирования лизина в композициях последовательностей, которые предпочтительно модифицируются KMT, но не обнаруживаются стандартными восходящими конвейерами MS.

Наши знания о ферментах, ответственных за добавление метилирования негистонового лизина, отсутствуют. Комплексное картирование субстратов KMT является важным шагом на пути к пониманию многих биологических ролей метилирования лизина. Для достижения этой важной и сложной цели потребуется разработка новых технологий и методов изучения метилирования лизина.Этот отчет подтверждает использование K-OPL в качестве надежной платформы для скрининга селективности субстрата, которую теперь можно использовать для дальнейшего изучения передачи сигналов метилирования лизина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение рекомбинантного белка

SET7 / 9 был приобретен в New England BioLabs (каталожный номер M0223). G9a (аминокислоты с 913 по 1210) продуцировали в виде N-концевого слияния 6XHis, а SMYD2 (полноразмерный) экспрессировали в виде N-концевого слияния глутатиона S -трансферазы (GST).MAPKAPK3 (аминокислоты с 1 по 520) (номер в каталоге 131688) и GDAP1 (полный размер) (номер в каталоге 162725) были получены от Abcam. PRDM11 (аминокислоты с 79 по 314) (плазмида Addgene № 32858) и полноразмерный человеческий TP53 (плазмида Addgene № 24859) были подарками от C. Arrowsmith. PER2 (аминокислоты с 691 по 900) был субклонирован в модифицированный вектор pQE в виде слияния N-концевой мальтозо-связывающий белок (MBP) -His. MAPKAPK3 (полная длина), ATP6V1G3 (полная длина) и CDC5L (аминокислоты от 150 до 280) были субклонированы в pGEX-6P2 (GE Healthcare) как N-концевые слитые GST.Точечные мутации были созданы с помощью сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene). Все экспрессионные конструкции трансформировали в Escherichia coli BL21 (DE3) и выращивали в среде LB (Caisson) при 37 ° C. Когда OD ₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм) достигала 0,6-0,8, температуру снижали до 16 ° C, добавляли изопропил-β-d-тиогалактопиранозид (0,5 мМ) и инкубацию продолжали в течение ночи при встряхивании. Бактерии собирали центрифугированием и либо замораживали при -80 ° C, либо сразу использовали.Белок очищали либо глутатион-агарозой (GE Healthcare), либо смолой TALON (Clontech) в соответствии с протоколом производителя.

Синтез K-OPL

Все 114 наборов пептидов были синтезированы на синтезаторе пептидов PTI Symphony с использованием химии Fmoc. Наборы были синтезированы на смоле Biotin-PEG NovaTag (10 мкмоль на набор; MillporeSigma № 855055) с использованием одного 70-минутного сочетания с 12-кратным избытком сочетания смеси (аминокислоты / HATU / 3-экв. N -метилморфолин ) и 2 × 10-минутное снятие защиты с помощью 20% пиперидина в N , N ‘-диметилформамиде (ДМФ).Вырожденные положения синтезировали с использованием смеси 19 Fmoc-защищенных l-аминокислот (за исключением цистеина) в молярных соотношениях, согласующихся с эффективностью связывания, как описано ранее. После окончательного снятия защиты с Fmoc смолы промывали (3 × ДМФ, 3 × дихлорметан и 3 × метанол) и оставляли на ночь в высоком вакууме. Смолы смешивали в течение 2 часов с 0,5 мл смеси для расщепления (92,5% трифторуксусной кислоты, 2,5% H ₂ O, 2,5% триизопропилсилана и 2,5% 1,2-этандитиола) и осаждали холодным диэтиловым эфиром.Осадки промывали диэтиловым эфиром и отделяли центрифугированием. Процедуру промывки повторяли пять раз. После разделения осадки сушили на воздухе в течение 5 минут, растворяли в 1 мл 50% ацетонитрила, замораживали при -80 ° C и сушили в быстром вакууме в течение ночи. Для оценки качества библиотек для каждой библиотеки с помощью спектрометра SCIEX TOF / TOF 5800 MALDI MS были собраны спектры масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией / ионизацией-временем пролета (MALDI-TOF) и сравнивались с теоретическими массовыми распределениями (аналитические данные доступны по запросу).

SPA для KMTs

Реакции (10 мкл), содержащие 1 мкг KMT, 1 мкг набора K-OPL и 1 мкКи ³ H-SAM (PerkinElmer) в реакционном буфере KMT [50 мМ трис (pH 8.8), 5 мМ MgCl ₂ и 4 мМ дитиотреитол] инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакции останавливали добавлением трифторуксусной кислоты до конечной концентрации 0,5%, нейтрализовали разбавлением 135 мкл 50 мМ NaHCO ₃ и переносили на планшеты FlashPlates, покрытые стрептавидином (PerkinElmer).Планшеты инкубировали в течение 15 мин, герметично закрывали и считали на жидкостном сцинтилляционном счетчике MicroBeta2 (PerkinElmer) в течение 1 мин на образец. Измерение начальной скорости и кинетический анализ выполняли с использованием той же процедуры с 200 нМ SMYD2, 50 мкМ SAM (соотношение холодный / горячий 5: 1) и 80 мкМ субстрата (измерения начальной скорости) или, как указано (кинетический анализ). Измерения IC ₅₀ проводили в тех же условиях с 5 мкМ пептида PER2 в качестве субстрата.

Реакции KMT in vitro

Реакции (10 мкл), содержащие 1 мкг KMT, 1 мкг указанных субстратов и 1 мкКи ³ H-SAM (PerkinElmer) в реакционном буфере KMT, инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. температура.Реакции гасили добавлением загрузочного буфера SDS и разрешали электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле. После обнаружения общего белка окрашиванием Кумасси гели обрабатывали EN ³ HANCE (PerkinElmer) и сушили, а метилированные белки выявляли авторадиографией.

MALDI-TOF-MS анализ реакций KMT

Для экспериментов MS 200 нМ KMT, 80 мкМ пептид и 50 мкМ SAM инкубировали в реакционном буфере KMT в течение 1 часа при комнатной температуре.Реакции гасили 0,5% трифторуксусной кислотой и анализировали с помощью МС. Образцы, прореагировавшие с KMT, наносили на пластину-мишень MALDI (4 мкл на пятно) и смешивали с 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота в 50% ацетонитриле). Спектры MALDI-TOF-MS и MS / MS (режим положительных ионов при 1 кВ) получали с использованием спектрометра SCIEX TOF / TOF 5800 MALDI MS. Моделирование фрагментации пептидов и назначение пиков выполняли с помощью инструмента моделирования фрагментации пептидных последовательностей (https: // omics.pnl.gov/software/molecular-weight-calculator).

Анализ PER2 с помощью ЖХ-МС / МС

Рекомбинантный меченый МВР PER2 экспрессировали и очищали, как описано выше. Три микрограмма MBP-PER2 заменяли буфером на 25 мМ бикарбонат аммония (pH 8,0). Образец сушили, используя скоростной вакуум, восстанавливали в 25 мМ бикарбонате аммония (pH 8,0): 50% ацетонитриле, и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Добавляли трипсин, Arg-C или Asp-N (по 500 нг; Promega), и образцы расщепляли в течение ночи при 37 ° C.Полученные пептиды сушили и восстанавливали в 25 мМ бикарбонате аммония: 5% ацетонитриле. Образцы загружали на колонку C18 (частицы 2 мкм, внутренний диаметр 25 см на 75 мкм) и элюировали с использованием 2-часового градиента ацетонитрила в масс-спектрометр Q Exactive HF-X, оборудованный источником нанораспыления (поток при 350 нл / мин). Полное разрешение MS было установлено на 60,000 при 200 m / z (отношение масса / заряд), цель с полной автоматической регулировкой усиления (AGC) MS была 3 × 10 ⁶ , а диапазон масс был установлен от 300 до 1400.Целевое значение AGC для спектров фрагментов было установлено на 1 × 10 ⁵ , порог интенсивности был установлен на 2 × 10 ⁵ , а ширина изоляции была на 1,3 m / z . Нормализованная энергия столкновения была установлена ​​на уровне 28% ( 34 ). Масс-спектры каждого образца сравнивали с человеческой базой данных UniProt и пользовательской базой данных, содержащей последовательность нашей конструкции MBP-PER2, с использованием Proteome Discoverer (версия 2.2). Допуск по массе прекурсора был установлен на уровне 10 частей на миллион, допуск на массу фрагмента был установлен на 0.02 Да, Delta Cn 0,05, частота ложных открытий 0,01, минимальная длина пептида 6 и минимальное количество пептидов 2

Моделирование MD

Для моделирования пептида SMYD2 каждый пептидный субстрат состоял из семи аминокислот. Моделирование сольватировали в воде TIP3P (переносимый межмолекулярный потенциал с 3 точками) и использовали ионы хлорида натрия для доведения системы до физиологической соли. Каждая индивидуальная система была минимизирована по энергии, ослаблена в каноническом ансамбле, уравновешена атмосферным давлением и без ограничений работала в каноническом ансамбле.Все входные данные GROMACS, файлы топологии и начальные координаты можно скачать по адресу https://github.com/BradleyDickson.

Кристаллизация белка, сбор данных и определение структуры

Для определения структуры полноразмерный человеческий SMYD2 был экспрессирован, очищен и кристаллизован, как описано ранее ( 25 ). Вкратце, SMYD2 (10 мг / мл) инкубировали с 600 мкМ SAH и кристаллизовали при 20 ° C в растворе, содержащем 0,1 М трис (pH 7,5), 20,5% полиэтиленгликоля (PEG) 3350 и 5% этанола.Затем кристаллы измельчали ​​для получения затравки для выращивания кристаллов комплекса SMYD2-пептид в растворе, содержащем SMYD2 (1,5 мг / мл), 2 мМ пептида GWKLNleSKRG, 600 мкМ SAH, 0,1 М трис (pH 7,5), 20,5% PEG 3350 и 5,9 % этиловый спирт. Кристаллы, подходящие для дифракции, подвергали криозащите в растворе, содержащем 0,1 М трис (pH 7,5), 25% PEG 3350 и 5,0% этанола, а затем мгновенно охлаждали в жидком азоте. Дифракционные рентгеновские лучи были получены в усовершенствованном источнике фотонов на канале 21-ID-F. Дифракционные изображения обрабатывались и масштабировались с помощью autoPROC и AIMLESS ( 35 , 36 ).Кристаллы принадлежат к тетрагональной пространственной группе P 4 ₂ с двумя молекулами на асимметричную единицу. Структура была решена путем молекулярной замены с использованием человеческого SMYD2 (PDB: 5KJK) в качестве модели поиска. Построение и доработка модели проводились в Coot и PHENIX соответственно. Окончательная модель была утверждена MolProbility ( 37 ). Структурные рисунки были подготовлены в PyMOL. Координаты и структурные факторы были депонированы в PDB с инвентарным номером 6MON.

Благодарности: Благодарим А.Нельсону за административную поддержку и членам лаборатории Ротбарта за полезные комментарии и предложения по этому исследованию. Финансирование: Эта работа была поддержана Исследовательским институтом Ван Андела и грантами Национальных институтов здравоохранения S.B.R. (R35GM124736) и Z.-W.S. (R43GM110869 и R44GM112234). Вклад авторов: E.M.C., B.M.D., M.W.C., Z.-W.S. и S.B.R. разработал все исследования и обсудил результаты. E.M.C. провели и проанализировали ферментные анализы с использованием данных M.ТУАЛЕТ. и Z.-W.S. B.M.D. выполнили и проанализировали моделирование MD и создали программное обеспечение для отображения данных K-OPL на любой протеом. Н.С., Дж.Б. и З.Й. решил структуру SMYD2. К.К. синтезированы и проанализированы пептиды. E.M.C., P.P.V., K.M.S. и R.M.V. продуцировал рекомбинантные белки. А.У. провели MS-анализ рекомбинантного PER2 под руководством I.E.V. E.M.C. и S.B.R. написал рукопись при участии всех авторов. Конкурирующие интересы: EpiCypher коммерциализирует варианты использования платформ, связанных с OPL, аналогичные описанным в этом исследовании.S.B.R. работал в качестве оплачиваемого консультанта в компании EpiCypher. Все авторы заявляют, что у них нет других конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов. Структура SMYD2-пептида депонирована в PDB с регистрационным номером 6MON.

Двойная метилтрансфераза METTL13 нацелена на N-конец и Lys55 eEF1A и модулирует скорость кодон-специфической трансляции

Идентификация METTL13 как метилтрансферазы eEF1A

Во время наших недавних попыток охарактеризовать события метилирования на eEF1A, мы заметили, что его N-конец является триметилированным. в культивируемых клетках человека, и это недавно было обнаружено и опубликовано другими исследователями ¹⁴ .Заинтригованные этим наблюдением, мы попытались определить ответственный фермент. Рассуждая, что МТаза, вероятно, будет более активно связываться со своим субстратом, чем со своим продуктом, мы провели количественный анализ пептидов взаимодействия на основе MS ¹⁹ с использованием синтетического биотинилированного пептида, соответствующего немодифицированной на N-конце последовательности eEF1A, в качестве приманки, и соответствующий N-концевой триметилированный пептид в качестве эталона для обогащения взаимодействующих белков из экстракта клеток человека (фиг. 1а).Связывание белков с иммобилизованными пептидами расщепляли трипсином, и полученные пептиды анализировали с помощью современной тандемной масс-спектрометрии с нанопоточной жидкостной хроматографией (ЖХ-МС / МС) с последующим количественным определением белка с использованием алгоритма MaxLFQ ²⁰ встроена в программный пакет MaxQuant ²¹ . Всего было обнаружено, что 157 белков значительно обогащены неметилированной приманкой, а 174 белка — ее метилированным аналогом (рис. 1b, дополнительный рисунок 1 и дополнительные данные 1).Важно отметить, что извлечение пептидов по своей сути обогащает белки, которые биофизически взаимодействуют с пептидом-приманкой in vitro, и, следовательно, не все совпадения при таких скринингах обязательно являются биологически значимыми.

Идентификация METTL13 как eEF1A-специфической метилтрансферазы. a Рабочий процесс выпадающего меню количественного анализа пептидов на основе масс-спектрометрии. Синтетические пептиды, соответствующие N-концевому триметилированному (Nt-Me3) и неметилированному (Nt-Me0) eEF1A, использовали в качестве приманок для обогащения белков из экстрактов клеток HAP-1. b График вулкана, демонстрирующий обогащение белков немодифицированными (голубые кружки) по сравнению с триметилированными на N-конце (пурпурные кружки) пептидами приманки. Кривая линия представляет границу значимости (FDR = 0,01 и s0 = 0,1). Указана предполагаемая метилтрансфераза METTL13, и все представленные белки перечислены в дополнительных данных 1. c Доменная организация METTL13. Указаны границы использованных конструкций, охватывающих N-концевой (MT13-N) и C-концевой (MT13-C) домены метилтрансферазы. d , e Оценка конструкций METTL13 на eEF1A-специфическую активность метилтрансферазы. MT13-N ( d ) и MT13-C ( e ) инкубировали с [ ³ H] -AdoMet и eEF1A1, несущими N-концевую или C-концевую His-метку в отсутствие кофакторов и в наличие либо GDP, либо GTP. Метилирование визуализировали с помощью флюорографии (верхние панели), и мембраны окрашивали Ponceau S (нижние панели) для оценки нагрузки белка

Интересно, что предполагаемая метилтрансфераза METTL13 была среди белков, наиболее сильно обогащенных немодифицированным пептидом-приманкой, и поэтому была выбрана для дальнейшая характеристика (рис.1б). METTL13 содержит два различных предсказанных МТазных домена, которые оба принадлежат к суперсемейству 7BS (Рис. 1c и Дополнительный Рис. 2). N-концевой домен (обозначенный здесь MT13-N) принадлежит к недавно обнаруженному семейству ферментов, состоящему, вероятно, из KMT ¹⁵ , а C-концевой домен (здесь обозначен MT13-C) не имеет близких паралогов, но отдаленно связан со спермидинсинтазой. (SpdS) (рис. 1в). Мы экспрессировали и очищали человеческие MT13-N и MT13-C индивидуально в виде рекомбинантных белков из E.coli и оценили их способность метилировать рекомбинантный eEF1A in vitro. Поскольку конформация eEF1A зависит от связывания нуклеотидов ²² , и мы ранее наблюдали, что эффективность других eEF1A-специфичных МТ может модулироваться добавлением нуклеотидов гуанозина ^16,23 , эксперименты проводились в присутствии GDP, GTP или без экзогенно добавленных кофакторов. Кроме того, мы оценили eEF1A1 с помощью аффинной метки, расположенной на N- или C-конце в качестве субстрата.Важно отметить, что N-концевое метилирование человеческого eEF1A происходит на Gly2 после ферментативного удаления iMet, и предполагается, что эндогенная метионинаминопептидаза в E.coli будет обрабатывать гетерологически экспрессированный человеческий eEF1A соответственно ²⁴ .

Эти эксперименты показали, что оба МТазных домена METTL13 способны метилировать eEF1A in vitro и что их активности четко различаются. MT13-N метилирует eEF1A1 независимо от размещения аффинной метки на N- или C-конце, а метилирование ингибируется добавлением нуклеотидов (рис.1г). Напротив, MT13-C был способен метилировать eEF1A исключительно со свободным N-концом (т.е. как меченный на C-конце белок) и был нечувствителен к добавлению GDP или GTP (рис. 1e).

В заключение, приведенные выше эксперименты демонстрируют, что METTL13 способен метилировать eEF1A in vitro, и предполагают, что MT13-C нацелен на N-конец eEF1A, в то время как MT13-N метилирует другой сайт.

MT13-C нацелен на N-конец eEF1A

Чтобы оценить MT13-C на N-концевую активность MTase на eEF1A, мы инкубировали рекомбинантный фермент с рекомбинантным eEF1A1 in vitro и количественно оценили N-концевой статус метилирования eEF1A с помощью MS.В этом анализе триметилированный на N-конце химотриптический пептид, соответствующий аминокислотам Gly2-Tyr29 в eEF1A, был обнаружен в обработанном ферментом образце, но не в контрольной реакции без MT13-C (рис. 2а и дополнительный рис. 3).

MT13-C катализирует N-концевое метилирование eEF1A. — спектр МС / МС для N-концевого триметилированного пептида, включающего Gly2-Tyr29 из eEF1A, обработанного MT13-C. b Состояние метилирования N-конца eEF1A1 (не-, моно-, ди- и триметилированный; Me0 (голубые квадраты), Me1 (серые кружки), Me2 (зеленые треугольники) и Me3 (пурпурные треугольники)) в образцах обрабатывались различными количествами MT13-C.Столбики ошибок представляют sd, n = 3. c Хроматограммы экстрагированных ионов на основе ЖХ-МС, представляющие различные метилированные формы N-конца eEF1A в HAP-1 дикого типа (WT), HAP-1 с нокаутом METTL13 (KO) , и KO-клетки, дополненные FLAG-tagged METTL13 (KO + METTL13)

Аминогруппы белков потенциально могут получать до трех метильных групп посредством ферментативного метилирования, а МТазы, вводящие одну метильную группу на одно событие связывания субстрата, называются распределительными, тогда как ферменты, вводящие множественные модификации, обозначаются как процессивные.Распределительное триметилирование характеризуется наибольшим распространением моно- и диметилированных продуктов при низком соотношении фермент / субстрат ²⁵ . Чтобы оценить процессивность MT13-C, eEF1A1 инкубировали с различными количествами фермента, а статус метилирования N-конца оценивали с помощью MS. N-конец метилировался дозозависимым образом, и основная часть субстрата (~ 75%) была триметилирована при эквимолярных количествах фермента и субстрата (рис. 2b). Примечательно, что только следовые количества моно- и диметилированных частиц были обнаружены при ограниченных количествах фермента, что указывает на то, что MT13-C является процессивным ферментом.

Чтобы оценить, катализирует ли METTL13 также метилирование eEF1A in vivo, ген был разрушен в клетках HAP-1 с использованием технологии CRISPR / Cas9. Чтобы гарантировать нокаут (KO) функции гена, направляющая РНК была разработана для нацеливания на ранний экзон, расположенный выше предсказанных каталитически важных областей (дополнительный рис. 4a). Клон, несущий делецию 20 нуклеотидов в этом экзоне, был выбран для дальнейших исследований, а отсутствие белка METTL13 было подтверждено иммуноблоттингом (дополнительный рис. 4b).MS-анализ статуса N-концевого метилирования eEF1A в клетках показал, что этот сайт преимущественно триметилирован в клетках дикого типа (WT) и исключительно немодифицирован в клетках KO (фиг. 2c и дополнительный фиг. 5). Более того, комплементация клеток KO конструкцией METTL13 частично восстанавливала N-концевое метилирование eEF1A (рис. 2c).

Таким образом, эти результаты демонстрируют, что METTL13 необходим и достаточен для N-концевого метилирования eEF1A в клетках, и приписывает активность С-концевому домену МТазы фермента.

MT13-C представляет собой высокоспецифичную метилтрансферазу

В то время как некоторые протеиновые МТазы распознают трехмерную структуру своих субстратов, другие в первую очередь взаимодействуют с линейной последовательностью, представленной целевой аминокислотой и окружающими остатками, и такие МТазы обычно активны. на соответствующие пептиды in vitro ^26,27 . Интересно, что мы обнаружили, что MT13-C был активен в отношении коротких пептидов, соответствующих (без iMet) N-концу eEF1A (дополнительный рис.6а). Поэтому мы решили исследовать требования к последовательности и предпочтения для метилирования, опосредованного MT13-C, с использованием синтетических пептидных массивов. В этих экспериментах были синтезированы пептиды, полученные из первых 15 аминокислот (после расщепления iMet) eEF1A, где каждый пептид содержал замену одного из N-проксимальных остатков каждой протеогенной аминокислотой (за исключением цистеина и триптофана). Массив инкубировали с MT13-C и [ ³ H] -AdoMet, и метилирование визуализировали с помощью авторадиографии (фиг.3а).

Оценка специфичности MT13-C. a Профилирование активности MT13-C. Массив пептидов, соответствующих N-концу eEF1A, несущему одиночные аминокислотные замены, инкубировали с MT13-C и [ ³ H] -AdoMet, после чего метилирование визуализировали с помощью флюорографии. Последовательность eEF1A (позиции 2–8) отображается на горизонтальной оси, а остатки, введенные в соответствующие позиции, показаны на вертикальной оси.b Графическое представление логотипа мотива последовательности предпочтения последовательности субстрата MT13-C, как показано в a . c Оценка возможных подложек MT13-C. Верхняя панель, контур пептидного массива, содержащего субстраты-кандидаты (1–49), а также расположение пептидов, соответствующих eEF1A без iMet (положительный контроль (ПК)) и с сохраненным iMet (отрицательный контроль (NC)). Нижняя панель, флюорограф мембраны, инкубированной с MT13-C и [ ³ H] -AdoMet. Все пептидные последовательности перечислены в дополнительных данных 2. d Оценка клеточных экстрактов как субстратов для MT13-C. Вверху, белковые экстракты из клеток HAP-1 WT и METTL13 KO инкубировали с MT13-C, как указано, и метилирование разделенных по размеру белков визуализировали с помощью флюорографии. Внизу, вестерн-блоттинг (WB) против eEF1A мембраны, используемой для флюорографии, на верхней панели. Не обрезанное изображение блота показано на дополнительном рисунке. 6b

В первом положении последовательности MT13-C показал сильное предпочтение глицину, остатку, который естественным образом обнаруживается на N-конце eEF1A, но некоторая активность также наблюдалась с N -терминальный аланин или пролин (рис.3а). eEF1A имеет лизин в положении 2 (P2), и, соответственно, MT13-C в первую очередь проявлял активность в отношении пептидов с положительно заряженными (лизин и аргинин) или ароматическими (фенилаланин и тирозин) остатками в P2, но с некоторыми другими аминокислотами, такими как глутамин и гистидин также переносились (рис. 3а). Глутамат находится в положении 3 (P3) в eEF1A, и, соответственно, MT13-C показал очень сильное предпочтение глутамату в P3 (рис. 3a). Как правило, нижние положения оказывались менее важными, но замена лизина в положении 4 обычно приводила к снижению активности, а с пролином в положении 5 активности не наблюдалось (рис.3а, б). Основываясь на профиле специфичности, полученном в результате экспериментов с пептидным массивом, мы провели поиск в протеоме человека белков, которые прикрепились к следующей N-концевой консенсусной последовательности: M — [ G AP] — [ K RFYQH] — E — [ K RQHIL] (указана аминокислота в eEF1A). Посредством этих ограниченных поисков BLAST мы идентифицировали 49 белков-кандидатов-субстратов (дополнительные данные 2) и создали массив, содержащий 15-мерные N-концевые пептиды (без iMet), полученные из этих белков, для исследования активности MT13-C по отношению к этим пептидам.Примечательно, что ни один из пептидов, полученных из субстратов-кандидатов, не был заметно метилирован (фиг. 3c), а мечение во всех случаях было ниже 5% по сравнению с eEF1A. Основываясь на нашем опыте, такое слабое мечение очень редко отражает специфическую активность МТазы в отношении данного пептидного субстрата, указывая на то, что МТ13-C является высокоспецифичным ферментом.

Для дальнейшего исследования специфичности MT13-C белковые экстракты из клеток HAP-1 WT и METTL13 KO инкубировали с рекомбинантным ферментом и [ ³ H] -AdoMet.Затем белки разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на мембрану и метилирование визуализировали с помощью флюорографии (фиг. 3d и дополнительный фиг. 6b). В этом эксперименте белок с молекулярной массой, соответствующей eEF1A (~ 50 кДа), был эффективно и исключительно метилирован в экстракте из клеток KO. Отсутствие метилирования в экстракте WT, вероятно, отражает то, что обработанный iMet eEF1A полностью триметилирован в METTL13-опытных клетках WT (Fig. 2c). Важно отметить, что метилирование других белков, опосредованное MT13-C, обнаружено не было.Вместе с результатами, полученными на основе массивов пептидов, это убедительно демонстрирует, что МТ13-С является высокоспецифичной МТазой, нацеленной на N-конец eEF1A.

MT13-C представляет собой новый тип N-концевой МТазы

MT13-C представляет новый тип N-концевой МТазы. Чтобы получить более полное представление о его молекулярном механизме, мы определили кристаллическую структуру его основного МТазного домена (остатки 470–699) (рис. 4a, дополнительный рисунок 7 и дополнительная таблица 1) в комплексе с S -аденозилгомоцистеином (AdoHcy). , который является побочным продуктом реакции метилирования и представляет собой деметилированную форму AdoMet.Исходя из своей последовательности, MT13-C относится к семейству складчатых МТаз Россманна 7BS, и, соответственно, детерминированная структура МТазного домена MT13-C выявляет классическую структуру 7BS, состоящую из скрученного листа 7BS, окруженного шестью α -спирали по три с каждой стороны (рис. 4а). Ближайшим гомологом последовательности MT13-C человека является SpdS, и, соответственно, его трехмерная структура соответствует SpdS человека (код PDB: 2o06) ²⁸ наиболее близко (среднеквадратичное отклонение ниже 2,2 Å) среди доступных записей в банке данных по белкам. .Примечательно, что SpdS не является МТазой, а скорее катализирует реакцию, в которой спермидин и 5′-метилтиоаденозин (МТА) образуются в результате переноса аминопропила от декарбоксилированного AdoMet на путресцин.

Структурный анализ MT13-C. a Кристаллическая структура основного МТазного домена MT13-C в комплексе с AdoHcy. Сгиб 7BS показан на ленте зеленым цветом, а AdoHcy показан на модели палочек у лосося. Неразрешенная плотность основной цепи Lys578 указана пунктирной линией.b Ключевые связывающие остатки AdoHcy в MT13-C и сравнение с SpdS (код PDB 2o06). AdoHcy и остатки, участвующие в его координации в структуре MT13-C, показаны зеленым цветом, тогда как соответствующие остатки и кофактор MTA в структуре SpdS показаны серым цветом. Выравнивание последовательностей иллюстрирует локализацию этих остатков в ключевых мотивах. c Сравнение остатков мотива Post II между MT13-C и SpdS (код PDB 2o06). В структурном представлении остатки мотивов Post II в MT13-C и SpdS обозначены как модели палочек зеленым и серым цветом соответственно.Субстрат путресцина SpdS обозначен пурпурным цветом. Выравнивание последовательностей указывает расположение соответствующих остатков в соответствующих первичных последовательностях и иллюстрирует сохранение мотива Post II между ортологами METTL13. d Изображение поверхности MT13-C, показывающее сохранение последовательности. Эволюционная сохранность оценивалась с помощью веб-сервера ConSurf ⁴⁷ . Кофактор AdoHcy и пристыкованный гексапептид eEFA1 (GKEKTH) показаны в виде стиков зеленым и желтым цветом соответственно. e Крупным планом сайт связывания субстрата MT13-C с пристыкованным пептидом. Остатки AdoHcy и MT13-C, которые, как предполагается, будут взаимодействовать с N-концевым глицином (G2), показаны зеленым в виде палочки. Остов субстратного пептида (GKEKTH) показан желтым в виде палочки. f Мутационный анализ ключевых остатков в MT13-C. Белковые конструкции MT13-C, содержащие указанные одиночные аминокислотные замены, оценивали на МТазную активность на eEF1A. Активности мутантных ферментов представлены относительно дикого типа.Столбики ошибок представляют s.d., n = 6

Ферменты 7BS содержат определенные мотивы отличительных последовательностей, соответствующие ключевым остаткам, участвующим в координации AdoMet / AdoHcy. Два наиболее консервативных / существенных мотива обозначены как мотив I и Post I и включают остатки, содержащие β-цепи 1 и 2, соответственно, а также части петлевых структур, расположенные ниже этих цепей ²⁹ . Хотя гомоцистеильный фрагмент AdoHcy не был полностью разделен электронной плотностью, структура MT13-C действительно показала, что остатки в этих мотивах (Gly503 и Glu524 в METTL13) участвуют в координации AdoHcy и имеют такое же расположение, как и в SpdS (в комплексе с MTA) (рис.4б). Более того, MT13-C и SpdS имеют общий короткий DG-мотив (Asp551-Gly552 в METTL13), локализованный после β-цепи 3 и обычно не обнаруживаемый в других ферментах 7BS. Локализация и ориентация кислотного остатка аспартата в этом мотиве позволяет образовывать водородные связи с первичным амином аденозинового фрагмента AdoHcy и MTA, соответственно (рис. 4b).

Область, расположенная ниже β-цепи 4 в ферментах 7BS, называемая мотивом Post II, включает остатки, участвующие в распознавании субстрата ^3,6,15 .Было показано, что для SpdS два остатка аспартата (Asp173 и Asp176) в Post II важны как для связывания субстрата тетраметилендиамина (путресцина), так и для эффективного катализа ²⁸ , и что интересно, MT13-C имеет остаток аспартата (Asp575) в положение, соответствующее Asp173 (рис. 4в). Кроме того, другие остатки мотива Post II демонстрируют аналогичное расположение между двумя ферментами, и MT13-C, в частности, также имеет остаток аспартата (Asp577) в пространственной близости к Asp176 в SpdS (рис.4в).

Чтобы изучить, как MT13-C взаимодействует со своим пептидным субстратом, мы смоделировали 6-мерный пептид (GKEKTH), соответствующий N-концу eEF1A, на структуре MT13-C путем молекулярного стыкования. Модель докинга наивысшего ранга поместила пептид-субстрат в эволюционно законсервированную бороздку с его N-концом, ориентированным в сторону AdoHcy (рис. 4d), т.е. ориентацию, очень похожую на ориентацию путресцина в SpdS. Кроме того, упомянутый выше Asp577, а также другой высококонсервативный остаток (Asn647), по-видимому, участвуют в координации пептидного субстрата (рис.4д). Чтобы проверить структурную модель, мы индивидуально мутировали в аланин остатки, содержащие боковую цепь, подразумеваемые в связывании AdoMet (Glu524 и Asp551) или координации пептида субстрата (Asp577 и Asn647), а также в другие остатки в так называемом мотиве Post II. (Asp575, Val576 и Ser578), который важен для распознавания субстрата и / или катализа для других 7BS MTases ^6,15 , и сравнивали активность соответствующих ферментов. Мы обнаружили, что Glu524 и Asp575 необходимы для ферментативной активности, тогда как мутации всех других исследованных остатков, кроме Ser578, снижали активность MT13-C (рис.4е). Взятые вместе, наши комбинированные структурные и биохимические анализы MT13-C раскрывают важные молекулярные детали о его взаимодействии с двумя его субстратами (пептидом и AdoMet / AdoHcy), а также его потребности в ферментативной активности.

Характеристики MT13-N

Недавно сообщалось, что MT13-N принадлежит к семейству вероятных KMT ¹⁵ . Чтобы идентифицировать субстраты-кандидаты для MT13-N, мы разработали протеомный скрининг на основе MS, направленный на создание полного охвата триптических пептидов ³⁰ и, следовательно, сайтов метилирования лизина в клетках HAP-1 WT и METTL13 KO.Для этого мы объединили метку стабильных изотопов с аминокислотами в культуре клеток (SILAC) ³¹ клеток WT и KO и автономное фракционирование триптических пептидов с помощью обращенно-фазовой хроматографии при щелочном pH перед онлайн-анализом нанопотоковой ЖХ-МС / МС. (Дополнительный рис. 8а). В трех биологических повторностях мы идентифицировали и количественно оценили примерно 10 000 белков человека со средним охватом последовательностей более 35% (дополнительные данные 3). Обнадеживает то, что METTL13 оказался одним из наиболее недопредставленных белков в клетках METTL13 KO, тем самым подтверждая их генотип (дополнительный рис.8б).

Опрос этого набора данных для метилирования выявил поддержку 132 событий метилирования лизина, включающих 39 монометиловых, 80 диметиловых и 13 три-метиловых сайтов (дополнительные данные 4). Обнадеживает то, что были идентифицированы несколько ранее установленных сайтов, включая Lys116 в кальмодулине ³² , Lys585 в HSPA5 ³³ и Lys525 в eEF2 ³⁴ . Примечательно, что интенсивности сигналов MS, соответствующие диметилированию Lys55 в eEF1A и монометилированию Lys1163 в APOB, были значительно ниже в клетках METTL13 KO (рис.5а). Относительная интенсивность, с которой обнаруживается сайт, зависит как от фракционной занятости модификации, так и от относительной распространенности модифицированного белка. Примечательно, что белок APOB был сильно недопредставлен в клетках METTL13 KO, но этого не было в случае eEF1A (дополнительный рис. 8b), предполагая, что только метилирование последнего зависит от METTL13.

MT13-N катализирует метилирование eEF1A-Lys55. — график вулкана , показывающий различия в средних интенсивностях МС для сайтов метилирования лизина в клетках HAP-1 WT и METTL13 KO.Изогнутые линии представляют границу значимости (FDR = 0,01 и s0 = 0,1). Указаны важные сайты, диметилирование Lys55 в eEF1A (eEF1A-K55-Me2) и монометилирование Lys1163 в APOB (APOB-K1163-Me1). b Ионные хроматограммы, представляющие различные метилированные формы eEF1A-Lys55 в клетках WT, KO и KO, дополненные меткой METTL13 с меткой FLAG (KO + METTL13-FLAG). c Оценка мутанта Lys55-to-Arg (K55R) eEF1A1 в качестве субстрата для MT13-N. Конструкции eEF1A1 инкубировали с MT13-N, как указано, и метилирование визуализировали с помощью флюорографии (верхняя панель).Соответствующая мембрана, окрашенная по Ponceau S, показана для оценки нагрузки белком (нижняя панель)

Чтобы подтвердить, что METTL13 отвечает за генерацию метилирования Lys55 in vivo, и чтобы оценить степень присутствия модификации, мы количественно определили уровни различные метилированные виды генерируемого эндопротеиназой Glu-C пептида eEF1A, включающего Lys55, в клетках WT и METTL13 KO (фиг. 5b и дополнительная фиг. 9). В клетках WT диметилированные разновидности Lys55 были преобладающей формой, и этот сайт был обнаружен исключительно неметилированным в клетках METTL13 KO.Более того, комплементация клеток KO эктопически экспрессируемым METTL13 частично восстанавливает метилирование. Чтобы установить, что MT13-N непосредственно метилирует Lys55 в eEF1A, и, таким образом, исключить возможность того, что метилирование этого сайта происходит как вторичное следствие другого METTL13-зависимого события in vivo, мы провели ферментные анализы in vitro. Рекомбинантный eEF1A инкубировали с MT13-N в присутствии AdoMet, и статус метилирования Lys55 оценивали с помощью MS. Этот анализ выявил MT13-N-зависимое образование как моно-, так и диметилирования по Lys55 (дополнительный рис.10). Затем мы оценили мутант Lys55Arg eEF1A в качестве субстрата для MT13-N. В соответствии с предыдущими результатами, MT13-N эффективно метилировал субстрат WT, но eEF1A1, несущий точечную мутацию Lys55Arg, не был субстратом для метилирования (фиг. 5c), что указывает на то, что Lys55 представляет собой единственный сайт-мишень для MT13-N в eEF1A. В заключение, вышесказанное убедительно демонстрирует, что MT13-N необходим и достаточен для метилирования Lys55 в eEF1A.

METTL13-опосредованное метилирование в клетках и тканях

N-концевые домены eEF1A1 и eEF1A2 очень гомологичны, и, следовательно, протеолитические пептиды, покрывающие N-конец или Lys55, идентичны.Таким образом, чтобы оценить, подвергаются ли оба паралога метилированию, опосредованному METTL13 в клетках, мы индивидуально сверхэкспрессировали версии eEF1A1 и eEF1A2 с тегами FLAG в клетках HEK-293, а затем очистили белки с помощью аффинности и проанализировали их статус метилирования (рис. 6a, b ). В соответствии с нашими предыдущими наблюдениями на клетках HAP-1 (рис. 2c и дополнительная таблица 2) мы обнаружили, что диметилированные разновидности Lys55 и триметилированная форма N-конца были преобладающими для обоих паралогов eEF1A (рис.6а, б). Кроме того, мы проанализировали статус метилирования целевых сайтов METTL13 в панели органов крыс, включая печень, почки и кишечник (рис. 6c, d). В соответствии с наблюдениями на линиях клеток человека, Lys55 и N-конец eEF1A в основном были ди- и триметилированы соответственно. Для дальнейшего изучения того, регулируется ли метилирование, опосредованное METTL13, в определенных условиях, мы оценили метилирование eEF1A в клетках HeLa, подвергнутых стрессу 4-нитрохинолин-1-оксидом (4NQO), чтобы вызвать УФ-подобный ответ, аденозиндиальдегид (AdOx) для нарушения метаболизма AdoMet. а также циклогексимид и анизомицин для нарушения трансляции мРНК.Мы обнаружили, что диметилирование Lys55 и триметилирование N-конца являются доминирующими видами во всех проанализированных условиях (рис. 6e, f), но метилирование в обоих сайтах снижается с помощью AdOx (рис. 6g, h). AdOx ингибирует гидролазу AdoHcy и, следовательно, приводит к увеличению уровня AdoHcy в клетке ³⁵ . Поскольку AdoHcy может действовать как конкурентный ингибитор AdoMet-зависимых МТАз ³⁶ , вероятно, что активность METTL13 снижается за счет конкурентного ингибирования из-за повышенного отношения AdoHcy-to-AdoMet в обработанных AdOx клетках.

METTL13-опосредованное метилирование в клетках и тканях. a , b Индивидуальная оценка статуса метилирования eEF1A1 и eEF1A2 в клетках человека. Меченные FLAG eEF1A1 и eEF1A2 были сверхэкспрессированы в клетках HEK-293, и статус метилирования N-конца ( a ) и Lys55 ( b ) оценивали с помощью MS. c , d Оценка статуса метилирования белков eEF1A в панели тканей крысы. То же, что и на предыдущих панелях, но ионные хроматограммы представляют статус коллективного метилирования как eEF1A1, так и eEF1A2 в печени, почках и кишечнике крыс. e , f Оценка метилирования eEF1A в клетках HeLa, подвергшихся стрессу различными соединениями. Показаны ионные хроматограммы, представляющие статус метилирования eEF1A в клетках, обработанных анизомицином, циклогексимидом, 4NQO и AdOx. Пики, соответствующие моно- и диметилированным формам N-конца eEF1A, показаны (стрелка). г , ч Количественный анализ метилирования eEF1A в клетках HeLa, обработанных AdOx. Значимость оценивалась с использованием двустороннего теста t , и столбцы ошибок представляют собой s.d., n = 4

Таким образом, вышеизложенное демонстрирует, что метилирование, опосредованное METTL13, происходит как на паралогах eEF1A, так и в широком диапазоне клеток и тканей млекопитающих. Диметилирование Lys55 и триметилирование N-конца было обнаружено преобладающим во всех оцениваемых условиях, и метилирование обоих сайтов снижалось после обработки AdOx.

Влияние нокаута METTL13 на трансляцию

Поскольку METTL13 нацелен на eEF1A, мы стремились изучить потенциальное влияние делеции гена METTL13 на динамику трансляции.Скорость декодирования конкретных кодонов мРНК можно оценить, анализируя их частоту в рибосомном A-сайте. Это позволяет сделать вывод об относительной скорости трансляции отдельных кодонов между двумя условиями. В соответствии с этой стратегией мы выполнили профилирование рибосом клеток HAP-1 WT и METTL13 KO, чтобы определить относительную занятость A-сайтов всех кодонов в клетках в стационарных условиях (рис. 7a).

Делеция гена METTL13 влияет на трансляцию. a Схема экспериментальной установки эксперимента по нанесению рибосомных отпечатков стопы. b Показана относительная занятость кодонов мРНК в акцепторном сайте рибосомы (A-сайте) в клетках WT по сравнению с KO клетками (темные кружки). В качестве контроля значения занятости кодонов в нижележащем кодоне (A-сайт + 1 кодон) показаны (пустые кружки), а разброс этих данных указан (пунктирные линии). Размер символа представляет частоту кодонов в квартилях (чем больше, тем чаще). Планки погрешностей представляют собой s.d., n = 3. c , d Количественная оценка ключевых аминоацил-тРНК синтетаз и компонентов комплекса eEF1 в клетках WT и METTL13 KO. c Содержание (значение iBAC) цитозольных аминоацил-тРНК синтетаз для Ala (AARS), Pro (EPRS), His (HARS), Lys (KARS), Asn (NARS), Arg (RARS), Ser (SARS). ), Thr (TARS), Trp (WARS) и Tyr (YARS). d Показано содержание eEF1A1 и eEF1A2, а также остальных компонентов комплекса eEF1 (eEF1B2, eEF1D, eEF1E1 и eEF1G).Планки погрешностей представляют s.d., n = 3

Мы обнаружили, что занятость нескольких кодонов была изменена в KO-клетках по сравнению с WT-клетками. Интересно, что кодоны, кодирующие одну и ту же аминокислоту, обычно демонстрируют сходное поведение (рис. 7b). В частности, кодоны для лизина (AAA и AAG) и гистидина (CAC и CAT) показали более высокую занятость A-сайта в KO-клетках, указывая на то, что они транслируются медленнее в мутанте (рис. 7b). И наоборот, все четыре кодона для аланина (GCA, GCG, GCC и GCT) и один кодон для триптофана (TGG) показали более низкую занятость, что указывает на более быструю трансляцию этих кодонов (рис.7б). Кроме того, выбранные кодоны для треонина (ACG), аргинина (AGG) и пролина (CCG) были в большей степени заняты в KO-клетках, в то время как частоты аспарагина (AAC), тирозина (TAC) и серина (TCA и TCC) в клетках A-сайт уменьшился (рис. 7b). Важно отметить, что значения занятости первого кодона, который не был прочитан рибосомой (здесь обозначен сайт A + 1), не демонстрировали подобную тенденцию, подчеркивая, что эти наблюдения являются подлинными биологическими событиями, а не экспериментальным шумом. Фенотипы, связанные с нарушениями ключевых клеточных функций, часто бывают сложными и являются следствием как прямых, так и последующих эффектов.Например, наблюдаемые изменения в скорости трансляции конкретных кодонов могут быть связаны с изменениями в количестве релевантных аминоацил-тРНК синтетаз (asses) в KO-клетках. Обнадеживает то, что уровни белков AARS, EPRS, HARS, KARS, NARS, RARS, SARS, TARS, WARS и YARS не были изменены в клетках KO (рис. 7c) и, более того, уровни белков в комплексе eEF1 также не пострадали (рис. 7d).

Чтобы потенциально получить дальнейшее понимание молекулярной функции метилирования, опосредованного METTL13, мы выполнили ряд дополнительных анализов.Сначала мы проанализировали структуры eEF1A в комплексе с фактором обмена гуаниновых нуклеотидов eEF1Ba ³⁷ и рибосомой ³⁸ (дополнительный рис. -молекулярные взаимодействия. Во-вторых, мы проанализировали использование кодонов и аминокислотный состав белков, отнесенных к категории чрезмерно или недостаточно представленных в протеоме клеток METTL13 KO (дополнительные рисунки 12–13). Таким образом, частотные профили как для кодонов мРНК, так и для аминокислот оказались неразличимы в популяциях модулированных и немодулированных белков, что позволяет предположить, что измененная скорость трансляции конкретных кодонов в METTL13 KO-клетках не является одной только причиной. сильный детерминант протеомного состава.В-третьих, мы исследовали потенциальную роль метилирования лизина eEF1A в модуляции его взаимодействия. С этой целью мы сверхэкспрессировали меченный аффинностью WT eEF1A и соответствующий мутант с дефицитом метилирования, несущие мутации лизина в аргинин хорошо установленных сайтов метилирования (Lys36, Lys55, Lys79, Lys165 и Lys318) в клетках HEK-293 и количественно очищающие белки. Мы обнаружили, что как WT, так и eEF1A с дефицитом метилирования эффективно обогащают компоненты комплекса eEF1 (EEF1B2, EEF1G и EEF1D), а также аминоацил-тРНК синтетазы (VARS и CARS) (дополнительный рис.14a, b и дополнительные данные 5-6) и, что важно, что взаимодействующие вещества для обоих белков-приманок были обогащены с сопоставимой эффективностью (дополнительный рис. 14c, d). Мы пришли к выводу, что метилирование лизина eEF1A не является сильной детерминантой его интерактома.

Таким образом, мы наблюдали кодон-специфические изменения скорости трансляции при сравнении клеток METTL13 KO с соответствующими WT и пришли к выводу, что эти изменения, вероятно, связаны с отсутствием метилирования на N-конце и Lys55 в eEF1A.

Страница не найдена «Домашняя страница Leen-Kiat Soh

Преодолеть разрыв в области цифровой обработки изображений с помощью регистраторов медицинских устройств

Медицинская визуализация — один из самых больших препятствий на пути к электронным медицинским картам (ЭМК).Многие медицинские учреждения вложили значительные средства в существующее оборудование для производства пленок и бумаги, которое они не могут легко заменить.

Радиология и кардиология продвинулись вперед в электронную эру, но другие специальности, такие как дерматология, офтальмология и эндоскопия, все еще находятся в стадии перехода. Это делает жизненно важным наличие стратегии подключения устаревшего оборудования к корпоративным системам EHR.

Регистраторы медицинских изображений и видеоустройств (MDR) являются важной частью этой стратегии.Видеорегистраторы записывают неподвижные изображения и видео в реальном времени в различных аналоговых форматах и ​​интегрируют полученные цифровые файлы в систему EHR.

Как правило, системы видеорегистратора содержат высокопроизводительные датчики изображения с достаточным объемом памяти и возможностей обработки. В MDR традиционно использовался проводной GbE для связи, но добавление Wi-Fi упрощает подключение устройств к корпоративной сети больницы. Проводные или беспроводные интерфейсы данных должны быть очень надежными и поддерживать передачу изображений в реальном времени.Это важно для таких приложений, как хирургия и реанимация.

Как и другие технологии обработки изображений, рынок видеорегистраторов основывает некоторые отличия своей продукции на способности работать с форматами с увеличивающимся разрешением изображения. Врачи ценят эту дополнительную четкость изображения, поскольку изображения более высокого качества часто позволяют поставить более точный диагноз.

Чтобы быть практичным, MDR должны быть небольшими, надежными и легко передвигаться по предприятию на небольшой тележке. Предпочтительны маломощные безвентиляторные конструкции, так как их легче чистить.Кроме того, безвентиляторные системы с меньшей вероятностью будут беспокоить пациентов, поскольку они производят меньше шума. И, конечно же, устройства должны пройти сертификаты FCC, CE и UL для использования в больничных условиях.

HIPAA требует, чтобы медицинские организации защищали данные пациентов, и налагает строгие штрафы за несоблюдение. Нарушение безопасности не только нарушает конфиденциальность пациента, но также может привести к краже личных данных, поскольку электронные записи содержат важную личную информацию. Таким образом, безопасность — основная цель проектирования любого устройства обработки данных, подключенного к сети, такого как видеомагнитофоны.

Новые процессоры Intel ^® Core ^™ 7-го поколения предлагают несколько важных функций для видеорегистраторов. В частности, они включают ускоренные аппаратные медиакодеки 4K, которые включают кодирование, декодирование и транскодирование видео HEVC (10-бит), VP8, VP9 и VDENC.

Улучшается качество фотографий. Производительность ЦП лишь немного выше, чем в предыдущем поколении, но память и хранилище значительно улучшены. В частности, интерфейсы памяти получают поддержку DDR4, включая поддержку DDR4 1.2 В до 2133. Что касается хранилища, технология Intel ^® Ready Mode для PCIe * повышает производительность, скорость отклика и надежность.

Несмотря на увеличение скорости, энергопотребление осталось прежним. Детали доступны с TDP всего 15 Вт, что делает безвентиляторную конструкцию легкой.

Не забыта и безопасность. Здесь представлены функции Intel ^® Software Guard Extensions (Intel ^® SGX) для защиты данных во время использования, Intel ^® Memory Protection Extensions (Intel ^® MPX) для защиты памяти от атак с перегрузкой буфера и Intel ^® Boot Guard для безопасной загрузки машин.

Достоинства нового чипа можно увидеть в компактной материнской плате Mini-ITX KU171 от DFI (рис. 1). Эта плата нацелена на такие рынки МЛУ, как рентгеновская флюорография, ультразвук и системы визуализации сосудов.

Благодаря технологии активного управления Intel ^® KU171 поддерживает удаленное внеполосное управление. Intel ^® AMT обеспечивает ИТ-мониторинг и управление активами обработки через защищенное соединение, позволяя медицинскому ИТ-персоналу управлять MDR, как и любым другим корпоративным устройством.

Модуль Wi-Fi, установленный в слот M.2 KU171, обеспечивает удобное подключение к сети, позволяя передавать захваченные изображения и видео на портативный компьютер врача или в центральную систему EHR.

Технология Embedded IoT предоставляет производителям видеорегистраторов средства для обновления интерфейсов, возможностей обработки и емкости хранилища по мере продвижения дорожных карт процессоров. Облегчая переход к ЭУЗ, МЛУ помогают медицинским организациям предоставлять более оперативную и качественную помощь, одновременно снижая стоимость этой помощи.

Идентификация янтарных и охристых мутантов вируса человека Ad2 + ND1 в JSTOR

Хотя аденовирусы человека плохо растут в клетках обезьян, этот дефект можно преодолеть либо путем коинфекции клеток обезьяньим вирусом 40 (SV40), либо путем встраивания соответствующей части генома SV40 в геном аденовируса с образованием гибридного вируса аденовирус-SV40. . Недефектный гибридный вирус аденовируса-2-SV40, Ad2 + ND1, содержит вставку 17% генома SV40, который кодирует по крайней мере часть белка 30 000 дальтон.Набор мутантов Ad2 + ND1 в диапазоне хозяев, которые утратили способность расти в клетках обезьян и ведут себя как точечные мутанты, не могут синтезировать белок ND1 30 000 дальтон. Трансляция in vitro SV40-специфической мРНК из инфицированных мутантами клеток дает уникальные короткие полипептиды вместо белка 30 000 дальтон. Здесь мы показываем, что этот набор мутантов диапазона хозяев включает бессмысленные мутации как охры, так и янтаря. Когда SV40-специфическая мРНК от мутантов диапазона хозяев транслируется in vitro с образованием полипептидных фрагментов, тРНК-супрессор дрожжей может частично восстанавливать синтез белка дикого типа размером 30 000 дальтон.Согласно этому анализу, один мутант имеет цвет охры, а два — янтарного цвета.

PNAS — это самый цитируемый в мире междисциплинарный научный сериал. Он публикует высокоэффективные исследовательские отчеты, комментарии, мнения, обзоры и т. Д. доклады коллоквиума и акции Академии. В соответствии с руководящими принципы, установленные Джорджем Эллери Хейлом в 1914 году, PNAS издает краткие первые объявления членов Академии и иностранных партнеров подробнее важный вклад в исследования и работу, которая, по мнению Участника, иметь особое значение.

Национальная академия наук (НАН) — это частная некоммерческая организация ведущих исследователей страны.