Стафилококк эпидермис 10 в 5 степени: Эпидермальный Стафилококк (Epidermidis Staphylococcus) норма в мазке у женщин, мужчин и детей в носу, моче, кале: посев, лечение

Содержание

Бесплатные консультации врачей онлайн

Вопрос создается. Пожалуйста, подождите…

Только зарегистрированные пользователи могу задавать вопрос.
Зарегистрируйтесь на портале, задавайте вопросы и получайте ответы от квалифицированных специалистов!

Напоминаем, что стоимость публикации вопроса — 10 бонусов.

Зарегистрироваться Как получить бонусы

К сожалению, у вас недостаточно бонусов для оплаты вопроса.
Напоминаем, что стоимость публикации вопроса — 10 бонусов.

Как получить бонусы

Раздел медицины*: — Не указано —КоронавирусАкушерствоАллергология, иммунологияАнестезиологияВенерологияВертебрологияВетеринарияГастроэнтерологияГематологияГепатологияГериатрияГинекологияГирудотерапияГомеопатияДерматологияДиетологияИглотерапия и РефлексотерапияИнфектология и паразитологияКардиологияКардиохирургияКосметологияЛабораторная и функциональная диагностикаЛечение травмЛогопедияМаммологияМануальная терапияМРТ, КТ диагностикаНаркологияНеврологияНейрохирургияНетрадиционные методы леченияНефрологияОбщая хирургияОнкологияОстеопатияОториноларингологияОфтальмологияПедиатрияПлазмаферезПластическая хирургияПодологияПроктологияПсихиатрияПсихологияПсихотерапияПульмонология, фтизиатрияРадиология и лучевая терапияРеабилитологияРеаниматология и интенсивная терапияРевматологияРепродукция и генетикаСексологияСомнологияСпортивная медицинаСтоматологияСурдологияТерапияТравматология и ортопедияТрансфузиологияТрихологияУЗИУльтразвуковая диагностикаУрология и андрологияФармакологияФизиотерапияФлебологияЧелюстно-лицевая хирургияЭндокринологияЗатрудняюсь выбрать (будет выбрана терапия)

Кому адресован вопросВопрос адресован: ВсемКонсультантам

Консультант, которому задается вопрос: Всем.

..Агабекян Нонна Вачагановна (Акушер, Гинеколог)Айзикович Борис Леонидович (Иммунолог, ЛОР (Оториноларинголог), Невролог, Педиатр, Терапевт, Аллерголог, Гастроэнтеролог)Акмалов Эдуард Альбертович (Аллерголог, Врач спортивной медицины)Александров Павел Андреевич (Венеролог, Гепатолог, Инфекционист, Паразитолог, Эпидемиолог)Александрова Анна Михайловна (Педагог, Психолог, Психотерапевт)Али Мохамед Гамал Эльдин Мансур (Педиатр)Аристова Анастасия Михайловна (Андролог, Уролог, Хирург)Армашов Вадим Петрович (Хирург)Афанасьева Дарья Львовна (Кардиолог, Терапевт)Беляева Елена Александровна (Гинеколог, Невролог, Рефлексотерапевт)Бушаева Ольга Владимировна (Пульмонолог, Терапевт)Врублевская Елена (Педиатр)Гензе Ольга Владимировна (Генетик, Педиатр)Глазной Василий Иванович (Сурдолог)Горохова Юлия Игоревна (Венеролог, Врач общей практики, Дерматолог)Григорьева Алла Сергеевна (Врач общей практики, Терапевт)Демидова Елена Леонидовна (Психолог, Психотерапевт)Денищук Иван Сергеевич (Андролог, Уролог)Дибиров Магомед Гусейнович (Стоматолог)Довгаль Анастасия Юрьевна (Маммолог, Онколог, Радиолог)Долгова Юлия Владимировна (Педиатр)Дьяконова Мария Алексеевна (Гериатр, Терапевт)Жердакова Дарья Владимировна (Акушер, Гинеколог)Загумённая Анна Юрьевна (Врач спортивной медицины, Гирудотерапевт, Диетолог, Косметолог, Терапевт)Зверев Валентин Сергеевич (Ортопед, Травматолог)Згоба Марьяна Игоревна (Окулист (Офтальмолог))Зинченко Вадим Васильевич (Рентгенолог, Хирург)Зорий Евген Владимирович (Невролог, Психолог, Терапевт, Хирург)Извозчикова Нина Владиславовна (Гастроэнтеролог, Дерматолог, Иммунолог, Инфекционист, Пульмонолог)Илона Игоревна (Врач общей практики, Гастроэнтеролог, Терапевт, Эндокринолог)Калявина Светлана Николаевна (Акушер, Гинеколог)Калягина Екатерина (Другая специальность)Карпенко Алик Викторович (Ортопед, Травматолог)Касимов Анар Физули оглы (Онколог, Хирург)Киреев Сергей Александрович (Психиатр, Психолог, Психотерапевт)Кирнос Марина Станиславовна (Стоматолог, Стоматолог детский, Стоматолог-терапевт)Копежанова Гульсум (Акушер, Гинеколог)Корж Анна Анатольевна (Акушер, Гинеколог, Маммолог, Эндокринолог)Кравцов Александр Васильевич (Нарколог, Психиатр)Красильников Андрей Викторович (Врач ультразвуковой диагностики, Медицинский директор, Флеболог, Хирург)Кряжевских Инна Петровна (Терапевт, Гастроэнтеролог)Кудряшова Светлана Петровна (Эндокринолог)Куртанидзе Ираклий Малхазович (Окулист (Офтальмолог))Кущ Елена Владимировна (Диетолог, Терапевт)Лазарева Татьяна Сергеевна (ЛОР (Оториноларинголог))Лаптева Лариса Ивановна (Невролог)Лебединская Татьяна Александровна (Психолог, Психотерапевт)Ледник Максим Леонидович (Венеролог, Дерматолог)Леонова Наталья Николаевна (Детский хирург)Литвиненко Станислав Григорьевич (Ортопед, Травматолог)Лямина Ирина Алексеевна (Акушер)Максименко Татьяна Константиновна (Инфекционист)МАЛЬКОВ РОМАН ЕВГЕНЬЕВИЧ (Диетолог, Остеопат, Реабилитолог)Мамедов Рамис (ЛОР (Оториноларинголог))Мартиросян Яков Ашотович (Детский хирург, Проктолог, Травматолог, Уролог, Хирург)Маряшина Юлия Александровна (Акушер, Венеролог, Врач ультразвуковой диагностики, Гинеколог, Педиатр)Матвеева Ярослава Дмитриевна (Педиатр)Мельшина Алёна Игоревна (Окулист (Офтальмолог))Мершед Хасан Имадович (Вертебролог, Нейрохирург)Миллер Ирина Васильевна (Невролог)Мильдзихова АЛЬБИНА Бексолтановна (Врач общей практики, Гинеколог, ЛОР (Оториноларинголог), Педиатр, Терапевт)Муратова Наталья Сергеевна (Врач общей практики, Диетолог)Мухорин Виктор Павлович (Нефролог)Наумов Алексей Алексеевич (Мануальный терапевт)Никитина Анна Алексеевна (Окулист (Офтальмолог))Никишин Андрей Александрович (Психиатр, Психолог, Психотерапевт)Ольга Викторовна (Невролог, Неонатолог, Педиатр, Реабилитолог, Терапевт)Павлова Мария Игоревна (Стоматолог, Стоматолог-хирург, Челюстно-лицевой хирург)Панигрибко Сергей Леонидович (Венеролог, Дерматолог, Косметолог, Массажист, Миколог)Пантелеева Кристина Алексеевна (Невролог)Пастель Владимир Борисович (Ортопед, Ревматолог, Травматолог, Хирург)Паунок Анатолий Анатольевич (Андролог, Уролог)Першина Наталия Сергеевна (Невролог)Пикульская Вита Григорьевна (Терапевт)Прокофьева Анастасия Михайловна (ЛОР (Оториноларинголог))Прохоров Иван Алексеевич (Нейрохирург, Хирург)Пушкарев Александр Вольдемарович (Гинеколог, Психотерапевт, Реабилитолог, Репродуктолог (ЭКО), Эндокринолог)Пыстогов Андрей Сергеевич (Терапевт, Эндокринолог)Пьянцева Екатерина Вячеславна (Педиатр)Радевич Игорь Тадеушевич (Андролог, Венеролог, Сексолог, Уролог)Сапрыкина Ольга Александровна (Невролог)Свечникова Анастасия Евгеньевна (Стоматолог, Стоматолог детский, Стоматолог-ортопед, Стоматолог-терапевт, Стоматолог-хирург)Семений Александр Тимофеевич (Врач общей практики, Реабилитолог, Терапевт)Сергейчик Никита Сергеевич (Анестезиолог, Гомеопат)Сидорова Людмила Александровна (Врач функциональной диагностики, Психиатр)Силуянова Валерия Викторовна (Акушер, Врач ультразвуковой диагностики, Гинеколог)Соболь Андрей Аркадьевич (Кардиолог, Нарколог, Невролог, Психиатр, Психотерапевт)Солдатов Вадим Александрович (Невролог)Сошникова Наталия Владимировна (Эндокринолог)Степанова Татьяна Владимировна (ЛОР (Оториноларинголог))Степашкина Анастасия Сергеевна (Гематолог, Пульмонолог, Терапевт)Сурова Лидия (Гирудотерапевт, Невролог, Терапевт)Суханова Оксана Александровна (Клинический фармаколог, Психолог)Сухих Данил Витальевич (Психиатр)Тимченко Алла Владимировна (Дерматолог, Косметолог)Тихомиров Сергей Евгеньевич (Нейрохирург)Тумарец Кирилл Михайлович (Врач лечебной физкультуры, Врач спортивной медицины, Кинезитерапевт, Реабилитолог, Физиотерапевт)Турлыбекова Венера Равильевна (Врач общей практики, Педиатр)Устимова Вера Николаевна (Гематолог, Терапевт, Трансфузиолог)Фатеева Анастасия Александровна (Гастроэнтеролог, Диетолог, Психотерапевт, Эндокринолог)Федотова Татьяна Владимировна (Врач ультразвуковой диагностики, Гематолог, Терапевт)Фомина Ольга Владимировна (Гематолог, Маммолог, Нарколог, Онколог)Фоминов Олег Эдуардович (Сексолог)Фоминов Олег Эдуардович (Сексолог)Фурманова Елена Александровна (Аллерголог, Иммунолог, Инфекционист, Педиатр)Хасанов Эльзар Халитович (Андролог, Врач ультразвуковой диагностики, Онколог, Уролог, Хирург)Хасанова Гульнара Сунагатулловна (Акушер, Врач ультразвуковой диагностики)Чупанова Аида (Акушер, Гинеколог)Чупанова Аида Идаятовна (Акушер, Гинеколог, Репродуктолог (ЭКО))Швайликова Инна Евненьевна (Окулист (Офтальмолог))Шибанова Мария Александровна (Нефролог, Терапевт)Щепетова Ольга Александровна (Терапевт)Ягудин Денар Лукманович (ЛОР (Оториноларинголог))Ярвела Марианна Юрьевна (Психолог)

Описание проблемы:

Пол: —укажите пол—ЖенщинаМужчина

Возраст:

Категория 18+: Обычный18+

Посев на золотистый стафилококк (S.

aureus), количественный результат

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить инфицированность золотистым стафилококком и определить количество возбудителя. При выявлении патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов будет определена их чувствительность к антимикробным препаратам (антибиотикам и бактериофагам). В ином случае чувствительность к антибиотикам и бактериофагам не определяется, т.к. не имеет диагностического значения.

Staphylococcus aureus culture, MRSA culture (Methicillin-resistant S. aureus culture), quantitative.

Микробиологический метод.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Грудное молоко, кал, мазок из зева, мазок с конъюнктивы, мазок из носа, мазок урогенитальный (с секретом предстательной железы), мокроту, отделяемое раны, отделяемое уха, ректальный мазок, среднюю порцию утренней мочи.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Золотистые стафилококки (Staphylococcus aureus) – грамположительные условно-патогенные бактерии рода Staphylococcus, являющиеся наиболее частой причиной стафилококковых, в частности внутрибольничных, инфекций.

Золотистые стафилококки в норме могут располагаться на коже, слизистой оболочке носа и реже в гортани, влагалище, кишечнике. Они встречаются у 30  % здоровых людей.

Если у человека слабая иммунная система или нарушен нормальный состав микрофлоры, то при повреждении кожи (слизистых оболочек) золотистый стафилококк может приводить к разнообразным местным и системным инфекционно-воспалительным поражениям:

  • кожи (карбункулам, импетиго, фолликулиту),
  • молочных желез (маститу),
  • дыхательных путей и ЛОР-органов (тонзиллиту, гаймориту, отиту, фарингиту, ларинготрахеиту, пневмонии),
  • мочевыводящих путей (уретриту, циститу, пиелонефриту),
  • пищеварительной системы (энтероколиту, аппендициту, перитониту, парапроктиту, холециститу),
  • костно-суставной системы (остеомиелиту, артриту).

В отдельных случаях возможна генерализация инфекции с развитием септикопиемии. Производимый золотистым стафилококком энтеротоксин вызывает пищевые отравления и синдром токсического шока. Основные источники инфекции: здоровые (носители) и больные люди, домашние и сельскохозяйственные животные, а также пища, содержащая возбудителя инфекции (чаще всего это сахаросодержащие молочные продукты). Инфицирование может происходить контактным и воздушно-пылевым путем. Возможно аутоинфицирование.

Для идентификации золотистого стафилококка проводится посев клинического материала на питательные среды, где при наличии S. aureus через 18-24 часа наблюдается рост колоний золотистого цвета.

Определение количества бактерий может потребоваться, например, чтобы понять, нужно ли проводить лечение: в некоторых случаях, если количество небольшое, лечение не проводится. Решение о его необходимости зависит от клинических проявлений, а также от количества стафилококка. При небольшом содержании микробов и отсутствии симптоматики лечение может вообще не понадобиться, т. к. и в норме на слизистой могут находиться эти микробы. Стафилококк в кишечнике обнаруживается постоянно, это не повод для лечения, но если его количество превышено, тогда нужны меры (бактерия может вызывать колики и расстройства). Стафилококк в мазке без симптомов вагинита также является нормой, в то время как большие количества стафилококка в мазке, наряду с повышением лейкоцитов, требуют лечения.

Наличие стафилококка не обязательно означает инфекцию, это может быть бессимптомное носительство, например при посеве мазков из носа и зева носительством считается количество бактерий до 103. Однако более высокие показатели говорят нам о золотистом стафилококке как о причине заболевания, и это уже далеко не бессимптомное носительство.

Многое зависит от возраста пациента. Например, золотистый стафилококк в количестве 104 является вполне нормальным показателем для детей старше 1 года, но у грудных детей в таком количестве уже потребует лечения.

В любом случае наличие стафилококка при отсутствии симптомов болезни – еще не повод к назначению лекарств.

Количество стафилококка может определяться до и после лечения. Если выясняется, что рост возбудителя обильный, значит, инфекция набирает обороты, предыдущая терапия была неудачной и срочно требуется новый курс лечения; умеренный и скудный рост микроорганизмов по результатам последних анализов говорит об успешности терапии. Кроме того, в дальнейшем необходимо контролировать количество стафилококков в течение 1 или 2 месяцев после пройденного лечения.

Отмечено также, что после пребывания больных в хирургической клинике стафилококк обнаруживался у них вдвое чаще, чем при поступлении. У больных, поступающих в стационары, наблюдается замена антибиотикочувствительных стафилококков на антибиотикоустойчивые.

Лечение больных стафилококковой болезнью препаратами пенициллина или другими давно применяемыми антибиотиками часто остается безрезультатным, поскольку такие препараты нередко только усугубляют тяжесть течения инфекции. Поэтому так важно установить, какие антибиотики будут эффективны при лечении стафилококка.

Для чего используется исследование?

  • Для определения целесообразности лечения.
  • Для дифференциации бактерионосительства и опасного инфицирования.
  • Для контроля за состоянием пациента после проведенного лечения.
  • Для того чтобы подтвердить, что стафилококк является причиной возникшего заболевания (об этом свидетельствуют высокие показатели посева).

Референсные значения: нет роста.

Золотистый стафилококк в мазке в небольших количествах является частью нор­мальной микрофлоры человека. Значительное повышение стафилококка в мазке может быть симптомом воспалительного процесса, кожных инфекций (угри и пр.) и очень опасных заболеваний (пневмония, остеомиелит, эндокардит и др.). Результат посева интерпретирует врач исходя из того, в каком количестве выделены микроорганизмы.

«Страшный зверь» стафилококк / «Мой кроха и я»

Сентябрь 2010

Наталия Рубина; консультанты: Ирина Перрэн, заведующая педиатрическим отделением Европейского Медицинского Центра; Наталья Таран, неонатолог, к. м. н., научный I сотрудник научно-консультативного отделения 1 НИИ Питания РАМН

Сразу после рождения малыш сталкивается с очень опасным врагом — золотистым стафилококком. Как распознать стафилококковую инфекцию и, по возможности, избежать её?

История одной мамы

На 12-й день после выписки из роддома Олеся обнаружила, что у её маленькой дочки опухли и стали гноиться глазки, а на попке появились покраснения. При этом малышка не переставая плакала. Участковый врач осмотрела девочку и предположила, что покраснения на её коже — результат погрешностей в питании мамы. Олеся села на жесточайшую диету. Однако ещё через две недели вокруг рта у ребёнка появились какие-то высыпания, кожа начала отчаянно шелушиться, а у самой Олеси появились трещины на сосках, грудь стала твёрдой и очень болезненной, подскочила температура.

В детской поликлинике ей предложили сдать грудное молоко на анализ. Через пару дней стали известны его результаты — в молоке обнаружен эпидермальный и золотистый стафилококк. Участковый врач настаивала на прекращении грудного вскармливания и назначила смесь. В течение месяца Олеся и её дочь принимали антибиотики. При этом она продолжала сцеживать молоко, не давая его ребёнку. За этот месяц малышке стало заметно лучше, и отпала необходимость давать ей лекарства. Второй анализ молока показал наличие в нём только эпидермального стафилококка, но врач всё равно настаивала на отмене грудного вскармливания. Тогда Олеся решила обратиться за консультацией к другому доктору, и тот заверил её, что наличие в молоке любой разновидности стафилококка не опасно для ребёнка. Когда Олесиной дочке исполнилось 2 месяца, она уже снова питалась исключительно маминым молоком.

Прокомментировать эту ситуацию мы попросили неонатолога Наталью Таран: «Скорее всего, девочка заразилась стафилококковой инфекцией ещё в роддоме, и после выписки болезнь перешла в активную форму. А уже от ребёнка через трещины на сосках заразилась и мама. Те высыпания на коже, которые участковый врач приняла за результат неправильного питания мамы, скорее всего, были также вызваны стафилококковой инфекцией. При этом странно, что врач не уделила никакого внимания симптомам конъюнктивита. Ведь он тоже может быть вызван стафилококком. Гнойное отделяемое из глаз нужно было сдать на анализ, чтобы выявить возбудителя. Зато врач явно переусердствовала, отменив грудное вскармливание. Если мама получает антибиотики против стафилококковой инфекции, то с молоком лечение против болезни получает и ребёнок. Грудное вскармливание отменяется в единственном случае — если у мамы гнойный мастит. Но молоко с гнойным отделяемым ребёнок не станет пить и сам. Хорошо, что мама не растерялась и, почувствовав сомнение, обратилась за дополнительной консультацией к другому специалисту».

Стафилококки — это целый род бактерий. На сегодня известно множество видов стафилококка, многие из которых живут на коже и слизистых оболочках человека, а также в кишечнике. Большинство стафилококков абсолютно безвредны, вызывать болезни могут только три представителя этого семейства — эпидермальный, сапрофитный и золотистый стафилококки. Причём последний — самый опасный. Организм здорового человека с лёгкостью справляется со стафилококком. Однако если по каким-то причинам снижается иммунитет, стафилококк идёт в атаку, вызывая различные заболевания. Этот микроб также может проникнуть в организм там, где нарушена целостность кожи (у роженицы, к примеру, через трещины на сосках, а у новорождённого — через пупочную ранку).

Знакомство со стафилококком возможно сразу же после рождения — младенец может получить эту бактерию, проходя через родовые пути или же с кожи мамы, как только она впервые приложит его к груди. Большинство детей легко справляется с микробом, но у недоношенных малышей и тех, кто родился со сниженным иммунитетом вследствие осложнений во время беременности, стафилококк может вызвать различные заболевания.

Симптомы

И у детей, и у взрослых различают раннюю и позднюю форму стафилококковой инфекции. Ранняя проявляется в течение нескольких часов после попадания бактерии в организм, болезнь при этом начинается остро и тяжело — резко повышается температура, могут начаться понос, рвота, ребёнок становится вялым, теряет аппетит. Что характерно, у младенцев с таких симптомов начинаются все инфекции. Поэтому даже не пытайтесь ставить диагноз самостоятельно, а при появлении первых признаков заболевания обращайтесь к врачу. Поздняя форма стафилококковой инфекции проявляется через 3-5 дней. Как правило, инфекция в первую очередь поражает кожу и, если вовремя не начать лечение, может пойти глубже, поражая внутренние органы, и даже вызвать сепсис.

Однако в некоторых случаях болезнь протекает и бессимптомно или с незначительными гнойничковыми поражениями кожи. Так что, если вы заметили на коже ребёнка какие-либо высыпания, не спешите списывать их на погрешности в вашем питании или потницу, — покажите их врачу. Если доктор заподозрит, что они имеют инфекционный характер, он назначит необходимые анализы, чтобы выявить возбудителя. Как правило, в таких случаях делаются соскобы с кожи и общий анализ крови, который покажет, болен ли ребёнок.

Бессимптомное носительство у взрослого крайне опасно для окружающих — ведь человек не знает, что он болен, и не предпринимает никаких мер, являясь при этом источником инфекции. В то же время в организме заболевшего человека количество стафилококка резко возрастает, а его патогенные свойства усиливаются. Поскольку стафилококковая инфекция передаётся контактным путём, то заразиться ей можно, просто прикоснувшись к больному.

«В организме ребёнка, иммунитет которого ослаблен в силу определённых причин, нарушается баланс полезных и вредных бактерий, и золотистый стафилококк может начать активно размножаться, — говорит педиатр Европейского Медицинского Центра Ирина Перрэн. — Но хочу особо отметить: даже если в анализах обнаружен стафилококк, но клинической картины заболевания нет (ребёнок хорошо себя чувствует, прибавляет в весе), то никакого медикаментозного лечения не требуется. Лечат пациента, а не анализы.

Бить тревогу нужно, если у ребёнка есть признаки бактериальной инфекции: повышенная температура, потеря аппетита, снижение прибавки веса, появление гнойничков на коже, воспаление околопупочного кольца, понос и т. д. В таком случае следует незамедлительно обратиться к врачу, который назначит необходимое лечение».

КАК ПРОЯВЛЯЕТСЯ СТАФИЛОКОККОВАЯ ИНФЕКЦИЯ?

Стафилококковая инфекция вызывает у новорождённых множество самых различных заболеваний. Все они крайне опасны, поэтому при обнаружении первых симптомов обратитесь к врачу.

ЭНТЕРИТ (ЭНТЕРОКОЛИТ)

Признаки болезни
Частый (до 15 раз в сутки) кашицеобразный, слизистый, водянистый ступ, ребёнок плачет, часто срыгивает, его животик вздут. Может подняться высокая температура и начаться рвота. Последнее особенно опасно для младенцев, поскольку приводит к быстрому обезвоживанию организма.

Лечение
Необходима госпитализация. Как только вы заметили первые симптомы, как можно скорее вызывайте врача. А пока доктор едет, восполняйте дефицит жидкости в организме ребёнка — каждые 10 минут давайте ему столовую ложку воды.

Народные средства — их можно использовать только параллельно с лечением в больнице или после выписки.

  • Настой цветов календулы: 1 ч. л. цветов на стакан воды. Давать малышу понемногу в промежутках между кормлениями.
  • Настой цветов ромашки аптечной: 1 ст. л. сухих цветов залить стаканом кипятка, кипятить 5 минут, настаивать 4 часа, процедить. Давать по 1 ч. л. после кормления.
Отвар из корок плодов граната: взять 20 г сухих корок или 50 г зёрен граната, залить стаканом воды, кипятить на медленном огне 30 минут, процедить. Давать пить по 1 ч. л. 2 раза в день.

ИНФЕКЦИОННЫЙ КОНЬЮНКТИВИТ

Признаки болезни
Ребёнок плачет, его глаза покраснели, опухли и слезятся, из них выделяется гной, образуются жёлто-зелёные корки. После сна ресницы склеены гноем так, что малыш с трудом открывает глазки.

Лечение
Назначает врач. Необходимо сдать выделения из глаз в лабораторию на анализ, чтобы выявить возбудителя заболевания и правильно подобрать антибиотик.

Народные средства

  • Протирать веки младенца грудным молоком. Однако это средство не подходит, если и у мамы в анализе молока обнаружен стафилококк.
  • Протирать глаза ребёнка ватными тампонами, смоченными в чайной заварке (крепкий раствор чёрного чая).
  • Прокипятите одну чайную ложку мёда в стакане воды в течение 2 минут. Когда медовая вода остынет, из неё делают примочки на глаза 2 раза в день по 20 минут. Эту же воду капают в глаза по 2-3 капли 2 раза вдень.
  • Одну чайную ложку цветков календулы залить стаканом кипятка, настаивать 30-40 минут, затем тщательно процедить. Полученным раствором несколько раз в день промывать глазки ребёнка.
«ПУЗЫРЧАТКА» (ПЕМФИГУС) НОВОРОЖДЁННЫХ (ПОВЕРХНОСТНОЕ ГНОЙНОЕ ВОСПАЛЕНИЕ КОЖИ)

Признаки болезни
На коже (в нижней части живота, в складках шеи, на спине) образуется множество пузырьков с мутным содержимым. Кожа в этих местах отёчная, покрасневшая. Ребёнок вялый, отказывается от еды.

Лечение
Лекарства назначает только врач. Как правило, это курс антибиотиков.

Народные средства

  • Протирать пузыри ваткой, смоченной в камфорном масле (до 4-5 раз в день).
МНОЖЕСТВЕННЫЕ АБСЦЕССЫ

Признаки болезни
На коже появляются багрово-красные гнойнички, которые вскрываются с выделением жёлто-зелёного гноя. У ребёнка поднимается температура, он вялый или, наоборот, капризный.

Лечение
При первых признаках заболевания обратитесь к врачу.

СЕПСИС

По течению болезни различают септицемию и септикопиемию. Септицемия начинается бурно с развития желтухи, быстрой потери массы тела, тахикардии. Ребёнок беспокойный, у него могут начаться судороги. Септикопиемия начинается с появления гнойничков на коже, иногда развиваются абсцессы. При пупочном сепсисе пупочная ранка воспаляется, кожа вокруг отёчная, красная.

Лечение
Лечение назначает врач. Как правило, это антибиотики широкого спектра, стимулирующая терапия — переливание крови, введение плазмы, витамины.

Нона Овсепян, врач-консультант Независимой лаборатории «ИНВИТРО

Для того чтобы определить наличие стафилококка, а также других вредных бактерий в грудном молоке, необходимо сделать посев молока на микрофлору и золотистый стафилококк с определением чувствительности к антибиотикам. Для анализа грудное молоко сцеживают в стерильную пробирку или баночку (вы можете приобрести их в аптеке или лаборатории). Перед сцеживанием руки и молочные железы необходимо обработать мылом, ареолы сосков вытереть 70%-ным спиртом (каждая грудь обрабатывается отдельным тампоном).

Первая порция (5-10 мл) анализа не используется, сцеживается в отдельную посуду, а вторая (10 мл) — в стерильную посуду для анализа. Молоко из левой и правой груди смешивать нельзя, надо собирать в отдельные контейнеры. Для точного результата анализа между сцеживанием молока и доставкой его лабораторию должно пройти не более 3-х часов.

Параллельно с определением количества и качества бактерий в молоке исследуется их устойчивость к антибиотикам и бактериофагам, это необходимо для правильного подбора препарата для лечения стафилококковой инфекции.

При подозрении на стафилококковую инфекцию у новорождённого необходимо исследование кала на патогенную и условно-патогенную микрофлору. Материалом для этого анализа служит кал после естественной дефекации, который нужно собрать в одноразовый контейнер и как можно быстрее (в течение 3-х часов) доставить в лабораторию. Для того, чтобы результаты были достовернее, рекомендуется провести 2-3 кратное исследование с интервалов 1-2 дня.

Золотистый стафилококк может быть причиной развития бронхитов, пневмонии и ряда других воспалительных заболеваний дыхательной системы. В такой ситуации берётся посев с зева и носа с целью выявления золотистого стафилококка. Сдают этот анализ все пациенты, в том числе самые маленькие, строго натощак, а взрослые перед этим анализом не должны чистить зубы (поскольку может искажаться истинная картина).

Посев берётся с помощью специального зонда, который затем помещается в специальную среду для роста бактерий.

При конъюнктивите материал для анализа желательно брать утром до умывания. При наличии обильного гнойного отделяемого используют стерильный тампон. Гной собирают с внутренней поверхности нижнего века движением от наружного к внутреннему углу глазной щели. При этом веки нужно придерживать руками, чтобы при моргании ресницы не касались тампона. Если гной в небольшом количестве, то предварительно тампон смачивают дистиллированной водой.

При кожных заболеваниях, вызванных стафилококком, необходимо брать кожный соскоб или исследовать отделяемое из раны на наличие золотистого стафилококка. Для этого следует обработать кожу вокруг раны антисептиком или ватным тампоном, смоченным 70%-ным этиловым спиртом. Стерильной марлевой салфеткой удаляют некротические (омертвевшие) массы и гной, затем с помощью специального ватного тампона берут отделяемое из раны.

«Больничная» инфекция

Стафилококковую инфекцию называют больничной или роддомовской. У пациентов этих заведений иммунитет, как правило, ослаблен, и стафилококк на этом фоне идёт в атаку. Однако, чтобы инфекция приобрела массовый характер, у неё должен быть очаг — больной человек. Им может быть кто-то из персонала, одна из рожениц или заболевший ребёнок. Механизм передачи инфекции прост — через руки. К примеру, носитель инфекции — медсестра в роддоме. У неё есть небольшие гнойнички на коже, которым она не придала должного значения. Перепеленав или обработав новорождённого без одноразовых перчаток, эта медсестра тут же заражает его. Или же если болен ребёнок, а медсестра взяла его на руки, то заражается уже она. И может передать инфекцию следующему младенцу, с которым будет контактировать.

Для предотвращения вспышек инфекции с рук медперсонала, с мебели и оборудования регулярно делаются смывы — эпидемиологическая служба обрабатывает их специальным раствором, а потом исследует его на наличие различных бактерий, попутно выясняя степень их патогенности. С той же целью роддома два раза в год закрываются на мойку (и, естественно, это делается внепланово сразу же, как только обнаружена инфекция). При этом все поверхности, включая потолок, обрабатываются дезинфицирующими растворами, которые уничтожают бактерии стафилококка. Поэтому выбирая роддом, поинтересуйтесь, когда в последний раз он закрывался на мойку. Если это было несколько месяцев назад, может быть, имеет смысл обратиться в другой роддом.

Молоко безвредно?

Главные «ворота» для стафилококковой инфекции у женщины — трещины на сосках. Поэтому как только они появились, их нужно сразу обработать анилиновыми растворами, к которым стафилококк очень чувствителен, — зелёнка, фукорцин или метиленовый синий. Кормить ребёнка грудью при этом надо, используя специальные накладки на соски (в том числе для облегчения болезненных ощущений). Не стоит мыть молочные железы с мылом перед каждым кормлением, вполне достаточно принимать душ два раза в день. Частое мытье сушит кожу, а это в свою очередь способствует появлению новых трещин на сосках, куда может проникнуть инфекция.

Если трещина резко болезненная, воспалённая, вокруг неё появилось уплотнение, а из груди выделяется гной, то, возможно, мы имеем дело со стафилококковой инфекцией. В этом случае врач может порекомендовать сдать грудное молоко на анализ. Однако если у вас просто появились трещины — это ещё не повод бежать с молоком на анализ. Для этого должны быть симптомы воспаления (резкая пульсирующая боль в груди и гнойное отделяемое). В любом случае, стоит прийти на осмотр к врачу, который определит, что с вами, и поможет быстрее справиться с трещинами.

Если в анализе молока обнаружен эпидермальный стафилококк, скорее всего, анализ был сдан неправильно, и микроб попал туда с кожи. Если же в молоке обнаружен золотистый стафилококк, то с большой вероятностью можно утверждать, что он есть и в крови у женщины. А это уже серьезная ситуация, которая бессимптомно протекать не может, — налицо должны быть проявления бактериальной инфекции (высокая температура, слабость).

Но важно помнить, что наличие любой разновидности стафилококка в молоке (если при этом у женщины нет гнойного мастита) — не повод прекращать грудное вскармливание. Женщине в таком случае нужно будет пройти курс лечения антибиотиками, разрешёнными во время лактации, которые, попадая с грудным молоком к ребёнку, одновременно защищают его от инфекции.

Лечение

Ставить диагноз, а тем более назначать лечение при стафилококковой инфекции должен только врач. Как правило, назначаются антибиотики пенициллинового ряда и бактериофаги (микроорганизмы, избирательно поражающие бактериальные клетки).

Самая распространённая ошибка мам — это самолечение. Как только у вас или ребёнка появились гнойничковые высыпания на коже, высокая температура, понос или рвота, потеря аппетита — сразу же обращайтесь к врачу.

Самая же большая ошибка врачей — это переоценка тяжести ситуации. Если вы считаете, что ваш доктор перестраховывается, например, отменяя грудное вскармливание, не поленитесь обратиться за дополнительной консультацией к другому специалисту.

ВОПРОС ОТ ПОСЕТИТЕЛЬНИЦЫ САЙТА WWW.KROKHA.RU

У ребёнка обнаружен в кале золотистый стафилококк, при этом есть симптомы обычного дисбактериоза (небольшое нарушение стула, срыгивание, лёгкое беспокойство). Надо ли лечить стафилококк? И что в таком случае делать вообще?

НАТАЛЬЯ ТАРАН: Стафилококк не вызывает дисбактериоза. Причина появления стафилококка в анализе, скорее всего, в том, что он (анализ) был неправильно собран, и микроб попал туда с кожи. Так что в первую очередь такой анализ надо пересдать (см. выше). А затем искать и устранять причину дисбактериоза.

ПРОФИЛАКТИКА СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ У НОВОРОЖДЁННЫХ

Как можно быстрее выписывайтесь из родильного дома с ребёнком домой, естественно, если врачи не возражают. Во время пребывания в роддоме, если есть такая возможность, находитесь в одноместной палате и совместно с ребёнком.

Обязательно мойте руки перед кормлением и процедурами по уходу за малышом. Если у вас на руках есть порезы, царапины, то обработайте их фукорцином или зелёнкой. Ну а если на вашей коже появились гнойнички, воспалённые места, то обязательно покажите их доктору. Пока не будет выяснена их причина, за ребёнком лучше ухаживать папе или бабушке.

Внимательно наблюдайте за своим ребёнком. Подъём температуры, вялость, отказ от еды, «беспричинный» плач, высыпания на коже, понос — все это должно насторожить вас и побудить вызвать врача.

Обязательно просите всех родственников, врачей из поликлиники, которые хотят подойти и взять на руки новорождённого, тщательно вымыть руки с мылом. Выделите для них отдельное полотенце. Не стесняйтесь отказать людям, чьё здоровье внушает вам опасение.

Закаливайте малыша с первых дней жизни (см. статью в № 5 журнала «Мой кроха и Я» за 2010 г.), чтобы у него был хороший иммунитет.

Стафилококк s-aureus 10 в 9 степени в носу и зеве — Вопрос детскому лору

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 71 направлению: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 97.52% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Дисбактериоз кишечника — Клиника Здоровье 365 г. Екатеринбург

Микробиоцеоз – это сообщество микроорганизмов, обитающих на территориально ограниченном участке с однородными условиями жизни. Бактерии нормальной кишечной флоры живут, прикрепляясь к кишечной стенке и образуя пленку, покрывающую кишечник изнутри. Через эту пленку происходит все всасывание в кишечнике. Бактерии нормальной кишечной микрофлоры обеспечивают по совокупности 50 – 80% всего пищеварения, а также выполняют защитные функции, нейтрализуют действие чужеродных и гнилостных бактерий.        Бифидобактерии. Это основные представители нормальной кишечной микрофлоры, количество которых в кишечнике должно быть 95 – 99%. Бифидобактерии выполняют важную работу по расщеплению, перевариванию и всасыванию различных компонентов пищи, например, углеводов; они сами синтезируют витамины, а также способствуют усвоению их из пищи. При участии бифидобактерий происходит всасывание в кишечнике железа, кальция и других важных микроэлементов; нейтрализуют различные токсические вещества. В бланке анализа указывается титр бифидобактерий, который должен быть не меньше 107 – 108. Существенное снижение количества бифидобактерий – признак выраженного дисбактериоза.

 

 

Лактобактерии (лактобациллы, молочнокислые микробы, молочнокислые стрептококки).

 

 

Второй по представительству (5% в совокупности микроорганизмов кишечника) и по значимости представитель нормальной флоры. Лактобактерии или молочнокислые микробы вырабатывают молочную кислоту – важнейший компонент для нормальной работы кишечника. В результатах исследования  их количество должно быть не меньше 106 – 107. Дефицит лактобактерий может привести к развитию аллергических заболеваний, запоров, лактазной недостаточности.

 

 

Кишечная палочка с нормальной ферментативной активностью (эшерихии).

 

 

Третий представитель нормальной флоры. Количество кишечной палочки среди других бактерий не превышает 1%, но роль ее очень важна. Во-первых, кишечная палочка является главным конкурентом условно-патогенной флоры, препятствуя заселению чужеродными микробами кишечной стенки; во-вторых, кишечная палочка забирает из просвета кишечника кислород, который является ядом для бифидобактерий и лактобактерий. Снижение общего количества кишечной палочки может быть признаком присутствия в кишечнике небактериальных паразитов (глистов, простейших, которые также нуждаются в кислороде, обделяя им кишечную палочку). Кишечная палочка со сниженной ферментативной активностью. Это неполноценная кишечная палочка, которая не представляет никакого вреда, но при этом не выполняет своих полезных функций. Присутствие данного показателя в анализе является признаком начинающегося дисбактериоза, а также как и снижение общего количества может быть косвенным признаком присутствия в кишечнике глистов или простейших.                               

 

 

В некоторых анализах описываются бактероиды, роль которых неясна, но известно, что это – не вредные бактерии, обычно их количество не имеет практического значения. Все остальные показатели микрофлоры являются условно-патогенной флорой. Они становятся патогенными (нарушающими нормальные функции кишечника) при определенных условиях: повышение их абсолютного количества или снижении функции иммунной системы.      

 

 

Условно-патогенная флора – это лактозонегативные энтеробактерии (клебсиелла, протей, цитробактеры, энтеробактеры, гафнии, серрации), гемолизирующая кишечная палочка и различные кокки (энтерококки, эпидермальные или сапрофитные стафилококки, золотистый стафилококк). Кроме того, к условно-патогенным относятся клостридии, которые высеваются не во всех лабораториях. Условно-патогенная флора внедряется, конкурируя с полезными бактериями, в микробную пленку кишечника, заселяет кишечную стенку и вызывает нарушения работы всего желудочно-кишечного тракта. Дисбактериоз кишечника с повышенным содержанием условно-патогенной флоры может сопровождаться аллергическими кожными реакциями, нарушениями стула (запоры, поносы, зелень и слизь в кале), болями в животе, вздутиями живота, срыгиваниями, рвотами.

 

 

Кокковые формы в общей сумме микробов.

Самыми безобидными представителями условно-патогенной флоры являются энтерококки. Они наиболее часто встречаются в кишечнике у здоровых людей, их количество до 106 — 107 не представляет угрозы здоровью. Если количество превышает 25% (более 107), это чаще всего связано со снижением нормальной флоры. Эпидермальный (или сапрофитный) стафилококк (S. epidermidis, S. saprophyticus). Эти виды стафилококков могут вызывать нарушения, но их количество до 104 является допустимым. Золотистый стафилококк (S. aureus). Один из самых неприятных (наряду с гемолизирующей кишечной палочкой, протеем и клебсиеллой) представителей условно-патогенной флоры. Даже небольшие его количества могут вызвать выраженные клинические проявления, особенно у детей первых месяцев жизни. Поэтому обычно в нормах, приведенных в бланке анализа, указывается, что его быть не должно (на самом деле допустимы количества, не превышающие 103). Патогенность золотистого стафилококка напрямую зависит от состояния нормальной флоры: чем больше бифидобактерий, лактобактерий и нормальной кишечной палочки, тем меньше вреда от стафилококка. Гемолизирующая кишечная палочка. Является представителем лактозонегативных энтеробактерий, но выделяется отдельно в связи с распространенностью и значимостью. В норме должна отсутствовать. К данному микробу применимо практически все, сказанное про золотистый стафилококк. То есть, она может вызывать аллергические и кишечные проблемы, очень распространена в окружающей среде (правда, практически никогда не встречается в грудном молоке), вызывает проблемы у ослабленных детей, требует иммунокоррекции. Следует отметить, что термин “гемолизирующая” не означает, что имеется какое-то влияние на кровь. Лактозонегативные энтеробактерии. Большая группа условно-патогенных бактерий большей или меньшей степени патогенности. Их количество не должно превышать  (в титрах: 103 – 106 ). Наиболее неприятными бактериями из этой группы являются протей (чаще всего с ними связаны запоры) и клебсиеллы (являются прямыми антагонистами (конкурентами) лактобактерий, что приводит к развитию аллергии и запоров, а также к проявлениям лактазной недостаточности). Часто в бланке анализа указывается общее количество лактозонегативных энтеробактерий (наиболее информативно процентное соотношение), а затем идет расшифровка: клебсиеллы, протей, хафнии, серрации, энтеробактерии и цитробактерии. Обычно какие-то количества этих бактерий постоянно живут в кишечнике, не вызывая проблем. В нормах могут быть указаны цифры от 104 до 105, являющиеся допустимыми.                            

 

Грибы рода Candida.

Допустимо присутствие до 103. Повышение этого параметра может быть после применения антибиотиков. Если количество грибов повышено, а количество нормальной кишечной флоры резко снижено, при этом отмечается кандидоз (молочница) видимых слизистых оболочек (ротовая полость, половые органы) – это проявления системного кандидоза, то есть имеется инфицирование грибами кишечника. Если же количество грибов в анализе на дисбактериоз увеличено, но нет снижения нормальной кишечной флоры, это свидетельствует о том, что грибы живут на коже вокруг заднего прохода, а не в кишечнике, в этом случае достаточно наружной терапии с использованием противогрибковых мазей или кремов.                       

 

Клостридии. Допустимое количество до 105. Проявляют патогенность обычно в комплексе с другой условно-патогенной флорой, редко изолированно вызывают проблемы (чаще всего – разжижение стула, понос). Их количество зависит от функции местного иммунитета кишечника.

 

 

Прочие микроорганизмы.

В данном параметре описываются редко встречающиеся виды бактерий, самым опасным из которых является синегнойная палочка (Pseudomonas aerugenosa). Чаще всего, микроорганизмы, описанные в этой позиции, не имеют практического значения. Термин “abs” обозначает отсутствие данного микроорганизма, также употребляется “не обнаружено”.

 

Угревая болезнь: клинико–иммуно–микробиологические аспекты | Васильева Е.С.

Здоровье кожи в значительной мере определяется состоянием ее симбиотической микрофлоры. Бла­годаря кооперации и метаболической активности симбионтная микрофлора кожи у здорового человека противодействует ее колонизации патогенными микроорганизмами. «Колонизационная резистент­ность» кожных покровов обеспечивается механизмами, связанными с организмом хозяина (продукция жирных кислот, иммуноглобулинов, лизоцима и др.), а также с образованием кожной микрофлорой разнообразных микробных агентов (органические кислоты, бактериоцины, перекиси, антибиотики и т.д.) [2,6]. Анализ данных литературы свидетельствует, что у больных акне имеются глубокие нарушения количественного и качественного состава микрофлоры кожи [2–5,11]. Наиболее выраженные изменения проявляются в увеличении количественного содержания на коже Staphylococcus аureus и Staphylo­coccus haemoliticus [5,6] и уменьшении содержания эпидермальных стафилококков, пропионибактерий и других представителей нормофлоры кожи [1,8,10]. Выде­ленные при акне патогенные и оппортунистические микробы, как показывают данные литературы, часто обладают устойчивостью к антибактериальным средствам (например, резистентность к эритромицину у Staphylococcus epidermidis составляет 95%, у Propio­ni­bacterium acnes – 52% [9]) и повышенным патогенным потенциалом [6,12–15].

Цель исследования: оценка состава микрофлоры кожи у больных с вялотекущими, торпидными формами акне и исследование чувствительности к наиболее часто применяемым при этой патологии антимикробным средствам.
Материалы и методы. Было обследовано 137 больных с воспалительными формами угревой болезни, которые отмечали неэффективность проводимого ранее лечения.
Согласно классификации Pochi P.E. et al. (1991) были выделены основные клинические формы заболевания: папуло–пустулезная – 104 пациента (76%) и узловатая – 33 больных (24%).
Степень тяжести заболевания определяли по методу С.Н. Соок et al. (1979) в модификации B.S. Allen, J.G. Smith (1982), на основании шкалы от 0 до 8 в зависимости от выраженности акне–элементов, их количества и площади поражения. У наблюдаемых больных отмечалась средняя и тяжелая степени тяжести, о чем свидетельствуют градации 4–6 и градации 7–8 по шкале Кука. Средняя степень тяжести преобладала у 115 (84%) больных папуло–пустулезной формой акне и у 86 (63%) – узловатой.
Возраст пациентов составил от 18 до 34 лет, давность заболевания от 5 до 12 лет. Больные на протяжении 1,5–3 лет неоднократно получали антимикробные препараты как местно, так и системно, но без клинического эффекта. Наиболее часто использовались эритромицин и доксициклин.
Объектом исследования явилась кожа лица в областях поражения до лечения и идентичные по локализации участки кожи через неделю после лечения. Взятие материала осуществлялось следующим образом: 1–2 воспалительных очага с визуально выявляемыми признаками гнойного воспаления вскрывались стерильной иглой. Шпателем осуществляли надавливание на пустулы и содержимое выдавливали на стерильный ватный тампон. Тампоны тотчас доставлялись в микробиологическую лабораторию в течение 2 часов после взятия материала. Изоляция микроорганизмов из представленного биоматериала осуществлялась в микробиологической лаборатории Больницы гражданской авиации. Посев, культивирование и идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико–диагностических лабораториях лечебно–профилактических учреждений».
Посевы бактериологического материала проводили в аэробных и анаэробных условиях количественным или полуколичественным методом на плотные и жидкие питательные среды (Приказ Минздрава СССР № 535, 1985 г.; Mannual of Clinical Microbiology, 1999). Для по­лу­чения изолированных колоний использовали модификацию рассева по Дригальски. Идентификацию аэроб­ной и анаэробной флоры проводили с помощью «рутинных» методик (постановка «пестрого ряда» на 12 тестах или на микробиологическом анализаторе с автоматизированной системой i EMS Reader, Labsys­tems, Финляндия, с использованием планшет: СТАФИ–тест 16, НФЕРМ–тест 24, СТРЕПТО–тест 16, ЭНТЕРО–тест 16 производства «PLIVA–Lachema», Чехия). Использовали программы: «МИКРОБ» и «МИКРОБ–АВТОМАТ».
Предварительные результаты оценивали в день забора материала и через 24–48 часов при первичном просмотре чашек. Окончательный ответ с результатами идентификации и постановкой чувствительности к антибактериальным препаратам получали на 5–6–е сутки.
Определение чувствительности к антибиотикам проводили в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890–04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (2004), а также руководствуясь стандартами Нацио­наль­ного комитета по клиническим лабораторным стандартам США (с 2005 года – Институт клинических и ла­бо­раторных стандартов) – диско–диффузионным ме­то­дом на агаре Мюллера–Хинтона (тест Кирби и Бауэ­ра) в соответствии с руководством по микробиологии «Меди­цин­ская Микробиология» (1998) с помощью коммерческих план­шет производства ЗАО «Ставро­поль» и автоматизированной программы «МИКРОБ– АВТОМАТ». Ис­поль­зовались диски для определения чувствительности к антибиотикам: эритромицину, доксициклину, тетрациклину, азитромицину, линкомицину. Количество выросших бактерий выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 мл патологического материала [7].
Результаты и обсуждение. Проведенное микробиологическое исследование позволило выделить из очагов поражения 184 штамма бактерий, из которых наиболее часто определялись в чистой культуре (всего 90 штаммов) штаммы гемолитического стафилококка (65 штаммов) и золотистого стафилококка (18 штаммов). Кроме того, были получены 94 штамма, обусловившие смешанный рост культур (2–3 и более). Встре­ча­лись комбинации стафилококков с Peptostreptococcus anaerobius, S. epider­midis, Neisseria sicca, Propionibacterium acnes.
Все микроорганизмы при первичном исследовании высевались в концентрациях более чем 104 КОЕ/мл.
Выводы: Анализ полученных результатов подтвердил данные литературы, что у больных с пустулезными формами акне из воспалительных элементов выделя­ются гемолитический и золотистый стафилококки (табл. 1). Результаты наших исследований впервые по­ка­зали, что у больных с упорно протекающим, торпидным к проводимому лечению течением дерматоза преобладающим возбудителем является Staph. haemoliticus (72%), в меньшей степени – Staph. аureus (20%), причем они выявлялись в 3–4 раза чаще других микроорганизмов. Кроме того, помимо Staph. аureus и Staph. haemoliticus, у части больных (8% случаев) выделялся пиогенный стрептококк (Streptococcus pyogenes).
Наиболее часто выделяемый у больных акне (табл. 2) гемолитический стафилококк в 78,6% случаев резистентен к эритромицину, в 48% случаев отмечается резистентность к доксициклину, в 76,7% – к тетрациклину, т.е. к тем антимикробным препаратам, которые в настоящее время традиционно используются в практической косметологии [8,9,11] для лечения больных. Эти данные позволяют нам высказать предположение, что одной из причин хронизации дерматоза и неэффективности проводимого лечения является широкое распространение антибиотикорезистентности среди основных возбудителей.
В связи с вышеизложенным считаем целесообразным:
1. Обязательное определение чувствительности к антибиотикам у всех больных; выбор антибактериального средства осуществлять с учетом этих данных.
2. Изыскание новых антимикробных средств.
3. Более широкое использование альтернативных методов лечения акне, осложненных гнойно–воспали­тель­ным процессом, к каковым можно отнести физиотерапевтические методы, иммуностимулирующие средства, использование пробиотических препаратов, содержащих микроорганизмы и проявляющих выраженную антагонистическую активность в отношении Staph. aureus и Staph. haemoliticus.

Литература
1. Донецкая С.В. Обоснование тактики лечения вульгарных угрей на основании изучения индивидуальных особенностей корреляции общего и местного иммунитета. Дис… канд. мед. наук. – М., 1997. – 113 с.
2. Иванов А.А. Микроэкология кожи человека и ее взаимосвязь с иммунным статусом человека //Мат. науч.–практ. конф. «Микрофлора кожи человека – клинико–диагностическое значение». – М., 1989. – С.3–11.
3. Клемпарская Н.Н. Изменение микрофлоры кожи при действии на организм экзогенных и эндогенных факторов // Мат. науч.–практ. конф. «Микрофлора кожи человека – клинико–диагностическое значение». – М., 1989. – С.12–23.
4. Ковалев В.М. Методы комплексной терапии угревой болезни в свете новых данных о патогенетической роли нарушений содержания простагландина Е 2 и циклического 3, 5–аденозинмонофосфата., 1983, Дис… к.м.н.
5. Кутасевич Я.Ф., Маштакова И.А., Багмет А.Н., Шаповалова О.В. Микробиоценоз кожи у больных угревой болезнью и пути его коррекции. Украiнський журнал дерматолог, венеролог, косметолог. №1, березень 2003.– 43–47 с.
6. Нобл У.К. Микробиология кожи человека. – М.: Медицина, 1986. – 496 С.
7. Фельдман Ю.М., Миханева Л.Г., Шапиро А.В., Кузьменко В.Д. Ко­ли­чественное определение бактерий в клинических материалах // Лаб. дело. – 1984.– №10.– С. 616–619.
8. Braun–Falco O., G. Plewig, H.H. Wolff, W.H.C. Burgdorf Dermatology, 2000; P. 1054–1055.
9. Dreno B, Reynaud A, Moyse D, Habert H, Richet H. Erythromycin– Resistance of cutaneous bacterial flora in acne. Eur. J. Dermatol. 2001. Nov–Dec; 11(6): 549–53.
10. Holland K. T., Aldana O., Bojar R.A., Cunllife W.J., Eady E.A. Propionibacterium acnes and Acne. // Dermatology, 1998; P. 196: 67–68.
11. Kennet A. Arndt, Kathryn E. Bowers. Manual of Dermatologic Therapeutics. LWW, 2002.p.3–20.
12. Leeming J.P., Holland K.T., Cunliffe W.J. The microbial colonization of inflamed acne vulgaris lesions. Brit. J. Derm., 1988, 118 (2), 203–8.
13. Plewig G., Kligman A.M. Acne: Morphogenesis and Treatment. Berlin: Springer, 1975.
14. Plewig G., Kligman A.M. Acne: Pathogenesis; Morphologie; Therapie. Berlin etr., Springer, 1978, 348 p.
15. Webster G.F. Acne vulgaris. Clinical review. B M J 2002; Volum 325: 475–9.

.

Порекомендуйте статью вашим коллегам

Staphylococcus epidermidis (стафилококк эпидермальный) — симптомы, причины, терапия. Какой показатель нормы в анализах

Патогенные бактерии вызывают заболевания человека и животных. Они могут иметь различную форму, вид, вирулентность, а также устойчивость к лекарственным препаратам. Наиболее распространённые формы бактерий – это палочки и кокки. К первой группе относятся кишечные, синегнойные, туберкулёзные возбудители. Кокки имеют округлую форму, могут состоять из различного количества шаровидных скоплений. К примеру, возбудитель гонореи включает в себя 2 части. Стафилококки состоят из множества скоплений округлых клеток и напоминают по своей форме виноградную гроздь. Они известны науке ещё с 19 века как одни из наиболее часто встречающихся бактерий. Если стафилококк окрасить по методу Грама, то он будет виден в мазке, то есть – положителен.

Свойства стафилококков

Опасность этих бактерий заключается в их способности к выработке экзотоксина – вещества, за счёт которого они оказывают своё патогенное действие на организм. Стафилококки обладают 2 разрушающими свойствами:

  1. Вызывают гемолиз эритроцитов – из-за этой способности кровь теряет свою нормальную структуру.
  2. Способствуют некротизации тканей – из-за этого действия стафилококка ткани организма подвергаются омертвению. Локализация и размер поражения зависит от распространения бактерий в организме, иммунных сил, а также от наличия или отсутствия терапевтических мер.

Виды стафилококков

Бактерии этого рода имеют множество разновидностей, из которых лишь небольшая часть способна к распространению в организме человека. В зависимости от того, какой именно возбудитель вызвал заболевание, можно судить о симптомах и правильном лечении. Наиболее распространёнными видами стафилококков, являющихся патогенными для человека, считают: Staphylococcus epidermidis, aureus, saprophyticus, haemolyticus. Каждый из них вызывает различные нарушения. Кроме того, некоторые виды являются наиболее опасными, другие – практически безобидны и не требуют лечения.

Заболевания, вызванные стафилококками

Основным симптомом появления в организме стафилококковой инфекции является гнойное воспаление. При этом поражение может возникать в любом органе и ткани. От места локализации воспаления зависят клинические проявления заболевания, которые могут быть самыми разнообразными. Возбудитель попадает в организм через раневые поверхности на коже, при ослабленном иммунитете (при вирусных инфекциях). Зачастую стафилококки наслаиваются на первичный источник заболевания, тем самым ухудшая состояние человека. При попадании возбудителей в кровоток и ослабленном иммунитете бактерии очень сложно поддаются лечению (особенно у детей).

Staphylococcus epidermidis

Наиболее безобидным для человека из всех видов возбудителей является эпидермальный стафилококк. Staphylococcus epidermidis относится к условно-патогенной микрофлоре. Это значит, что бактерия находится в организме человека постоянно, даже при условии отсутствия болезни. Эпидермальный стафилококк живёт на кожных покровах, точнее – в верхнем их слое. Помимо этого, возбудитель можно найти на слизистых оболочках рта, носа и наружного уха. Как и все условно-патогенные бактерии, стафилококк не вызывает поражений при нормальном функционировании организма. Но при появлении каких-либо нарушений, например, ран на кожных покровах, различных высыпаний, при воспалении слизистых оболочек дыхательных путей Staphylococcus epidermidis начинает стремительно размножаться и выступает в роли вторичной инфекции. Помимо указанных состояний, патогенность микроорганизма усиливается при значительном снижении защитных сил организма, что наблюдается при длительных хронических заболеваниях, стрессах, переохлаждении, иммунодефицитных состояниях.

Нормальные и патологические количества микроорганизма

Практически у всех людей присутствует Staphylococcus epidermidis в посеве, взятом с кожных покровов или слизистых оболочек. Тем не менее далеко не у всех его количество превышает нормальные значения. Это связано с наличием или отсутствием инфекционного процесса, вызванного эпидермальным стафилококком. От того, какая цифра обнаружена в бактериальном посеве, зависит, вызвано или нет заболевание именно Staphylococcus epidermidis. Норма возбудителя в посеве составляет до 10 в 5 степени. Если его количество выходит за пределы этой цифры, то следует применять этиологическое лечение, направленное на борьбу с эпидермальным стафилококком.

Заболевания, вызванные эпидермальным стафилококком

Под влиянием неблагоприятных факторов и снижения работы иммунной системы условно-патогенная микрофлора начинает размножаться и вызывать различные заболевания в организме. В связи с тем, что эпидермальный стафилококк обитает на коже и слизистых оболочках, при его повышении могут страдать многие органы. При постановке венозных и мочевых катетеров Staphylococcus epidermidis проникает во внутренние органы, вызывая опасные осложнения. К ним относятся такие заболевания, как эндокардит – воспаление сердечных клапанов, в том числе и искусственных. Инфекции мочеполовой системы, вызванные эпидермальным стафилококком, могут быть самыми разнообразными, например, цистит, пиелонефрит, вульвовагинит, уретрит. При восходящем проникновении возбудителя развиваются более тяжёлые заболевания, такие как эндометрит, простатит, интерстициальный нефрит и т. д. При травмах суставов часто прибегают к эндопротезированию, при этом искусственные материалы тоже могут вызывать инфицирование эпидермальным стафилококком. Наиболее опасно распространение возбудителя у новорожденных, так как оно часто осложняется сепсисом.

Staphylococcus epidermidis при беременности

Во время беременности в организме женщины происходит глобальная перестройка, которая касается всех органов и систем, в том числе и иммунитета. Защитные силы в период вынашивания ребёнка значительно снижены, поэтому заражение любыми микроорганизмами является опасным. Если женщина во время беременности не употребляет витамины, переохлаждается, подвергается стрессам, имеет хронические очаги инфекции, то условно-патогенная флора, находящаяся в её организме, начинает активироваться и вызывать различные заболевания. Нахождение в анализах беременной (мазок из зева, носа, влагалища) Staphylococcus epidermidis 10*3 уже заставляет врача-гинеколога тщательно обследовать её, чтобы избежать возможных осложнений.

Лечение заболеваний, вызванных эпидермальным стафилококком

Несмотря на то что эпидермальный стафилококк является условно-патогенным микроорганизмом и часто присутствует у здоровых людей, повышение его уровня свидетельствует о наличии заболевания. Симптомы зависят от локализации инфицирования Staphylococcus epidermidis, лечение при этом является специфичным для различных органов и систем. Тем не менее во всех случаях назначается антибактериальная терапия, направленная на уничтожение непосредственного возбудителя заболевания – эпидермального стафилококка. Часто S. epidermidis оказывается устойчивым к препаратам пенициллинового ряда, в таких случаях прибегают к более сильным медикаментам, группе фторхинолонов: рифампицину, ванкомицину и т. д. Помимо этого, необходимо назначение противовоспалительных и иммуномодулирующих средств. При частом инфицировании условно-патогенными организмами необходимо избегать переохлаждений, контактов с вирусными больными, стрессовых ситуаций, повреждений кожи и слизистых оболочек. При наличии открытых раневых поверхностей необходимо их тщательно обработать антисептическими растворами и обратиться к врачу.

Влияние низкой температуры на рост и ультраструктуру Staphylococcus spp.

PLoS One. 2012; 7 (1): e29031.

, 1 , 1 , * , 2 , 3 и 1

Лаура А. Оньянго

1 Лаборатория экологической и патогенной микробиологии, Школа наук об окружающей среде и жизни, Университет Ньюкасла, Ньюкасл, Новый Южный Уэльс, Австралия,

Р. Хью Данстан

1 Лаборатория экологической и патогенной микробиологии, Школа наук об окружающей среде и жизни, Университет Ньюкасла, Ньюкасл, Новый Южный Уэльс, Австралия,

Йохан Готтфрис

2 Химический факультет Гётеборгского университета, Гётеборг, Швеция,

Кристоф фон Эйфф

3 Институт медицинской микробиологии, Мюнстерский университет, Мюнстер, Германия,

Тимоти К.Робертс

1 Лаборатория экологической и патогенной микробиологии, Школа наук об окружающей среде и жизни, Университет Ньюкасла, Ньюкасл, Новый Южный Уэльс, Австралия,

Дипшиха Чакравортти, редактор

1 Лаборатория экологической и патогенной микробиологии, Школа наук об окружающей среде и жизни, Университет Ньюкасла, Ньюкасл, Новый Южный Уэльс, Австралия,

2 Химический факультет Гётеборгского университета, Гётеборг, Швеция,

3 Институт медицинской микробиологии, Мюнстерский университет, Мюнстер, Германия,

Индийский институт науки, Индия

Задумал и спроектировал эксперименты: LAO TKR RHD.Проведены эксперименты: ЛАО. Проанализированы данные: ЛАО ТКР РЖС. Написал статью: ЛАО РХД ТКР Ю.Г. ЦвЭ.

Поступила 12 октября 2011 г .; Принято 19 ноября 2011 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Влияние колебаний температуры является важным фактором роста бактерий, особенно таких патогенов, как стафилококки, которые должны оставаться жизнеспособными в потенциально жестких и длительных условиях переноса между хозяевами.Целью этого исследования было изучить реакцию S. aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis на длительное воздействие низкой температуры (4 ° C) и то, как этот фактор повлиял на их последующее воздействие. рост, морфология колоний, клеточная ультраструктура и аминокислотный состав в нецитоплазматической фракции гидролизата. Клинические изоляты выращивали в оптимальных условиях, а затем подвергали воздействию условий 4 ° C в течение 8 недель. Образцы, подвергнутые холодному стрессу, и контрольные образцы были оценены с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для выявления потенциальных ультраструктурных изменений.Чтобы определить изменения в аминокислотном составе, клетки разрушали для удаления липидных и цитоплазматических компонентов, а оставшиеся структурные компоненты гидролизовали. Затем профили аминокислот для гидролизной фракции анализировали на предмет изменений с помощью анализа главных компонентов (PCA). Воздействие трех стафилококков на длительный низкотемпературный стресс приводило к формированию увеличивающейся доли фенотипов вариантов малых колоний (SCV). ПЭМ показала, что клетки SCV имели значительно более толстые и более диффузные клеточные стенки, чем их соответствующие образцы WT для обоих S.aureus и S. epidermidis , но изменения не были значительными для S. lugdunensis . Существенные видоспецифические изменения в аминокислотном составе фракции структурного гидролизата также наблюдались в обработанных холодом клетках. Данные показали, что стафилококки реагировали на длительные периоды лечения холодовым стрессом, превращаясь в популяции SCV. Было высказано предположение, что наблюдаемые ультраструктурные и аминокислотные изменения представляют собой механизмы ответа для выживания стафилококков в неблагоприятных условиях, таким образом поддерживая жизнеспособность видов до тех пор, пока благоприятные условия не возникнут снова.

Введение

Хотя стафилококки принадлежат к общей флоре кожи и слизистых оболочек, они могут быстро стать условно-патогенными микроорганизмами, когда иммунная система хозяина нарушена, вызывая ряд заболеваний. Различные штаммы S. aureus стали известны своей устойчивостью к нескольким антимикробным агентам, и вместе с рядом коагулазонегативных стафилококков (ЦНС), включая S. epidermidis и S. lugdunensis , эти бактерии составляют: значительная доля внутрибольничных инфекций [1], [2], [3].

Было показано, что воздействие антибиотиков на стафилококки является одной из причин образования вариантов с малыми колониями (SCV). Эти варианты представляют собой субпопуляции бактерий, которые демонстрируют особенности роста, нетипичные по сравнению с таковыми у их аналогов дикого типа (WT). Как следует из названия, эти варианты характеризуются в основном негемолитическими и непигментированными крошечными колониями, примерно 1/10 размера их аналогов дикого типа [4]. Интерес к формам SCVs возник, когда они были связаны со стойкими клиническими инфекциями [5], [6].У людей SCV связаны с хроническими стойкими инфекциями скелетной системы, сердца и легких, а также других органов, а также при использовании стационарных медицинских устройств [7]. Лечение таких инфекций стало проблемой, поскольку было показано, что SCV менее чувствительны к нескольким антибиотикам, и, кроме того, эти фенотипы лучше сохраняются внутриклеточно в клетках-хозяевах [8]. Исследования, включающие модели на животных, показали, что многие вирулентные факторы, выраженные фенотипами WT и вызывающие заболевание, либо не экспрессируются, либо остаются минимальными в популяциях SCV [9], [10], [11].Вместо этого SCV активируют механизмы, которые поддерживают их прикрепление и захват клетками-хозяевами, а также запускают метаболические стратегии, которые будут способствовать их выживанию после интернализации без необходимости использования цитотоксических мер [12]. Сообщения о множественном ауксотрофизме [5], [13], [14], [15] предполагают, что определенные метаболические пути были инактивированы в SCV. Дальнейшие молекулярные исследования предоставили доказательства того, что клинические SCV имели разные фенотипы по сравнению с их родителями WT, но были способны возвращаться к форме WT [16], [17], предполагая, что фенотипические изменения включали значительные изменения метаболического гомеостаза в SCV.

Стафилококкам требуется способность выживать на неодушевленных предметах в процессе перехода от одного хозяина к другому. Они должны уметь адаптироваться к быстро меняющимся условиям окружающей среды и быть готовыми к реактивации факторов метаболизма и вирулентности, когда появляются возможности. Для хранения пищевых продуктов, растворов и биологических материалов часто используются температуры 4 ° C, поскольку большинство патогенов считаются мезофильными и поэтому не могут хорошо расти при этой температуре [18].Стафилококки способны расти в широком диапазоне температур (6,5–46 ° C), хотя их оптимальный диапазон составляет 30–37 ° C, и было высказано предположение, что они могут выжить при экстремальных температурах <6,5 ° C и> 46 ° C в течение ограниченного периода времени. периоды времени [18]. Способность стафилококков быстро адаптироваться к колебаниям низких и высоких температур особенно важна для патогенных штаммов стафилококков, поскольку в некоторых случаях эти бактерии должны оставаться жизнеспособными вне хозяина [19].

Стенка бактериальной клетки и связанные с ней белки представляют собой интерфейс между окружающей средой и цитоплазмой.Он действует как структурный барьер против токсичных химикатов, защищает клетку от колебаний условий окружающей среды и играет важную роль в развитии инфекции и патогенности [20]. В нескольких исследованиях изучали структуру клеточной стенки устойчивых к антибиотикам штаммов S. aureus , и результаты показали, что утолщение клеточной стенки было обычной характеристикой, возникающей только тогда, когда бактерия выращивалась в присутствии антибиотиков [21]. В этих исследованиях предполагаемая функция утолщенной клеточной стенки заключалась в связывании и секвестрации ванкомицина на большем удалении от его целевого сайта.Таким образом, была выдвинута гипотеза о том, что бактериальные клетки, подвергшиеся воздействию ряда стрессоров, могут адаптировать состав своей клеточной стенки и связанных белков для облегчения защиты от изменения условий окружающей среды. Чтобы потенциально измерить этот измененный состав, будет исследован анализ нецитоплазматической фракции и, в частности, аминокислотных изменений.

В настоящем исследовании цель исследования заключалась в том, чтобы определить, будет ли воздействие низкой температуры при 4 ° C в течение 8 недель стимулировать формирование фенотипов SCV как механизма выживания клинических изолятов S.aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis . Кроме того, скорость изменений числа SCV как пропорции жизнеспособных бактериальных популяций определялась в течение 8-недельного времени воздействия, и любые связанные изменения в морфологии и составе клеточной стенки оценивались с помощью ТЕМ и ГХ-МС соответственно. Было высказано предположение, что воздействие холодового стресса приведет к увеличению толщины клеточной стенки и изменению биохимического аминокислотного состава.

Материалы и методы

Бактериальные образцы

С.aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis были изолятами, полученными в результате более раннего исследования [22] и поддерживаемыми в качестве культурального материала в лаборатории. Изоляты надлежащим образом хранили и регулярно субкультивировали для поддержания жизнеспособности. Проверки личности регулярно выполнялись с помощью ПЦР и стандартной биохимии API® Staph.

Рост бактерий

Ночные бульонные культуры S. aureus , S. epidermidis и S.lugdunensis использовали для создания свежих жидких культур (100 мл, выращенных в колбах на 250 мл), которые выращивали до средней экспоненциальной фазы при 37 ° C, 120 об / мин, а затем инкубировали при 4 ° C в течение 8 недель. Каждую неделю из этих жидких культур, подвергшихся холодному стрессу, получали n = 9 образцов, которые разбавляли 1 × 10 перед нанесением аликвот по 5 мкл каждого образца в трех экземплярах на колумбийский агар с лошадиной кровью (HBA, Oxoid). Засеянные планшеты инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C, а затем исследовали. Регулярные проверки чистоты сохраняемых бульонных культур проводились с помощью анализов на основе ПЦР, чтобы гарантировать отсутствие перекрестного загрязнения во время отбора проб.Колонии, растущие из субкультивированных стрессовых бульонов, анализировали на чистоту культуры. Это было выполнено с использованием теста API® Staph (bioMérieux) и основанных на ПЦР анализах гена 16SrRNA с использованием метода Brown et al. , [23] и результаты проверены через базу данных NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Характеристика колоний

Колонии были физически оценены и разделены на две группы в зависимости от размера, гемолитической активности и пигментации.Колонии характеризовались как SCV, если они представляли собой точечные колонии (<1 мм в диаметре) со сниженной гемолитической активностью и пигментацией через 24–48 часов после инкубации, как описано в литературе [17], [24], [25]. Все остальные колонии были характеризуется как дикого типа (WT).

Reversion

SCV, полученные в результате холодовой обработки, были протестированы на реверсию путем субкультивирования отдельных колоний (n = 9) на чашках с HBA в течение ночи в оптимальных условиях, и скорость реверсии была записана как процент колоний WT в общем численность населения.

Подготовка образца для ТЕА

Используемая процедура подготовки образца для ТЕА была объединена с методами Глауэрта [26], Дайкстры и Ройсса [27]. N = 9 колоний колоний WT и SCV, выращенных на HBA, фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде. Вторичную фиксацию проводили в 1% растворе четырехокиси осмия. Дегидратацию выполняли в градуированной серии вода-этанол (об. / Об.), Доведенной до следующих концентраций: 10%, 30%, 50%, 70%, 90% и 100%. Инфильтрацию проводили в белой смоле LR, приготовленной в этаноле до следующих концентраций: 10%, 30%, 50%, 70%, 90% и 100% (об. / Об.).Ультратонкие срезы вырезали, окрашивали и исследовали под просвечивающим электронным микроскопом, установленным на ускоряющее напряжение 80 кВ, и изображения получали при 40–100 000X.

Подготовка образцов для исследования аминокислот

После 8-недельного периода воздействия клетки собирали и экстрагировали на компоненты клеточной стенки и мембран в соответствии с методами Hanaki et al. [28] и de Jonge et al. [29]. Клетки разрушали кипячением со стеклянными шариками в течение ½ часа.Суспензию центрифугировали при 3000 g в течение 5 мин и супернатант отбрасывали. Осадки клеток, содержащие фрагменты клеточной стенки и мембраны, затем лиофилизировали. Липидные компоненты мембран лиофилизированных образцов экстрагировали, добавляя хлороформ: метанол в соотношении 2–1 об. / Об. До конечного объема 3 мл. Образцы перемешивали, а затем центрифугировали 5–10 мин при 3500 об / мин и 4 ° C. Нижние фазы хлороформа аспирировали в пробирки для экстракции объемом 8 мл. Эту процедуру повторяли еще дважды с добавлением одного хлороформа и объединением образовавшихся фаз хлороформа.Остаточные суспензии метанола переносили в пробирки для дериватизации объемом 8 мл и центрифугировали в течение 5–10 мин. Эти гранулы лиофилизировали для удаления метанола перед гидролизом в кислоте. Осушенный осадок метанола гидролизовали, добавляя к образцу 200 мкл 6 М HCl, и суспензию инкубировали в течение 6 часов при 100 ° C. После этого образцы охлаждали и сушили вымораживанием.

Аминокислотные анализы гидролизованной клеточной стенки / белкового экстракта

Высушенные гидролизованные образцы были подготовлены для анализа с использованием набора Ez∶Faast ™ (Phenomenex® EZ∶faast ™) и разделены для анализа с помощью газовой хроматографии (ГХ). подходит для обнаружения более 40 аминокислот и родственных производных.Процедура включает твердофазную экстракцию с помощью ионообменной хроматографии, дериватизацию с образованием пропиловых эфиров аминокислот и заключительную стадию экстракции жидкость / жидкость перед анализом с помощью ГХ. Лиофилизированные гидролизованные образцы ресуспендировали в 500 мкл воды milliQ и экстрагировали, следуя 8-ступенчатой ​​процедуре, как указано производителем, с использованием норвалина в качестве внутреннего стандарта. Анализ образцов, дериватизированных EZ∶Faast ™, выполняли на системе ГХ Hewlett Packard HP 6890 series, снабженной пламенно-ионизационным детектором и колонкой ZB-PAAC-MS (10 м × 0.Внутренний диаметр 25 мм), поставляемый Phenomenex® Inc. Метод прибора включал раздельное впрыскивание (соотношение 15∶1) с температурой инжектора 250 ° C и скоростью потока через колонку 0,5 мл / мин. Объем инъекции для всех образцов был установлен на уровне 2,5 мкл.

Статистический анализ

Эксперименты проводили трижды (каждый в трех экземплярах, n = 9) для обеспечения воспроизводимости результатов. Анализ главных компонентов (PCA) проводили с использованием SIMCA-p + (12.0, Umetrics, Швеция), [30]. Все данные были предварительно обработаны логарифмическим преобразованием, центрированием среднего и масштабированием единичной дисперсии до генерации PCA.Оптимальная сложность модели PCA была определена в соответствии с процедурой перекрестной проверки (CV) [31]. CV включал семь раундов моделирования исключенных данных, в то же время все данные были исключены один раз, как это реализовано в SIMCA-P +. Сканирование резко отклоняющихся данных проводилось по критическому ортогональному расстоянию до модели и с помощью прибора Hotelling T 2 в пределах размеров модели. Ни один из методов не выявил ложных данных. Доверительные интервалы нагрузок оценивали методом складывания ножей с использованием результатов CV.

Результаты

Бульонные культуры S. aureus S. epidermidis и S. lugdunensis , подвергнутые длительному воздействию температуры 4 ° C после начального роста при 37 ° C, дали ряд вариантов колоний при пересеве на чашки с HBA с вариациями размера, пигментации и гемолитической активности. Способность образовывать варианты небольших колоний (SCV) в ответ на стресс при 4 ° C наблюдалась у всех трех видов стафилококков, хотя их частота в популяциях различалась между видами, а их численность была связана с продолжительностью стресса.На начальных этапах стресса (1-2 недели) наиболее многочисленным типом колонии, наблюдаемым в культуре для каждого вида, была колония WT. SCVs также присутствовали в это время, хотя они составляли <40% населения (). Однако при длительной инкубации в условиях температурного стресса наблюдался сдвиг в динамике популяции: SCV-колонии представляли> 50% популяции через 3 недели для S. epidermidis (R 2 = 0,51, p <0,05) и через 7 недель. для S. lugdunensis (R 2 = 0.97, р <0,05). Культуры S. aureus не давали значимых значений SCV до пяти недель инкубации (R 2 = 0,78, p <0,05).

Изменение процентного состава SCV-колоний популяций культур S. aureus S. epidermidis и S. lugdunensis , подвергшихся температурному стрессу при 4 ° C в течение 8 недель (n = 9).

Температурно-индуцированные SCV имели размер колонии <1 мм и демонстрировали пониженную пигментацию с небольшим и переменным диапазоном гемолиза на HBA ().Сравнения окрашенных по Граму клеток также суммированы, показывая заметную разницу в интенсивности окрашивания между каждым типом колонии для всех 3 исследованных видов. Для определения интенсивности красителя использовалась упрощенная цветовая шкала и шкала от 1 до 5, где 5 - самая темная интенсивность, а 1 - самая светлая интенсивность. Клетки колонии WT постоянно окрашивались в темно-фиолетовый цвет и имели среднее значение ± SD 4,7 ± 1,0 (n = 20), в то время как клетки SCV всегда окрашивались значительно светлее со средним значением 2.1 ± 1,0 (n = 20).

Морфологические различия в размере, пигментации, гемолизе и окрашивании по Граму между WT и соответствующими SCV у S. aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis .

Колонка (A) показывает различия в размере и пигментации между колониями WT (слева), которые больше и более пигментированы, чем их SCV (справа), которые являются маленькими с уменьшенной пигментацией (шкала представляет собой 1 мм). Колонка (B) показывает различия в ответе на окрашивание по Граму с окрашиванием клеток WT (слева) значительно темнее, чем их соответствующие SCV (справа).

Идентификация видов

Чтобы убедиться, что наблюдаемая смешанная популяция колоний не была контаминантами, WT и подозреваемые SCV всех трех видов были оценены по показаниям API® Staph и с помощью ПЦР гена 16S рРНК. ПЦР всех протестированных колоний SCV подтвердила их идентичность как совместимые с исходным исходным материалом WT. Результаты API® Staph для колоний дикого типа были положительными для соответствующих им исходных видов, но результаты для SCV были неубедительными, что соответствовало предполагаемым изменениям метаболического гомеостаза, описанным в литературе.Для дальнейшей оценки идентичности SCV было показано, что эти колонии превращаются в колонии WT при субкультивировании на чашках с HBA и инкубировании при 37 ° C. SCV возвращались после 2 субкультур в условиях хранения клеток в течение 4 недель или меньше при 4 ° C, и до трех субкультур для восстановления, которые наблюдались для культур, хранящихся в течение 5-8 недель. Эти ревертанты, образованные таким образом из субкультуры, впоследствии были подтверждены как сходные с родительскими штаммами как API® Staph, так и ПЦР.

Электронная микроскопия

Фиксированные колонии WT и SCV (n = 9 каждая) были разделены на срезы и исследованы с использованием ТЕМ.Результаты выявили нарушения внешнего вида цитоплазматических компонентов, перегородок, симметрии клеток и свойств клеточной стенки SCV-клеток по сравнению с их родительскими WT-клетками. Микрофотографии клеток WT каждого вида показали четко выраженное образование перегородок, происходящее в основном через середину клетки, делящее клетку на две симметричные дочерние клетки (). Напротив, клетки SCV демонстрировали более диффузные перегородки и преимущественно более «асимметричные» клеточные деления, при этом одна дочерняя клетка оказывалась существенно меньше другой, как показано на примере S aureus SCV.Оценка симметричных и асимметричных делений клеток в n = 100 клеток от каждого типа колонии от всех трех видов была проведена и обобщена, что подтвердило, что в популяциях SCV была значительно большая доля их клеток с очевидными «асимметричными» клеточными делениями. по сравнению с их соответствующими клетками WT (p <0,01).

ТЕМ-изображения (a) S. aureus , (b) S. epidermidis и (c) S. lugdunensis WT и SCV клеток, демонстрирующие их соответствующие ультраструктурные характеристики.

Клетки WT имели четко очерченные клеточные стенки по сравнению с SCV, которые имели более толстые, более диффузные клеточные стенки после воздействия стресса (4 ° C).

Таблица 1

Анализ частоты очевидных «симметричных» против «асимметричных» делений клеток в WT против SCV клеток из препаратов ТЕА из S. aureus , S. epidermidis и С. lugdunensis .

Тип колонии Симметричное деление клеток Асимметричное деление клеток
С.aureus WT 62,2% 37,8%
S. aureus SCV 19,3% 80,7%
S. epidermidis WT 70,6% 29,4%
S. epidermidis SCV 35,0% 65,0%
S. lugdunensis WT 66,9% 33,1%
S. lugdunensis SCV 28.5% 71,5%

Дальнейший анализ ТЕА показал, что клетки SCV, по-видимому, имели более диффузные клеточные стенки, которые также оказались толще, чем их родительские штаммы. Чтобы установить, действительно ли были существенные различия, измерения толщины стенок были выполнены для n = 300 клеток на тип колонии для каждого вида. Для каждой ячейки измерения были взяты из трех отдельных областей, и среднее значение этих значений записали как толщину стенок этой конкретной ячейки.Для каждой подготовленной реплики было записано не менее десяти микрофотографий и изучались 10 полей зрения на каждую микрофотографию для записи различных данных (диффузные и утолщенные клеточные стенки и образование асимметричных перегородок) и подтверждения того, что ультраструктурные изменения не были артефактами. Анализ этих данных выявил значительные различия в толщине стенок между колониями WT и SCV S. aureus и S. epidermidis . Средняя (± стандартное отклонение) толщина клеточной стенки для S. aureus SCV (24 ± 7 нм) была значительно больше, чем у их соответствующих клеток WT (17 ± 3 нм). S. epidermidis SCV-клетки также были значительно толще (33 ± 15 нм) по сравнению с их клетками WT (27 ± 5 нм). Не было существенной разницы в толщине клеточной стенки между S. lugdunensis WT-клетками (24 ± 5 ​​нм) и их соответствующими клетками SCV (24 ± 6 нм).

Анализ основных компонентов

Из-за изменений морфологии, наблюдаемых на снимках ПЭМ SCV-клеток после воздействия 4 ° C, было высказано предположение, что будут сопутствующие изменения в составе белков, связанных с клеточной стенкой и клеточной стенкой.Фракции клеточной стенки, полученные из клеток SCV и WT S. aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis , таким образом, расщепляли и гидролизовали для определения аминокислотного состава с помощью газовой хроматографии. Данные по аминокислотному составу были сопоставлены с 3 изолятами стафилококков, выращенных в качестве контрольных образцов в культурах при 37 ° C или подвергнутых длительному холодовому стрессу при 4 ° C (n = 9 для каждой комбинации). Полная матрица данных была подвергнута PCA визуализации решения с 3 основными компонентами (ПК) в соответствии с перекрестной проверкой (CV) с объясненными отклонениями 82% R 2 X и 72% по CV (Q 2 X).Однако вклад третьего ПК в совокупную CV составлял менее 5%, поэтому он не принимался во внимание.

Проверка оценок PCA выявила 3 ​​кластера, при этом все образцы стафилококков, независимо от штамма, выращенного при 37 ° C, были помещены в контрольную группу, смоделированную близко к ориджину (). Обработанные холодом образцы S. aureus сформировали второй кластер, который был смоделирован с, как правило, высокими значениями t1 для всех аминокислот, но близкими к нулю баллами t2. Эта ориентация указывает на то, что всех аминокислот было больше во всех обработанных холодом S.aureus по сравнению с контрольными образцами. Напротив, обработанные холодом образцы S. epidermidis и S. lugdunensis , которые накладывались друг на друга, имели близкие к нулю баллы на первом ПК, но низкие баллы t 2 по сравнению с контрольными образцами. Данные показали, что все 3 вида имели сходные профили аминокислотного состава в клеточной стенке при выращивании в оптимальных условиях при 37 ° C, то есть в контрольных образцах. Однако, когда клетки подвергались длительному холодовому стрессу при 4 ° C, все 3 штамма ответили существенным изменением состава аминокислот в их клеточных стенках и связанных с ними белков.Однако у S. aureus была очень уникальная и характерная реакция, которая явно отличалась от реакции, вызванной у S. epidermidis и S. lugdunensis .

Разброс показателей анализа основных компонентов (PCA) (t1 по сравнению с t2), построенный на основе данных аминокислотного профиля стафилококковой клеточной стенки.

Культуры стафилококков выращивали в идеальных условиях при 37 ° C, представляющих контрольные образцы (Cont), или подвергали длительному воздействию 4 ° C в течение 8 недель (TE) перед взятием образцов и анализом аминокислот.Три различных штамма, S. aureus (SA), S. epidermidis (SE) и S. lugdunensis (SL), были исследованы в повторностях (n = 9) для каждого штамма на предмет реакции на температурные условия.

Расположение всех обработанных холодом образцов S. aureus справа от диаграммы разброса PCA было обусловлено высокими значениями t1 (как показано на рисунке), что явилось результатом повышения уровня аминокислот во всех S. aureus образцы (см. PC1, т.е. ось x в).Паттерны корреляции индивидуальных аминокислотных уровней с PC-компонентами были получены путем нагрузок. Они были определены как корреляция между отдельными ПК и содержанием отдельных аминокислот во включенных образцах. Для первого ПК в настоящем исследовании все корреляции были положительными для образцов S. aureus по сравнению с эталоном, что определялось в целом положительной корреляционной структурой при нагрузках p -1. Эта полная корреляционная картина между S. aureus , обработанными холодным способом, и контрольными образцами соответствовала нагрузкам, отображаемым в.

Показатели p1 для аминокислот из экстрактов клеточной стенки S. aureus после длительного воздействия при 4 ° C в течение 8 недель по сравнению с соответствующими культурами, выращенными в идеальных условиях при 37 ° C, представляющими контрольные образцы сравнения.

S. aureus отреагировал на холодовой стресс, как правило, увеличив аминокислотный состав в этой фракции по сравнению с контролем, то есть контрольными образцами от всех трех штаммов.

Аминокислотные изменения, характеризующие реакцию на холодную обработку S.epidermidis и S. lugdunensis были ортогональны ответу t 1, поскольку отдельные образцы варьировались в основном в направлении PC2 (). Кроме того, направление корреляции PCA было обратным по сравнению с PC1, на что указывало расположение обработанных холодом образцов S. epidermidis и lugdunensis по более низким баллам t 2 по сравнению с контрольными образцами. На практике это означало, что отрицательные нагрузки в PC2 указывали на повышенные уровни аминокислот в обработанных холодом образцах от S.epidermidis и lugdunensis по сравнению с контрольными образцами, например APA и GLN, как правило, были выше, а SER и ASN были ниже в обработанных холодом образцах S. epidermidis и lugdunensis по сравнению с контрольными образцами. Эти ответы включали значительные изменения аминокислотных профилей по сравнению с соответствующими контрольными культурами, например, с повышением содержания аминокислот. SER, ASP и MET и снижение, например, THR, GLU и GLN (см. Все загрузки для PC2 в).

Показатели p2 для аминокислот из экстрактов клеточной стенки S. epidermidis и S. lugdunensis после длительного воздействия при 4 ° C в течение 8 недель по сравнению с соответствующими культурами, выращенными в идеальных условиях при 37 ° C, представляющих эталон. контрольные образцы.

S. epidermidis и S. lugdunensis ответили на холодовой стресс существенным изменением аминокислотных профилей по сравнению с соответствующими контролями. Следует подчеркнуть, что PC2 обратно коррелировали с обработкой холодом, так что отрицательные нагрузки, например.грамм. — 0,20 для GLN указывает на повышенный уровень аминокислот в обработанных холодом образцах S. epidermidis и S. lugdunensis , и наоборот.

Обсуждение

Когда культуры стафилококков подвергались воздействию температуры 4 ° C, культуры S. epidermidis и S. lugdunensis генерировали SCV быстрее, чем культуры S. aureus . В конечном итоге все три вида образовали колонии SCV, но 100% конверсия никогда не наблюдалась в течение 8-недельного периода воздействия 4 ° C.Зависимое от времени увеличение пропорций SCV в отобранных популяциях указывает на процесс адаптации, в котором растущее преобладание SCV представляет собой естественный отбор SCV с повышенной способностью к выживанию в неблагоприятных условиях [32]. Фенотипическое переключение было отмечено в S. aureus как эффективная бактериальная стратегия против иммунного ответа хозяина и успешного установления хронической инфекции [33]. Это явление имеет эволюционное значение, поскольку оно дает избирательное преимущество для выживания бактерий в неблагоприятных условиях окружающей среды.В этом исследовании было высказано предположение, что этот механизм будет полностью подходящим для периодов выживания между потенциальными хозяевами для этих комменсалов (условно-патогенных микроорганизмов) в отличие от спорообразующих бактерий, таких как бациллы, которым может потребоваться выживание в течение продолжительных периодов времени в более экстремальных условиях. условия водного лишения, воздействия УФ-излучения и токсичных химикатов. Хотя образование SCV произошло у S. aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis после воздействия 4 ° C, было отмечено, что SCV учащались в культурах коагулазонегативных стафилококков (ЦНС) при температуре быстрее, чем у S.Ауреус . Изменчивость колоний ранее наблюдалась в ЦНС в ответ на лечение антибиотиками [34], но было высказано предположение, что, возможно, об этой особенности не сообщалось, поскольку измененные морфологические характеристики были неверно интерпретированы как контаминация, а не как представление фенотипического разнообразия [34].

Окрашивание по Граму использовалось как рутинная процедура как часть процесса идентификации видов. Было быстро замечено, что SCV-клетки всегда окрашивались светлее, чем их соответствующие WT-клетки, что указывает на возможные несоответствия между структурами их клеточной стенки, что является основой этого метода окрашивания.Оценка нескольких образцов с использованием простой визуальной аналоговой шкалы выявила значительные различия в интенсивности окрашивания, что является дополнительным доказательством того, что изменения клеточной стенки и связанного с ней белкового состава могут быть связаны с образованием SCV-клеток в ответ на холодовой стресс. Исследование, проведенное Серадски и Томаш [21] с участием мутанта S. aureus , устойчивого к ванкомицину, , показало, что этот мутант содержал большое количество пептидогликана и внеклеточного мусора, который имел вид материала клеточной стенки.Считалось, что накопление материала клеточной стенки изолирует ванкомицин из среды, тем самым не позволяя ему достичь своей цели и повредить клетку. Вероятно, что утолщение клеточной стенки, наблюдаемое в образцах SCV в этом текущем исследовании, могло предотвратить проникновение некоторого количества кристаллического фиолетового красителя внутрь стенки, что привело к появлению более светлых пятен по Граму, наблюдаемых во многом так же, как Серадски и Томаш сообщили, что более толстые клеточные стенки изолируют и связывают антибиотик, тем самым предотвращая его проникновение в клетку.Была высказана гипотеза, что более толстые клеточные стенки S. aureus и S. epidermidis SCV в сочетании с изменениями в аминокислотном составе у всех трех видов ограничивают поглощение красителя по Граму.

TEM-микрофотографии S. aureus и S. epidermidis SCV-клеток показали диффузные клеточные стенки, которые были значительно толще у этих видов стафилококков, тогда как между клетками WT и SCV для S.Лугдуненсис . Утолщение клеточной стенки было отмечено как механизм устойчивости, используемый S. aureus против проникновения клинически важных антибиотиков [35], [36]. В нашем исследовании SCV были вызваны воздействием температурного стресса с аналогичными результатами, предполагающими, что утолщение клеточной стенки может быть общей реакцией бактериальных клеток, подвергшихся стрессу. Более толстая клеточная стенка может действовать как защитный механизм для клетки от внеклеточных проблем, которые в противном случае могут поставить под угрозу жизнеспособность бактерии.В устойчивой к антибиотикам ЦНС диффузная природа клеточной стенки была идентифицирована как слизь, связанная с клеточной стенкой, которая, как считалось, усиливает прилипание и колонизацию этими видами, что делает их очень успешными в возникновении патогенеза, связанного с устройством [37]. Аналогичные ответы S. aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis , вызванные воздействием более холодных условий, также будут давать соответствующие преимущества для адгезии и выживания на фомитах для передачи между хозяевами.Очевидно, что S. lugdunensis вызывал другой клеточный ответ на холодовую обработку по сравнению с S. aureus и S. epidermidis , поскольку не имел поддающихся измерению изменений толщины клеточной стенки. Ответы S. aureus и S. epidermidis соответствовали гипотезе о том, что воздействие холода может приводить к утолщению клеточных стенок, как это наблюдается у обработанных антибиотиками клеток [35], но это не обязательно так для все стафилококки.

Дальнейший анализ микрофотографий ПЭМ показал, что образцы SCV имели более диффузные перегородки в делящихся клетках. В этих образцах также была значительно более высокая доля очевидных «асимметричных» делений клеток в S. aureus S. epidermidis и S. lugdunensis с меньшими дочерними клетками, наблюдаемыми в 81, 65 и 72% образцов SCV по сравнению только с 38. , 29 и 33% наблюдались в образцах WT, соответственно. Kahl и соавторы также [15] задокументировали нарушение образования перегородок в своем исследовании клинического S.aureus SCV и предположил, что это могло привести к нарушению разделения клеток. Sianglum и др. [38] отметили тот же результат, когда S. aureus лечили новым антибиотиком, и пришли к выводу, что антибиотик прерывает процессы деления клеток. Саньял и Гринвуд [39] наблюдали эту характеристику в культурах S. epidermidis , обработанных антибиотиком тейкопланином. ПЭМ-микрофотографии их образцов показали, что клетки подверглись делению на две дочерние клетки, но перегородки были сформированы ближе к одному полюсу клетки, а не прямо через середину клетки, подобно тому, что наблюдалось в этом текущем исследовании.Они не рассматривали возможные причины этой характеристики. Ультраструктурные изменения, наблюдаемые в S. aureus S. epidermidis и S. lugdunensis в ответ на длительное воздействие 4 ° C, согласуются с гипотезой о фенотипе выживаемости. продуцируется в популяции бактерий, подвергшихся стрессу, частота которых увеличивается при длительном воздействии. Было высказано предположение, что такой ответ будет совпадать с изменениями в биохимическом составе структуры клеточной стенки для оптимизации выживания клетки.Анализ экстрактов переваренных стенок и белков из клеток, собранных после роста в идеальных условиях (WT), по сравнению с таковыми из клеток, собранных после последующих 8 недель хранения при 4 ° C, выявил существенные изменения в аминокислотном составе.

Проверка оценок PCA показала ортогональную разницу в аминокислотном составе клеточной стенки и связанных белков между обработанными низкой температурой S. aureus , с одной стороны, по сравнению с S. epidermidis и S.lugdunensis , с другой стороны. Сравнение было проведено с использованием показателей аминокислот дикого типа для всех трех видов стафилококков, и применима прямая интерпретация, поскольку в пределах дикого штамма наблюдались незначительные вариации в уровнях аминокислот, не зависящие от штамма. Математическая интерпретация очевидной ортогональной кластеризации S. aureus по сравнению с S. epidermidis и S. lugdunensis в PC1 по сравнению с PC2, влечет за собой полное различие в физиологической реакции между двумя кластерами.Увеличение концентраций аминокислот, наблюдаемое в S. aureus , интерпретировалось как пропорциональное увеличение белков, связанных с клеточной стенкой, с соответствующими качественными различиями, поскольку все измеренные аминокислоты были повышены в разной степени. Напротив, у S. epidermidis и lugdunensis , по-видимому, обнаружены существенные качественные изменения в аминокислотном составе, которые согласовывались бы с качественными изменениями включения белка. Далее был сделан вывод, что пропорции белков, ассоциированных с клеточной стенкой, у S.epidermidis и S. lugdunensis были подобны своим соответствующим контрольным WT.

Данные показывают, что все три вида адаптируются путем изменения профилей аминокислотного состава клеточной стенки и связанных структурных белков, что подразумевает изменение состава белков. Дальнейшие выводы относительно возможной уникальной стратегии адаптации S. aureus в различных штаммах Staphylococcus при воздействии окружающей среды потребуют дополнительных эмпирических данных.Однако настоящие результаты соответствуют клиническим наблюдениям тяжелой патогенности, наблюдаемой у инфекций S. aureus по сравнению с другими видами стафилококков, что можно объяснить улучшением выживаемости за счет быстрой и радикальной адаптации [40]. Будущие исследования будут включать попытки идентифицировать изменения белков, которые могут произойти в ответ на стрессы окружающей среды. Более глубокое понимание белковых реакций, связанных с клеточной стенкой, на стимулы и стрессы окружающей среды может дать новое понимание для разработки противомикробных стратегий.

В заключение, результаты этого исследования достоверно показали, что воздействие низких температур S. aureus , S. epidermidis и S. lugdunensis спровоцировало морфологические, ультраструктурные и биохимические изменения в составе клеточной стенки, которые определяет их фенотипические результаты. Изменения, связанные с фенотипом SCV, были скорее временными, чем генетическими, о чем свидетельствует способность вернуться к фенотипу WT после субкультуры без стресса. Быстрое переключение между двумя фенотипами обеспечивает гибкость бактерий, что служит преимуществом, когда требуются быстрые реакции на колебания окружающей среды.

Благодарности

Мы благодарим Трейси Харрисон и Крейга Эванса за их помощь в проведении ПЦР изолятов. Демин Чжу и Син Дин Ван за помощь в работе с ТЕА.

Сноски

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Финансирование: Эта работа была поддержана международной стипендией Университета Ньюкасла, стипендией Гидеона Ланга и исследовательским грантом Гарольда Стэннета Уильямса и Джудит Мейсон.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Ссылки

1. Франк К.Л., Патель Р. Staphylococcus lugdunensis — Не средний коагулазонегативный стафилококк. Информационный бюллетень клинической микробиологии. 2008. 30: 55–62. [Google Scholar] 2. Шаберг Д.Р., Калвер Д.Х., Гейнес Р.П. Основные тенденции микробной этиологии внутрибольничной инфекции. Американский журнал медицины. 1991; 91 (приложение 3B): 72–75.[PubMed] [Google Scholar] 3. Носкин Г.А., Рубин Р.Дж., Шентаг Дж.Дж., Клюйтманс Дж., Хедблом ЕС и др. Бремя инфекций Staphylococcus aureus для больниц в США. Архивы внутренней медицины. 2005; 165: 1756–1761. [PubMed] [Google Scholar] 4. Оньянго Л.А., Данстан Р.Х., Робертс Т.К. Варианты небольших колоний стафилококков: патогенез и эволюционное значение в возникновении и поддержании проблемных инфекций человека. Журнал питания и экологической медицины. 2008; 17: 56–75. [Google Scholar] 5.von Eiff C, Becker K. Варианты малых колоний: еще один механизм, с помощью которого Staphylococcus aureus может уклоняться от иммунного ответа и противомикробной терапии. В: Fluit AC, Schmitz FJ, редакторы. MRSA: текущие перспективы. Уаймондем, Великобритания: Caister Academic Press; 2003. С. 253–273. [Google Scholar] 6. Хоффштадт RE, Youmans GP. Staphylococcus aureus : Диссоциация и ее связь с инфекцией и иммунитетом. J Infect Dis. 1932; 51: 216–242. [Google Scholar] 7. Зайферт Х., Висплингхофф Х., Шнабель П., фон Эйфф К.Варианты небольших колоний Staphylococcus aureus и инфекция, связанная с кардиостимулятором. Emerg Infect Dis. 2003; 9: 1316–1318. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Проктор Р.А., фон Эйфф С., Каль BC, Беккер К., Макнамара П. и др. Варианты небольших колоний: патогенная форма бактерий, способствующая хроническим и рецидивирующим инфекциям. Nat Rev Microbiol. 2006; 4: 295–305. [PubMed] [Google Scholar] 9. Sifri CD, Baresch-Bernal A, Calderwood SB, von Eiff C. Вирулентность Staphylococcus aureus небольших вариантов колонии в модели инфекции Caenorhabditis elegans .Заражение иммунной. 2006; 74: 1091–1096. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Баддур Л. М., Симпсон В. А., Вимс Дж. Дж., Хилл М., Кристенсен Г. Д.. Фенотипический отбор малых колоний вариантных форм Staphylococcus epidermidis на модели эндокардита на крысах. J Infect Dis. 1988. 157: 757–763. [PubMed] [Google Scholar] 11. Йонссон И.М., фон Эйфф С., Проктор Р.А., Петерс Дж., Райден С. и др. Вирулентность мутанта hemB, демонстрирующего фенотип варианта маленькой колонии Staphylococcus aureus в мышиной модели септического артрита.Microbiol Patho. 2003. 34: 73–79. [PubMed] [Google Scholar] 12. Vaudaux P, Francois P, Bisognano C, Kelley WL, Lew DP, et al. Повышенная экспрессия фактора слипания и фибронектин-связывающих белков мутантами hemB Staphylococcus aureus , экспрессирующими фенотипы вариантов малых колоний. Заражение иммунной. 2002; 70: 5428–5437. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Шерис Дж. К. Два небольших варианта колонии S. aureus , выделенные в чистой культуре из закрытых инфицированных поражений, и их потребности в диоксиде углерода.J Clin Pathol. 1952; 5: 354–355. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Макнамара П.Дж., Проктор Р.А. Staphylococcus aureus Варианты малых колоний, перенос электронов и стойкие инфекции. Int J Antimicrob Agents. 2000. 14: 117–122. [PubMed] [Google Scholar] 15. Каль BC, Беллинг Дж., Райхельт Р., Херрманн М., Проктор Р.А. и др. Тимидин-зависимые варианты небольших колоний Staphylococcus aureus обнаруживают грубые морфологические и ультраструктурные изменения, согласующиеся с нарушением разделения клеток.J Clin Microbiol. 2003. 41: 410–413. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Адлер Х., Видмер А., Фрей Р. Появление устойчивого к тейкопланину варианта небольшой колонии Staphylococcus epidermidis во время терапии ванкомицином. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2003. 22: 746–748. [PubMed] [Google Scholar] 17. Зайферт Х., Олтманнс Д., Беккер К., Висплингхофф Х., фон Эйфф К. Staphylococcus lugdunensis Инфекция, связанная с кардиостимулятором. Emerg Infect Dis. 2005; 11: 1283–1286. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18.Прескотт Л. М., Харли Дж. П., Кляйн Д. А.. Рост микробов — влияние факторов окружающей среды на рост. Микробиология. 5-е изд. Нью-Йорк: Макгроу-Хилл; 2002. [Google Scholar] 19. Сингх В.К., Хаттангади Д.С., Джотис Е.С., Сингх А.К., Чемберлен Н.Р. и др. Инсерционная инактивация дегидрогеназы альфа-кетокислот с разветвленной цепью в Staphylococcus aureus приводит к снижению содержания жирных кислот в мембране с разветвленной цепью и повышенной восприимчивости к определенным стрессам. Прикладная и экологическая микробиология.2008. 74: 5882–5890. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Дмитриев Б.А., Тукач Ф.В., Холст О., Ритчел Э.Т., Элерс С. Третичная структура Staphylococcus aureus murein клеточной стенки. Журнал бактериологии. 2004; 186: 7141–7148. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21. Серадски К., Томаш А. Ингибирование обновления клеточной стенки и автолиза ванкомицином у мутанта Staphylococcus aureus с высокой устойчивостью к ванкомицину. Журнал бактериологии. 1997; 179: 2557–2566.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 22. Батт Х.Л., Данстан Р.Х., МакГрегор Н.Р., Робертс Т.К., Зербес М. и др. Связь токсинов, повреждающих мембраны, от коагулазонегативных стафилококков и хронической боли в орофациальных мышцах. J Med Microbiol. 1998. 47: 577–584. [PubMed] [Google Scholar] 23. Браун Г.К., Мартин А.Р., Робертс Т.К., Эйткен Р.Дж. Обнаружение Ehrlichia platys у собак в Австралии. Aust Vet J. 2001; 79: 554–558. [PubMed] [Google Scholar] 24. фон Эйфф С., Петерс Г., Беккер К. Концепция варианта малой колонии (SCV) — роль стафилококковых SCV в хронических инфекциях.Травма, Int J Care Раненых. 2006; 37: S26 – S33. [PubMed] [Google Scholar] 25. Кипп Ф., Беккер К., Петерс Г., фон Эйфф С. Оценка различных методов определения устойчивости к метициллину в вариантах небольших колоний Staphylococcus aureus . J Clin Microbiol. 2004. 42: 1277–1279. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 26. Glauert AM. Фиксация, обезвоживание и заделка биологических образцов; В: Глауэрт AM, редактор. Кембридж: Биомедицинская пресса Эльзевьера-Северной Голландии; 1975. 207 [Google Scholar] 27.Дикстра MJ, Reuss LE. Подготовка образцов для электронной микроскопии и методы. В: Дикстра М.Дж., Ройсс Л.Е., редакторы. Биологическая электронная микроскопия: теория, методы и устранение неисправностей. 2-е изд. Нью-Йорк: издатели Kluwer Academic / Plenum; 2003. 534 [Google Scholar] 28. Ханаки Х., Лабищински Х., Инаба Й., Кондо Н., Мураками Х. и др. Повышение содержания глутамин-неамидированных муропептидов в пептидогликане устойчивого к ванкомицину штамма Staphylococcus aureus Mu50. Журнал антимикробной химиотерапии.1998. 42: 315–320. [PubMed] [Google Scholar] 29. de Jonge BLM, Chang Y-S, Gage D, Tomasz A. Пептидогликановая композиция высокоустойчивого к метициллину штамма Staphylococcus aureus . Журнал биологической химии. 1991; 267: 11248–11254. [PubMed] [Google Scholar] 30. Джексон Дж. Руководство пользователя по основным компонентам. Нью-Йорк: Уайли; 1991. [Google Scholar] 31. Уолд С. Перекрестная проверка количества компонентов в факторных и главных компонентных моделях. Технометрика. 1978; 20: 397–405.[Google Scholar] 33. Tuchscherr L, Medina E, Hussain M, Volker W., Heitmann V, et al. Staphylococcus aureus Переключение фенотипа: эффективная бактериальная стратегия, позволяющая избежать иммунного ответа хозяина и вызвать хроническую инфекцию. EMBO Mol Med. 2011; 3: 129–141. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 34. Леунг MJ, Nuttall N, Pryce TM, Coombs GW, Pearman JW. Вариация колонии Staphylococcus lugdunensis . J Clin Microbiol. 1998; 36: 3096–3098. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35.Цуй Л., Ма Х, Сато К., Окума К., Теновер Ф.К. и др. Утолщение клеточной стенки является общим признаком устойчивости к ванкомицину у Staphylococcus aureus
. J Clin Microbiol. 2003; 41: 5–14. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Цуй Л., Мураками Х., Кувахара-Араи К., Ханаки Х., Хирамацу К. Вклад утолщенной клеточной стенки и ее неамидированного компонента глутамина в устойчивость к ванкомицину, выражаемую Staphylococcus aureus Mu50. Противомикробные средства и химиотерапия. 2000; 44: 2276–2285.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Хогт А.Х., Данкерт Дж., Фейен Дж. Инкапсуляция, образование слизи и поверхностная гидрофобность коагулазонегативных стафилококков. FEMS Microbiol Lett. 1983; 18: 211–215. [Google Scholar] 38. Sianglum W, Srimanote P, Wonglumsom W, Kittiniyom K, Voravuthikunchai SP. Протеомный анализ клеточных белков метициллин-резистентного стафилококка Staphylococcus , обработанного родомиртоном, новым кандидатом в антибиотики. PLoS ONE. 2011; 6: 1–10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39.Саньял Д., Гринвуд Д. Исследование под электронным микроскопом устойчивых к гликопептидам антибиотиков штаммов Staphylococcus epidermidis . Журнал медицинской микробиологии. 1993; 39: 204–210. [PubMed] [Google Scholar] 40. Abu-Qatouseh LF, Chinni SV, Seggewiss J, Proctor RA, Brosius J, et al. Идентификация дифференциально экспрессируемых малых небелковых РНК в Staphylococcus aureus , демонстрирующих как нормальный, так и вариантный фенотип с малыми колониями. Журнал молекулярной медицины.2010. 88: 565–575. [PubMed] [Google Scholar]

клонов Staphylococcus epidermidis экспрессируют тейхоевую кислоту типа Staphylococcus aureus, чтобы перейти от комменсального к патогенному образу жизни

  • 1.

    Becker, K., Heilmann, C. & Peters, G. Коагулазонегативные стафилококки . Clin. Microbiol. Ред. 27 , 870–926 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 2.

    Берд, А. Л., Белкайд, Ю.И Сегре, Дж. А. Микробиом кожи человека. Нат. Rev. Microbiol. 16 , 143–155 (2018).

    CAS PubMed Google ученый

  • 3.

    Lee, J. Y. H. et al. Глобальное распространение трех линий с множественной лекарственной устойчивостью Staphylococcus epidermidis . Нат. Microbiol. 3 , 1175–1185 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 4.

    Li, M., Wang, X., Gao, Q. & Lu, Y. Молекулярная характеристика штаммов Staphylococcus epidermidis , выделенных из учебной больницы в Шанхае, Китай. J. Med. Microbiol. 58 , 456–461 (2009).

    CAS PubMed Google ученый

  • 5.

    Meric, G. et al. Связанные с заболеванием генотипы комменсальной кожной бактерии Staphylococcus epidermidis . Нат. Commun. 9 , 5034 (2018).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 6.

    Heilmann, C., Ziebuhr, W. & Becker, K. Являются ли коагулазонегативные стафилококки вирулентными ?. Clin. Microbiol. Заразить. 25 , 1071–1080 (2019).

    CAS PubMed Google ученый

  • 7.

    Weidenmaier, C. & Peschel, A. Тейхоевые кислоты и родственные гликополимеры клеточной стенки в грамположительной физиологии и взаимодействиях с хозяином. Нат. Rev. Microbiol. 6 , 276–287 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 8.

    Моллер А.Г., Линдсей Дж. А. и Рид Т.Д. Детерминанты диапазона фаговых хозяев у видов Staphylococcus . Заявл. Environ. Microbiol. 85 , e00209-19 (2019).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 9.

    Chen, J. et al. Гипермобильность генома за счет боковой трансдукции. Наука 362 , 207–212 (2018).

    CAS PubMed Google ученый

  • 10.

    Хаабер Дж., Пенадес Дж. Р. и Ингмер Х. Передача устойчивости к антибиотикам у Staphylococcus aureus . Trends Microbiol. 25 , 893–905 (2017).

    CAS PubMed Google ученый

  • 11.

    Lee, A. S. et al. Метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus . Нат. Преподобный Дис. Праймеры , , 4, , 18033 (2018).

    PubMed Google ученый

  • 12.

    Пенадес, Дж. Р. и Кристи, Г. Э. Фаго-индуцируемые хромосомные острова: семейство высокоразвитых молекулярных паразитов. Annu. Rev. Virol. 2 , 181–201 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • 13.

    Meric, G. et al. Экологическое перекрытие и горизонтальный перенос генов у Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis . Genome Biol. Evol. 7 , 1313–1328 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 14.

    Li, M. et al. Эпидемия MRSA связана с быстро распространяющейся детерминантой колонизации и вирулентности. Нат. Med. 18 , 816–819 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 15.

    Winstel, V. et al. Структура тейхоевой кислоты стенки регулирует горизонтальный перенос генов между основными бактериальными патогенами. Нат. Commun. 4 , 2345 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 16.

    Fitzgerald, J. R. et al. Характеристика предполагаемого острова патогенности крупного рогатого скота Staphylococcus aureus , кодирующего несколько суперантигенов. J. Bacteriol. 183 , 63–70 (2001).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 17.

    Maiques, E. et al. Роль стафилококкового фага и интегразы SaPI во внутри- и межвидовом переносе SaPI. J. Bacteriol. 189 , 5608–5616 (2007).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 18.

    Браун, С., Санта-Мария, Дж. П. младший и Уолкер, С. Уолл тейхоевые кислоты грамположительных бактерий. Annu. Rev. Microbiol. 67 , 313–336 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 19.

    Винстел В., Ся Г. и Пешель А. Пути и роль гликозилирования тейхоевой кислоты стенки в Staphylococcus aureus . Внутр. J. Med. Microbiol. 304 , 215–221 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 20.

    Krismer, B. et al. Ограничение питательных веществ регулирует метаболизм Staphylococcus aureus и адаптацию ниши в носу человека. PLoS Pathog. 10 , e1003862 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 21.

    Xia, G. et al. Гликозилирование тейхоевой кислоты стенки у Staphylococcus aureus с помощью TarM. J. Biol. Chem. 285 , 13405–13415 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Дин Б. А., Уильямс Р. Э., Холл Ф. и Корс Дж. Фаготипирование коагулазонегативных стафилококков и микрококков. J. Hyg. (Лондон) 71 , 261–270 (1973).

    CAS Google ученый

  • 23.

    Miragaia, M. et al. Сравнение методов молекулярного типирования для характеристики Staphylococcus epidermidis : предложение по определению клона. J. Clin. Microbiol. 46 , 118–129 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 24.

    Sivadon, V. et al. Частичное секвенирование atlE штаммов Staphylococcus epidermidis от инфекций протезных суставов. J. Clin. Microbiol. 47 , 2321–2324 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 25.

    Мертенс А. и Гебремедин Б.Генетические детерминанты и образование биопленок клинических изолятов Staphylococcus epidermidis из посевов крови и постоянных устройств. Eur. J. Microbiol. Иммунол. 3 , 111–119 (2013).

    CAS Google ученый

  • 26.

    Sharma, P. et al. Мультилокусное типирование последовательности для интерпретации изолятов крови Staphylococcus epidermidis . междисциплинарный. Перспектива. Заразить. Дис. 2014 , 787458 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 27.

    Post, V. et al. Сравнительное исследование геномики изолятов Staphylococcus epidermidis от инфекций, связанных с ортопедическими устройствами, коррелировало с исходом для пациента. J. Clin. Microbiol. 55 , 3089–3103 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28.

    Both, A. et al. Четкие клональные линии и разнообразие внутри хозяина формируют инвазивные популяции Staphylococcus epidermidis . PLoS Pathog. 17 , e1009304 (2021 г.).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 29.

    Weiser, J. et al. Субингибирующие концентрации тигециклина индуцируют образование биопленок, зависящее от белка Embp, связывающего внеклеточный матрикс, Staphylococcus epidermidis и уклонение от иммунитета. Внутр. J. Med. Microbiol. 306 , 471–478 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 30.

    Ван, Л. и Арчер, Г. Л. Роли CcrA и CcrB в вырезании и интеграции стафилококковой кассетной хромосомы mec , геномного острова Staphylococcus aureus . J. Bacteriol. 192 , 3204–3212 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 31.

    Jiang, Y., Oliver, P., Davies, K. E. & Platt, N. Идентификация и характеристика мышиного SCARA5, нового рецептора мусорщика класса A, который экспрессируется популяциями эпителиальных клеток. J. Biol. Chem. 281 , 11834–11845 (2006).

    CAS PubMed Google ученый

  • 32.

    Baur, S. et al. Назальный эпителиальный рецептор для Staphylococcus aureus WTA регулирует адгезию к эпителиальным клеткам и модулирует носовую колонизацию. PLoS Pathog. 10 , e1004089 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Widerstrom, M., McCullough, CA, Coombs, GW, Monsen, T. & Christiansen, KJ Клон Staphylococcus epidermidis (ST2) с множественной лекарственной устойчивостью является постоянной причиной внутрибольничной инфекции в Больница Западной Австралии. J. Clin. Microbiol. 50 , 2147–2151 (2012).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Ziebuhr, W. et al. Нозокомиальные инфекции, вызванные Staphylococcus epidermidis : как комменсальная бактерия превращается в возбудителя. Внутр. J. Antimicrob. Агенты 28 , S14 – S20 (2006).

    CAS PubMed Google ученый

  • 35.

    Du, X. et al. Молекулярный анализ штаммов Staphylococcus epidermidis , выделенных из местных сообществ и больниц в Китае. PLoS ONE 8 , e62742 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 36.

    Zhang, Y.Q. et al. Геномный анализ генов вирулентности в не образующем биопленку штамме Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228). Мол. Microbiol. 49 , 1577–1593 (2003).

    CAS PubMed Google ученый

  • 37.

    Mack, D., Siemssen, N. & Laufs, R. Параллельная индукция глюкозой адгезии и полисахаридного антигена, специфичного для прилипшего к пластику Staphylococcus epidermidis : доказательства функциональной связи с межклеточной адгезией. Заражение. Иммун. 60 , 2048–2057 (1992).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 38.

    Отто М. Стафилококковые биопленки. Microbiol.Спектр. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.GPP3-0023-2018 (2018).

  • 39.

    Weidenmaier, C. et al. Недостаток тейхоевой кислоты в стенке у Staphylococcus aureus приводит к снижению взаимодействий с эндотелиальными клетками и ослаблению вирулентности на кроличьей модели эндокардита. J. Infect. Дис. 191 , 1771–1777 (2005).

    CAS PubMed Google ученый

  • 40.

    Weidenmaier, C.и другие. Роль тейхоевой кислоты в носовой колонизации Staphylococcus aureus , являющейся основным фактором риска внутрибольничных инфекций. Нат. Med. 10 , 243–245 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • 41.

    Schade, J. & Weidenmaier, C. Гликополимеры клеточной стенки Firmicutes и их роль в качестве небелковых адгезинов. FEBS Lett. 590 , 3758–3771 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 42.

    Weidenmaier, C. et al. Дифференциальная роль заякоренных сортазой поверхностных белков и тейхоевой кислоты стенки в носовой колонизации Staphylococcus aureus . Внутр. J. Med. Microbiol. 298 , 505–513 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 43.

    Фостер Т. Дж. Поверхностные белки Staphylococcus epidermidis . Фронт. Microbiol. 11 , 1829 (2020).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 44.

    Zipperer, A. et al. Комменсалы человека, продуцирующие новый антибиотик, ухудшают колонизацию патогенов. Природа 535 , 511–516 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 45.

    Iwase, T. et al. Staphylococcus epidermidis Esp ингибирует Staphylococcus aureus образование биопленок и колонизацию носа. Природа 465 , 346–349 (2010).

    CAS PubMed Google ученый

  • 46.

    Ladner, J. T., Grubaugh, N. D., Pybus, O. G. & Andersen, K. G. Прецизионная эпидемиология для борьбы с инфекционными заболеваниями. Нат. Med. 25 , 206–211 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 47.

    Wirth, T. et al. Специализация ниши и распространение Staphylococcus capitis , вовлеченных в неонатальный сепсис. Нат. Microbiol. 5 , 735–745 (2020).

    CAS PubMed Google ученый

  • 48.

    van Dalen, R. et al. Не выбрасывайте Staphylococcus aureus WTA в качестве вакцинного антигена. Природа 572 , E1 – E2 (2019).

    PubMed Google ученый

  • 49.

    Tormo, M. A. et al. Staphylococcus aureus ДНК острова патогенности упакована в частицы, состоящие из фаговых белков. J. Bacteriol. 190 , 2434–2440 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 50.

    Винстел В., Кунер П., Роде Х. и Пешель А. Генетическая инженерия нетрансформируемых коагулазонегативных стафилококковых патогенов. Нат. Protoc. 11 , 949–959 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 51.

    Зербино, Д. Р. и Бирни, Э. Вельвет: алгоритмы для сборки короткого чтения de novo с использованием графов де Брейна. Genome Res. 18 , 821–829 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 52.

    Банкевич А. и др. SPAdes: новый алгоритм сборки генома и его приложения для секвенирования отдельных клеток. J. Comput. Биол. 19 , 455–477 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 53.

    Thomas, J. C. et al. Улучшенная схема мультилокусного типирования последовательностей для Staphylococcus epidermidis . J. Clin. Microbiol. 45 , 616–619 (2007).

    PubMed Google ученый

  • 54.

    Kaya, H. et al. SCC mec Finder, веб-инструмент для типирования хромосомы стафилококковой кассеты mec в Staphylococcus aureus с использованием данных последовательности всего генома. мSphere https: // doi.org / 10.1128 / mSphere.00612-17 (2018).

  • 55.

    Siguier, P., Perochon, J., Lestrade, L., Mahillon, J. & Chandler, M. ISfinder: справочный центр для последовательностей бактериальных вставок. Nucleic Acids Res. 34 , D32 – D36 (2006).

    CAS PubMed Google ученый

  • 56.

    Sahl, J. W. et al. NASP: точный и быстрый метод идентификации SNP в наборах данных WGS, поддерживающий гибкие форматы ввода и вывода. Micro. Геном. 2 , e000074 (2016).

    Google ученый

  • 57.

    Li, H. & Durbin, R. Быстрое и точное выравнивание в режиме длительного считывания с помощью преобразования Барроуза – Уиллера. Биоинформатика 26 , 589–595 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 58.

    McKenna, A. et al. Набор инструментов для анализа генома: платформа MapReduce для анализа данных секвенирования ДНК следующего поколения. Genome Res. 20 , 1297–1303 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 59.

    DePristo, M. A. et al. Структура для обнаружения вариаций и генотипирования с использованием данных секвенирования ДНК следующего поколения. Нат. Genet. 43 , 491–498 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 60.

    Делчер А. Л., Филлиппи А., Карлтон Дж. И Зальцберг С. Л. Быстрые алгоритмы для крупномасштабного выравнивания и сравнения геномов. Nucleic Acids Res. 30 , 2478–2483 (2002).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 61.

    Kurtz, S. et al. Универсальное и открытое программное обеспечение для сравнения больших геномов. Genome Biol. 5 , R12 (2004 г.).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 62.

    Arndt, D. et al. PHASTER: улучшенная и быстрая версия инструмента поиска фагов PHAST. Nucleic Acids Res. 44 , W16 – W21 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 63.

    Краучер, Н. Дж. И др. Быстрый филогенетический анализ больших выборок последовательностей целого генома рекомбинантных бактерий с использованием Gubbins. Nucleic Acids Res. 43 , e15 (2015).

    PubMed Google ученый

  • 64.

    Edgar, R.C. MUSCLE: множественное выравнивание последовательностей с высокой точностью и высокой пропускной способностью. Nucleic Acids Res. 32 , 1792–1797 (2004).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 65.

    Guindon, S. & Gascuel, O. Простой, быстрый и точный алгоритм для оценки крупных филогений по максимальной вероятности. Syst. Биол. 52 , 696–704 (2003).

    Google ученый

  • 66.

    Guindon, S. et al. Новые алгоритмы и методы для оценки филогении максимального правдоподобия: оценка производительности PhyML 3.0. Syst. Биол. 59 , 307–321 (2010).

    CAS PubMed Google ученый

  • 67.

    Анисимова, М., Гил, М., Дюфаярд, Дж. Ф., Дессимоз, К. и Гаскуэл, О. Обзор методов поддержки ветвей демонстрирует точность, мощность и надежность схем аппроксимации, основанных на быстром правдоподобии. Syst. Биол. 60 , 685–699 (2011).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 68.

    Гервиг, Дж. Дж., Камерлинг, Дж. П. и Флигентхарт, Дж. Ф. Определение абсолютной конфигурации моносахаридов в сложных углеводах с помощью капиллярных G.L.C. Carbohydr. Res. 77 , 10–17 (1979).

    CAS PubMed Google ученый

  • 69.

    Geiger, T. et al. Строгий ответ Staphylococcus aureus и его влияние на выживаемость после фагоцитоза за счет индукции внутриклеточной экспрессии PSM. PLoS Pathog. 8 , e1003016 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 70.

    Bruckner, R. Серия челночных векторов для Bacillus subtilis и Escherichia coli . Ген 122 , 187–192 (1992).

    CAS PubMed Google ученый

  • 71.

    Wang, L. et al. SarZ является ключевым регулятором образования биопленок и вирулентности у Staphylococcus epidermidis . J. Infect. Дис. 197 , 1254–1262 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 72.

    Кречмер Д., Раутенберг М., Линке Д. и Пешель А.Длина пептида и состояние фолдинга регулируют способность стафилококковых фенолрастворимых модулянов бета-типа активировать человеческие рецепторы формилпептидов 1 или 2. J. Leukoc. Биол. 97 , 689–697 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • Назальный комменсальный Staphylococcus epidermidis противодействует вирусу гриппа

  • Frank, D. N. et al. Микробиота носа человека и носительство золотистого стафилококка.PLoS One 5, e10598, 10.1371 / journal.pone.0010598 (2010).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Wei, W. et al. Консервативные гены на пути от комменсализма к патогенности: сравнительные филогенетические профили Staphylococcus epidermidis RP62A и ATCC12228. BMC Genomics 7, 112 (2006).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • Джи, Г., Бивис, Р. и Новик, Р. П. Бактериальное вмешательство, вызванное аутоиндуцирующими вариантами пептидов. Science 276, 2027–2030 (1997).

    CAS PubMed Google ученый

  • Отто, M. Staphylococcus epidermidis — «случайный» возбудитель. Nat. Rev. Microbiol. 7. С. 555–567 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Уайтхед, С.С., Ливитт, Р.W. & Jensen, M. M. Стафилококкоз индеек. 6. Развитие устойчивости к пенициллину у интерферирующего штамма Staphylococcus epidermidis. Птичий Дис. 37, 536–541 (1993).

    CAS PubMed Google ученый

  • Николл Т. Р. и Дженсен М. М. Стафилококкоз индеек. 5. Масштабные программы борьбы с бактериальным вмешательством. Птичий Дис. 31, 85–88 (1987).

    CAS PubMed Google ученый

  • Уилкинсон, Д.М. и Дженсен, М. М. Стафилококкоз индеек. 4. Характеристика бактериоцина, продуцируемого мешающим стафилококком. Птичий Дис. 31, 80–84 (1987).

    CAS PubMed Google ученый

  • Фалагас, М. Э., Рафаилидис, П. И. и Макрис, Г. С. Бактериальное вмешательство для профилактики и лечения инфекций. Int. J. Antimicrob. Агенты 31, 518–522 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • Друц, Д.Дж., Ван Вэй, М. Х., Шаффнер, В. и Кениг, М. Г. Бактериальное вмешательство в терапию рецидивирующих стафилококковых инфекций. Множественные абсцессы из-за имплантации штамма стафилококка 502А. N. Engl. J. Med. 275, 1161–1165 (1966).

    CAS PubMed Google ученый

  • Штраус У. Г., Майбах Х. И. и Шайнфилд Х. Р. Лечение рецидивирующего фурункулеза с помощью бактериального вмешательства. 2. Демонстрация взаимосвязи штамма и патогенности.JAMA 208, 861–863 (1969).

    CAS PubMed Google ученый

  • Шайнфилд, Х. Р., Риббл, Дж. К. и Борис, М. Бактериальное вмешательство между штаммами Staphylococcus aureus, 1960–1970 гг. Am. J. Dis. Ребенок. 121, 148–152 (1971).

    CAS PubMed Google ученый

  • Iwase, T. et al. Staphylococcus epidermidis Esp подавляет образование биопленок Staphylococcus aureus и колонизацию носа.Nature 465, 346–349 (2010).

    ADS CAS PubMed Google ученый

  • Керр, Т. Дж. И Макхейл, Б. Б. В приложениях в общей микробиологии (изд. Керр, Т. Дж.) 331–335 (Hunter Textbooks, Inc., 2003).

  • Линоли О., Маркони С. и Гараффа М. Количественная бактериальная экология нормальной слизистой оболочки носа. Ann Sclavo 23, 151–161 (1981).

    CAS PubMed Google ученый

  • McCabe, W.R. Бактериальное вмешательство, индуцированное стафилококками в яйцах с зародышем. J. Clin. Инвестировать. 46, 453–462 (1967).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Скехел, Дж. Дж. И Уотерфилд, М. Д. Исследования первичной структуры гемагглютинина вируса гриппа. Proc. Natl. Акад. Sci. США 72, 93–97 (1975).

    ADS CAS PubMed Google ученый

  • Лакенби, А., Thompson, C. I. & Democratis, J. Потенциальное влияние гриппа, устойчивого к ингибиторам нейраминидазы. Curr. Opin. Заразить. Дис. 21. С. 626–638 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • Huber, H. et al. Распространенность и характеристики метициллин-резистентных коагулазонегативных стафилококков домашнего скота, куриных туш, бестарного молока, мясного фарша и контактных лиц. BMC Vet. Res. 7, 6, 10.1186 / 1746-6148-7-6 (2011).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • Nagase, N. et al. Выделение и видовое распространение стафилококков из кожи животных и человека. J. Vet. Med. Sci. 64, 245–250 (2002).

    PubMed Google ученый

  • Lowe, B.A. et al. Микробные сообщества в миндалинах здоровых свиней. Вет. Microbiol. 147. С. 346–357 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • Халлер, О.& Вебер, Ф. Схема ответа интерферона в противовирусной защите хозяина. Верх. К. акад. Geneeskd. Бельг. 71, 73–86 (2009).

    CAS PubMed Google ученый

  • Fey, P. D. et al. Характеристика взаимосвязи полисахаридного межклеточного адгезина и гемагглютинации у Staphylococcus epidermidis. J. Infect. Дис. 179, 1561–1564 (1999).

    CAS PubMed Google ученый

  • Мак, Д.и другие. Существенная функциональная роль полисахаридного межклеточного адгезина Staphylococcus epidermidis в гемагглютинации. Заразить. Иммун. 67, 1004–1008 (1999).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Begun, J. et al. Экзополисахарид стафилококковой биопленки защищает от иммунной защиты Caenorhabditis elegans. PLoS. Патог. 3. С. 526–540 (2007).

    CAS Google ученый

  • Коста, А.Р., Энрикес, М., Оливейра, Р. и Азередо, Дж. Роль полисахаридного межклеточного адгезина (PIA) в адгезии Staphylococcus epidermidis к тканям хозяина и последующей толерантности к антибиотикам. Евро. J. Clin. Microbiol. Заразить. Дис. 28, 623–629 (2009).

    CAS PubMed Google ученый

  • Christner, M. et al. Гигантский связывающий внеклеточный матрикс белок Staphylococcus epidermidis опосредует накопление биопленок и прикрепление к фибронектину.Мол. Microbiol. 2010. Т. 75. С. 187–207.

    CAS PubMed Google ученый

  • Manicassamy, B. et al. Анализ in vivo динамики инфицирования вирусом гриппа мышей с использованием репортерного вируса GFP. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 107, 11531–11536 (2010).

    ADS CAS PubMed Google ученый

  • Макки-Лоуренс, Н. М., Поттер, Д. Э., Серка, Н.& Джефферсон, К. К. Иммунодоминантный поверхностный антиген B Staphylococcus aureus представляет собой связанный с поверхностью клетки белок, связывающий нуклеиновую кислоту. BMC Microbiol. 9, 61, 10.1186 / 1471-2180-9-61 (2009).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Смит Д. Г., Уилкокс М. Х., Уильямс П., Финч Р. Г. и Дениер С. П. Характеристика белков клеточной оболочки Staphylococcus epidermidis, культивируемых в перитонеальном диализате человека.Заразить. Иммун. 59, 617–624 (1991).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Равиндранат Р. М., Хасан С. А. и Мондино Б. Дж. Иммунопатологические особенности эндофтальмита, вызванного Staphylococcus epidermidis, у крыс. Curr. Eye Res. 16, 1036–1043 (1997).

    CAS PubMed Google ученый

  • Uehara, Y. et al. Бактериальное вмешательство среди обитателей носа: уничтожение Staphylococcus aureus из носовых полостей путем искусственной имплантации Corynebacterium sp.J. Hosp. Заразить. 44. С. 127–133 (2000).

    CAS PubMed Google ученый

  • Schommer, N. N. et al. Эпидермальный стафилококк использует различные механизмы образования биопленок, чтобы препятствовать фагоцитозу и активации макрофагоподобных клеток мыши 774A.1. Заразить. Иммун. 79, 2267–2276 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Рош, Ф.M., Meehan, M. и Foster, T. J. Поверхностный белок Staphylococcus aureus SasG и его гомологи способствуют прикреплению бактерий к слущенным эпителиальным клеткам носа человека. Microbiology 149, 2759–2767 (2003).

    CAS Google ученый

  • Wei, Y. et al. Рецепторы урокиназы необходимы для передачи сигналов, опосредованной интегрином альфа 5 бета 1, в опухолевых клетках. J. Biol. Chem. 282, 3929–3939 (2007).

    CAS PubMed Google ученый

  • Юлкунен, И., Vartio, T. & Keski-Oja, J. Локализация сайтов связывания вирусной оболочки-гликопротеина в фибронектине. Biochem. J. 219, 1984. С. 425–428.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Юлкунен, И., Хаутанен, А. и Кески-Оя, Дж. Взаимодействие гликопротеинов вирусной оболочки с фибронектином. Заразить. Иммун. 40, 876–881 (1983).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Раддац, Э., Monnet-Tschudi, F., Verdan, C. & Kucera, P. Распределение фибронектина в курином эмбрионе во время образования бластулы. Анат. Эмбриол. (Берл) 183, 57–65 (1991).

    CAS Google ученый

  • Бернард Б. А., Акияма С. К., Ньютон С. А., Ямада К. М. и Олден К. Структурные и функциональные сравнения клеточных фибронектинов курицы и человека. J. Biol. Chem. 259, 9899–9905 (1984).

    CAS PubMed Google ученый

  • Куэпперс, Ф.Роль усиливающей терапии при дефиците альфа-1-антитрипсина. Curr. Med. Res. Opin. 27. С. 579–588 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • Гамез, А., Ван, Л., Штрауб, М., Патч, М. Г. и Стивенс, Р. С. К заместительной ферментной терапии ФКУ: ПЭГилирование с сохранением активности трех форм рекомбинантной фенилаланингидроксилазы. Мол. Ther. 9. С. 124–129 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • Пейн, Р.В., Мерфи, Б. М. и Мэннинг, М. С. Проблемы разработки продуктов для ПЭГилированных белков. Pharm. Dev. Technol. 16. С. 423–440 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • Goldstein-Daruech, N. et al. Табачный дым опосредует индукцию микробных биопленок придаточных пазух носа. PLoS One 6, e15700, 10.1371 / journal.pone.0015700 (2011).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Холмс, Э.C. et al. Обширное географическое смешение вируса гриппа A человека h2N1 2009 г. в одном университетском сообществе. J. Virol. 85, 6923–6929 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Wang, C. W. и Wang, C. H. Экспериментальный отбор производных вируса с вариациями вирулентности из одного полевого изолята вируса птичьего гриппа H6N1 с низкой патогенностью. Птичий Дис. 47, 1416–1422 (2003).

    PubMed Google ученый

  • Балыш, А.Л., Кац, Дж. М. и Климов, А. И. Грипп: распространение, количественная оценка и хранение В текущих протоколах микробиологии (ред. Григг, М. и др.), Гл. 15, 10.1002 / 9780471729259.mc15g01s29 (2013).

  • Климов А.В. и др. Титрование вируса гриппа, антигенная характеристика и серологические методы выявления антител. Методы Мол. Биол. 2012. Т. 865. С. 25–51.

    CAS PubMed Google ученый

  • Чен, К.H. et al. Важность альфа-2-макроглобулина для врожденного иммунитета слюны человека против нового вируса гриппа А свиного происхождения h2N1. Proteomics 10, 2396–2401 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Martin, A. & Clynes, M. Кислая фосфатаза: конечная точка для тестов на токсичность in vitro . In vitro Cell. Dev. Биол. 27А, 183–184 (1991).

    CAS PubMed Google ученый

  • Biacchesi, S.и другие. Быстрый анализ микронейтрализации метапневмовируса человека на основе экспрессии зеленого флуоресцентного белка. J. Virol. Методы 128, 192–197 (2005).

    CAS PubMed Google ученый

  • Chen, H. W. et al. Ингибирующее и комбинаторное действие дифиллина, блокатора v-АТФазы, на вирусы гриппа. Antiviral Res. 99, 371–382 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Цзян, Х., Yang, H. & Kapczynski, D. R. Предварительная обработка куриным интерфероном альфа снижает репликацию вирусов пандемического птичьего гриппа h2N1 и H5N9 в культурах клеток легких различных видов птиц. Virol. J. 8, 447, 10.1186 / 1743-422X-8-447 (2011).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Ли, М.С., Чанг, П.С., Шиен, Дж. Х., Ченг, М. С. и Ши, Х. К. Идентификация и субтипирование вирусов птичьего гриппа с помощью ПЦР с обратной транскрипцией.J. Virol. Методы 97, 13–22 (2001).

    CAS PubMed Google ученый

  • Adams, S. et al. Влияние аллеля NS1 вируса гриппа птиц на репликацию вируса и экспрессию врожденных генов в клетках птиц. Мол. Иммунол. 56, 358–368 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • Пантин-Джеквуд, М. Дж. Иммуногистохимическое окрашивание для обнаружения вируса птичьего гриппа в тканях.Методы Мол. Биол. 2014. Т. 436. С. 77–83.

    Google ученый

  • Границы | Распространение через воздух устойчивых к метициллину Staphylococcus aureus со свиноводческой фермы

    Введение

    Сельскохозяйственные животные являются резервуаром для передачи связанных с животноводством метициллин-резистентных Staphylococcus aureus (LA-MRSA) к людям (1–3). Способы передачи вызывают серьезную озабоченность в нескольких европейских странах, особенно в странах с низким уровнем заболеваемости MRSA среди людей и крупных свиноводческих хозяйств.В Дании доля стад свиней, положительных по LA-MRSA, резко увеличилась с момента получения первых результатов в 2008 году, достигнув 95% в 2019 году (4), и в то же время наблюдалось резкое увеличение случаев заражения человека LA-MRSA. В первую очередь это касалось лиц, напрямую контактировавших со свиноводческими фермами; например, сельскохозяйственных рабочих и членов семьи. Однако примерно одна треть инфекций LA-MRSA в Дании не связана с прямым контактом с домашним скотом (5, 6). В 2019 году было зарегистрировано 1122 новых случая заболевания человека LA-MRSA, включая как клинические случаи, так и бессимптомных носителей.Среди новых случаев LA-MRSA 34% инфекций и 11% колонизаций не были связаны с прямым контактом с домашним скотом, соответственно (4). Передача людям, не контактирующим с домашним скотом, скорее всего, происходит через контакты с людьми, но может также возникнуть в результате распространения LA-MRSA в окружающей среде от свиноводческих хозяйств.

    LA-MRSA у датских свиней почти исключительно принадлежит клональному комплексу (CC) 398, в котором преобладают spa типов t011 и t034, отрицательны по лейкоцидину Panton-Valentine (PVL) и не несут ген scn в качестве маркера для кодируемый фагом кластер иммунного уклонения человека (IEC).Было показано, что стафилококки связаны с частицами пыли на свинофермах (7), а LA-MRSA можно культивировать из частиц пыли более чем через 30 дней после отбора проб (8). Было показано, что передача LA-MRSA людям-добровольцам при кратковременном пребывании на зараженной свиной ферме зависит от концентрации LA-MRSA в воздухе и вызывает временное заражение только у 95% добровольцев (9 ). В том же исследовании сообщалось об уровнях переносимого по воздуху MRSA на одной свиноферме в помещениях с поросятами-отъемышами в возрасте от 24 до 5 лет.452 КОЕ / м 3 и другое исследование на пяти свиноводческих фермах показало, что концентрация LA-MRSA в воздухе составляет от 21 до 517 КОЕ / м 3 (10). Немецкое исследование показало, что LA-MRSA может быть обнаружен в низких концентрациях в пробах воздуха рядом с фермой и в образцах почвы, собранных на расстоянии до 300 метров от свиноводческих ферм (11). Доступна лишь ограниченная информация о степени выбросов LA-MRSA в воздух от свиноводческих ферм и о предполагаемом риске передачи людям, остающимся в среде ферм, что вызвало обеспокоенность в некоторых общинах, соседствующих с свинофермами.

    Целью настоящего исследования является количественная оценка распространения MRSA по воздуху на ферме свиней с положительным результатом LA-MRSA. Для этого был применен метод отбора проб больших объемов воздуха промышленным пылесосом, работающим как импинджер (12). Результаты сравнивались с метеорологическими данными и бактериологическими исследованиями образцов почвы и людей, участвовавших в процессе отбора проб.

    Материалы и методы

    Описание фермы

    Исследование проводилось на ферме свиней с положительной реакцией на LA-MRSA, в которой содержалось около 2500 поросят-отъемышей.Здание (дополнительный рисунок 1) состоит из 11 секций, восемь из которых содержат отъемышей в возрасте 4–12 недель. В каждой секции содержались поросята, родившиеся на одной неделе, которых перевезли со свиноматки, расположенной в 2 км. В трех разделах были только финишеры. В каждом отделении отъемышей было 10 загонов, в каждом из которых находилось 30-40 поросят. Каждая секция имела две вентиляционные шахты, за исключением двух комнат для отъема, в которых была только одна вентиляционная шахта.

    Ближайшая свиноводческая ферма была расположена в 860 м к юго-востоку от исследовательской фермы.

    Описание метода отбора проб

    Ферму посетили пять раз с октября по декабрь 2018 года. Во время двух посещений процедура отбора проб проводилась дважды (утром и вечером), в результате чего в исследование было включено в общей сложности семь проб. Биоаэрозоли собирались из выпускных отверстий системы вентиляции фермы и с территории вокруг фермы пылесосами Kärchner DS5800, работающими как импинджеры, как описано ранее (12, 13). Отбор проб выполнялся, как описано Jang et al.(13) с 2 л PBS в вихревой камере и пылесосом, работающим с расходом 1,5 м 3 / мин.

    Для сбора биоаэрозолей из выпускных отверстий системы вентиляции фермы вход пылесоса был соединен с трубкой из углеродного волокна (длиной 9 м, диаметром 4,5 см), чтобы обеспечить доступ к выходным отверстиям на крыше фермы. Четыре активных выхода вентилятора были взяты в течение 15 мин.

    При каждом отборе проб биоаэрозоли собирали с подветренной стороны от фермы на расстояниях 50, 100, 200 и 300 м от зданий.Фактическое направление ветра на ферме, использованное для размещения импинджеров в начале дня отбора проб, было основано на местном прогнозе погоды от Датского метеорологического института и наблюдениях в этом месте. На каждом из расстояний 50, 100 и 200 м четыре пылесоса были размещены перпендикулярно направлению ветра на расстоянии ~ 27, 33 и 44 м соответственно, а два пылесоса — на расстоянии 300 м с интервалом 56 м между ними. Кроме того, один пылесос был установлен в 50 м против ветра (дополнительный рисунок 1).Пылесосы были размещены на высоте ~ 1,5 м над уровнем земли на платформе наверху стремянки, соответствующей высоте поступления воздуха человеком, и работали в течение 3 часов с расходом 1,5 м 3 / мин. при каждом отборе пробы собираются частицы из 270 м 3 воздуха.

    После каждого отбора проб содержимое PBS из вихревой камеры переносилось во флаконы Bluecap, выдерживалось при 4 ° C и транспортировалось в лабораторию для анализа в течение 24 часов. Между отбором образцов вихревую камеру промывали 70% этанолом в течение 5 минут с последующей промывкой стерильной деионизированной водой.

    Количественное определение MRSA в пробах воздуха вне фермы

    MRSA в жидких образцах определяли путем фильтрации 10, 100 и 1000 мл через поликарбонатные мембраны 0,4 мкм (Microfunnel, Pall Corporation). Фильтры переносили на чашку с агаром Brilliance MRSA 2 (Oxoid). Кроме того, 0,5 мл образца высевали на каждую из двух чашек с агаром MRSA 2. Чашки с агаром инкубировали при 35 ° C в течение 22-24 ч и подсчитывали MRSA-положительные колонии. MRSA был идентифицирован как джинсовые синие колонии.По одной колонии из каждого образца, взятой из чашки с агаром с наименьшим количеством MRSA-подобных колоний, отбирали для молекулярной проверки. Все субкультуры MRSA были проверены с помощью ПЦР-анализа, выявляющего mecA, lukF-PV, scn , CC398- hsd и spa с последующим типированием spa (14). LA-MRSA был идентифицирован по наличию ампликонов mecA , CC398- hsd и spa и отсутствию lukF-PV .

    Были проведены эксперименты по исследованию стабильности MRSA в буфере PBS, использованном для отбора проб воздуха.Для тестирования роста MRSA в полевых условиях полевой штамм MRSA CC398 (изолят 55-109-3106) добавляли к PBS до конечной концентрации 10 2 КОЕ / мл. Количество MRSA определяли из десятикратных разведений на чашках с агаром MRSA 2 после 0, 1, 6 и 24 ч инкубации при 4 ° C.

    Отбор проб воздуха на ферме

    Образцы

    переносимых по воздуху MRSA на ферме отбирали на желатиновых фильтрах с помощью пробоотборника воздуха AirPort MD8 (Sartorius, Германия) при скорости потока 50 л / мин. Пробоотборник воздуха держали на высоте ~ 1.5м над полом. В каждый желатиновый фильтр отбирали от 100 до 500 л воздуха, которые затем переносили на чашку с агаром MRSA 2, к которой фильтр прилипал и растворялся. Отбор проб воздуха производился дважды в каждой секции. Чашки с агаром MRSA 2 инкубировали при 35 ° C в течение 22–24 ч, начиная примерно через 3 ч после выхода из фермы. Подсчитывали количество колоний и рассчитывали концентрацию MRSA в воздухе. Одна предполагаемая колония MRSA на чашку с агаром была подтверждена как LA-MRSA, как описано выше.

    Тест на человеческих образцах

    От трех до шести человек участвовали в процедурах отбора проб во время посещений фермы, где они оставались в районе 0–400 метров от фермы в среднем 10 человек.5 ч (диапазон 6–13 ч). Никто из них не заходил на ферму и не имел прямого контакта со свиньями. Во время всех отборов один и тот же человек забирался на крышу, чтобы поместить сборную трубку в вентиляционные отверстия.

    У всего персонала, участвовавшего в отборе проб, были взяты пробы из носа путем пятикратного вращения eSwab ™ (Copan) в передней части каждой ноздри. Образцы из носа были взяты сразу после прибытия на ферму и непосредственно перед отъездом с фермы. Все образцы хранили при 4 ° C до культивирования на следующее утро.После посещения фермы было собрано в общей сложности 25 образцов из носа. Присутствие LA-MRSA было обнаружено прямым культивированием на чашках с агаром Brilliance MRSA 2 или после обогащения, а предполагаемый LA-MRSA был подтвержден с помощью ПЦР, как описано ранее (14).

    Образцы носков

    Образцы носков ботинок (Abena, полипропилен, артикул 210854) отбирали на расстояниях 50, 100, 200, 300 и 400 м по ветру от фермы и на 50 м по ветру. Образцы почвы собирали, накрыв один ботинок чистым пластиковым носком, затем носок для сбора и пройдя 25 метров перпендикулярно прямой видимости фермы.Места отбора проб определялись положением пылесосов (см. Дополнительный рисунок 1), а на 400 м отправная точка определялась направлением ветра, как и на других расстояниях. Носки были перенесены в индивидуальные стерильные пластиковые пакеты и оставлены на ночь в охлаждаемом контейнере для хранения.

    Образцы Sock переносили в бульон Мюллера-Хинтона (Sigma) с добавлением 6,5% NaCl для обогащения в течение ночи при 35 ° C с последующим распределением 10 мкл на чашках с агаром Brilliance MRSA 2.Планшеты считывали после 20–24 ч инкубации при 35 ° C, и колония джинсовой ткани из каждого образца была подтверждена как LA-MRSA с помощью ПЦР, как описано выше.

    Метеорологические данные

    Скорость ветра, направление ветра, турбулентность и температура были измерены ультразвуковым датчиком (Metek 10 Гц, США-1) на мачте на высоте 4,14 м над землей. Мачта была размещена на расстоянии ~ 35 м к югу от здания фермы. Данные ультразвукового исследования можно использовать только для направлений ветра от 120 до 255 градусов из-за нарушения со стороны растительности и фермы.Для других направлений ветра метеорологические данные из погодной модели WRF применялись из точки сетки в 25 км к востоку от фермы. WRF (Модель исследования и прогнозирования погоды) — это система численного прогнозирования погоды, разработанная Национальным центром атмосферных исследований США (NCAR) и другими организациями (https://www.mmm.ucar.edu/weather-research-and-forecasting-model ). Метеорологические данные использовались для оценки ширины шлейфа ветра от ферм во время отбора проб. Ширина шлейфа определяется как размах направлений ветра во время каждого из трехчасовых экспериментов и рассчитывается как промежуток между тремя средними значениями направления ветра за 1 час ± 5 градусов.

    Результаты

    Бактериальные изоляты

    Все изоляты MRSA принадлежали к CC398, несли ген mecA , они были отрицательными для scn и PVL и принадлежали к любому из spa типов t011 или t034.

    Отбор проб воздуха на ферме

    Во время одного из посещений концентрация переносимого по воздуху LA-MRSA была измерена дважды в 11 секциях свиней, у восьми из них содержали поросят через 1–8 недель после отъема и у трех свиней на откорме.Количество переносимого по воздуху LA-MRSA было самым высоким в отделениях, содержащих поросята через 2–3 недели после отъема, и самым низким в отделениях откорма (Рисунок 1). Используя данные из системы вентиляции, было вычислено количество LA-MRSA (КОЕ / ч), вытесненное из валов вентилятора, и оно сравнено с соответствующими данными, полученными из валов активного вентилятора, образцы которых были взяты извне. Обнаружилась сильная статистически значимая корреляция ( p = 0,01; корреляция Пирсона) между значениями, измеренными внутри и в вентиляционной шахте за пределами здания фермы (рис. 2).

    Рисунок 1 . Концентрация переносимого по воздуху LA-MRSA (средние значения двух измерений) внутри стойл среди групп поросят разного возраста. КОЕ, колониеобразующие единицы; Фин., Отделочные свиньи.

    Рисунок 2 . Концентрация LA-MRSA в воздухе, измеренная внутри и из вентиляционной шахты за пределами свиноводческой фермы. Данные по двум осям измеряются разными методами: желатиновыми фильтрами (внутри) и сбором PBS (снаружи). КОЕ, колониеобразующие единицы; R — коэффициент корреляции Пирссона.

    Скорость, направление и температура ветра

    Скорость ветра, его направление и температура в течение пяти дней отбора проб перечислены в таблице 1. Как и ожидалось, во время первого и последнего отбора проб скорость ветра, измеренная ультразвуком, была намного ниже, чем скорость модели WRF из-за подветренный эффект от фермы. В остальные три дня скорости WRF были немного выше, потому что данные были с высоты 10 метров. Направление ветра соответствовало двум различным наборам данных и показало колебания от 129 до 302 °.Направление ветра было почти одинаковым для первого и последнего отбора проб, в то время как в других случаях оно различалось. Температура изменялась от 5 до 16 ° C в течение всего периода отбора проб.

    Таблица 1 . Скорость ветра (м / с), направление ветра (градусы) и температура (° C), рассчитанные по ультразвуковой (4,1 м) и погодной модели (WRF, 10 м).

    Измерения MRSA в полевых пробах воздуха

    Результаты количественного определения LA-MRSA в пробах воздуха из выпускных отверстий системы вентиляции фермы и в воздухе вокруг фермы обобщены в рамке и на диаграмме усов, показанных на Рисунке 3.Из рисунка видно, что концентрация LA-MRSA в пробах воздуха снизилась с 10,9 КОЕ / м 3 в вентиляционной шахте (средние значения) до 0,085 КОЕ / м 3 на расстоянии 50 м в шлейф на высоте 1,5 м над поверхностью почвы, что соответствует уменьшению в 128 раз, и далее до значения, близкого к нулю на расстоянии 300 м. Разница в данных о концентрации LA-MRSA, обнаруженной на выходе из системы вентиляции фермы, была значительной и варьировала от 0 (пустой хлев) до 929 КОЕ / м 3 .Данные не распространялись нормально. Кроме того, похоже, что LA-MRSA присутствует в воздушном шлейфе от фермы, поскольку концентрация, обнаруженная в шлейфе на всех расстояниях от фермы, была значительно выше, чем концентрация, обнаруженная за пределами шлейфа (U-тесты Манна-Уитни; p <0,01). На расстоянии 50 м расчетное медианное значение составляло 0,085 КОЕ / м 3 в шлейфе (мин – макс: 0,052–0,355) по сравнению с расчетным медианным значением 0,009 КОЕ / м 3 вне шлейфа (мин – макс: 0–0.343). Вариация была намного ниже на больших расстояниях, где в воздухе было обнаружено лишь несколько MRSA. Биоаэрозоли, собранные в 50 м против ветра от фермы, не содержали MRSA. Мы не обнаружили простой зависимости между скоростью ветра, направлением ветра или температурой и воздушным распространением MRSA. Примеры этих наблюдений показаны на дополнительном рисунке 2. Указанные шлейфы ветра являются средними за весь период наблюдений и представляют направления ветра, которые могут постоянно меняться.

    Рисунок 3 . Концентрация LA-MRSA, измеренная за пределами свиноводческой фермы. −50: измерения в 50 метрах против ветра от вентиляционных отверстий, 0: измерения из вентиляционных шахт (не включая измерения из пустых конюшен), 50–300: измерения по ветру от фермы. Концентрация, обнаруженная в шлейфе на всех расстояниях от фермы, была значительно выше, чем концентрация, обнаруженная за пределами шлейфа (U-тесты Манна-Уитни; p <0,01).

    В тестах на стабильность было обнаружено, что после добавления 10 2 КОЕ / мл LA-MRSA в буфер PBS, количество КОЕ было стабильным в течение 24 часов при 4 ° C.

    LA-MRSA в образцах носков

    LA-MRSA был обнаружен в образцах носков, взятых на поверхности почвы на расстоянии до 400 м от хозяйственных построек. Процент MRSA-положительных образцов значительно снизился с ~ 80 до 30% с увеличением расстояния от фермы (критерий хи-квадрат, p <0,05), как показано на рисунке 4. Против ветра от фермы, только один из образцов носков ( 12,5%) был признан положительным по MRSA.

    Рисунок 4 . LA-MRSA обнаружен в образцах носков за пределами свиноводческой фермы с использованием данных семи образцов. N = количество отсчетов на каждом расстоянии.

    LA-MRSA в образцах из носа человека

    Всего после посещения фермы было взято 25 образцов из носа у 6 человек. Все участники были отрицательными по MRSA по прибытии на ферму, в то время как два образца (8%) были положительными по LA-MRSA при выходе с фермы. В обоих случаях это был один и тот же человек, который находился в тесном контакте с вентиляционными шахтами во время отбора проб.

    Обсуждение

    Исследованная ферма была положительной на LA-MRSA, по крайней мере, с 2014 года (9) и является репрезентативной для большинства датских свиноводческих хозяйств, где 95% из 73 протестированных хозяйств были положительными в 2019 году (4).Большое количество ферм с положительным результатом MRSA вызывает опасения по поводу здоровья людей, живущих поблизости от свиноводческих ферм или проезжающих мимо них. Наше исследование показывает, что LA-MRSA действительно присутствует в воздухе, собранном на расстоянии до 300 м от ферм, но также, что концентрация резко снижается по мере удаления от фермы и является очень низкой (0,085 КОЕ / м 3 на расстоянии 50 м). В соответствии с настоящим исследованием, немецкое исследование обнаружило только низкие концентрации (2–14 КОЕ / м 3 ) MRSA в пробах воздуха на расстоянии 50–150 метров с подветренной стороны от свиноводческой фермы (11).Различия в концентрациях MRSA по сравнению с настоящим исследованием могут быть связаны с различиями в размере хозяйств, распространенности MRSA, количестве и составе частиц пыли, скорости ветра в дни отбора проб и положении точек отбора проб относительно шлейф ветра.

    Кроме того, уровень MRSA на свиноводческих фермах значительно варьируется в зависимости от возраста свиней и их активности, в пределах одной фермы от 24 до 5,452 КОЕ / м 3 в отъемных единицах с самыми высокими значениями среди поросят 4 –5 недель после отлучения от груди и связано с высоким уровнем активности (9).Вероятно, также будут большие различия в уровне линьки между разными фермами в зависимости от размера стада, вентиляции и уровня LA-MRSA у свиней.

    Наше количественное определение LA-MRSA, выделенного из свиноводческой фермы, показало взаимосвязь между уровнем MRSA, измеренным внутри свиноводческой фермы и в вентиляционных шахтах, однако также и то, что уровни MRSA, по-видимому, внутри фермы были в три раза выше, чем в вентиляционных шахтах, что может быть результатом разбавления, вызванного атмосферным воздухом, поскольку пробы отбирались в верхней части шахт.

    Для количественной оценки переносимых по воздуху микроорганизмов применялся ряд методов отбора проб, например, удар, столкновение и фильтрация (15). Отбор проб с помощью фильтрации — это широко используемый метод, но он может привести к потере жизнеспособности из-за напряжения высыхания во время отбора проб. В этом исследовании мы попытались минимизировать стресс высыхания, используя два метода для отбора проб в помещении (с высоким уровнем MRSA) и на открытом воздухе (с низким уровнем MRSA), соответственно. Было продемонстрировано, что импинджер с высокой скоростью потока, используемый для отбора проб MRSA на открытом воздухе, собирает большинство переносимых по воздуху частиц в диапазонах размеров, аналогичных тем, которые наблюдаются для бактерий.Кроме того, к этому выводу пришли Сантл-Темкив и др. (12), что импинджер Kärcher имеет преимущества для отбора проб атмосферных бактерий из окружающей среды по сравнению с другими испытанными импинжерами из-за его высокой скорости потока, а также его сравнительно высокой эффективности удержания и возможности длительного отбора проб. Кроме того, было показано, что импинджер сохранил метаболическую активность и жизнеспособность исследуемых бактерий с использованием периодов отбора проб от 2 до 5 часов (12). Для краткосрочного отбора проб на ферме образцы бактерий отбирали на желатиновый фильтр с последующей инкубацией непосредственно на агаре, селективном для MRSA.Ранее сообщалось, что этот метод имеет хорошую эффективность (7, 10, 16). Несмотря на то, что оба метода показали благоприятные свойства в отношении выживаемости бактерий, использование двух разных методов может повлиять на сравнение количества MRSA в воздухе внутри и за пределами фермы (как показано на рисунке 2).

    По мере удаления от фермы уровень MRSA, измеренный в воздухе, резко снижался и сильно зависел от того, проводился ли отбор проб внутри или за пределами предполагаемых ветровых шлейфов (рис. 3).Эти наблюдения, вероятно, в основном представляют собой эффект разбавления бактерий, поскольку время транспортировки в воздухе, вероятно, слишком короткое, чтобы существенно повлиять на жизнеспособность бактерий. В некоторых случаях концентрация КОЕ вне шлейфа ветра была относительно высокой, что могло быть связано с неправильным определением шлейфа ветра, неопределенностью в определенном направлении ветра или сложным обтеканием зданий. Все измерения, представленные в этой статье, были выполнены осенью, когда бактериальный распад может быть менее подвержен воздействию ультрафиолетового света и высоких температур, чем летом, когда можно ожидать распада (17).

    Аналогичная зависимость от расстояния до фермы наблюдалась для образцов носков, где только несколько образцов носков были положительными в 400 метрах от фермы. Это соответствует наблюдению Schulz et al. (11) где MRSA обнаруживали с низкой частотой в образцах почвы на расстоянии до 300 метров от свиноводческих ферм. Поскольку MRSA постоянно откладываются в окрестностях фермы каждый день в году, эти низкие уровни могут указывать на то, что MRSA имеют ограниченную выживаемость на поверхности почвы. Присутствие MRSA в почве также может быть связано с внесением навоза, содержащего MRSA, с фермы.Навоз вносили в почву ранней весной, почти за 6 месяцев до начала отбора проб, и поэтому не являлись очевидным источником LA-MRSA в почве. Предыдущие исследования показали небольшое накопление бактерий в почве фермы, где навоз был внесен раньше (18), поэтому этот эффект считается незначительным, тогда как другие переносчики, такие как грызуны и мухи, могут влиять на распространение LA-MRSA в окрестностях фермы.

    Попытка интерпретировать эти результаты для оценки риска, чтобы ответить на озабоченность общественности, является сложной задачей.Несмотря на то, что на расстоянии 50 метров от свиноводческой фермы наблюдались только низкие уровни MRSA, можно предположить, может ли это тем не менее вызывать общественное беспокойство. Ранее было показано, что передача LA-MRSA людям-добровольцам зависит от концентрации MRSA в воздухе (9). Однако было обнаружено, что контаминация носа LA-MRSA носит временный характер после кратковременного (1 час) пребывания на ферме свиней с положительной реакцией на LA-MRSA. Предварительный вывод заключается в том, что колонизация человека зависит от многократного воздействия LA-MRSA в течение продолжительных периодов времени и не будет наблюдаема в краткосрочных исследованиях.В другом датском исследовании добровольцы были отобраны в пяти разных стадах свиней для оценки переносимой по воздуху дозы MRSA, необходимой для носовой колонизации после пребывания в отделении для свиней в течение 1 часа. Также здесь было обнаружено, что колонизация носит временный характер, и невозможно установить стабильную оценку дозы колонизации, в основном из-за большого разброса в измерениях переносимых по воздуху MRSA (10).

    В настоящем исследовании образцы из носа были взяты у людей, участвовавших в отборе образцов на ферме.Во время каждого отбора проб они оставались в среднем на 10,5 ч вне здания фермы и на расстоянии до 400 метров от фермы, большую часть времени примерно в 50–100 метрах от фермы, где было собрано большинство проб. Из 25 образцов из носа, собранных сразу после периода отбора образцов, только два образца оказались положительными на LA-MRSA, оба были получены от одного человека, который брал образцы из вентиляционных шахт. Это указывает на то, что степень заражения человека LA-MRSA в окрестностях свиноводческой фермы ограничена и носит временный характер.В подтверждение этого было показано, что проживание на расстоянии до 2 км от свинофермы не увеличивает риск заражения LA-MRSA по сравнению с проживанием на расстоянии до 5 км (19).

    В заключение, наше исследование показывает низкий уровень MRSA в пробах воздуха, взятых в окрестностях фермы свиней с положительным результатом LA-MRSA. Таким образом, интерпретация данных заключается в том, что только люди, живущие в непосредственной близости (<50 м) или на ферме, будут подвергаться воздействию LA-MRSA в количествах, которые могут вызывать беспокойство.Риск распространения LA-MRSA с поверхности почвы на людей, остается без ответа в нашем исследовании, но выглядит скорее спекулятивным.

    Заявление о доступности данных

    Исходные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

    Заявление об этике

    Сбор бактерий из носовых образцов участников-людей был рассмотрен Национальным комитетом по этике медицинских исследований (журнал No.H-21000591), который пришел к выводу, что в отношении этого проекта может быть отказано в этическом одобрении. Информированное согласие было получено от всех участников.

    Авторские взносы

    ØA: концептуализация исследования, отбор проб на местах, анализ данных и написание первоначального проекта. MN: концептуализация исследования, полевой выборки, чтение и редактирование рукописи. PL: анализ данных, чтение и редактирование рукописи. А.Л .: концептуализация изучения и чтения и редактирования рукописи. NH: концептуализация исследования, выборки на местах, чтение и редактирование рукописи.Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

    Финансирование

    Эта работа была поддержана Министерством окружающей среды и продовольствия Дании через Датское агентство по сельскому хозяйству (33010-NIFA-14-612).

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Авторы хотели бы поблагодарить Миккеля Кристенсена, Пиа Турё Хансен, Маргрет Карлсен, Тину Тейн и Таню Бегович за квалифицированную техническую помощь.Авторы хотели бы поблагодарить Ларса Бого Йенсена (покойного) за его вклад в рукопись перед отправкой. Авторы также хотели бы поблагодарить Дэвида Фурдала, Франсиско Фернандо Кальво Артавиа, Анну Ирен Ведель Соренсен и Ульриха Гозевинкеля за практическую помощь во время отбора проб с фермы. Благодарим Ханса Якобсена, факультета биологических наук Орхусского университета, за помощь в рисовании фигур. Особая благодарность Сёрену Ларсену за предоставление доступа к его свиноводческой ферме.

    Дополнительные материалы

    Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.644729/full#supplementary-material

    Список литературы

    1. Graveland H, Wagenaar JA, Heesterbeek J, Mevius D, Van Duijkeren E, Heederik DJJ. Метициллин-резистентный Staphylococcus aureus ST398 в разведении телят: перенос MRSA человека, связанный с использованием противомикробных препаратов животными и гигиеной фермы. PLoS ONE. (2010) 5: e10990. DOI: 10.1371 / journal.pone.0010990

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    2.Grøntvedt CA, Elstrøm P, Stegger M, Skov RL, Skytt Andersen P, Larssen KW, et al. Метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus CC398 у людей и свиней в Норвегии: подход «Единое здоровье» к интродукции и передаче. Clin Infect Dis. (2016) 63: 1431–8. DOI: 10.1093 / cid / ciw552

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    3. van Duijkeren E, Hengeveld P, Zomer TP, Landman F, Bosch T., Haenen A, et al. Передача MRSA от человека к животным на утиных и индюковых фермах. J Antimicrob Chemother. (2016) 71: 58–62. DOI: 10.1093 / jac / dkv313

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    4. ДАНМАП. Использование противомикробных агентов и возникновение устойчивости к противомикробным препаратам у бактерий, полученных из пищевых продуктов, животных, продуктов питания и людей в Дании . (2019).

    Google Scholar

    5. Ларсен Дж., Петерсен А., Сёрум М., Стеггер М., ван Альфен Л., Валентинер-Брант П. и др. Метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus CC398 является все более частой причиной заболеваний среди людей, не контактировавших с домашним скотом в Дании, с 1999 по 2011 год. Euro Surveill . (2015) 20: 30021. DOI: 10.2807 / 1560-7917.ES.2015.20.37.30021

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    6. Ларсен Дж., Петерсен А., Ларсен А.Р., Зибер Р.Н., Стеггер М., Кох А. и др. Датская исследовательская группа MRSA. Появление в Дании метициллин-резистентных инфекций кровотока Staphylococcus aureus, связанных с домашним скотом. Clin Infect Dis. (2017) 65: 1072–6. DOI: 10.1093 / cid / cix504

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    7.Чжао Ю., Аарнинк А.Дж., Де Йонг М.С., Грут Керкамп П.В. Микроорганизмы, переносимые по воздуху из систем животноводства, и их связь с пылью. Crit Rev Environ Sci Technol. (2014) 44: 1071–128. DOI: 10.1080 / 10643389.2012.746064

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    9. Angen Ø, Feld L, Larsen J, Rostgaard K, Skov R, Madsen AM, et al. Передача метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus людям-добровольцам, посещающим свиноводческую ферму. Appl Environ Microbiol. (2017) 83: e01489–17. DOI: 10.1128 / AEM.01489-17

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    10. Angen Ø, Skade L, Urth TR, Andersson M, Bkbo P, Larsen AR. Контроль передачи MRSA людям во время краткосрочных посещений свиноводческих ферм с использованием противопылевых масок. Front Microbiol. (2019) 9: 3361. DOI: 10.3389 / fmicb.2018.03361

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    11. Schulz J, Friese A, Klees S, Tenhagen BA, Fetsch A, Rösler U, et al.Продольное исследование загрязнения воздуха и поверхности почвы вблизи свинарников ассоциированным с животными метициллин-резистентным Staphylococcus aureus . Прил. Микробиол. Среды . (2012) 78: 5666–71. DOI: 10.1128 / AEM.00550-12

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    12. Сантл-Темкив Т., Амато П., Гозевинкель У. Б., Тирхауг Р., Чартон А., Шико Б. и др. Импинджер с высокой скоростью потока для изучения концентрации, жизнеспособности, метаболической активности и активности образования льдов у бактерий, переносимых по воздуху. Environ Sci Technol. (2017) 51: 11224–34. DOI: 10.1021 / acs.est.7b01480

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    13. Jang J, Hendriksen NB, Jakobsen HH, Gosewinkel U. Применение проточного цитометра Cytosense для анализа переносимых по воздуху бактерий, собранных с помощью пробоотборника большого объема. J Microbiol Methods. (2018) 154: 63–72. DOI: 10.1016 / j.mimet.2018.10.012

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    14.Ислам М.З., Эспиноза-Гонгора С., Дамборг П., Зибер Р.Н., Мунк Р., Хустед Л. и др. Лошади в Дании являются резервуаром различных клонов метициллин-резистентных и чувствительных Staphylococcus aureus . Передний микробиол . (2017) 8: 543. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.00543

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    15. Гриншпун С., Буттнер М., Майнелис Г., Виллеке К. Отбор проб на переносимые по воздуху микроорганизмы. В: Ятс, М., Накацу, К., Миллер, Р., Пиллаи, С., редакторы. Руководство по микробиологии окружающей среды . 4-е изд. Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press (2016). п. 3.2.2 1–17.

    Google Scholar

    17. Сметс В., Моретти С., Денис С., Лебеер С. Бактерии, переносимые по воздуху в атмосфере: присутствие, цель и потенциал. Атмосферная среда. (2016) 139: 214–21. DOI: 10.1016 / j.atmosenv.2016.05.038

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    18. Sengeløv G, Agersø Y, Halling-Sørensen B, Baloda SB, Andersen JS, Jensen LB.Уровни бактериальной устойчивости к антибиотикам на датских сельскохозяйственных угодьях в результате обработки навозом свиного навоза. Environ Int. (2003) 28: 587–95. DOI: 10.1016 / s0160-4120 (02) 00084-3

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    19. Анкер Ю.Ч., Кох А., Этельберг С., Мёльбак К., Ларсен Дж., Джепсен М.Р. Расстояние до свиноводческих хозяйств как фактор риска возникновения инфекции MRSA CC398, связанной с домашним скотом, у лиц, неизвестных о контакте с свинофермами — общенациональное исследование. Зоонозы в области общественного здравоохранения. (2018) 65: 352–60. DOI: 10.1111 / zph.12441

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мониторинг метаболических реакций в Staphylococcus epidermidis, подвергнутых воздействию нитрида кремния, с использованием покадровой рамановской спектроскопии in situ

    1.

    Введение

    Одной из целей клинических исследований в течение последнего десятилетия было выяснение механизмов патогенеза стафилококков, поскольку они связаны с имплантированные биоматериалы для протезов суставов, катетеров, сердечных клапанов и кардиостимуляторов. 1 Патогеном, который представляет собой общий источник инфекций на постоянных медицинских устройствах, является Staphylococcus epidermidis , грамположительная бактерия, постоянно проживающая на коже человека и слизистых оболочках. S. epidermidis способен прилипать к поверхностям синтетического биоматериала и образовывать стабильную биопленку, ведущую к стойким инфекциям. 2 , 3 Во время образования биопленки бактериальные клетки секретируют внеклеточные полимерные вещества, которые включают липиды, белки, полисахариды и другие; они защищают бактериальную колонию от внешнего нападения. 4 , 5 Соответственно, лечение инфекций, связанных с биопленками, чрезвычайно сложно. Действия иммунной системы могут быть неэффективными, и для искоренения патогена часто требуются экстремальные дозы антибиотиков. Бактерии, заключенные в биопленку, в 1000 раз более устойчивы к бактерицидным препаратам, чем их планктонные предшественники. 6 Кроме того, у пациентов с ослабленной иммунной системой высвобождение бактерий из биопленки часто вызывает инфекции отдаленных вторичных участков.Одним из возможных способов предотвращения перипротезных инфекций является создание биоматериалов с физическими или химическими барьерами, которые способны противостоять бактериальной адгезии к поверхности. 7 , 8 Одним из возможных материалов с такими свойствами является Si3N4, неоксидная керамика, поверхность которой может быть изменена химически и топографически. 9 Предыдущие испытания, проведенные Bock et al. 9 подтвердил антибактериальные свойства этой биокерамики. Они сравнили бактериостатические характеристики различных биоматериалов, используемых в медицинских устройствах, с S.epidermidis и Escherichia coli ( E. coli ). Их результаты показали выраженное снижение адгезии бактерий и живых бактерий при повышенном воздействии Si3N4.

    Рамановская спектроскопия живых бактерий использовалась для отслеживания их метаболизма и понимания химических взаимодействий между бактериальными клетками и биоматериалами. 10 12 Этот спектроскопический метод in situ полезен для выявления и наблюдения конкретных зависящих от времени биохимических изменений в составе и активности прокариотических клеток.Neugebauer et al. 10 удалось охарактеризовать S. epidermidis в отношении его метаболических функций с использованием различных спектроскопических методов; Самек и др. 11 проанализировали образование биопленки S. epidermidis , пометив характерные полосы комбинационного рассеяния в ее спектре. Метаболизм грамотрицательного микроорганизма Porphyromonas gingivalis также был разъяснен в недавней статье до и после его посева на различные субстраты Si3N4. 12

    В этом исследовании метаболическая активность in situ , клеточный рост и лизис S.epidermidis были исследованы в разные моменты времени под химическим и физическим воздействием различных подложек Si3N4. Были получены сравнительные данные по двум другим популярным биоматериалам: полиэфирэфиркетону (PEEK) и титановому сплаву (Ti). In situ спектроскопия комбинационного рассеяния предоставила физико-химическое понимание взаимодействия колоний S. epidermidis с этими различными биоматериалами, на основании чего было предложено механистическое понимание бактериостатического поведения Si3N4.

    2.

    Материалы и методы

    2.1.

    Исследованные биоматериалы

    Образцы Si3N4 были произведены Amedica Corporation (Солт-Лейк-Сити, Юта) с использованием обычных методов изготовления керамики. 13 Вкратце, 90 мас.% Порошка Si3N4 (Ube SN E-10, Ube City, Япония) смешивали с 6 мас. % оксида иттрия (Y2O3, Grade C, H.C. Starck, Мюнхен, Германия) и 4 мас. % оксида алюминия (Al2O3, SA8-DBM, Baikowski / Malakoff, Charlotte, North Carolina) с последующим измельчением и сушкой распылением.Добавками для спекания служили добавки Y2O3 и Al2O3. Образцы дисков (Ø12,7 × 1 мм) были подвергнуты сухому прессованию, дебиндеризации и спеканию в атмосфере азота при температурах, превышающих 1700 ° C, а затем уплотнены горячим изостатическим прессованием при> 1650 ° C под давлением газа N2 > 200 МПа. Полученные плотные образцы Si3N4 состояли из двухфазной микроструктуры — игольчатых зерен β-Si3N4 и зернограничной фазы аморфного или кристаллического оксинитрида алюминия иттрия (т.е. SiYAlON). 14 Полученные диски были обозначены как «необработанные» или «изготовленные» Si3N4.Подмножество этих дисков было дополнительно подвергнуто постденсификационному отжигу в атмосфере азота (~ 1,1 бар) при 1400 ° C в течение 30 мин. После этой термообработки поверхностная плотность аминов по отношению к гидроксильным группам увеличилась на 15 , и часть стекла SiYAlON переместилась на поверхности образца. Сравнительные испытания были также выполнены на идентичных по размерам образцах PEEK (ASTM D6262, Ketron ® PEEK 1000, Quadrant EPP USA, Inc., Рединг, Пенсильвания, распространяемых McMaster-Carr, Санта-Фе-Спрингс, Калифорния) и сплава Ti. (ASTM F136, Ti6Al4V-ELI, распространяется Vincent Metals, Миннеаполис, Миннесота).Образцы из ПЭЭК и сплава Ti использовали в качестве отрицательного и положительного контролей соответственно.

    2.2.

    Бактериальная культура

    S. epidermidis (14990 ® ATCC ™) культивировали в Медицинском университете префектуры Киото с использованием агаровой среды для инфузии мозга и сердца (BHI). Первоначальные 1,8 × 1010 КОЕ / мл затем разбавляли до 1 × 108 КОЕ / мл, используя фосфатно-солевой буферный раствор для имитации концентраций ионов в крови. Затем 100 мкл раствора бактерий переносили в отдельные чашки Петри, содержащие агар BHI.Все образцы стерилизовали УФ перед инокуляцией бактериями. Инкубация при 37 ° C происходила в аэробных условиях в течение трех временных точек: 12, 24 и 48 часов соответственно.

    2.3.

    Лазерная микроскопия

    Морфология поверхности исследуемых подложек, которая может влиять на первичное взаимодействие между телом имплантата и окружающей средой, была охарактеризована с точки зрения его микроскопической топографии. Средняя шероховатость, Ra, , для различных поверхностей была получена с использованием конфокального сканирующего лазерного микроскопа (Laser Microscope 3D & Profile sizes, Keyence, серия VKx200, Осака, Япония), способного получать оптические изображения высокого разрешения с избирательностью по глубине.Средняя шероховатость была рассчитана как среднее значение по 36 изображениям, полученным случайным образом на каждом образце с использованием 150-кратного увеличения.

    2.4.

    Флуоресцентная микроскопия и анализ жизнеспособности микроорганизмов

    После воздействия на поверхности различных материалов образцы бактерий исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа (BZ-X700; Keyence, Осака, Япония). Для облегчения исследования бактерии окрашивали различными растворами: иодидом пропидия (PI; Додзиндо, Кумамото, Япония), диацетатом 5 (6) -карбоксифлуоресцеина (CFDA; Додзиндо, Кумамото, Япония) и 4 ‘, 6-диамидино- 2-фенилиндол (DAPI; Додзиндо, Кумамото, Япония).Красный цвет PI выделил мертвые или поврежденные бактерии; Зеленый цвет CFDA показал наличие живых бактерий; и DAPI, который связывается с ДНК, проверяет расположение ядер клеток. Протокол окрашивания включал добавление 1 мкл DAPI, раствора PI и 15 мкл раствора CFDA к образцам, а затем инкубацию в течение 5 минут при 37 ° C. После удаления буфера клетки окрашивали и анализировали под флуоресцентным микроскопом. Время экспозиции каждого изображения составляло 5 с при использовании металлогалогенной лампы мощностью 80 Вт. После воздействия в течение 12 и 48 часов метаболизм бактерий исследовали с помощью колориметрического анализа (Microbial Viability Assay Kit-WST, Dojindo, Kumamoto, Japan).В этом анализе использовался колориметрический индикатор (WST-8), который дает водорастворимый краситель формазан после восстановления в присутствии электронного медиатора. Количество образующегося красителя формазана прямо пропорционально количеству живых микроорганизмов. Растворы анализировали с помощью ридеров для микропланшетов (EMax, Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния) методом оптической плотности (OD) для живых клеток. 16

    2.5.

    Рамановская спектроскопия in situ

    Замедленные спектры комбинационного рассеяния были получены после экспонирования культивированного S.epidermidis к двум разным образцам Si3N4, титановому сплаву и контролю из кварцевого стекла (Silanized Slides; DAKO, Дания). Спектры бактерий на образцах PEEK не могли быть получены из-за высокой флуоресценции, излучаемой материалом PEEK. Спектры собирали с помощью конфокального рамановского микроскопа (LabRAM HR800; Horiba / Jobin-Yvon, Киото, Япония), в котором использовался единственный монохроматор, подключенный к ПЗС-детектору с воздушным охлаждением (Andor DV420-OE322; 1024 × 256 пикселей). Возбуждающее излучение создавалось когерентной гелий-неоновой лампой, излучающей на длине волны 633 нм мощностью ∼10 мВт на поверхности образца.Решетка 600 г / мм и голографический режекторный фильтр D.03 использовались с линзой объектива 100 ×. Использовались поперечная щель 100 мм и конфокальное отверстие 200 мм. Спектры комбинационного рассеяния были получены при времени экспозиции 2 с в каждом из четырех различных спектральных диапазонов. Средние спектры комбинационного рассеяния для каждой подложки были рассчитаны на основе 15 измерений в различных произвольных местах. Сбор спектров комбинационного рассеяния и предварительная обработка необработанных данных (то есть вычитание базовой линии, сглаживание, нормализация и аппроксимация) выполнялись с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (LabSpec, Horiba / Jobin-Yvon, Kyoto, Japan и Origin 8.5, OriginLab Co., Нортгемптон, Массачусетс). Базовое вычитание всех спектров было получено в соответствии с полиномиальным методом с использованием полиномиальной функции степени 8. Подгонка была выполнена с использованием функций Гаусса / Лоренца.

    2.6.

    Статистический анализ

    Все данные были выражены как средние значения ± одно стандартное отклонение и были проанализированы на предмет их статистической значимости (p≤0,05) с использованием критерия t Стьюдента.

    3.

    Результаты

    3.1.

    Топография поверхности подложки

    Изображения с лазерной микроскопии и соответствующие трехмерные (3-D) графики для различных подложек показаны на рис. 1. Необработанный Si3N4 [Рис. 1 (а)] демонстрирует своеобразную топологию с наличием выступающих игольчатых зерен, вкрапленных в оксидную межзеренную матрицу. Поверхность Si3N4, отожженная в N2 (рис. 1 (b)] представляли аналогичную игольчатую зернистую структуру, но также отображали увеличенные поверхностные доли межзеренной фазы, которые были выделены из объема во время термической обработки. 15 На рисунках 1 (c) и 1 (d) показаны поверхности сплава Ti и PEEK, соответственно.

    Рис. 1

    Лазерные микрофотографии (слева) и графики относительной топографии (справа) необработанного Si3N4 (a), Si3N4, отожженного в N2, (c) сплава Ti и (d) PEEK. Изображения получены перед бактериальной обработкой при 150-кратном увеличении.

    Топология поверхности Ti-сплава была регулярной и однородной без наличия вторичных фаз; поверхность PEEK оказалась самой гладкой из протестированных материалов.Средняя шероховатость, Ra, , для этих образцов (n = 4 каждого) сравнивается на рис. 2 вместе со статистическим анализом наблюдаемых различий. Si3N4, отожженный в N2, имел самую высокую шероховатость (0,40 ± 0,04 мкм), за ним шел необработанный Si3N4 (0,32 ± 0,02 мкм). Поверхность PEEK имела самую низкую шероховатость (0,26 ± 0,03 мкм), тогда как топология сплава Ti (0,29 ± 0,04 мкм) существенно не отличалась от необработанного Si3N4.

    Рис. 2

    Параметр шероховатости, Ra , образцов подложки; Образцы, отожженные в N2, были более гладкими, чем другие образцы (прим.с. = не имеет значения; p <0,05), тогда как необработанный Si3N4 не показал значительной статистической разницы по сравнению с Ti-сплавом (p> 0,05).

    3.2.

    Анализ жизнеспособности микробов и флуоресцентная микроскопия

    Как показано на рис. 3 (а) и 3 (б) жизнеспособность бактериальных клеток проверяли через 12 и 48 ч соответственно. После 12 ч выдержки Si3N4, отожженный в N2, показал наивысшее значение ОП (3,12 ± 0,044), что указывает на наибольшее количество живых бактерий среди исследованных материалов.Сплав Ti имел самое низкое значение OD (1,38 ± 0,02), тогда как PEEK (2,14 ± 0,06) и необработанный Si3N4 (2,03 ± 0,08) имели промежуточные значения OD. Значения OD между тестируемыми материалами значительно различались (p <0,05), за исключением PEEK и необработанного Si3N4. Тем не менее, через 48 часов произошли заметные изменения в росте бактерий. Наибольшее значение OD принадлежало PEEK (0,87 ± 0,09), тогда как отожженный в N2 Si3N4 показал наименьшее значение OD (0,59 ± 0,02). Опять же, сравнение необработанного Si3N4 (0.73 ± 0,02) и сплава Ti (0,69 ± 0,04) дали минимальную статистическую разницу. Через 48 ч все образцы статистически различались (p <0,05).

    Рис. 3

    Диаграмма анализа

    WST, полученная после (а) 12 ч и (б) 48 ч бактериальной обработки S. epidermidis . Через 48 ч все образцы показали статистические различия между собой (p> 0,05).

    Обратите внимание, что значения ОП, измеренные для всех образцов, были ниже через 48 часов, чем через 12 часов. Вероятно, это было следствием того, что две серии экспериментов выполнялись на независимых выборках, а не представляли события временного ряда.

    Через 24 часа воздействия были получены флуоресцентные микрофотографии всех образцов после их первого окрашивания маркерами PI, CFDA и DAPI, которые окрашивали мертвые бактерии (красный), живые бактерии (зеленый) и ядра (синий), соответственно. Результаты показаны на рис. 4 с постоянным увеличением в 20 раз для всех образцов. Для подложек из нитрида кремния было обнаружено относительно большое количество бактерий [ cf . Микрофотографии, окрашенные DAPI в синий цвет, на рис. 4 (а) и 4 (б)] как для необработанных, так и для отожженных N2 образцов, соответственно.Однако участки, окрашенные в красный цвет PI, связанные с мертвыми бактериями, ясно указывали, что произошел значительный лизис, и это было более очевидно на отожженном N2 материале. Красные пятна были обнаружены и на титановом сплаве [рис. 4 (c)], на поверхности которого наблюдается относительно низкая плотность бактериальных клеток. Микрофотографии на ПЭЭК [рис. 4 (d)] подтвердили отсутствие антимикробных свойств этого материала. Не было видимых мертвых бактерий и большого количества живых клеток на всей поверхности образца, что указывает на значительное размножение бактерий.

    Рис. 4

    Флуоресцентная микрофотография после окрашивания PI, CFDA и DAPI S. epidermidis , подвергнутых в течение 24 часов воздействию: (a) необработанного Si3N4, (b) отожженного N2 Si3N4, (c) сплава Ti, и (d) ПЭЭК. Живые и мертвые клетки были помечены зелеными и красными пятнами соответственно, тогда как ядра отображались синим цветом. Изображения были получены при 20-кратном увеличении.

    3.3.

    Результаты рамановской спектроскопии

    3.3.1.

    Маркировка комбинационного излучения контрольных образцов

    На рисунке 5 показаны средние спектры комбинационного рассеяния, полученные на живых S.epidermidis , культивируемые на контрольной подложке из кварцевого стекла. Три спектра показаны как функция времени экспозиции (12, 24 и 48 ч; как указано на вставке) в спектральной области от 300 до 3500 см-1. Все наблюдаемые полосы принадлежали молекулярным видам в пределах S. epidermidis . Спектры были разделены на четыре основные области, обозначенные зонами от I до IV, и отдельные полосы были отнесены к их физическому происхождению и колебательным модам в клеточных соединениях ( cf .Рис. 5 и таблицы 1, таблицы 2–3).

    Рис. 5

    Рамановские спектры S. epidermidis ATCC 14990 в диапазоне от 350 до 3500 см – 1, полученные после разного времени воздействия на поверхность кварцевого стекла, используемого в качестве контрольного образца для метаболической эволюции бактерий. Спектры были разделены на четыре отдельные зоны (обозначенные как зоны с I по IV), а частоты основных полос были обозначены в соответствии с таблицами 1–3.

    Таблица 1

    Маркировка полос, назначение и соответствующие ссылки в спектральной зоне I.

    923- poly дезоксиаденозин 923 00 9
    Ремешок Назначение Частота (см − 1) Ссылка
    1 Скелетные колебания в тирозине 638 17, 18 650 14, 15
    3 Кольцо, дышащее гуанином (ДНК) 670 14, 15
    4 Фосфатид2 7205 Кольцевое дыхание с аденином (ДНК) 735 15
    6 Кольцевое дыхание с триптофаном (ДНК) 760 17, 18
    7 Фосфор 15
    8 внеплоскостное дыхание кольца в ДНК 820 17, 18
    COC 1,4 гликозидное звено в углеводах 840 16
    10 Кольцо, дышащее трипсином (ДНК) 850 14

    Таблица 2

    , и связанные ссылки в спектральной зоне II.

    125023 β-лист
    Группа Назначение Частота (см − 1) Ссылка
    11 C─O─C гликозидная связь углеводов 937 19 19 19 19 C-растяжение в β-листе 976 17, 18
    13 Кольцо, дышащее фенилаланином 1004 17, 18
    14 C─C липидное растяжение мембраны gauche 1092 19
    15 C─C trans растяжение в липидах мембраны 1125 19
    16 C─N растяжение амид 20
    17 Скручивание насыщенного Ch3 в мембранных липидах 1313 21
    18 Симметричное растяжение изменение O─C─O в COO− 1400 22
    19 Изгиб насыщенного Ch3 в мембранных липидах 1442 21

    Таблица 3

    Маркировка, назначение и назначение полос соответствующие ссылки в спектральных зонах III и IV.

    Полоса Назначение Частота (см − 1) Ссылка
    20 C = O растягивающий амид I (α-спираль) 1600 15 21005 C = O растягивающийся амид I (разрушенная структура) 1630 27
    22 C = O растягивающийся амид I (β-лист) 1680 23

    В зоне I, между 600 и 900 см-1, набор полос, относящихся к ДНК и РНК, доминировал в спектре комбинационного рассеяния.В частности, полоса при 720 см-1 была отнесена к видам, содержащим аденин, тогда как полосы при 735 и 782 см-1 были связаны с режимом дыхания аденинового кольца в ДНК и растяжением фосфодиэфира ДНК соответственно. 17 , 18 Дополнительные полосы в этой области были расположены на 820 и 840 см-1, первая из которых соответствует внеплоскостным кольцевым режимам дыхания тирозина, а вторая — растягивающей вибрации C─O─C. 1,4 гликозидного звена в углеводах. 19 21

    Зона II от 900 до 1500 см – 1 характеризовалась серией полос излучения амидов, липидов и углеводов. Две основные полосы в этой области, при 1092 и 1125 см-1, связаны с антисимметричным растяжением C─O─C в алифатических сложных эфирах и гликозидной связи углеводов, белков и липидов, соответственно. 22 Дополнительные полосы при 1253 и 1313 см-1 связаны с растяжением C─N в амиде III и скручиванием насыщенных фрагментов Ch3 в липидах мембран соответственно. 23 , 24 Другая заметная полоса при 1442 см-1 соответствует изгибу насыщенного Ch3 в полисахаридах и липидах мембран. 24 , 25

    Зона III между 1500 и 1850 см – 1 содержала одну связанную с α-спиралью полосу (участок C = O) при 1600 см – 1, 18 , но в ней преобладала β связанное с листом C = O вытягивающее излучение амида I при 1680 см-1. 26

    Зона IV между 2800 и 3100 см-1 содержала три основные полосы при 2880 см-1 (симметричное растяжение Ch4 в липидах и жирных кислотах 27 ), 2934 см-1 (симметричное и антисимметричное растяжение CH для Ch3 и Ch4 в липидах, белках и углеводах 28 ) и 2970 см-1 (отнесено к симметричному растяжению Ch4 в липидах и жирных кислотах 29 ).

    Просмотр покадровых спектров, собранных на контрольной подложке, выявил небольшое снижение интенсивности триплета при 2881, 2934 и 2970 см-1 и полосы амида I при 1670 см-1 при 24-часовой выдержке по сравнению с с 12 ч. Однако спектр через 48 часов не показал значительных изменений по сравнению с 24 часами или какого-либо значительного уменьшения интенсивности полос. Скорее, полосы ДНК фосфодиоксигрупп и аденина при 1092 и 729 см-1 имели более высокую интенсивность через 48 часов, чем через 24 часа.Другим отмеченным отличием была полоса амида I при 1680 см-1. Через 48 часов он был немного более интенсивным, чем через 24 часа. Аналогичная тенденция наблюдалась для полос белков и углеводов при 836 и 858 см-1; они полностью отсутствовали через 24 часа, но были отчетливо видны через 48 часов. Развитие этих полос в зависимости от времени на кремнеземном субстрате использовали в качестве стандарта для метаболической активности S. epidermidis . Его использовали для установления значимых критериев для оценки изменений метаболизма бактерий при воздействии на них исследуемых образцов.Следует отметить, что полосы, относящиеся к белкам и углеводам, фактически изменяются с образованием биопленки, тогда как полосы, относящиеся к ДНК, являются барометрами пролиферации бактериальных клеток и их благополучия.

    3.3.2.

    Рамановское излучение S. epidermidis на разных субстратах

    Нормализованные рамановские спектры бактерий как функция времени воздействия на различных субстратах в зоне I показаны на рис. 6 (а) –6 (в) для 12, 24 и 48 ч соответственно. Как показано в Таблице 1, 17 , 18 , 19 21 Было обнаружено 10 различных полос, и ряд особенностей стал видимым в их временных зависимостях.По сравнению с контрольным образцом, эмиссия при 720 см-1 (обозначенная как полоса 4 и относящаяся к фосфатидилсерину) имела тенденцию исчезать как для необработанного, так и для отожженного в N2 Si3N4. Напротив, эта полоса претерпела уменьшение интенсивности через> 24 ч для бактерий, подвергшихся воздействию сплава Ti. В основном триплете полос 5-7 только фосфодиэфирная полоса 7 полностью исчезла с истекшим временем для обеих подложек Si3N4, тогда как относительная интенсивность полосы 6, связанной с ДНК, увеличилась для обоих образцов Si3N4.Полоса 7 сохранялась до 24 часов с относительно высокой интенсивностью для подложки из сплава Ti. Полоса 8 имела тенденцию исчезать при воздействии на бактерии необработанного Si3N4, тогда как она показывала увеличение через 24 часа и затем уменьшение через 48 часов в случае отожженного в N2 Si3N4. Тенденция, обнаруженная для полосы 8 у бактерий, подвергшихся воздействию подложки из сплава Ti, была аналогична тенденции, наблюдаемой для подложки, отожженной N2. Полоса 10 (кольцевое дыхание в трипсине) была довольно сильной для бактерий, подвергшихся воздействию обоих типов подложек Si3N4, тогда как она почти исчезла через 48 часов на Ti-сплаве.

    Рис. 6

    Нормализованные и деконволютированные спектры комбинационного рассеяния света в спектральной зоне I от S. epidermidis , подвергнутых воздействию различных субстратов ( cf . Метки на вставке к каждому столбцу) в течение (a) 12 ч, (b) 24 ч, и (в) 48 ч.

    Спектральные излучения в зоне II [Рис. 7 (a) –7 (c) для 12, 24 и 48 часов экспозиции соответственно] показаны в таблице 2. 17 21

    Рис. 7

    Нормализованные и деконволюционные спектры комбинационного рассеяния в спектральном зоны II и III из S.Epidermidis подвергали воздействию различных субстратов ( cf . метки на вставке к каждому столбцу) в течение (а) 12 часов, (б) 24 часов и (в) 48 часов.

    Они включали девять полос, обозначенных как полосы от 11 до 19. В этой зоне была отмечена четкая разница в тенденции полосы 13 фенилаланина при ∼1004 см − 1 для контроля стекла, двух материалов Si3N4 и сплава Ti. . Хотя в случае стеклянного контроля эта полоса сохраняла умеренную относительную интенсивность с истекшим экспонированием по сравнению с соседними полосами, ее интенсивность была достаточно выраженной для обеих подложек Si3N4 и почти нулевой для сплава Ti.Полосы 17-19, которые вносятся мембранными липидами, показали аномальное увеличение их относительной интенсивности для S. epidermidis при промежуточных воздействиях на отожженный N2 субстрат. Аналогичная тенденция, хотя и менее выраженная, наблюдалась для необработанного Si3N4 и сплава Ti. Две полосы, чувствительные к конформации липидов, а именно полосы 14 и 15, показали четкую обратную тенденцию в их относительной интенсивности при воздействии необработанного Si3N4 и сплава Ti по сравнению со стеклянным контролем.Это изменение заключалось в значительном увеличении последней полосы, что можно интерпретировать как липидную популяцию с транс по сравнению с гош конфигурацией.

    Зона III с преобладанием амида I [от 1500 до 1750 см – 1; Рис. 7 (а) –7 (в); Таблица 18 , 25 , 29 , 30 ], где ее основной особенностью является полоса 21 (растягивающее излучение C = O при 1680 см − 1). Эта полоса следовала той же тенденции, что наблюдалась для связанных с липидами полос с 17 по 19 в зоне II, а именно, значительное усиление при промежуточных временах выдержки для обеих подложек на основе Si3N4, но было более выраженным для материала, отожженного N2.Повышение относительной интенсивности полосы 21 также наблюдалось для сплава Ti по сравнению со стеклянным контролем. Однако не было отмечено никаких существенных различий в зависимости от времени воздействия до 48 часов.

    4.

    Обсуждение

    Механизмы бактериальной адгезии и взаимодействия с поверхностями биоматериала сложны и зависят от многих факторов, таких как морфологические и химические особенности поверхностей. Топография поверхности играет фундаментальную роль во взаимодействии бактерий и субстрата, влияя как на адгезию, так и на образование биопленок.Как правило, шероховатые поверхности способствуют адгезии и заселению. 31 Например, Yoda et al. 32 тестировал бактериостатическое поведение различных субстратов с контролируемой шероховатостью поверхности в отношении S. epidermidis. Они показали, что адгезия и разрастание в значительной степени благоприятствуют более грубым материалам. Однако наношероховатые поверхности имеют противоположный эффект. Вдохновленные природой, наноструктурированные поверхности крыльев цикады 33 привели к разработке противомикробных свойств различных биоматериалов, включая титан, полиуретан и PEEK. 34 37 Кроме того, как показали два независимых исследования, нано-характеристики необработанного Si3N4 оказались более устойчивыми к бактериальной адгезии и образованию биопленок, чем химически идентичные подложки, которые были обработаны или отполированы. 38 , 39

    В этом исследовании Si3N4, отожженный N2, показал наивысшее значение Ra среди протестированных материалов ( cf . Рис. 2). Он также показал наибольшее количество живых клеток через 12 часов в соответствии с тестами на микробную жизнеспособность [ cf .Рис. 3 (а)]. Напротив, подложка из ПЭЭК имела самую гладкую поверхность среди протестированных подложек, но количество живых бактерий на ее поверхности через 12 часов было сопоставимо с необработанными Si3N4 и сплавом Ti, несмотря на то, что эти последние материалы имели значительно более высокие значения Ra . . Ситуация через 48 часов была полностью изменена: отожженный в N2 Si3N4 имел самое низкое количество, а PEEK — самое большое количество живых бактерий среди испытанных образцов.Эти данные предполагают, что бактериостатическое поведение тестируемых поверхностей нельзя просто интерпретировать, используя только данные о шероховатости поверхности. Также необходимо учитывать химию поверхности. Химические реакции на поверхности Si3N4 обсуждались в предыдущем исследовании. 12 Они предположили существование термодинамической движущей силы, ограниченной диффузией, для превращения нитрида кремния в кремниевую кислоту (Si (OH) 4) и аммиак (Nh4). Высвобождение Nh4 с керамической поверхности было экспериментально продемонстрировано значительным увеличением локального pH (т.е.е., от ∼5,5 до ∼8,5). 12 Как показали предыдущие исследования, сильно щелочная среда может задерживать или предотвращать бактериальную адгезию и образование биопленок. Например, Hamadi et al. 40 исследовал адгезию Staphylococcus aureus к стеклу при различных значениях pH и обнаружил, что бактерии прочно прилипали к диапазону pH от 4 до 6, тогда как адгезия была слабой как в сильно кислых (pH ≈ 2–3), так и в щелочных условиях ( pH> 7).

    Рамановская спектроскопия позволила лучше понять метаболизм бактерий, продемонстрировав зависящие от времени изменения их молекулярной структуры после контакта с различными субстратами.Значительное снижение интенсивности связанных с ДНК полос в спектральной зоне I (например, полосы 2, 3, 7 и 8) после 48 часов воздействия обоих типов Si3N4 и подложек из сплава Ti было важным показателем его метаболическая деградация. Escoriza et al. 41 изучил покадровую рамановскую реакцию бактерий во время их пролиферации и обнаружил, что полосы, относящиеся к нуклеиновым основаниям, обычно показывают высокую интенсивность в начале роста бактерий, но их интенсивность медленно снижается со временем.В текущих экспериментах наблюдалась аналогичная начальная тенденция в сочетании с резким уменьшением через 48 ч. Это внезапное уменьшение убедительно свидетельствует о том, что и материалы Si3N4, и сплав Ti обладают антибактериальными механизмами.

    Также наблюдались изменения полос, связанных с фосфолипидами и белками, что указывало на серьезные необратимые модификации мембран и структур белков бактерий. Спектральные полосы при 1125 см-1 (полоса 15) и 1442 см-1 (полоса 19) контролируют полисахариды на межклеточную адгезию и образование биопленок. 42 , 43 Эти полосы первоначально увеличивались, но затем заметно исчезли после воздействия Si3N4, отожженного в N2, в течение 48 часов. Эту тенденцию можно интерпретировать как разрушение биопленки после ее первоначального образования в промежуточные сроки. Важным маркером для белков является полоса 13 при 1004 см-1, относящаяся к колебательным модам в фенилаланине. Однако эта полоса имела тенденцию исчезать только для бактерий, подвергшихся воздействию сплава Ti. Сильная полоса 17 (1313 см-1) отражает крутильные колебания насыщенных связей Ch3 в липидах мембран.При сравнении относительной интенсивности этой полосы с таковой для фенилаланина (полоса 13) было замечено значительное усиление после 24 часов воздействия на оба типа поверхностей Si3N4, за которым последовало четкое снижение интенсивности через 48 часов. Увеличение интенсивности полос 17 было интерпретировано как закисление липидов мембран. 24 Однако бактерии обладают способностью контролировать биофизические свойства фосфолипидов в своих мембранах в присутствии внешнего физиологического стресса 44 , и это наблюдалось с помощью спектроскопического мониторинга комбинационного рассеяния в текущих экспериментах.Следуя работе Nostro et al., 45 , бактериальное поведение, наблюдаемое на подложках Si3N4, было интерпретировано как реакция на повышение локального pH. Эта реакция снизила первоначальную способность бактерий к адгезии и впоследствии привела к нарушению созревания биопленок. Щелочной pH напрямую влияет на прикрепление бактерий, поскольку он влияет на степень D-аланилирования липотейхоевой кислоты и тейхоевой кислоты стенки, которые являются наиболее распространенными полианионами в липидах цитоплазматической мембраны и связаны с пептидогликаном.Другой важный аспект изменения pH — это его влияние на ферменты, связанные с автолизом прокариотических клеток. Изменение pH способствует активации автолизина, что приводит к превращению пептидогликангидролазы, которая сильно изменяет пептидогликан. Когда гидролаза активируется, пептидогликаны разлагаются, и осмотический баланс бактериальной клетки теряется, и клетка переходит из дышащего состояния в деполяризованное. Фрагменты аммония, высвобождаемые с поверхности Si3N4 12 , затем становятся свободными для протекания в цитоплазматическую среду, поскольку структурная целостность клеточной стенки нарушается.В конечном итоге этот процесс приводит к лизису клеток. 46 На рисунке 8 показана схематическая модель S. epidermidis , экспонированная на поверхности нитрида кремния с зависящим от времени повышением местного pH. Предусмотрен процесс неконтролируемого автолиза, который изменяет структуру стенки пептидогликана и увеличивает чувствительность мембран к молекулярным фрагментам, высвобождаемым субстратом, тем самым дестабилизируя клетку.

    Рис.8

    (а) Схематическая модель S.Epidermidis в осмотическом равновесии и (б) в деполяризованном состоянии после воздействия полигликангидролазы.

    5.

    Заключение

    Чтобы прояснить происхождение бактериостатического поведения Si3N4, были изучены изменения внутри грамположительных S. epidermidis после его воздействия на подложки, состоящие из двух вариантов Si3N4, сплава Ti и стеклянного контроля для временные точки до 48 ч. Ранее опубликованные результаты были подтверждены с помощью анализов жизнеспособности микробов и анализов под флуоресцентным микроскопом.Затем была использована спектроскопия комбинационного рассеяния in situ для отслеживания метаболических изменений бактерий при разном времени воздействия. Эти вариации были интерпретированы на основе вибрационных откликов их биологической ДНК. Спектры комбинационного рассеяния показали уменьшение интенсивности полос, связанных с образованием биопленок и ДНК, через 48 часов, что свидетельствует об инициации лизиса. Данные комбинационного рассеяния согласуются с результатами биологических тестов. На основании этих наблюдений и по сравнению с ранее опубликованной литературой, метаболические изменения у S.Epidermidis объясняется дрейфом pH в сторону щелочных значений на поверхности Si3N4. Этот дрейф изменил поведение ферментов и клеточных соединений, ограничив их адгезию и увеличив проницаемость клеточных стенок. В заключение, это исследование продемонстрировало, что химический состав поверхности Si3N4 может быть полезен для подавления перипротезных инфекций, препятствуя образованию биопленок и размножению бактерий.

    Раскрытие информации

    Конкурирующие финансовые интересы: Джузеппе Пеццотти — консультант Amedica Corporation, а Брайан Макинтайр работает в Amedica Corporation.

    Ссылки

    1.

    O. Samek et al., «Рамановская спектроскопия для быстрого распознавания клонов Staphylococcus epidermidis, связанных с инфекциями, связанными с медицинскими устройствами», Лазерная физика, 5465 –470 (2008). https://doi.org/10.1002/lapl.200810011 LAPHEJ 1743-44401054-660X Google Scholar

    9.

    M. R. Bock et al., «Бактериостатическое поведение нитрида кремния с модулированной поверхностью по сравнению с полиэфирэфиркетоном и титаном», Дж.Биомед. Матер. Res. Часть A, 105 1521 –1534 (2017). https://doi.org/10.1002/jbm.v105.5 Google Scholar

    11.

    О. Самек, Дж. Ф. М. Аль-Мараши и Х. Х. Телле, «Возможности рамановской спектроскопии для идентификации образования биопленок Staphylococcus Epidermidis», Laser Phys. Lett., 7 378 –383 (2010). https://doi.org/10.1002/lapl.v7:5 1612-2011 Google Scholar

    16.

    S. E. McBirney et al., «Нормированный по длине волны спектроскопический анализ скорости роста Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa», Биомед.Опт. Экспресс, 7 4034 –42 (2016). https://doi.org/10.1364/BOE.7.004034 BOEICL 2156-7085 Google Scholar

    22.

    Р. М. Джарвис, А. Брукер и Р. Гудакр, «Рамановская спектроскопия с усилением поверхности для распознавания бактерий с использованием сканирующего электронного микроскопа с интерфейсом для рамановской спектроскопии», Анальный. Chem., 76 5198 –5202 (2004). Google ученый

    31.

    О. Озтюрк, М. Судагидан и У. Тюркан, «Формирование биопленки Staphylococcus epidermidis на материале сплава CoCrMo, имплантированном ионами азота», Дж.Биомед. Матер. Рез., 81А 663 –668 (2007). https://doi.org/10.1002/(ISSN)1552-4965 JBMRBG 0021-9304 Google Scholar

    35.

    A. V. Singh et al., «Количественная характеристика влияния наноразмерной морфологии наноструктурированных поверхностей на бактериальную адгезию и образование биопленок», PLoS One, 6 e25029 (2011). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025029 APSPA4POLNCL 0003-70281932-6203 Google Scholar

    38.

    М.Исикава и др., «Топография поверхности нитрида кремния влияет на антимикробные и остеоинтеграционные свойства большеберцовых имплантатов на мышиной модели», J. Biomed. Матер. Res. А, 105 3413 –3421 (2017). https://doi.org/10.1002/jbm.a.36189 Google Scholar

    42.

    M. Harz et al., «Микро-рамановская спектроскопическая идентификация бактериальных клеток рода Staphylococcus и зависимость от условий их культивирования», Аналитик, 130 1543 –1550 (2005).https://doi.org/10.1039/b507715j ANLYAG 0365-4885 Google Scholar

    43.

    D. Mack et al., «Межклеточный адгезин, участвующий в накоплении биопленок Staphylococcus epidermidis, представляет собой линейный бета-1,6-связанный глюкозаминогликан: очистка и структурный анализ», J. Bacteriol., 178 175 –183 (1996). https://doi.org/10.1128/jb.178.1.175-183.1996 JOBAAY 0021-9193 Google Scholar

    Биография

    Франческо Боскетто — аспирант Киотского технологического института, лаборатория физики керамики.В 2016 году он окончил Венецианский университет «Ка ‘Фоскари» по специальности «наука и технологии нано- и биоматериалов». Его исследования сосредоточены на спектроскопических и микроскопических исследованиях взаимодействия между биокерамическими материалами и окружающей средой человеческого тела.

    Тэцуя Адачи — доцент кафедры стоматологии Медицинского университета префектуры Киото. Он получил свой DDS на кафедре стоматологии Университета медицинских наук Хоккайдо в 2006 году и докторскую степень на кафедре иммунологии Высшей школы медицины Университета Рюкю в 2012 году.С 2011 по 2017 год он проживал в университетской больнице Медицинского университета префектуры Киото.

    Сатоши Хоригути — аспирант кафедры иммунологии Медицинского университета префектуры Киото с 2016 года. Окончил аспирантуру Университета Осаки. Школа стоматологии в 2015 году.

    Дэнни Файноцци — аспирант синхротрона Элеттра, Басовицца, Триест, Италия, где он исследует «Новый путь определения структуры белка в физиологической среде».”Он получил степень бакалавра физики в 2015 году и степень магистра физики конденсированного состояния в Университете Триеста, Италия, в 2017 году.

    Фульвио Пармиджани — профессор физики в Университете Триеста. С 2014 года он также является приглашенным профессором Кельнского университета. В прошлом приглашенный научный сотрудник Исследовательского центра IBM в Алмадене, Калифорния, он был аффилированным лицом в LBNL, Беркли, Калифорния, с 2001 по 2017 год. С 2004 по 2015 год он работал научным директором FERMI-FEL в Elettra Synchrotron в Триесте.Его научные интересы простираются от неравновесной физики сильно коррелированных электронных систем до низкоразмерных материалов и высокотемпературных сверхпроводников. Соавтор около 300 статей, научный сотрудник APS.

    Элиа Марин — доцент Киотского технологического института, лаборатория физики керамики. Он также является специально назначенным доцентом Медицинского университета префектуры Киото, Высшей школы медицинских наук, Департамента стоматологической медицины.Его исследования сосредоточены на характеристике биоматериалов с помощью комбинированных спектроскопических и микроскопических методов и оценке биологической реакции in vitro .

    Вэньлян Чжу получил докторскую степень в области материаловедения в Технологическом институте Киото в 2005 году. Он стал доцентом, а затем доцентом Медицинской школы Университета Осаки. В настоящее время он является доцентом лаборатории физики керамики Киотского технологического института.Его основная область исследований связана с разработкой и применением фото- и электростимулированной спектроскопии высокого разрешения для количественного анализа структурных, механических и химических свойств в монокристаллической и поликристаллической керамике.

    Брайан Дж. Макинтайр — технический директор Amedica Corporation. Он получил степени бакалавра (с отличием) и магистра делового администрирования в Университете штата Юта и докторскую степень в Киотском технологическом институте. У него более 40 лет промышленного опыта в разработке и производстве современной керамики.Он является соавтором более 65 рецензируемых публикаций и имеет четыре патента. Он член Американского керамического общества.

    Тоширо Ямамото получил степень доктора стоматологии и докторскую степень на стоматологическом факультете Осакского стоматологического университета в 1995 году. С 1995 по 2001 год он проживал в университетской больнице Медицинского университета префектуры Киото, где он в настоящее время является врачом. преподаватель и заместитель главного врача с 2001 года.

    Нарисато Канамура — доцент и главный врач Медицинского университета префектуры Киото с 2001 года.Он получил докторскую степень на кафедре стоматологии Университета Асахи в 1984 году. Ранее он был назначен лектором в Медицинском университете префектуры Киото в период с 1992 по 2001 год. Его исследовательские интересы в основном сосредоточены в области пародонтальной медицины и тканевой инженерии.

    Осам Мазда — профессор кафедры иммунологии Медицинского университета префектуры Киото с 2011 года. Ранее он был профессором кафедры микробиологии и иммунологии того же университета.Он также был исследователем PRESTO до 2012 года в Японском агентстве по науке и технологиям. С 1993 года он был научным сотрудником Японского общества содействия науке.

    Эрико Огитани получила степень бакалавра ветеринарной медицины в 1979 году в Университете Нихон. В 1997 году она получила докторскую степень по медицине на кафедре микробиологии Медицинского университета префектуры Киото. С 1979 по 1984 год она работала в ветеринарной клинике, а с 1997 по 2005 год — научным сотрудником в Центре медицинских исследований Луи Пастера.С 2005 года она является доцентом кафедры иммунологии Медицинского университета префектуры Киото.

    Джузеппе Пеццотти — вице-президент и профессор лаборатории физики керамики Киотского технологического института. Он также является приглашенным профессором кафедры ортопедии Токийского медицинского университета, адъюнкт-профессором кафедры иммунологии Медицинского университета префектуры Киото и приглашенным профессором Центра современной медицинской инженерии и информатики в Осаке. Университет.Он имеет три степени доктора наук в области инженерии (материаловедение из Университета Осаки), медицины (ортопедия из Токийского медицинского университета) и физических наук (физика твердого тела из Университета Киото). Он является автором / соавтором около 620 научных работ, 8 статей и 1 книги как один автор.

    Патогенность Staphylococcus epidermidis на органы кишечника крыс и мышей: экспериментальное исследование | BMC Gastroenterology

    Пероральное введение этих организмов было предпринято для имитации того, что может быть получено в результате колонизации желудочно-кишечного тракта этими организмами. S. epidermidis изолятов из образцов фекалий маленьких детей продемонстрировали инвазивность в желудочно-кишечном тракте у мышей и крыс с интактной иммунной системой. Исходя из этого наблюдения, этот организм может быть важным эпидемиологическим агентом, связанным с дисфункцией тканей и органов кишечника.

    Модели грызунов, особенно мышей, являются общепринятыми и используются в качестве коррелятов физиологических и поведенческих предрасположенностей людей. Одним из очевидных преимуществ использования мышей является то, что геномы человека и мыши очень похожи, так что многие гены человека имеют аналоги у мышей [15, 16].Также было обнаружено, что многие органы мышей очень похожи на органы человека [15, 16]. Таким образом, мышей и крыс чаще всего использовали для изучения экспериментальных коагулазонегативных стафилококковых инфекций как грубых коррелятов человеческих инфекций [9, 11], отсюда и их использование в данном исследовании. Острое пероральное введение этих организмов грызунам в большинстве случаев не могло привести к немедленной летальности, но вызывало такие симптомы, как снижение двигательной активности, потеря аппетита, интенсивный уход и дискомфорт в животе.Эти реакции, связанные с тревогой, также могут указывать на воздействие на центры возбуждения центральной нервной системы [17].

    Еще в 1957 году минимальная патогенная доза для вирулентных стафилококков оценивалась в размере от 2 до 8 × 10 6 организмов [18]. Подобные дозы бактерий в диапазоне от 2 × 10 8 КОЕ до 2 × 10 9 КОЕ / кг массы тела изолятов S. aureus , вводимых внутрибрюшинно, ранее использовались для получения 100% смертности мышей со смертью в пределах 5– 10 часов [19].Этот диапазон доз не может обеспечить такой уровень смертности в этом исследовании, что, возможно, подтверждает хорошо известное сообщение о том, что S. epidermidis менее патогенен, чем S. aureus [13].

    С другой стороны, результирующая смертность, наблюдаемая у мышей после перорального приема одного штамма S. epidermidis , предполагает способность этих организмов вызывать смерть после острой инфекции. В дополнение к этому открытие того, что эти диапазоны доз привели к серьезным гистопатологическим повреждениям у этих животных, является подтверждением вирулентности этого организма в определенных условиях, а также предполагает полезность таких доз для определения его патогенного потенциала.

    Три штамма S. epidermidis , испытанные на мышах, вызвали поразительные гистопатологические изменения в органах желудочно-кишечного тракта. Эти патологические поражения, хотя и различались по степени тяжести, качественно соответствовали. Инвазивный характер патогистологических поражений предполагает участие токсинов. Кроме того, патологические изменения были аналогичны известным классическим гистопатологическим изменениям, связанным с S. aureus [20, 21].

    Эти наблюдения помогают подтвердить роль факторов вирулентности, таких как гемагглютинация, биопленка, капсула и гемолизин, экспрессируемые штаммами этого организма, в патогенности [13].Например, гемагглютинация рассматривается как мера адгезии патогенов к хозяину, что является первым шагом в колонизации. Повреждение клеток-хозяев может быть опосредовано гемолизинами, которые являются токсинами, повреждающими мембрану. Формирование капсулы связано с защитой организмов от фагоцитоза, что приводит к повышенной вирулентности. Ранее было продемонстрировано, что инкапсулированный S. aureus был более вирулентным для мышей, чем их неинкапсулированный аналог [22]. Кроме того, образование биопленок является установленным механизмом патогенности CoNS [23].Результаты показывают, что эти факторы могут играть существенную роль в образовании этих поражений, поскольку тяжесть патологических эффектов была прямо пропорциональна количеству и типу факторов вирулентности, экспрессируемых организмом [13, 20]. Дальнейшая работа должна определить конкретные детерминанты вирулентности, ответственные за эти эффекты.

    Клетки печени показали скопление, агрегаты и многоядерные гепатоциты. Все это может быть сигналами воспалительного процесса, особенно инфильтрации воротного тракта хроническими воспалительными клетками.Застой в печени может быть результатом чрезмерного потребления или присутствия токсинов в крови, и это может привести к дисфункции печени. Другая ситуация, которая, как сообщается, приводит к застою в печени, связана с уменьшением или остановкой оттока желчи. Виды S. epidermidis также могут играть определенную роль в этом отношении, и это заслуживает дальнейшего изучения.

    В почках наблюдалась инфильтрация интерстициальных канальцев хроническими воспалительными клетками от легкой до умеренной.В некоторых случаях, помимо легкой компрессии просвета капилляра, наблюдались некрозы. Некроз относится к спектру морфологических изменений, которые следуют за гибелью клеток в живых тканях [24]. При коагуляционном некрозе почек клетки обычно выглядят бледными и похожими на призрак. Посередине была геморрагическая зона, где клетки умирали или не совсем умерли, а нормальные клетки паренхимы находились в крайнем правом углу. Эти эффекты были наиболее выражены у мышей, инфицированных штаммом A245A S. epidermidis .Три штамма S. epidermidis , использованные в этом исследовании, по-видимому, не обладали способностью проникать в некоторые клетки клубочков, поскольку они, по-видимому, не были затронуты их инфекциями.

    Коагуляционный некроз наблюдался как наиболее частые патологические изменения в селезенке, кишечнике и желудке. Эти эффекты могут быть результатом инфильтрации воспалительными клетками. Известно, что коагуляционный некроз в значительной степени является результатом прогрессирующего разрушающего действия ферментов на смертельно поврежденные клетки [24].Некроз также возникает при необратимом экзогенном повреждении. Некротические клетки демонстрируют повышенную эозинофилию, частично связанную с потерей нормальной базофилии, передаваемой РНК в цитоплазме, и частично с повышенным связыванием эозина с денатурированными структурными ферментативными белками [24].

    Коагуляционный некроз — наиболее распространенный тип некроза с необратимым очаговым повреждением, в большинстве случаев вызванный внезапным прекращением кровотока бактериальными или химическими агентами [24, 25]. Ранее сообщалось, что S.aureus у мышей вызывает повреждение тканей, которое характеризуется воспалительной инфильтрацией полиморфно-ядерных клеток и некрозом гепатоцитов, гранулематозным воспалением в легких и сужением легочных альвеолярных перегородок [26].

    Наличие абсцессов почек, печени и брюшины, а также спленомегалии у мышей, внутрибрюшинно зараженных тремя штаммами S. epidermidis , выделенными из ран, крови и мочи стационарных пациентов, было продемонстрировано еще в 1992 г. [9].Рабочие сообщили о спленомегалии как о наиболее частом макроскопическом патологическом изменении, вызванном штаммами этого организма. Наши результаты могут служить подтверждением более ранних отчетов, которые продемонстрировали селезенку как орган-мишень для CoNS [9]. Тот факт, что штаммы S. epidermidis , использованные в этом исследовании, были из желудочно-кишечного тракта человека, может указывать на важность CoNS, колонизирующего кишечный тракт, в патогенезе дисфункции селезенки.

    Другое исследование показало, что количество случаев спленомегалии было прямо пропорционально LD 50 штаммов S.Epidermidis исследовали в этом исследовании [27]. В данном исследовании этого не было, поскольку летальность не могла быть продемонстрирована для большинства этих организмов при аналогичных дозах и, следовательно, не могла быть коррелирована с этим состоянием. Однако дисфункция селезенки, в дополнение к другим патологическим нарушениям, вероятно, является частью того, что несет ответственность за летальные эффекты, наблюдаемые при субхронических инфекциях, которые привели к гибели 52,4% мышей. Сообщалось, что спленомегалия вызывается лимфопролиферацией и способностью стафилококковой внеклеточной слизи стимулировать выработку иммунологически компетентных клеток [28].Кроме того, белок A S. aureus , как сообщается, вызывает истощение предшественников В-клеток, В-клеток маргинальной зоны селезенки, что приводит к плохой генерации специфического В-клеточного ответа [22, 29]. Хотя эта роль не была описана для S. epidermidis , возможность ее появления остается, поскольку этот организм является постоянным колонизатором людей и, как считается, вызывает инфекцию у восприимчивых людей [12].

    Следует отметить, что никаких патологических повреждений не наблюдалось ни у одного из контрольных животных, ни одно из которых не умерло в ходе исследования.Это указывает на то, что все эффекты, наблюдаемые у инфицированных животных, были связаны с активностью штаммов S. epidermidis , которыми они были инфицированы.

    Структурное обоснование модуляции образования абсцесса капсульными полисахаридами Staphylococcus aureus

    Реферат

    Staphylococcus aureus — важный с медицинской точки зрения бактериальный патоген, который является частой причиной поверхностных и глубоких абсцессов у людей.Большинство изолятов S. aureus продуцируют капсульный полисахарид (CP) серотипа 5 или 8, который, как было показано, усиливает вирулентность бактерий. Мы исследовали роль CP S. aureus в модулировании образования абсцесса на экспериментальной животной модели внутрибрюшной инфекции. Структурные исследования CP8 показали, что он имеет мотив цвиттерионного заряда, связанный с отрицательно заряженной карбоксильной группой N- ацетилманнозаминуроновой кислоты и свободными аминогруппами, доступными на частично N ацетилированных остатках фукозамина.Мы сообщаем, что очищенные CP5 и CP8 способствовали формированию внутрибрюшного абсцесса у животных при внутрибрюшинном введении. со стерильным адъювантом содержимого слепой кишки. Химические модификации, которые нейтрализовали положительно или отрицательно заряженные группы на CP8, лишили его способности вызывать абсцессы. Крысы, получавшие профилактическое лечение CP8 s.c. были защищены от образования абсцесса, индуцированного гомологичными или гетерологичными цвиттерионными полисахаридами. Точно так же обработка CP8 защищала от заражения жизнеспособным S.aureus штаммы PS80 (капсульный штамм 8-го типа) или COL (метициллин-резистентный капсульный штамм 5-го типа). Очищенный CP8 был мощным активатором CD4 + Т-клеток крысы и человека in vitro . При передаче наивным крысам эти активированные Т-клетки модулировали развитие образования внутрибрюшного абсцесса. Эти результаты обеспечивают структурное / функциональное обоснование образования абсцесса у S. aureus и расширяют сферу инкапсулированных организмов, которые напрямую взаимодействуют с Т-клетками, чтобы регулировать этот ответ хозяина на бактериальную инфекцию.

    S Taphylococcus aureus — это основной бактериальный патоген, ответственный за широкий и разнообразный спектр инфекций человека и животных. Эти инфекции варьируются от кожных инфекций, таких как импетиго, фолликулит и фурункулы, до инфекций ран и инфекций, вызванных протезами, до тяжелых опасных для жизни инфекций, таких как остеомиелит, эндокардит и бактериемия с метастатическими осложнениями. Токсин-опосредованные заболевания, вызванные S.aureus включают пищевое отравление, синдром токсического шока и синдром ошпаренной кожи. Бактериальные компоненты и секретируемые продукты, которые влияют на патогенез инфекций S. aureus , многочисленны и включают связанные с поверхностью адгезины, экзоферменты, экзотоксины и капсульный полисахарид (CP). Эта совокупность бактериальных продуктов позволяет стафилококкам прилипать к эукариотическим мембранам, противостоять опсонофагоцитозу, лизировать клетки млекопитающих, проникать в глубокие ткани и запускать производство каскада иммуномодулирующих молекул хозяина (1).

    Бактериальные ХП представляют собой хорошо изученные факторы вирулентности, которые потенцируют микробные инфекции. CP серотипа 5 или 8 экспрессируются большинством изолятов S. aureus (2, 3), и эти полисахариды усиливают вирулентность в ряде животных моделей стафилококковой инфекции (4-6). Напротив, CP5 и CP8 ослабляют вирулентность стафилококков в катетер-индуцированной модели эндокардита (7). Капсула S. aureus защищает бактерию от in vitro опсонофагоцитарного уничтожения полиморфно-ядерными лейкоцитами человека (5, 8).

    Большинство бактериальных ЦП, структура которых установлена, не заряжены или обладают отрицательным зарядом. Однако некоторые бактериальные CP обладают мотивом цвиттерионного заряда, который не только обеспечивает устойчивость к фагоцитозу, но также напрямую модулирует иммунный ответ хозяина на бактериальную инфекцию. Лучше всего охарактеризована система Bacteroides fragilis , анаэроб, который продуцирует по крайней мере два различных CP, полисахариды A и B (PS A и PS B) со свободными амино, карбоксильными и / или фосфонатными группами (9).Каждая капсула (в очищенном виде) при внутрибрюшинном введении вызывает образование абсцесса. со стерильным адъювантом содержимого слепой кишки (SCCA) в модели внутрибрюшного сепсиса на крысах (10). Напротив, s.c. введение этих полимеров в отсутствие адъюванта и до бактериального заражения защищает от образования абсцесса, вызванного живыми бактериями (11). Химическая нейтрализация или удаление свободных амино или отрицательно заряженных групп отменяет модуляцию образования абсцесса (10). Гетерологичный полисахарид, такой как капсула типа 1 из Streptococcus pneumoniae , с другой повторяющейся структурой субъединицы сахара, но схожими заряженными структурными группами, также проявляет эту биологическую активность (10).

    Поскольку S. aureus представляет собой инкапсулированный патоген, который тесно связан с образованием абсцесса у людей и животных, мы стремились определить, модулируют ли очищенные полисахариды, связанные с клеточной стенкой стафилококка, образование абсцесса у крыс, и исследовать структурную основу этой активности. . Мы сообщаем, что очищенные CP5 и CP8, а также рибитолтейхоевая кислота из S. aureus модулируют образование абсцесса в модели формирования внутрибрюшного абсцесса на крысах.Структурный анализ показал, что CP8 обладает частично повторяющейся единицей ацетилированного трисахарида N с мотивом цвиттерионного заряда, который может способствовать преобладанию этого организма в клинических случаях образования абсцесса.

    Материалы и методы

    Бактериальные штаммы.

    S. aureus штаммы Рейнольдса и Беккера являются штаммами-прототипами капсульных серотипов 5 и 8 соответственно (12). Штамм PS80 серотипа 8 был получен из Американской коллекции типовых культур (№27700). S. aureus штамм O13 (13), изолят серотипа 8 от пациента с муковисцидозом, был предоставлен Али Фаттомом (Наби, Роквилл, Мэриленд). S. aureus Штамм COL, устойчивый к метициллину штамм серотипа 5, был получен от Джона Иандоло (Центр медицинских наук Университета Оклахомы, Оклахома-Сити, Оклахома). Мутант JL243 — акапсулярный мутант штамма Reynolds (5). Стафилококки культивировали в течение 24 ч при 37 ° C на колумбийском агаре (Difco) с добавлением 2% NaCl. B. fragilis Национальная коллекция типовых культур 9343 — эталонный штамм, использованный в наших предыдущих исследованиях (14).

    Очистка бактериальных полисахаридов.

    B. fragilis
    PS A.

    PS A был выделен из B. fragilis NCTC 9343, как описано ранее (11). Его состав и чистоту оценивали с помощью спектроскопии ЯМР 1 H, УФ-спектроскопии (260 и 280 нм) и восстановлением ПААГ на градиентных гелях с последующим окрашиванием серебром.

    S. aureus
    CP5 и CP8.

    стафилококков культивировали на твердой среде, на которую накладывали слой молекулярно-пористой диализной мембраны Spectra / Por (Spectrum Laboratories, Хьюстон; отсечка по молекулярной массе 12 000–14 000). CP5 и CP8 были очищены из капсульных экстрактов бактерий методами, модифицированными по сравнению с опубликованными ранее (15, 16). Вкратце, автоклавированные бактериальные экстракты обрабатывали ДНКазой и РНКазой (100 мкг / мл каждая) в течение 6 часов при 37 ° C с последующей обработкой проназой в течение ночи (4 единицы / мл).Образцы диализовали и обрабатывали 0,05 М NaIO 4 для окисления полимеров тейхоевой кислоты. Диализованный материал пропускали через колонку (2,6 × 30 см) с DEAE-Sephacel (Amersham Pharmacia Fine Chemicals), уравновешенную 0,05 M ацетатом Na / 0,05 M NaCl, pH 6,0. Фракции, элюированные 2-литровым градиентом (0,05 М ацетат натрия с 0,05–0,5 М NaCl), анализировали на серологическую активность с антителами к CP5 или CP8. Соответствующие фракции объединяли, диализовали и лиофилизировали. Полисахарид хроматографировали на колонке S-300 (Amersham Pharmacia), уравновешенной 0.2 М NaCl. И CP5, и CP8, обнаруженные по поглощению при 206 нм, элюировались вблизи пустого объема колонки со значениями K av , равными 0,01. Серологически активные фракции объединяли, диализовали и лиофилизировали. Чистоту полисахаридов оценивали с помощью УФ (260 и 280 нм) и ЯМР-спектроскопии.

    Другие полисахариды.

    Выделение и очистка тейхоевой кислоты S. aureus проводилась методами, описанными Peterson et al. (17). Очищенный CP стрептококка III типа был щедро предоставлен Лоуренсом Паолетти (лаборатория Ченнинга, Бостон, Массачусетс). S. pneumoniae CP типа 1 и 3 были приобретены в ATCC и очищены, как описано ранее (18).

    Химические модификации CP8.

    Три различные химические модификации CP8 были выполнены, как описано ранее (10). Вкратце, свободные аминогруппы на CP8 были преобразованы в ацетильные фрагменты N путем обработки образца уксусным ангидридом в 5% (мас. / Об.) NaHCO 3 (9).Карбоксильные группы были преобразованы в гидроксиметильные группы путем восстановления с участием карбодиимида (19). Наконец, полимер подвергали деацетилированию O обработкой 0,1 н. NaOH в течение ночи при комнатной температуре (20). Затем часть этого материала ацетилировали N , как описано выше. Все модификации полисахаридных структур подтверждены ЯМР-спектроскопией.

    ЯМР-спектроскопия и аналитические методы.

    ЯМР-эксперименты

    выполнены на спектрометре Varian Unity 500 (Varian) с резонансной частотой протонов 500.13 МГц. Спектры протонов регистрировали при 70 ° C в D 2 O, и химические сдвиги относились к водному резонансу при 4,35 м.д. при внешней калибровке. Свободные аминогруппы цвиттерионных полисахаридов определяли флуорометрическим анализом после дериватизации флуоресцином (21).

    Животная модель формирования внутрибрюшного абсцесса.

    Модель формирования внутрибрюшного абсцесса на животных была описана ранее (11). Для экспериментов, в которых использовались бактериальные инокуляты, 10-кратные серийные разведения [в диапазоне от 10 9 до 10 1 колониеобразующих единиц (КОЕ)] S.aureus . Для экспериментов по защите животных заражали 1 × 10 7 КОЕ S. aureus или 1 × 10 8 КОЕ B. fragilis NCTC 9343. В исследованиях по оценке индукции абсцесса различными полисахаридами S. aureus соответствующие 10-кратные разведения тестируемого полимера (в диапазоне от 200 до 0,02 мкг) смешивали с SCCA. Контрольную группу, зараженную одним SCCA, включали в каждый эксперимент. Животных умерщвляли через 6 дней после заражения и осматривали «слепым способом» на предмет внутрибрюшных абсцессов.Модель логистической регрессии (10) использовалась для (-1 ) расчета дозы, необходимой для индукции абсцессов у 50% животных (обозначенных AD 50 ) для каждого тестируемого бактериального штамма или полисахарида и ( II ) для сравнения биологическая активность модифицированных и немодифицированных полисахаридов в диапазоне доз. Для исследований защиты животных лечили подкожно. с 20 мкг тестируемого полисахарида при -24, 0 и +24 ч относительно контрольного заражения. Этих животных обследовали, как описано выше, на предмет развития абсцессов.Оценку различий между группами животных в исследованиях защиты проводили с помощью анализа χ 2 (instat, GraphPad, San Diego). Показанные результаты представляют собой компиляцию по крайней мере двух отдельных экспериментов.

    Анализ пролиферации Т-клеток.

    Лейкоциты человека были получены из лейкопаков человека (выброшенные белые клетки от анонимных доноров тромбоцитов), как описано ранее (22, 23). Анализы пролиферации Т-клеток CD4 + крысы проводили, как описано ранее (24).Для анализа Т-клеток человека и крысы клетки культивировали с 20 мкг / мл либо CP8 S. aureus PS80, CP S. pneumoniae типа 1, либо CP стрептококка группы B типа III. Стафилококковый энтеротоксин А (5 нг / мл, Sigma) был включен в качестве положительного контроля. Пролиферацию измеряли через 6 и 9 дней после культивирования для CD4 + Т-клеток человека и через 4 и 6 дней после культивирования для CD4 + Т-клеток крысы. Данные были выражены как среднее число импульсов в минуту для трех лунок ± стандартное отклонение.Для всех экспериментов по распространению представленные данные являются репрезентативными для экспериментов, проведенных не менее трех раз.

    Эксперименты по переносу Т-клеток.

    CD4 + Т-клетки культивировали в течение 5 дней in vitro с облученными антигенпредставляющими клетками и CP8 (20 мкг / мл), как описано выше. После прохождения через колонку из нейлоновой ваты Т-клетки тщательно промывали для удаления полисахарида. Полученная популяция составляла> 95% Т-клеток (18).Чтобы оценить их способность вызывать образование абсцесса, 3 × 10 6 Т-клеток были хирургически имплантированы в брюшную полость крыс вместе с SCCA, как описано ранее (25). В качестве альтернативы, Т-клетки (3 × 10 6 клеток / животное) были перенесены внутрикардиально (i.c.) наивным крысам за 24 ч до перитонеального заражения ≈1 × 10 7 КОЕ S. aureus PS80 и SCCA. Через 6 дней после заражения животных оценивали на предмет образования абсцесса.

    Результаты

    Индукция внутрибрюшного абсцесса с помощью

    S.Ауреус .

    Модель индукции внутрибрюшного абсцесса на крысах наиболее часто использовалась с бактериальными представителями флоры толстой кишки человека. В то время как AD 50 B. fragilis в этой модели составляет ≈10 5 КОЕ / крысу (неопубликованные наблюдения), факультативные организмы, такие как Enterococcus faecalis и Escherichia coli , не вызывают абсцессов при контрольных дозах, поскольку высокий как 5 × 10 7 КОЕ (26). Наши результаты с S.aureus указывают на то, что этот организм является мощным индуктором образования абсцесса у крыс. Крысам вводили дозы штамма Reynolds серотипа 5, которые варьировались от 10 7 до 10 1 КОЕ, и было рассчитано, что AD 50 для штамма Reynolds составляло 60 КОЕ (фиг. 1 A ). Жизнеспособность бактерий не была важным компонентом индукции абсцесса, поскольку убитые формалином клетки Рейнольдса также вызывали образование абсцесса (AD 50 = 667 КОЕ; P = 0.05 по сравнению с живыми клетками Рейнольдса). Вклад экспрессии CP5 в индукцию образования абсцесса оценивали путем заражения дополнительных групп крыс серийными разведениями акапсулярного мутанта JL243. Мутант также индуцировал абсцессы у крыс (фиг. 1 B ), хотя расчетное значение AD 50 1,2 × 10 3 КОЕ было значительно больше, чем у родительского штамма ( P = 0,02). Это открытие предполагает, что другие бактериальные продукты, кроме капсул, также могут способствовать индукции абсцесса.Эксперименты со штаммом PS80 серотипа 8 (рис. 1 B ) показали, что его AD 50 составлял 51 КОЕ, аналогично штамму Reynolds.

    Рисунок 1

    Индукция абсцесса с помощью S. aureus . ( A ) Крыс заражали живыми или убитыми формалином клетками Рейнольдса S. aureus . ( B ) Кривые титрования доз для штамма Reynolds серотипа 5, акапсулярного мутанта JL243 и штамма PS80 серотипа 8. Рассчитанные значения AD 50 для трех штаммов составили 60,1.2 × 10 3 и 51 КОЕ соответственно.

    Структурный состав

    S. aureus CP8.

    Предыдущие исследования показали, что CP8 имеет структуру [→ 3) -4-O-Ac-β-ManNAcA- (1 → 3) -α-FucNAc- (1 → 3) -β-FucNAc- (1 →] n (27, 28). CP8 был экстрагирован и очищен из трех различных штаммов S. aureus типа 8 и проанализирован с помощью ЯМР-спектроскопии. CP8 из штаммов Becker, PS80 и O13 были структурно схожими, но каждый демонстрировал разную степень N ацетилирование.Протонная ЯМР-спектроскопия природного CP8 выявила резонансные сигналы около 2 м.д., соответствующие метильным протонам как из групп -OAc, так и из групп -NAc (фиг. 2 A и C ). Обработка CP8 мягкой щелочью для удаления ацетильных групп O , связанных с ManNAcA, привела к лучшему разрешению сигналов около 2 ppm (рис. 2 B и D ). Для Becker CP8 резонансные сигналы при 2,032, 2,011 и 1,963 м.д. были от метильных протонов ацетильных групп N трех аминосахаров, составляющих повторяющееся звено этого полимера (рис.2 В ). Отношение этих сигналов составляло 1: 0,87: 0,51, что указывает на то, что по крайней мере два аминосахара не были полностью ацетилированы N (87 и 51% соответственно). Для штамма O13 спектр ЯМР деацетилированного полимера O показывает, что два компонента сахара на ≈85% ацетилированы N (рис. 2 D ). Свободные аминогруппы, скорее всего, присутствуют на двух остатках FucNAc, поскольку различные изомеры FucNAc были обнаружены с помощью двумерного ЯМР-анализа (данные не показаны).Флуорометрический анализ CP8 после обработки флуорескамином подтвердил наличие свободных аминогрупп на этом полисахариде.

    Рисунок 2

    Частичный 1 Спектры ЯМР H нативного и O деацетилированного CP8, показывающие метильные протоны NAc и OAc. ( A ) Родной CP8 от Becker; ( B ) O деацетилированный Becker CP8; ( C ) нативный CP8 из штамма O13; ( D ) O деацетилированный CP8 из штамма O13.Спектры в B и D показывают, что CP8 из штаммов Becker и O13 имеют разную степень ацетилирования N . CP8 штаммов O13 и PS80 имеют практически идентичные спектры ЯМР.

    Индукция абсцесса с помощью

    S. aureus полисахаридов.

    На основании нашего анализа повторяющаяся единица CP8 имеет положительно заряженные свободные аминогруппы (на частично N ацетилированных остатках FucNAc) и отрицательно заряженный остаток ManNAcA, придающий этому полимеру мотив цвиттерионного заряда.Способность PS80 CP8 вызывать абсцесс оценивалась на крысах внутрибрюшинно. с дозами от 20 до 0,02 мкг на крысу. Как показано в таблице 1, очищенный CP8 был мощным индуктором образования абсцесса с AD 50 0,33 мкг. Эта активность сопоставима с активностью B. fragilis PS A (AD 50 = 0,67 мкг) (10) и выше, чем у B. fragilis PS B (AD 50 = 25 мкг) или S . pneumoniae CP типа 1 (AD 50 = 31 мкг) (10).CP8, очищенный из штаммов Becker и O13, также был протестирован на модели на животных и продемонстрировал биологическую активность, аналогичную активности CP8, очищенного из PS80 (данные не показаны).

    Таблица 1

    Индукция абсцесса модифицированными полисахаридами S. aureus CP8

    S. aureus CP5 структурно аналогичен CP8; два полисахарида различаются только связями между сахарами и сайтами ацетилирования O остатков ManNAcA.Как показано в таблице 1, CP5 также был мощным индуктором образования абсцесса с AD 50 0,30 мкг у крыс. Связанная с клеточной стенкой тейхоевая кислота является другим растворимым полисахаридом из S. aureus с мотивом цвиттерионного заряда. Он состоит из линейной основной структуры, состоящей из 4- O -β- и 4- O -α- N -ацетил-d-глюкозаминил-d-рибита, соединенных мостиковыми связями 1,5-фосфодиэфира. Примерно 50% остатков рибита этерифицируются в положении C-2 с d-аланином (29).Поскольку эта структура содержит отрицательно заряженные фосфатные группы и положительно заряженные свободные аминогруппы (на аланинах), она соответствует мотиву цвиттерионного заряда, описанному выше. Очищенная тейхоевая кислота показала эффективность, аналогичную эффективности CP5 и CP8, с AD 50 0,88 мкг (Таблица 1).

    Роль заряженных групп заместителей в формировании абсцесса, вызываемого

    S. aureus CP8.

    Мы химически модифицировали CP8, чтобы нейтрализовать заряженные группы, связанные с повторяющимся звеном CP8, и полученные модифицированные полимеры были протестированы на модели на животных.N ацетилирование свободных аминогрупп на повторяющейся единице CP8 привело к значительной потере активности, вызывающей абсцесс. AD 50 для модифицированного сахарида в диапазоне испытанных доз составлял 184 мкг (таблица 1; P <0,0001 по сравнению с нативным CP8). Точно так же опосредованное карбодиимидом восстановление карбоксильных групп на CP8 до гидроксиметильных групп привело к аналогичной потере биологической активности, давая полимер с AD 50 240 мкг ( P <0.0001).

    Остаток ManNAcA ЦП, продуцируемых разными изолятами S. aureus , в разной степени ацетилирован O (15, 30). Хотя присутствие или отсутствие ацетильных групп O не придает положительный или отрицательный заряд полимеру, мы O деацетилировали CP8 слабой щелочью, чтобы исключить вклад этой группы в образование абсцесса. Как и предполагалось, AD 50 этого модифицированного полимера составлял 0,25 мкг, что сравнимо с таковым для нативного CP8 (таблица 1).Напротив, ацетилирование N деацетилированного CP8 O привело к значительной потере активности (AD 50 > 245 мкг; P <0,0001 по сравнению с деацетилированным CP8 O ). Эти результаты демонстрируют, что ацетильные группы O не влияли на образование абсцесса, тогда как нейтрализация свободных аминогрупп на CP8 ацетилированием N отменяла его биологическую активность.

    Защита от образования абсцесса обработкой крыс препаратом

    S.aureus или B. fragilis Полисахариды.

    Группы животных обрабатывали физиологическим раствором, 20 мкг S. aureus CP8 или 20 мкг B. fragilis PS A, как описано в разделе «Материалы и методы », и заражали i.p. с 20 мкг CP8 или PS A, смешанного с SCCA. Результаты представлены в таблице 2. У животных, получавших физиологический раствор перед заражением CP8, частота абсцессов составляла 89%, тогда как предшествующее лечение CP8 или PS A приводило к значительному снижению образования абсцесса в каждой группе (37 и 5%, соответственно, P <0.0005). Кроме того, обработка CP8 или PS A защищала от заражения PS A, уменьшая образование абсцесса в обработанном физиологическим раствором контроле с 85% до 15% в каждом случае ( P <0,0001).

    Таблица 2

    Защита от абсцесса, вызываемого S. aureus CP8

    Чтобы определить, может ли лечение этими полисахаридами защитить от абсцессов, вызванных живыми бактериями, животных лечили подкожно. физиологическим раствором, CP8 или PS A, а затем провоцируют 10 7 КОЕ S.aureus PS80. Обработка физиологическим раствором приводила к абсцессам, обнаруженным у 85% животных, тогда как обработка CP8 или PS A снижала частоту абсцессов до 33 и 26% соответственно ( P <0,005; Таблица 2). Подобное лечение отрицательно заряженным полисахаридом ( S. pneumoniae тип 3 CP) не давало защиты от штамма PS80, что приводило к частоте абсцессов 75%. В отдельном эксперименте животных лечили физиологическим раствором или CP8 и заражали метициллин-устойчивым S.aureus COL. Только у 27% крыс, получавших CP8, развились абсцессы по сравнению с 86% в контрольной группе, получавшей физиологический раствор (таблица 2, P = 0,003).

    In vitro Активация Т-клеток с помощью S. aureus CP8.

    В этих исследованиях мы протестировали CP8, очищенный из S. aureus PS80, поскольку этот бактериальный штамм не продуцирует суперантигены (энтеротоксины A, B, C, D, E, H, токсин-1 синдрома токсического шока или эксфолиативный токсин A).CD4 + Т-клетки культивировали с облученными антигенпрезентирующими клетками и либо с S. aureus CP8, либо с контрольными полисахаридами. Клеточную пролиферацию измеряли через 6 и 9 дней после культивирования для CD4 + Т-клеток человека и через 4 и 6 дней после культивирования для CD4 + Т-клеток крысы. CP8 вызывал мощный пролиферативный ответ как в Т-клетках человека, так и в крысах (рис. 3). Этот ответ имел место в зависимости от дозы в клетках человека и достиг пика на 9-й день посткультуры (рис.3 А ). Ответ Т-клеток был сравним с ответом, наблюдаемым с CP S. pneumoniae типа 1 в том же диапазоне доз, и был значительно выше, чем ответ только на среду. Капсула группы B Streptococcus типа III, отрицательно заряженный полисахарид, не смогла активировать человеческие Т-клетки в этом анализе (данные не показаны). Суперантиген SEA S. aureus (5 нг / мл) индуцировал пролиферативный ответ Т-клеток, который был значительно выше, чем пролиферация, индуцированная любым из полисахаридных антигенов.

    Рисунок 3

    Очищенный CP8 вызывал сильный пролиферативный ответ как в Т-клетках человека ( A, ), так и крысы ( B ). Активация человеческих Т-клеток с помощью S. pneumoniae CP1 и S. aureus CP8 достигла пика на 9-й день посткультуры ( A ), тогда как реакция Т-клеток крысы достигла пика на 6-й день ( B ).

    CP8 также вызывал мощный пролиферативный ответ в CD4 + Т-клеток крысы после совместного культивирования (рис.3 В ). Ответ Т-клеток достигал пика на 6 день после культивирования и был сравним с ответом, вызванным CP S. pneumoniae типа 1 при 20 мкг / мл. Отрицательно заряженный полисахарид типа III Streptococcus группы B не смог стимулировать Т-клетки крысы in vitro .

    CD4

    + Т-клетки, активированные CP8 in vitro Модулируют образование абсцесса in vivo .

    Роль активации Т-клеток с помощью СР8 в модуляции образования абсцесса была определена в экспериментах по переносу Т-клеток.Очищенные крысиные CD4 + Т-клетки культивировали in vitro с СР8 в присутствии облученных антигенпредставляющих клеток в течение 5 дней, разделяли на две аликвоты и переносили различным группам животных двумя отдельными путями введения. Первая группа животных получала стимулированные Т-клетки внутрибрюшинно. вместе с SCCA. Второй группе животных вводили стимулированные Т-клетки i.c. За 24 ч до i.p. Проба с ≈10 7 КОЕ S. aureus PS80 и SCCA.Через 6 дней у животных оценивали развитие абсцессов, и результаты представлены в таблице 3. CD4 + Т-клетки, культивированные со средой или нерелевантным контрольным полисахаридом (капсула стрептококка типа III группы B ), которые были имплантированы в брюшная полость с SCCA не смогла вызвать абсцессы. Однако у животных, зараженных SCCA и CD4 + Т-клеток, культивированных с CP8, частота абсцесса составила 80%. i.p. провокация CD4 + Т-клеток в отсутствие SCCA не вызывала образования абсцесса.

    Таблица 3

    CP8-активированные Т-клетки могут способствовать или защищать от образования абсцесса

    Введение животным тех же CP8-стимулированных CD4 + Т-лимфоцитов i.c. За 24 часа до бактериального заражения защищалось от образования абсцесса (таблица 3). У животных, которым вводили средне- или GBS-стимулированные CP8 Т-клетки CD4 + и заражали жизнеспособными S. aureus PS80, частота абсцесса составляла 90%, тогда как только 20% крыс получали стимулированные CP8 CD4 + Т-клетки. развитые абсцессы ( P <0.01).

    Обсуждение

    Цвиттерионные полисахариды являются мощными агентами, вызывающими абсцесс, при имплантации в брюшную полость вместе с SCCA (10). И наоборот, s.c. введение этих полимеров (в отсутствие адъюванта) перед внутрибрюшинным введением. заражение различными бактериями, вызывающими абсцесс, предотвращает последующее образование абсцесса (11). Бактериальные полисахариды с разными повторяющимися структурными единицами, которые демонстрируют этот мотив цвиттерионного заряда ( B.fragilis PS A и PS B и S. pneumoniae CP типа 1) обладают этими биологическими свойствами. На основе этих данных мы предположили, что такой организм, как S. aureus , который тесно связан с клиническими случаями абсцессов, может иметь один или несколько полисахаридов, связанных с клеточной стенкой, с мотивом цвиттерионного заряда, и что эти полимеры могут модулировать абсцесс. индукция этим организмом.

    В 1990 году Моро et al. (15) показал, что S.aureus CP5 был частично (50%) O ацетилированным полимером со следующей структурой повторяющихся звеньев: [→ 4) -3- O- Ac-β-d-Man p NAcA- (1 → 4 ) -α-l-Fuc p NAc- (1 → 3) -β-d-Fuc p NAc- (→] n . Vann и др. (28) сообщили о структуре CP8 для be [→ 3) -4- O -Ac-β-d-Man p NAcA- (1 → 3) -α-l-Fuc p NAc- (1 → 3) -β-d- Fuc p NAc- (→] n , но для подтверждения этого вывода были предоставлены только данные по 13 C.Наш анализ структуры S. aureus CP8 показал, что он только частично ацетилирован N , в результате чего получается полимер, который имеет свободные аминогруппы и отрицательно заряженные карбоксильные группы. Очищенный CP8 из трех штаммов (Becker, O13 и PS80) показал различную степень ацетилирования N . Обнаружение мотива цвиттерионного заряда, связанного с этим полимером, побудило нас оценить его способность модулировать образование абсцесса на соответствующей модели на животных. Наши результаты показали, что жизнеспособный S.aureus , убивало S. aureus , очищенные CP и рибитолтейхоевую кислоту из S. aureus вызывали абсцессы у крыс. Химические модификации структуры CP8 показали, что свободные амино- и карбоксильные группы этого повторяющегося звена имеют решающее значение для его активности. Однако удаление ацетильных групп O не повлияло на его способность вызывать абсцессы.

    Животные, получавшие подкожно с CP8 за 24 ч до заражения либо CP8, либо PS A, смешанными с SCCA, были защищены от образования абсцесса.Доза полисахарида в 20 мкг, использованная для заражения животных в этих экспериментах, была в 60 раз выше, чем значения AD 50 для этих полимеров. Профилактическое лечение CP8 также предотвратило абсцессы, возникшие в результате бактериального заражения жизнеспособным S. aureus PS80 или штаммом 5 типа COL. Контрольная доза PS80 в этом исследовании была в 1,6 × 10 5 — раз больше, чем значение AD 50 для этого организма. Способность предотвращать абсцессы, вызванные гетерологичными антигенами, указывает на то, что CP8 обладает широкой защитной активностью.

    Демонстрация того, что CP8 из S. aureus активирует CD4 + Т-клеток как человека, так и крысы in vitro , дополнительно поддерживает иммуномодулирующие свойства этого полимера. Активация Т-клеток бактериальными полисахаридами встречается редко, и до сих пор было показано, что только полимеры с мотивом цвиттерионного заряда обладают такой активностью (18). CP8, очищенный из S. aureus PS80, использовался для большинства этих исследований, поскольку штамм Becker продуцирует энтеротоксин B.Подробный химический и ЯМР-анализ показал, что препараты полисахаридов не содержат белков и липополисахаридов. Биологическая роль CD4 + Т-клеток, активированных CP8, была продемонстрирована на животной модели. Клетки из той же культуры , стимулированной in vitro CP8, могут способствовать формированию абсцесса при имплантации SCCA в брюшную полость крыс или обеспечивать защиту при внутривенном введении. 24 ч до заражения жизнеспособным S. aureus . Эти результаты подтверждают наши предыдущие исследования с Т-клетками, активированными B. fragilis PSA или S. pneumoniae типа 1 CP (25), и поднимают вопросы, касающиеся роли CD4 + T-клеток в модуляции образования абсцесса. . Демонстрация того, что один и тот же тип клеток может иметь, казалось бы, парадоксальную активность, приводящую к иммунопатологии (образование абсцесса) или иммунитету (предотвращение образования абсцесса), аналогична модуляции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE).Этот болезненный процесс может быть вызван у грызунов путем инъекции аутоантигена, основного белка миелина, в присутствии полного адъюванта Фрейнда, тогда как профилактическое введение этого белка в отсутствие белка Фрейнда приводит к защите (31). Эти биологические свойства также находятся под контролем CD4 + Т-клеток. Кроме того, роль SCCA в наших исследованиях аналогична роли адъюванта Фрейнда при EAE. Однако можно утверждать, что использование SCCA в качестве адъюванта в нашей модели очень похоже на ход событий (т.например, попадание содержимого толстой кишки в брюшную полость), которые приводят к образованию абсцесса при заболевании человека. В настоящее время мы изучаем, ответственны ли различные субпопуляции CD4 + Т-клеток за индукцию или защиту абсцесса, или же наличие SCCA в брюшной полости для экспериментов по индукции абсцесса является определяющим фактором.

    Ранее мы показали, что обработка крыс цвиттерионными полисахаридами перед заражением инокулятом с содержимым слепой кишки предотвращает образование абсцесса и снижает уровень смертности животных (32).Эти результаты коррелируют с предыдущими исследованиями на людях и крысах, в которых использование фибринолитических соединений снижало смертность и сопровождалось повышенной дренажной эффективностью, отсутствием фрагментации содержимого брюшной полости и отсутствием вторичных абсцессов (33). Это ставит под сомнение представление о том, что ограждение бактерий внутри развивающихся абсцессов полезно для хозяина, и согласуется с более свежими экспериментальными и клиническими данными, которые поддерживают концепцию о том, что предотвращение внутрибрюшных абсцессов в конечном итоге полезно для пациентов.

    Таким образом, мы продемонстрировали, что S. aureus продуцирует множественные связанные с клетками цвиттерионные полимеры, которые усиливают образование внутрибрюшного абсцесса. Помимо СР5, СР8 и тейхоевой кислоты, несшитый пептидогликан (присутствует в растущих клетках) и липотейхоевая кислота также обладают мотивом цвиттерионного заряда и могут способствовать индукции абсцесса. Интересно, что испытанные стафилококковые полисахариды более эффективны, чем большинство ХП, которые, как было показано, вызывают образование абсцесса (10). S. aureus CP8 активирует CD4 + Т-клеток человека и крысы, а активированные Т-клетки демонстрируют очевидную роль в модулировании образования абсцесса в экспериментальной модели на животных. Эта работа обеспечивает структурное / функциональное обоснование способности стафилококка вызывать внутрибрюшные абсцессы и может частично объяснить распространенность стафилококковых абсцессов в различных участках инфекции. Роль цвиттерионных полисахаридов S. aureus в индукции абсцессов на других участках тела в настоящее время изучается.

    Благодарности

    Мы благодарим докторов наук. Деннису Касперу и Эндрю Ондердонку за критические предложения и доктору Лоуренсу Паолетти за полисахарид стрептококка III типа группы B. Мы признательны за техническую помощь Джин-сэру Паку, Дереку Фредериксону, Брайану Хетту и Барбаре Рейнап. Работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения AI34073 и AI45563 (для A.T.) и AI29040 (для J.L).

    Сноски

    • ↵ * Кому запросы на перепечатку следует направлять по адресу: Channing Laboratory, 181 Longwood Avenue, Boston, MA 02115.Электронная почта: atzianabos {at} channing.harvard.edu.

    • Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

    Сокращения

    CP,
    капсульный полисахарид;
    PS A,
    Bacterioides fragilis полисахарид A;
    SCCA,
    стерильный адъювант содержимого слепой кишки;
    КОЕ,
    колониеобразующих единиц;
    AD 50 ,
    доза, необходимая для индукции абсцессов у 50% испытанных животных;
    i.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *