Туберкулез под микроскопом: Микроскоп для туберкулеза

Микроскопическое исследование на микобактерию туберкулеза окрашенного мазка

Скачайте мобильное приложение

  

Просмотр результатов

Описание Подготовка Интерпретация результатов

Методы лабораторной диагностики туберкулеза весьма разнообразны как по характеру производимых исследований, так и по тому патологическому материалу, который подвергается исследованию. Кроме общепринятых исследований, используемых в практике при различных заболеваниях, в клинике туберкулеза применяются специальные лабораторные методы, связанные со спецификой этого заболевания. Получаемые результаты помогают клиницистам в дифференциальной диагностике процессов различной локализации, способствуют раннему выя влению туберкулеза, учитываются при выборе тех или иных методов лечения и определения его эффективности.

Скрининговым методом диагностики туберкулеза является микроскопический (бактериоскопический) метод. Материалом для исследования могут быть мокрота, моча (при необходимости другие жидкости организма). Они  исследуются путем приготовления мазков (нанесение тонкого слоя материала на стекло), с последующим окрашиванием специальными красителями, позволяющими сделать бактерии видимыми при помощи микроскопа. Результат микроскопического исследования носит предварительный характер, так как метод не позволяет определить вид микобактерии, а выявляет лишь ее наличие. Присутствие кислотоустойчивых микобактерий в клиническом материале может быть установлено при микроскопическом и/или культуральном исследовании. Однако необходимо иметь в виду, что микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудителей туберкулеза) от нетуберкулезных («атипичных») микобактерий — возбудителей микобактериозов. На основании микроскопического исследования возможно сделать заключение только о наличии или отсутствии в биоматериале кислотоустойчивых микобактерий.

Это объясняется тем, что в природе существует большое число нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих микобактериозы, а также кислотоустойчивых сапрофитов, не вызывающих заболевания человека. Микроскопически они неотличимы от Mycobacterium tuberculosis.

Несмотря на указанные недостатки, микроскопия остается одним из основных методов микробиологических исследований. Ее преимущество заключается в быстроте получения результата и относительной простоте исследования. Метод позволяет в короткие сроки обнаружить наиболее эпидемически опасных больных туберкулезом и микобактериозами, выделяющих большие количества микобактерий, и остается актуальным  методом при выявлении больных туберкулезом и микобактериозами на первичных этапах обследования больных, а также при динамическом наблюдении за состоянием микобактериальной популяции в процессе лечения. Кроме того, микроскопическое подтверждение тинкториальных свойств культуры остается обязательным исследованием при ее диагностике.

Человеческий туберкулез вызывают определенные бактерии, относящиеся к микобактериям. Но очень редко заболевание, схожее с туберкулезом, могут вызвать другие виды микобактерий, а также в мазке могут присутствовать неопасные микобактерии. Для более точного исследования используется бактериологический метод посева.

При подозрении на туберкулез всегда исследуется мокрота, так как легкие поражаются этим заболеванием наиболее часто. При ее отсутствии на исследование направляют промывные воды бронхов. Иногда для уточнения поражения туберкулезом других органов на исследование направляется моча, кал, отделяемое из ран и гнойников.

Микроскопия является предварительным методом исследования с целью выявления наиболее опасных форм туберкулеза («открытых»), при которых больной человек выделяет возбудителя заболевания в окружающую среду. При подозрении на туберкулез органов дыхания необходимо исследовать не менее трёх проб мокроты – это связано с особенностями выделения микобактерий из легких, а также чувствительностью методов исследования. Сбор мокроты осуществляют в течение 3-х дней подряд. Одновременно часть мокроты (или других жидкостей) направляется в бактериологическую лабораторию на посев.

Метод окраски по Ziehl-Neelsen (Цилю-Нильсену) является наиболее распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных методических приемов:

• окраска фуксином (с подогреванием) — при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий, и последние не окрашиваются;
• обесцвечивание (3 мин.) — приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы стойко удерживают краситель и остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет;
• контрастирующая окраска (1 мин.) — обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности препарату.

Показания к назначению:

• наличие явных  симптомов туберкулеза органов дыхания
• наличие продолжительного (более 3 недель) кашля, сопровождающегося выделением мокроты, особенно с кровью, и жалобами на боли в груди
• контактные с больными, имеющими положительный результат бактериоскопического исследования и соответствующие симптомы заболевания
• пациентам, имеющим рентгенологические изменения в легких, подозрительные в отношении туберкулеза

Метод исследования:  микроскопия

Правила сбора мокроты

Исследованию подлежит утренняя мокрота, выделяющаяся во время приступа кашля.

Перед откашливанием необходимо почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости. Необходимо следить за тем, чтобы в контейнер не попала слюна и носоглоточная слизь (особенно при насморке)! При плохом отделении мокроты, накануне исследования применить отхаркивающее средство.

Выделившуюся мокроту собрать в стерильный контейнер.

Референсные значения: не обнаружено (отрицательный результат) Интерпретация результатов: Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает того, что пациент выделяет микобактерии туберкулеза в окружающую среду. Если количество микобактерий очень низкое, то их можно не увидеть в микроскоп. Метод посева намного чувствительнее, так как для того чтобы выросли микобактерии на питательной среде, достаточно одной живой «палочки». В настояще время актуальным является определение специфической ДНК методом ПЦР.

Используя сайт gemohelp.ru, вы соглашаетесь с использованием файлов cookie

Подтверждаю

Подробнее

Всемирный день борьбы с туберкулёзом

ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

Опубликовано: 23/03/2011 — 19:19

Микобактерия туберкулеза «палочка Коха» под электронным микроскопом DR

Елена Сапгир

Дата была выбрана Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в тот же день — 24 марта, когда в 1882 году немецкий микробиолог Роберт Кох (Robert Koch) объявил об открытии возбудителя туберкулеза. Всемирный день борьбы с болезнью, которая по сей день уносит ежегодно около 2 миллионов жизней, отмечается с 1993 года.

Реклама

Всемирный день борьбы с туберкулёзом

Елена Сапгир

Целью проведения Всемирных дней борьбы с тем или иным заболеванием является необходимость напомнить каждому о том, что болезнь, в данном случае – туберкулёз, по сей день уносит во всём мире миллионы жизней, особенно в странах развивающихся. В нынешнем году Всемирный день отмечает второй этап борьбы с туберкулёзом, отводя особо важное место исследованиям в лабораториях и в местах распространения эпидемии. В этом году особым вниманием будут отмечены врачи и учёные всего мира, которые нашли новые способы остановить распространение туберкулёза, и чьи открытия могут воодушевить научное сообщество.

Такая отчаянная борьба с туберкулёзом в наши дни более чем оправдана, так как ежегодно в мире регистрируется девять миллионов новых случаев заболевания и около двух миллионов смертей от этой болезни. Самый тяжёлый груз в классификации стран и континентов, чьё население особо страдает от эпидемии, падает на 22 государства мирового сообщества. В первую очередь – это страны Азии и Африки. Из 85% всех зарегистрированных случаев туберкулёза 55 насчитываются в азиатских странах, и 30% – на африканском континенте. Широко распространена эпидемия туберкулёза в Индии и в Китае.

Однако, если сейчас мы считаем, что количество случаев заболеваний туберкулёзом (9 млн. в год) можно считать эпидемией, то представьте на секунду то время, когда в Европе и в Америке от туберкулёза погибал каждый седьмой житель. А ведь это было не так уж и давно – в XIX столетии. Когда 24 марта 1882 года немецкий микробиолог доктор Роберт Кох объявил о своём открытии причины возникновения заболевания – бациллы туберкулёза, вся научная общественность была взбудоражена. Открытие доктора Коха открыло путь к диагностике и лечению туберкулёза.

Полностью болезнь, однако, победить не удавалось никакими средствами. Более века спустя после открытия палочки Коха (научный термин – микобактерия туберкулёза), в 1993 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила туберкулёз национальным бедствием, а 24 марта – Всемирным днём борьбы с туберкулёзом.

В 2011 году в преддверии проведения Всемирного дня борьбы с туберкулёзом международная организация Врачи без границ напомнила представителям прессы, что из 9 миллионов зарегистрированных случаев заболевания, 450 тысяч пациентов страдают мультирезистентной формой туберкулёза, что сильно осложняет как диагностику болезни, так и её лечение. Почему? Проблема в том, что мультирезистетный туберкулёз, иными словами — туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью, вызывается бактериями, устойчивыми, по меньшей мере, к двум наиболее мощным противотуберкулезным препаратам первой линии – изониазиду и рифампицину.

Однако при всей мощности этих препаратов, медицина нуждается в новых лекарственных средствах, чтобы победить туберкулёз.

Я не думаю, что существует ещё какая-нибудь болезнь, кроме туберкулёза, для лечения которой не появилось никакого нового препарата за последние 50 лет. И не стоит удивляться устойчивости заболевания к существующим антибиотикам, иными словами – мультирезистетности.

Стоит всё же отметить прогресс, который наблюдается в поисках средств борьбы с туберкулёзом. Так, в частности, в 29 странах, где Врачи без границ вплотную занимаются его лечением, ассоциация вводит в практику использование нового теста «Xpert MTB/RIF», с помощью которого результаты можно получить в течение двух часов. Об этом также сообщает представитель Ассоциации, доктор Франсис Варэн. Этот тест не только диагностирует наличие бациллы туберкулёза, но и определяет чувствительность пациента к лечению рифампицином. Однако, как отмечает доктор Варэн, возможности этого теста ограничены. Для его проведения необходимо, как минимум в течение двух часов, снабжение электроэнергией, что не во всех зонах является доступным. Кроме того, до сих пор основная диагностика туберкулёза проводится по анализу мокроты, что сразу исключает возможность определения болезни у детей, не страдающих лёгочной формой туберкулёза.

Говоря о противотуберкулёзных прививках, Франсис Варэн отмечает несовершенство единственной существующей вакцины БЦЖ. Она была создана двумя французскими учёными, по чьим именам и получила своё название бацилла Кальметта-Герена (Bacillum Calmette Guerin, BCG). Её делают в первые дни после рождения ребёнка.

Говоря о вакцинах, мы говорим о БЦЖ, которая была разработана в 1920 году. В этом и заключается проблема туберкулёза: мы говорим только о давно изобретённых методах борьбы с ним. Эта вакцина никогда не была особенно эффективна, вызывала массу споров. Она защищает только детей от тяжёлой формы болезни, но нельзя сказать, что это действительно хорошая вакцина. В реальности она не защищает взрослых. Но если мы хотим избавиться от этой болезни как от серьёзной опасности мирового здравоохранения, нам нужна новая вакцина. Но я думаю, что у нас ничего пока не появится, по крайней мере, в течение ближайших 15 лет.

Тем не менее, учёные не опускают руки и продолжают работать над новыми вакцинами. Так, например, в ЮАР, в настоящий момент идёт испытание самой многообещающей вакцины против туберкулёза, когда-либо существовавшей за последние 90 лет. Он была разработана в Оксфорде. В настоящий момент, как сообщают учёные, существует 12 потенциальных вакцин против туберкулёза в разработке, которые уже были протестированы, но клинические исследования на самом продвинутом уровне ведутся именно в ЮАР. Для тестирования нового медикамента врачи в ЮАР, которая сильно поражена туберкулёзом, вводят вакцину десяткам малышей с целью определить, насколько новая вакцина защитит человеческую жизнь от этой лёгочной инфекции. Врачи также подчёркивают, что впервые вакцина тестируется вне медицинских кругов.

И вновь Врачи без границ напоминают о необходимости продолжить борьбу с туберкулёзом и поиск новых препаратов.

Когда мы сталкиваемся со случаями туберкулёза во Франции, это нам напоминает, что болезнь ещё не побеждена, что до сих пор существуют случаи заболевания туберкулёзом даже в развитых странах. Нужно продолжать быть бдительными, нужно искать новые виды лечения. Всё, о чём мы можем сожалеть, это то, что туберкулёз, по большей части, исчез в них и не является больше приоритетной задачей здравоохранения богатых стран. Возможно, это объясняет такое малое количество исследований этого заболевания.

Слушать больше по этой теме

• Здравоохранение
• Туберкулез

Читайте также

02/03/2023

Участники One Forest Summit в Либревиле обсудили, как сделать защиту лесов прибыльной

02/03/2023

В Тель-Авиве прошла многотысячная демонстрация против судебной реформы

02/03/2023

Глава МАГАТЭ встретится с президентом Ирана в субботу для «возобновления диалога»

02/03/2023

Блинкен и Лавров встретились впервые после вторжения России в Украину

01/03/2023

Макрон в Габоне: президент Франции испытает на прочность «новые отношения» с Африкой

01/03/2023

One Forest Summit: президент Макрон в Либревиле для участия в саммите по спасению тропических лесов

санкции

28/02/2023

ЧВК Вагнер, «Росбанк» и «Русское имперское движение»: Япония объявила о новом раунде санкций

27/02/2023

Столкновения на Западном берегу Иордана — один человек погиб и более 100 ранены

24/02/2023

«Мы не успокоимся, пока Украина не победит и не будет восстановлена»: как Запад отреагировал на годовщину российского вторжения в Украину

24/02/2023

141 страна: Генассамблея ООН приняла резолюцию с требованием к РФ прекратить войну и вывести войска из Украины

22/02/2023

Приостановка участия Москвы в СНВ-3: этапы размежевания России и Запада

21/02/2023

В Турции произошло землетрясение магнитудой 6,3, есть разрушения и погибшие

18/02/2023

Число жертв землетрясения в Турции и Сирии превысило 45 тысяч человек

Микроскопия мазка мокроты при туберкулезе: актуальна ли еще?

Indian J Med Res. 2013 март; 137(3): 442–444.

Информация об авторе Информация об авторских правах и лицензиях Заявление об ограничении ответственности

Туберкулез (ТБ) является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире: примерно два миллиарда человек инфицированы и около двух миллионов человек умирают ежегодно. По оценкам, в 2010 г. во всем мире было зарегистрировано 8,8 миллиона новых случаев ТБ (диапазон 8,5–9,2 миллиона), что эквивалентно 128 случаям на 100 000 населения, и примерно 12,0 миллионов случаев ТБ (диапазон 11,0–14,0 миллионов) распространенных случаев. Это эквивалентно 178 случаям на 100 000 населения. Таким образом, в 2010 г. от туберкулеза умерло около 1,4 млн человек (диапазон 1,2–1,5 млн) 9 .0007 1 . В действующих руководствах Всемирной организации здравоохранения ¹ и Международного союза по борьбе с туберкулезом и болезнями легких (The Union) ² указано, что обязательным этапом обследования пациентов с подозрением на туберкулез легких должно быть микроскопическое исследование образцы их мокроты. Стандарт 2 Международных стандартов лечения туберкулеза категорически гласит, что у всех пациентов (взрослых, подростков и детей, способных выделять мокроту) с подозрением на туберкулез легких должно быть не менее двух, а лучше трех образцов мокроты, полученных для микроскопического исследования ³ . Однако в нынешнюю эпоху молекулярной диагностики какое место занимает микроскопия мазка мокроты? Важно учитывать роль микроскопии мазка, особенно в связи с недавним одобрением ВОЗ нового быстрого автоматизированного теста амплификации нуклеиновых кислот, Xpert MTB/RIF ² .

Микроскопия мазка мокроты была основным методом диагностики туберкулеза легких в странах с низким и средним уровнем дохода ³ , где почти 95 процентов случаев8% смертей от туберкулеза происходят. Это простой, быстрый и недорогой метод, обладающий высокой специфичностью в районах с очень высокой распространенностью туберкулеза ³ . Он также выявляет наиболее заразных пациентов и широко применим в различных группах населения с различным социально-экономическим уровнем ^{3 ,4 ,5} . Таким образом, она стала неотъемлемой частью глобальной стратегии борьбы с ТБ. Однако микроскопия мазка мокроты имеет существенные ограничения в своих возможностях. Чувствительность резко снижается, когда бактериальная нагрузка составляет менее 10 000 организмов/мл образца мокроты. Он также имеет плохую репутацию при внелегочном туберкулезе, педиатрическом туберкулезе и у пациентов с сочетанной инфекцией ВИЧ и туберкулеза ^{6 ,7} . В связи с необходимостью проведения повторных исследований мокроты некоторые пациенты, которые не возвращаются для повторного исследования мокроты, становятся «нарушителями диагностики» ⁸ . Некоторые не возвращаются за результатами и теряются из-за лечения и последующего наблюдения. Личное наблюдение показало, что ограниченные ресурсы, большое количество образцов, все вместе взятые часто сокращают время наблюдения за одним слайдом до менее 60 секунд, что также способствует снижению чувствительности теста. Таким образом, методы оптимизации микроскопии мазка находятся в стадии активного изучения. Была предпринята попытка уменьшить диагностические ошибки путем оценки возможности диагностики туберкулеза легких путем сбора двух образцов мокроты в один день (однодневный протокол) и сравнения этого протокола с национальной политикой сбора образцов в последовательные дни (двухдневный протокол). протокол дня). Было сочтено, что, поскольку 2-дневный протокол не показал статистически значимой разницы в диагностической эффективности по сравнению с 1-дневным протоколом, последний может быть принят в качестве альтернативного протокола, особенно для пациентов, которые с большей вероятностью не справятся с лечением.0007 9 .

Флуоресцентная микроскопия была введена в 1930-х годах в попытке улучшить результаты микроскопии мазка. Для окрашивания мазка используют флуорохромные красители. Галогенная или ртутная лампа высокого давления традиционно используется для возбуждения красителя и его свечения. Мета-анализ исследований, сравнивающих флуоресцентную и обычную микроскопию, показал, что чувствительность флуоресцентной микроскопии была на 10% выше, чем у обычной микроскопии, и что она остается высокой даже после концентрирования образцов ³ . Было обнаружено, что чувствительность выше, особенно при низкосортной положительной мазке мокроты. Однако оценки специфичности были аналогичны обычной микроскопии, хотя время обработки было короче. Этот мета-анализ пришел к выводу, что успешное и широкое внедрение флуоресцентной микроскопии, как можно ожидать, улучшит выявление случаев за счет ожидаемого повышения чувствительности и сокращения времени, затрачиваемого на микроскопическое исследование. Хотя флуоресцентная микроскопия повышает чувствительность микроскопии мазка мокроты, необходимы дополнительные данные о специфичности и клинических последствиях, связанных с ложноположительными результатами, чтобы руководствоваться внедрением этой технологии в условиях высокой распространенности ВИЧ ¹⁰ . Ограничения по стоимости являются основными проблемами флуоресцентной микроскопии. Этого можно избежать за счет использования светоизлучающих диодов (СИД), стоимость которых составляет менее 10 процентов стоимости ртутной лампы. При сроке службы более 50 000 часов он может работать от батарей и, таким образом, используется на периферии с определенными эксплуатационными преимуществами ¹¹ .

Методы диагностики туберкулеза, основанные на экспресс-культивировании, включают экспресс-культуру в жидкой среде, результаты которой могут быть получены через несколько недель ¹² ; тонкослойная агаровая культура, среднее время обработки которой составляет 11,5 дней ¹³ , и анализ чувствительности к лекарственным препаратам под микроскопом (MODS), который может дать результаты в среднем через 9,2 дня ¹³ . Анализы на основе фагов дают результаты через 2 дня ¹⁴ . Хотя показатели эффективности этих методов могут быть лучше, чем у микроскопии мазка, время выполнения работ больше. Существуют также требования с точки зрения инвестиций в инфраструктуру и оборудование, что приводит к более высоким затратам на испытание.

Тесты амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) пытаются обеспечить точную и быструю диагностику ТБ с использованием технологии, которая обеспечивает улучшенные функции чувствительности и специфичности по сравнению с микроскопией мазка мокроты. К сожалению, у NAAT есть инфраструктура и требования к инвестициям, которые часто выходят за рамки возможностей большинства диагностических учреждений, предлагающих диагностику ТБ населению, особенно в развивающихся странах. В то время как большинство МАНК не могут сравниться с доступностью микроскопии мазка мокроты, петлевая изотермическая амплификация (LAMP) является одним из МАНК, который потенциально может быть доступным и экономически эффективным. LAMP оценивается как тест для диагностики туберкулеза легких. Общие рабочие характеристики LAMP и флуоресцентной микроскопии мазка кажутся в целом схожими. Однако эффективность LAMP в образцах с отрицательным мазком не оказалась полностью приемлемой ¹⁵ . Кроме того, для отслеживания прогресса заболевания по-прежнему потребуются посев и тестирование на чувствительность к лекарствам.

В реальных условиях потребуется немало времени, прежде чем новый МАНК на блоке, Xpert MTB/RIF, сможет быть достаточно децентрализован, чтобы заменить микроскопию мазка в качестве диагностического теста. Это особенно актуально для географических районов с высокой распространенностью туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью или коинфекции ВИЧ/ТБ, поскольку большинство этих районов находятся в слаборазвитых зонах стран с низким доходом, с нерегулярным доступом к электричеству и воде, а также а также слабо развитая инфраструктура для бесперебойных поставок расходных материалов и их хранения. По иронии судьбы именно в этих областях Xpert может оказать максимальное влияние. Таким образом, следует также иметь в виду, что технология Xpert MTB/RIF не устраняет необходимость в обычной микроскопии, посевах и тестах на чувствительность к лекарственным средствам, которые необходимы для мониторинга хода лечения и выявления устойчивости к другим препаратам, кроме рифампицина. Кроме того, соображения стоимости склоняются в пользу микроскопии мазка в качестве первоначального инструмента диагностики и скрининга туберкулеза.

Гипотетически, быстрый и общедоступный тест, на который не влияет ВИЧ-статус, с чувствительностью 85% и специфичностью 97%, может ежегодно спасать 392 000 скорректированных жизней, или 22% глобальная смертность от туберкулеза ¹⁶ . В идеале, чтобы можно было эффективно диагностировать туберкулез, тест должен быть доступен для использования в периферийных центрах с ограниченными ресурсами. Этот тест не должен требовать электричества, охлаждения или доступа к чистой воде. Он должен быть широко доступен, удобен для пользователя, с минимальными требованиями или вообще без обучения. Результаты должны быть доступны в течение часа, и они должны иметь высокую чувствительность, специфичность и положительную и отрицательную прогностическую ценность. Технология должна быть надежной и выдерживать испытание временем. Диагностический тест должен решать задачу обеспечения доступности эффективной диагностики ТБ для групп населения, которые больше всего в ней нуждаются, но могут позволить себе меньше всего.

В настоящее время такого диагностического теста не существует. Однако на данный момент ближе всего к этому у нас есть микроскопия мазка мокроты. До тех пор, пока не будет доступен такой эффективный диагностический тест в месте оказания медицинской помощи; возможно, микроскопия мазка мокроты останется. ¹⁸

1. Глобальная борьба с туберкулезом: Доклад ВОЗ, 2011 г. [по состоянию на 22 декабря 2012 г.]. Доступно по адресу: http://www.who.int/tb/publications/global_report/2011/gtbr11_main.pdf.

2. Reider HL, Van Deun A, Kam KM, Kim SJ, Chonde TM, Trebucq A, Urbanczik R, редакторы. 68 бульвар Сен-Мишель, 750006, Париж, Франция: Международный союз по борьбе с туберкулезом и легочными заболеваниями; 2007. Приоритеты для служб бактериологии туберкулеза в странах с низким уровнем дохода. [Академия Google]

3. Международные стандарты лечения туберкулеза. [по состоянию на 6 марта 2013 г.]. Доступно по адресу: http://www.who.int/tb/publications/2006/istc_report.pdf.

4. Технология автоматизированной амплификации нуклеиновых кислот в режиме реального времени для быстрого и одновременного выявления туберкулеза и устойчивости к рифамицину: система Xpert MTB/RIF. Программное заявление ВОЗ. 2011. [по состоянию на 23 декабря 2012 г.]. Доступно по адресу: http://whqlibdoc. who.int/publications/2011/9789241501545_eng.pdf.

5. Steingart KR, Henry M, Ng V, Hopewell PC, Ramsay A, Cunningham J, et al. Сравнение флуоресценции с обычной микроскопией мазка мокроты при туберкулезе: систематический обзор. Ланцет Infect Dis. 2006; 6: 570–81. [PubMed] [Академия Google]

6. Luelmo F. ​​Какова роль микроскопии мокроты у пациентов, посещающих медицинские учреждения? В: Фриден Т., редактор. Туберкулез Томана: выявление, лечение и мониторинг — вопросы и ответы. 2-е изд. Женева: Всемирная организация здравоохранения; 2004. С. 7–13. [Google Scholar]

7. Перкинс, доктор медицины. Новые средства диагностики туберкулеза. Int J Tuberc Lung Dis. 2000;4(12 доп. 2):S182–8. [PubMed] [Google Scholar]

8. Харрис А.Д., Махер Д., Нанн П. Подход к проблемам диагностики и лечения туберкулеза легких с отрицательным мазком у взрослых в условиях высокой распространенности ВИЧ в странах Африки к югу от Сахары. Всемирный орган здравоохранения Быка. 1998;76:651–62. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

9. Шингадия Д., Новелли В. Диагностика и лечение туберкулеза у детей. Ланцет Infect Dis. 2003; 3: 624–32. [PubMed] [Google Scholar]

10. Рават Дж., Бисвас Д., Синдхвани Г., Кешарвани В., Масих В., Чаухан Б.С. Нарушители диагноза: упущенный из виду аспект в индийской пересмотренной национальной программе борьбы с туберкулезом. J заражает страны разработчиков. 2012;6:20–2. [PubMed] [Google Scholar]

11. Рават Дж., Бисвас Д., Синдхвани Г., Масих В. Альтернативный протокол однодневной микроскопии мазка для диагностики туберкулеза легких. Респирология. 2010;15:1127–30. [PubMed] [Академия Google]

12. Каттаманчи А., Дэвис Дж.Л., Вородриа В., Ден Бун С., Ю С., Матову Дж. и соавт. Чувствительность и специфичность флуоресцентной микроскопии для диагностики туберкулеза легких в условиях высокой распространенности ВИЧ. Int J Tuberc Lung Dis. 2009;13:1130–6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

13. Хунг Н.В., Си Д.Н., Энтони Р.М., Кобеленс Ф.Г., ван Солинген Д. Флуоресцентная микроскопия для диагностики туберкулеза. Ланцет Infect Dis. 2007; 7: 238–9. [PubMed] [Google Scholar]

14. Балабанова Ю., Дробневский Ф., Николаевский В., Круунер А., Маломанова Н., Симак Т. и соавт. Комплексный подход к экспресс-диагностике туберкулеза и множественной лекарственной устойчивости с использованием жидкокультуральных и молекулярных методов в России. ПЛОС Один. 2009 г.;4:e7129. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

15. Leung E, Minion J, Benedetti A, Pai M, Menzies D. Методы культивирования микроколоний для диагностики туберкулеза: систематический обзор. Int J Tuberc Lung Dis. 2012; 16:16–23. [PubMed] [Google Scholar]

16. Prakash S, Katiyar SK, Purwar S, Singh JP. Клиническая оценка анализа на основе микобактериофагов для быстрого обнаружения Mycobacterium tuberculosis в образцах из дыхательных путей. Индийская J Med Microbiol. 2009; 27:134–138. [PubMed] [Академия Google]

17. Джордж Г., Мони П., Кеннет Дж. Сравнение эффективности петлевой изотермической амплификации, флуоресцентной микроскопии мазка и посева для диагностики туберкулеза. ПЛОС Один. 2011;6:e21007. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

18. Keeler E, Perkins M, Small P, Hanson C, Reed S, Cunningham J, et al. Снижение глобального бремени туберкулеза: вклад улучшенной диагностики. Природа. 2006; 444:49–57. [PubMed] [Google Scholar]

Электронно-микроскопический анализ деления клеток Mycobacterium tuberculosis | Письма по микробиологии FEMS

Abstract

Методом электронной микроскопии изучена ультраструктура делящихся клеток Mycobacterium tuberculosis . Две особенности клеточного деления наблюдались и описаны здесь. Во-первых, клетки способны к своего рода «защелкивающемуся» движению после деления. Это движение, вероятно, связано с многослойной клеточной стенкой, в которой внутренний слой участвует в формировании перегородки, а внешний слой разрывается первым с одной стороны. Второй особенностью, связанной с клеточным делением, является способность делящихся клеток образовывать временные ветвящиеся структуры.

Mycobacterium tuberculosis , щелкающее деление клеток, электронная микроскопия, ветвление клеток электронной микроскопии (ЭМ) [1],[2]. Большинство этих ранних исследований ЭМ давали изображения гладких бацилл с низким разрешением по сегодняшним стандартам. С 1950-х годов большинство исследований микобактерий с помощью ЭМ было сосредоточено на видах, отличных от 9.0101 M.tuberculosis , что отражает инфекционный риск работы с этим возбудителем [3]. Исторически сложилось так, что большинство ЭМ-исследований микобактерий были сосредоточены на ультраструктуре клеточной оболочки [4]. В дополнение к обычным функциям, определяющим форму клеток и выступающим в качестве барьера проникновения, клеточная оболочка M.tuberculosis также является важным элементом в регуляции взаимодействия патогенов с хозяином [5]. Клеточная оболочка состоит из плазматической мембраны и окружающей клеточной стенки. Клеточная стенка содержит два отдельных слоя, видимых с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ): внутренний, электронно-плотный слой, состоящий из пептидогликана; и внешний, проницаемый для электронов слой, который, как полагают, представляет собой комплекс миколиларабиногалактана, ковалентно связанный с пептидогликаном [6], [7]. В настоящем исследовании была выдвинута гипотеза о существовании двухслойной клеточной стенки в M.tuberculosis может придавать свойства клеточного деления, отличные от наблюдаемых у большинства грамположительных бактерий с однослойными клеточными стенками. В настоящем исследовании использовалась сканирующая электронная микроскопия высокого разрешения (СЭМ) для наблюдения за тем, подвергается ли M.tuberculosis делению клеток подобно бактериям с несколькими слоями клеточной стенки.

2 Материалы и методы

2.

1 Рост M.tuberculosis

M.tuberculosis 9Штамм 0102 h47Rv (ATCC 27294) выращивали в бульоне Middlebrook 7H9 (Difco) с ADC (альбумин [бычий, фракция V], декстроза и каталаза) и Tween 80 (0,05% об./об.). После засева культур с OD ₆₀₀ 0,1 их выращивали с использованием аппарата с вращающимися колбами при 37 °C. Аликвоты образцов отбирали для анализа с помощью электронной микроскопии через 4 дня роста (OD ₆₀₀ из 1.1) и через 20 дней роста. На четвертый день клетки демонстрировали 20-часовое время удвоения, что указывало на наличие в культурах активно делящихся жизнеспособных клеток. Для этого исследования были проанализированы три разные культуры с инокуляциями, происходящими в разные даты. Культуры выращивали в закрытом помещении BSL3.

2.2 Световая микроскопия

Аликвоты клеток (при плотности ~5 × 10 ⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) мл ^-1 ) смешивали с 0,25 объемами 10% нигрозина, наносили на предметное стекло , и дать высохнуть на воздухе. Образцы просматривали при 1000-кратном увеличении с использованием светового микроскопа Olympus BH-2.

2.3 СЭМ

Сканирующую электронную микроскопию проводили, как описано ранее с небольшими изменениями [8]. Вкратце, 5-мл аликвоты культуры концентрировали центрифугированием (5000 мкл).0101 г ) перед суспендированием в свежем 7H9. Аликвоты концентрированных клеток (с плотностью примерно 5 × 10 ⁸ КОЕ мл ^-1 ) помещали на покрытые поли-1-лизином покровные стекла thermox в 24-луночные планшеты для тканевых культур. Бактериям давали отстояться в течение 30 минут, после чего осторожно декантировали и добавляли 1 мл раствора, содержащего 2% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М буфере какодилата натрия (рН 7,4) с 0,2 М сахарозой. Образцы насыщали при 4 ° C в течение ночи перед удалением из хранилища BSL3. Затем образцы обрабатывали 2% OsO ₄ в 0,1 М какодилатном буфере на 2 ч при комнатной температуре. Была проведена серия последовательных дегидратаций этанола по 10 мин каждая (50%, 70%, 95% и 100%) перед сушкой образцов в атмосфере CO ₂ с использованием сушилки с критической точкой (Samdri-PVT-3B; .). Образцы покрывали золотым напылением (Techanics Hummer V; Anatech) и визуализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi S-570.

2,4 ТЭМ

ТЭМ проводили, как описано ранее [7].

3 Результаты и обсуждение

3.1

M.tuberculosis способен подвергаться механизму «защелкивающегося постделения» клеточного деления

На рис. 1 показано, что популяция клеток M.tuberculosis выросла до средней логарифмической фазы ( OD ₆₀₀ 1.1) содержит ряд парных ячеек в «V-форме»[9]. Эти клетки визуализировали с использованием негативной кислой окраски нигрозином. Это не сильное окрашивание, и для подготовки этих окрашенных образцов не использовалось нагревание, поэтому искажения клеточной морфологии были минимальными. Эти V-образные структуры были дополнительно проанализированы с помощью СЭМ, которая использовалась для демонстрации ряда топографических изменений в 9Клетки 0101 M. tuberculosis подвергаются бинарному делению (рис. 2). Стрелки на рис. 2(а)–(в) указывают на внешне видимые гребни, лежащие рядом друг с другом в начальном месте клеточного деления. Эта структура двойного гребня была очень похожа на ту, что наблюдалась при делении клеток Actinomyces israelli [10], что указывало на лежащую в основе перегородку. На рис. 2(b) показаны две дочерние клетки в начальном состоянии разделения друг от друга в щелкающем движении. Первоначальные параллельные гребни все еще видны на поверхностях, поскольку клетки продолжают изгибаться (рис. 2 (с)). Рис. 2(d) показывает продолжающееся движение дочерних клеток, поскольку они качаются параллельно друг другу, оставаясь при этом соединенными на концах, проксимальных к исходному месту деления. Эти V-формы M. tuberculosis , вероятно, являются очень временными структурами, поскольку менее 5% рассмотренных здесь клеток появлялись в таком расположении. Это контрастирует с V-формами Arthrobacter crystallopoietes , которые представляют собой гораздо более стабильные структуры, поскольку представляют большую часть популяции [11]. Однако в описанном здесь исследовании пары туберкулезных бацилл часто обнаруживались лежащими параллельно и рядом друг с другом; возможно, в результате щелкающего механизма клеточного деления. По завершении клеточного деления исходные два гребня из M. tuberculosis может временно оставаться интактным (рис. 2(e)). Концы, проксимальные к стороне деления, могут продолжать расти, образуя выступ на конце клетки (рис. 2(е)).

1

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Световая микрофотография клеток M.tuberculosis , отрицательно окрашенных нигрозином. Бациллы показаны в виде бесцветных палочек на темном фоне. Незакрытые стрелки указывают на парные бациллы в процессе схватывания (V-формы).

2

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

СЭМ-анализ клеток M.tuberculosis , подвергшихся методу «защелкивания» клеточного деления. (а–г) Прогрессивные стадии разделения клеток после образования перегородки. (а) Стрелки указывают на образование параллельных выступающих гребней в месте формирования подлежащей перегородки. (b и c) Стрелки указывают выступающие гребни, когда клетки разрываются между внешним и внутренним слоями клеточной стенки. (d) Две дочерние клетки соединены вместе в «V-образной форме». (e) Дочерние клетки почти полностью обособлены. Первоначальные внешние гребни все еще видны (стрелки). (f) Как только клетки разделяются, исходный гребень присутствует в виде рубца деления (стрелка), а вновь синтезированный материал клеточной стенки появляется в виде терминального выступа. (а, г, д, е) Бар = 1,5 мкм. (б и в) Бар = 300 нм.

Одна клетка M.tuberculosis могла накапливать многочисленные гребни по мере продолжения клеточных делений (рис. 3(b)). Поскольку положения нескольких гребней не были равноудалены от концов бацилл, это предполагает, что после завершения клеточного деления дочерняя клетка не обязательно удлиняется симметрично. Стрелки на рис. 3(с) указывают на два гребня на одной клетке и означают, что клетка удлиняется быстрее с левой стороны, чем с правой. В качестве альтернативы, правый гребень бактерии на рис. 3(с) мог образоваться в результате более позднего деления клетки, чем левая сторона.

3

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Внешний вид полосчатости на поверхности M. tuberculosis . (а) Стрелки указывают на гребни на клетках, которые, судя по их расположению, могут быть связаны с недавними клеточными делениями. (б) Стрелки указывают на несколько полос на поверхности одной клетки. (в) Показаны два гребня на ячейке (стрелки) с неравной длиной ячейки, выступающей наружу из гребней. Бар = 300 нм.

Наружные гребни на поверхности М.tuberculosis 9Клетки 0102 также видны с помощью ПЭМ (рис. 4). Видна плазматическая мембрана (белая стрелка) с пептидогликаном и электронно-прозрачной областью, видимой дальше наружу. Положение внешних гребней (черные стрелки) возле концов клеток предполагает, что клетки, возможно, недавно разделились, и эти гребни представляют собой шрамы деления (сравните с рис. 3 (а)). В качестве альтернативы, эти периферические полосы могут также быть местами будущих образований перегородок, как это видно на примере M. vaccae [12]. Для нескольких полос, показанных на рис. 3(b), неясно, какие полосы являются результатом предыдущих клеточных делений, а какие полосы могут указывать на продолжающееся образование подлежащих перегородок. Если гребни на концах клеток представляют продолжающееся образование перегородок, то бациллы туберкулеза могут делиться асимметрично. Это асимметричное деление видно с двумя удлиненными 9Клетки 0101 M. tuberculosis на рис. 5. Видно, что короткие дочерние клетки отрываются около одного конца родительской клетки, а не образуются в результате симметричного бинарного деления. Однако более вероятно, что одиночные гребни, видимые на рис. 3(b), представляют собой предыдущие участки клеточного деления, поскольку вновь формирующиеся перегородки могут с большей вероятностью сопровождаться двумя полосами (рис. 2(a)).

4

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

ПЭМ-анализ клеток M. tuberculosis , показывающий рубцы деления на поверхности клеток. Плазматическая мембрана обозначена белой стрелкой. Стрелки указывают гребни возле конца туберкулезной палочки, которые, вероятно, являются рубцами деления. Бар = 20 нм.

5

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Асимметричное деление клеток. (а) От удлиненной клетки одновременно отходят две короткие палочки (стрелки). Толстая стрелка указывает на клетки, подвергающиеся «защелкивающемуся» делению. (б) Стрелка указывает на асимметричное положение перегородки. Бар = 3,33 мкм.

Ребра были видны не на всех ячейках, что может быть связано с износом и истиранием поверхности ячеек в более старых ячейках. Если это так, то образование гребня на клетке M. tuberculosis может свидетельствовать о том, как недавно произошло деление клетки. Активно делящиеся клетки (4-дневные культуры) с большей вероятностью содержали множественные полосы, в то время как клетки более старых культур (20-дневные) имели относительно более гладкий вид (данные не показаны). Альтернативно, отсутствие гребней в клетках может быть связано с динамическими изменениями в структуре клеточной стенки, коррелирующими с изменениями в клеточном метаболизме.

Щелчковое деление клеток было описано для других видов бактерий и не считается артефактом пробоподготовки. Это явление наблюдалось для микобактерий, таких как M. leprae [13] и M. vaccae [12], а также для Nocardia asteroids [14], A. israelli [9] и A. , crystallopoietes [11]. Подобно M. tuberculosis , A. israelli и A. crystallopoietes являются членами класса микробов Actinobacteria, для которых в качестве возможного таксономического инструмента был предложен механизм привязки [10]. Ранее опубликованное СЭМ-изображение 9Штамм 0101 M. tuberculosis h47Ra показывает то, что кажется двумя клетками, претерпевающими щелкающее движение после деления, но не предлагается никакого возможного объяснения [2].

Возможный механизм разделения привязки был описан ранее [3],[11]. Бактерии, способные к этому типу деления, имеют двухслойную клеточную стенку, состоящую из внутреннего и внешнего слоев. Двойная структура клеточной стенки хорошо видна при делении клеток M. avium [15] и M. tuberculosis 9.0102 [7], в котором внутренний слой участвует в формировании поперечной стенки перегородки, а наружный слой клеточной стенки остается интактным в качестве мостика между дочерними клетками. Согласно этому ранее описанному механизму, во время образования перегородки плазматическая мембрана и внутренняя клеточная стенка прорастают внутрь, но внешний слой клеточной стенки остается интактным. После завершения формирования перегородки с поперечной стенкой внутренний слой может продолжать расти и, таким образом, оказывать давление на внешний слой клеточной стенки. Внешний слой в конце концов разрывается сначала на одной стороне клетки, а две дочерние клетки изгибаются на той стороне, где внешний слой все еще не поврежден, образуя «V-образную форму» [10], [11]. В конечном итоге две получившиеся дочерние клетки могут лежать параллельно друг другу, но при этом быть соединенными на одном конце. Разорванный наружный слой оставляет рубец на поверхности клетки, что указывает на бывшее место образования перегородки [12].

3.2 На поверхности

M.tuberculosis

видны переходные ответвления и почки. На рис. 6 показано несколько клеток M.tuberculosis , образующих ответвления. Эти ответвления обычно располагались на концах бацилл и, по-видимому, не вырастали до заметной длины. По этой причине может быть более уместно называть эти проекции «почками» или «аполярными делениями» [2]. Однако в дополнение к этим коротким верхушечным зачаткам можно было увидеть некоторые «Y-образные» клетки с ветвями, расположенными ближе к клеткам и большей длины (рис. 6 (с)).

6

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

СЭМ-анализ M.tuberculosis ветвления клеток. Стрелками указаны ячейки с ответвлениями. а) Ветвь находится ближе к концу бациллы. (b) Ветвь располагается ближе к центру клетки. (c) Y-образная ячейка с ветвью такой же длины, как и ячейка. (d) Стрелка указывает на появление бутонообразного выступа. Бар = 1,5 мкм.

Считается, что ветвление у микобактерий похоже на ветвление актиномицетов в целом: временное и, вероятно, средство, обеспечивающее простое вегетативное деление [16]. Эта временная природа подтверждается здесь небольшим количеством клеток (1–3%), которые демонстрируют ветвистые структуры. 9Клеточная ветвь 0101 M. tuberculosis , вероятно, сначала видна как небольшая почка, которая не вырастает до сколько-нибудь заметных размеров, а затем отламывается как отдельная клетка. Это резко контрастирует с обширным ветвлением, наблюдаемым у M. avium [17] и M. intracellulare [18], а также у видов Streptomyces , у которых стабильный мицелий является неотъемлемой частью их жизненного цикла [19]. Для M.tuberculosis почки напоминают почки дрожжей, поэтому, скорее всего, это механизм простого типа вегетативного деления, чем образование настоящего мицелия.

В заключение, делящиеся клетки M.tuberculosis обнаруживают большее морфологическое разнообразие, чем обычно считается. В этом исследовании сообщается об особенностях клеточного деления, которые редко приписывают M.tuberculosis : способность подвергаться щелкающим движениям после деления, образовывать короткие ответвления и асимметрично делиться. Подобные признаки можно найти у представителей класса бактерий актиномицетов, и эти признаки могут иметь таксономическое значение для этого класса.

Благодарности

Я хотел бы поблагодарить Кристин Дэвитт из Университета штата Вашингтон и Элизабет Фишер из Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH за их техническую помощь в исследованиях с помощью электронной микроскопии. Я также благодарен Энтони Гарзе и Гарольду Джонсону за полезные комментарии. Это исследование стало возможным благодаря исследовательскому гранту от Американской ассоциации легких и гранту для новых исследователей от Национального фонда инфекционных заболеваний.

Каталожные номера

[1]

Rosenblatt

M.B.

Фуллам

Э.Ф.

Гесслер

А.Э.

(

1942

)

Исследования микобактерий под электронным микроскопом

.

Ам. Преподобный Туберк.

46

,

587

–

599

.

[2]

Вернер

Г.Х.

(

1951

)

Электронно-микроскопические исследования клеточной морфологии туберкулезных палочек

.

Библ. Туберкулез.

5

,

53

–

90

.

[3]

Дрейпер

P.

Анатомия микобактерий

.

Ratledge

C.

Stanford

J.

, Eds.

Биология микобактерий. Физиология, идентификация и классификация. об. 1 1982

,

Academic Press, Inc

.,

Лондон

,

9

–

52

903.

[4]

Бреннан

П.Дж.

(

2003

)

Структура, функция и биогенез клеточной стенки Mycobacterium tuberculosis

.

Туберкулез

83

,

91

–

97

.

[5]

Бреннан

П.Дж.

Никайдо

Х.

(

1995

)

Оболочка микобактерий

.

год. Преподобный Биохим.

64

,

29

–

63

.

[6]

Пол

Т.Р.

Беверидж

Т.Дж.

(

1992

)

Повторная оценка профилей оболочки и ультраструктуры цитоплазмы микобактерий, обработанных с помощью обычных протоколов встраивания и замораживания

.

J. Бактериол.

174

,

6508

–

6517

.

[7]

Takade

A.

UMEDA

A.

Matsuoka

M.

Yoshida

S.

Nakamura

M.

0003

Амако

К.

(

2003

)

Сравнительные исследования клеточных структур Mycobacterium leprae и M.tuberculosis с использованием метода замораживания-замещения под электронной микроскопией

.

Микробиолог. Иммунол.

47

,

265

–

270

.

[8]

Борелли

В.

Вита

F.

Shankar

S.

Soranzo

M.R.

Banfi

E.

Scialino

G.

Brochetta

C.

ZabuCCHI

9000 2

. (

2003

)

Пероксидаза эозинофилов человека вызывает изменение поверхности, уничтожение и лизис Mycobacterium tuberculosis

.

Заразить. Иммун.

71

,

605

–

613

.

[9]

Старр

М.П.

Кун

Д.А.

(

1962

)

О происхождении V-форм в Arthrobacter atrocyaneus

.

Архив микробиол.

42

,

289

–

298

.

[10]

Акияма

Х.

(

1977

)

Исследования деления и ветвления клеток Actinomyces israelii

.

Шигаку

65

,

707

–

723

.

[11]

Крулвич

Т.А.

Паштет

J.L.

(

1971

)

Ультраструктурное объяснение резкого движения после деления в Arthrobacter crystallopoietes

.

J. Бактериол.

105

,

408

–

412

.

[12]

Takade

A.

Takeya

T.

Taniguchi

H.

Mizuguchi Y.

3 9 00003 9 (

1983

)

Электронно-микроскопические наблюдения за делением клеток Mycobacterium vaccae

.

J. Gen. Microbiol.

29

,

2315

–

2320

.

[13]

Эдвардс

RP

(

1970

)

Электронно-микроскопические иллюстрации деления в Mycobacterium leprae

.

J. Med. Микро.

3

,

493

–

499

.

[14]

Фарщи

Д.

МакКланг

Северная Каролина

(

1967

)

Тонкая структура астероидов Nocardia , выращенных в среде с определенным химическим составом

.

J. Бактериол.

94

,

255

–

257

.

[15]

Растоги

Н.

Давид

Х.Л.

(

1981

)

Рост и деление клеток Mycobacterium avium

.

J. Gen. Microbiol.

126

,

77

–

84

.

[16]

Биссет

К.А.

Мур

FW

(

1949

)

Родство некоторых разветвленных родов бактерий

.

J. Gen. Microbiol.

3

,

387

–

390

.

[17]

Brieger

E.M.

Cosslett

V.E.

Глауэрт

А.М.

(

1954

)

Репродуктивные изменения птичьих туберкулезных бацилл при изучении под электронным микроскопом

.

J. Gen. Microbiol.

10

,

294

–

303

.

[18]

Мидзугути

Ю.

Мидори

О.

Удо

Т.

(

1985

)

Морфологические изменения, вызванные бета-лактамными антибиотиками в Mycobacterium avium-intracellulare комплекс

.

Антимикроб. Агенты Чемот.

27

,

541

–

547

.

[19]

Klieneberger-Nobel

E.

(

1947

)

Жизненный цикл спороносных Actinomyces по результатам изучения их строения и разделения

.